Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Klinische interpretatie van varianten met de Integrative Genomics Viewer (IGV) voor moleculaire pathologen

134 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/71808

⸱

14 augustus 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University of Pennsylvania, Department of Pathology and Laboratory Medicine, 2University of Michigan, Department of Pathology, 3Genomics Organization for Academic Laboratories (GOAL), 4University of Chicago, Department of Pathology, 5University of Colorado, Department of Pathology, 6University of Pennsylvania, Department of Pathology and Laboratory Medicine, 7Broad Institute of MIT and Harvard, 8University of California San Diego, Department of Medicine, 9Cincinnati Children's Hospital Medical Center, Division of Pathology and Laboratory Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

De software van de integrative genomics viewer (IGV) biedt een uitgebreid, intuïtief venster op de onderliggende gegevens voor klinische variant-calling. Hier presenteren we vijf vignettes die aantonen hoe een snelle differentiatie kan worden gemaakt tussen werkelijke pathogene gebeurtenissen en artefacten, waardoor uiteindelijk het diagnostische vertrouwen wordt versterkt voor praktijkbeoefenaren die betrokken zijn bij de moleculaire rapportage van next-generation sequencing-assays.

Samenvatting

De Integrative Genomics Viewer (IGV) is een cruciaal instrument in de klinische genomica, dat de visualisatie en interpretatie van complexe sequentiegegevens mogelijk maakt. Het combineren van klinische kennis met de visuele evaluatie van sequentieresultaten is de primaire methode waarmee moleculaire pathologen en andere professionals casussen beoordelen en afronden. Diverse softwaretools kunnen hierbij ondersteunen, maar hun relatie tot de onderliggende gegevens moet systematisch worden begrepen en toegepast. Deze studie bevat essentiële achtergrondinformatie over bestandstypen van next-generation sequencing (NGS) gegevens (bijv. FASTQ, BAM, VCF), inclusief een bespreking van hun formaat en doel. Vervolgens beschrijven we de functies van IGV die nuances uit deze bestanden afleiden. We maken gebruik van een reeks gecureerde praktijkcasussen op basis van klinische vignetten, via welke de lezer zal interageren met klinische NGS-sequentiegegevens middels de IGV-software om diverse typen klinisch relevante varianten te beoordelen ten opzichte van het menselijk referentiegenoom. Deze klinische vignetten zijn samengesteld om voorbeelden te geven van enkele complexiteiten bij de interpretatie van genomische gegevens, en hoe het gebruik van IGV als onderdeel van een routinematige workflow aanvullende interpretatieve informatie kan bieden voor varianten, verdergaand dan de standaard variant calls van bioinformatische softwarealgoritmen. De visuele inspectie van genomische varianten met behulp van de tools in IGV kan subtiele contextuele aanwijzingen onthullen (zoals variant allele frequency, strand bias, weefselspecifieke context) die de interpretatie van genomische varianten kunnen beïnvloeden. Hoewel deze studie zich richt op het gebruik van IGV voor de detectie en interpretatie van somatische varianten, kunnen de beschreven toepassingen worden geëxtrapoleerd naar de kiemlijnsetting, inclusief de analyse van complexe varianten en de detectie van mosaicisme.

Inleiding

De oncologische zorg is de afgelopen jaren getransformeerd door het gebruik van next-generation sequencing (NGS)-technologieën om diagnoses, prognoses en de keuze van therapieën te onderbouwen1. NGS-testen zijn de standaardzorg geworden bij meerdere tumortypen voor 1) het vaststellen van de diagnose van een moleculair gedefinieerde tumor, 2) het gebruik van tumortype-agnostische biomarkerresultaten voor therapiebeslissingen en 3) het bepalen van de risicostratificatie voor specifieke tumortypen2,3. Nauwkeurige en tijdige resultaten van NGS en andere biomarkertesten zijn een cruciaal onderdeel geworden van de patiëntenzorg en de behandelplanning in de oncologie.

NGS-testen worden doorgaans uitgevoerd in grote referentielaboratoria of in ziekenhuis- of academische laboratoria, wanneer instellingen over voldoende expertise en middelen beschikken om dergelijke testen te ontwikkelen en te onderhouden. De organisatie Genomics Organization for Academic Laboratories (GOAL) is opgezet als een collaboratief netwerk, gericht op het delen van academische kennis en reagenskosten4. Een aanzienlijk onderdeel van de inspanningen van het GOAL-consortium bestond uit trainingssessies voor kritieke componenten bij de beoordeling en rapportage van klinische studies. Deze zijn ontwikkeld als praktische instructiesessies en omvatten een interactieve workshop over de integrative genomics viewer (IGV) om de basis- en geavanceerde functies ervan in de genomische geneeskunde te demonstreren.

IGV is een datavisualisatietool die is ontworpen om gebruikers in staat te stellen NGS-gegevens en andere grote datasets eenvoudig te beoordelen, aangezien de meeste NGS-gegevens enorm en onhandelbaar zijn zonder een grafische gebruikersinterface5. IGV was aanvankelijk niet ontworpen voor klinische variantanalyse. Vanwege het gebruiksgemak voor alle moleculaire professionals, ongeacht hun ervaring met bio-informatica, is het echter door veel laboratoria breed geadopteerd als onderdeel van de complexe workflow voor gegevensbeoordeling6. Deze studie is opgezet als een mechanisme om deze informatie te verspreiden onder de bredere gemeenschap van professionals in genomische laboratoria.

De klinische noodzaak voor het gebruik van IGV als onderdeel van een klinische workflow omvat het detecteren van sequentiefouten, het omgaan met complexiteiten bij het vaststellen van genomische varianten (variant calling) en andere recurrente alteraties waarbij aanvullende visualisatie kan helpen bij een adequate interpretatie van de gegevens.7Het gebruik van IGV vereist standaard bio-informatica-bestanden afkomstig uit een NGS-studie.8De kernfuncties van de IGV-software maken de visualisatie van sequeneringsgegevens mogelijk en vereisen het configureren van een reeks voorkeuren en opties voor klinische variantinterpretatie (Aanvullend bestand 1).

De workflow voor short-read sequencing wordt gekenmerkt door bestandsstandaarden voor FASTQ, binary alignment map (BAM) en variant call format (VCF). NGS bereikt een hoge doorvoer door miljoenen short reads parallel te genereren. Hoewel deze strategie de dataproductie sterk versnelt, is elke read slechts een fragment van het oorspronkelijke DNA of RNA. De read wordt via zijn adaptersequentie bevestigd aan een positie op een NGS-flowcell. Informatie over de sequentie en de basekwaliteit uit de optische verwerking wordt vastgelegd in FASTQ-bestanden. Deze ruwe reads bevatten nucleotide-sequenties samen met hun kwaliteitsscores per base. Daarom is een vroege stap in de verwerking van ruwe reads het aligneren van elke read aan een referentiegenoom8. Omdat elke read wordt toegewezen aan een specifieke locatie in het referentiegenoom met de hoogste aligneringswaarschijnlijkheid, "stapelen" de reads die overeenkomen met dezelfde locatie zich op bij elke locus. Dergelijke gegevens worden opgeslagen in een BAM-bestand volgens de specificaties voor sequence alignment mapping (SAM) (beschikbaar op https://samtools.github.io/hts-specs/SAMv1.pdf; laatst geverifieerd: 30-09-2025) (Figuur 1A). Deze informatie kan visueel worden geïnspecteerd met een genoomdownloader zoals IGV. Zoals geïllustreerd in Figuur 1B, kan het vergelijken van de reads met elkaar of met de referentiesequentie zelf verschillen of discrepanties tussen de nucleotide-sequenties aan het licht brengen. Samenvattingen van enkel deze "variante" posities over het gehele genoom worden samengesteld in een VCF-bestand. Dit bestand kan daarom veel kleiner zijn dan een BAM-bestand, maar bevat nog steeds veel van de nuttige informatie die nodig is voor de beoordeling van varianten. Om die reden is het VCF-bestand gewoonlijk de uiteindelijke output van variant-calling pipelines (Figuur 1C). Zo bevatten FASTQ-bestanden de ruwe read- en kwaliteitsgegevens, biedt het BAM-bestand inzicht in de mate van zekerheid waarmee deze reads in het genoom zijn geplaatst, en vertegenwoordigt het VCF de verschillen tussen de referentiesequentie en de monstersequentie, wat een veel beter beheersbare hoeveelheid gegevens oplevert voor evaluatie ten behoeve van potentiële rapportage.

De zes klinische casussen in deze studie illustreren veelvoorkomende analytische scenario's die gepaard gaan met de detectie van somatische varianten in moleculaire laboratoria, evenals de problemen die het correcte begrip en de interpretatie van de onderliggende gegevens bemoeilijken. Over het algemeen zijn deze casussen gekozen om steeds complexere interpretatiescenario's te illustreren en om aan te tonen hoe het gebruik van geavanceerde functies in IGV uitgebreide genomische kenmerken beter kan beschrijven. Hoewel deze studie zich richt op de interpretatie van somatische varianten, zijn deze functies ook toepasbaar bij het gebruik van IGV voor de visualisatie en interpretatie van kiembaanalteraties6. Merk op dat de in dit artikel gebruikte termen zijn gebaseerd op sequencing-by-synthesis chemie en, waarvan van toepassing, andere analoge termen/concepten voor andere platforms.

Elke klinische casus begint met een zeer beknopte klinische context, gevolgd door instructies over hoe de variant of varianten onderzocht moeten worden om de vraag te beantwoorden: welke aanwezige variant (indien van toepassing) reëel is en welke (indien van toepassing) een artefact is. De klinische context, samen met de details van de sequentiegegevens, is essentieel voor het beantwoorden van die vraag.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De hier gepresenteerde gegevens zijn een mengeling van gesimuleerde en echte NGS-gegevens van patiënten. Alle patiëntgegevens zijn echter gedeïdentificeerd door middel van een combinatie van het verwijderen van labels en extractie van reads op een enkele locus. Dit protocol volgt de toepasselijke richtlijnen van de ethische commissies voor mensonderzoek van alle instellingen van de auteurs.

1. Downloaden van de meest recente versie van de Integrative Genomics Viewer (IGV)

OPMERKING: IGV is een gratis downloadbaar programma voor het visualiseren van diverse genomen, waaronder het menselijk genoom (https://igv.org/doc/desktop/#DownloadPage/). IGV wordt periodiek bijgewerkt om nieuwe versies van transcripten, kenmerken en tracks op te nemen, waarbij de meest recente versie doorgaans bovenaan de lijst staat.

  1. Download het bestand met de naam 'IGV for Windows, Java Included', beschikbaar via de bovenstaande uniform resource locator (URL), naar het bureaublad; afhankelijk van de instelling kunnen hiervoor beheerdersrechten vereist zijn.
  2. Selecteer de menselijke genoomversie (genome build) die in de rapportages zal worden aangeroepen (bijv. hg19 of hg38), welke binnen IGV worden gehost.
    OPMERKING: In deze studie is gebruikgemaakt van IGV 2.19.7. In dit protocol is de versie voor Windows, inclusief Java, gedownload. IGV werd uitgevoerd met de standaardgeheugenallocatie van 8Gb RAM. De instellingen die worden aanbevolen in het voorkeurenstabelblad van IGV en andere secties in IGV zijn geannoteerd in Aanvullend bestand 1.

2. Het begrijpen van de klinische casussen en het downloaden van de benodigde bestanden

  1. Navigeer naar de GitHub-repository: Alle bestanden zijn beschikbaar voor download in de GitHub-repository https://github.com/Eitan177/Demo_IGV.
    OPMERKING: In de GitHub-repository bevindt zich voor elke vignette een sessiebestand; het laden van dit sessiebestand maakt het overbodig om bestanden afzonderlijk te laden en naar de betreffende locus te navigeren, aangezien het sessiebestand deze stappen afhandelt.
  2. Laad een sessiebestand via het bestandmenu. Klik op Bestand > Sessie openen en selecteer het juiste sessiebestand.

3. Het instellen van het dekkingstraject

OPMERKING: In IGV bevat het hoofdvenster een "coverage track". In bepaalde contexten kan zelfs een klein fractie van de reads die specifieke kankervarianten bevatten, klinisch significant zijn. Daarom is het cruciaal om een zeer hoge read-diepte te bereiken in de delen van het genoom die worden geanalyseerd. Als slechts 2% van de reads een bepaalde variant bevat, kunnen honderden of duizenden reads nodig zijn om de variant overtuigend aan te tonen – vandaar de term "deep sequencing".

  1. Controleer of het dekkingstrak aanwezig is: Klik in het bovenmenu op View > Preferences, en selecteer het tabblad Alignments. Bovenaan het tabblad staat een vakje met het label 'Show coverage track'. Zorg dat dit is aangevinkt.
  2. Stel een klinisch significante drempelwaarde in voor varianten op laag niveau: Ga naar het tabblad Alignments zoals beschreven in stap 3.1 en scrol omlaag tot het vakje met het label Coverage allele-fraction zichtbaar is. Stel de waarde in het vak in op 0,01 en klik op Save (het venster met voorkeuren zou moeten sluiten na het klikken op Save).

4. Opzetten van soft-clipped reads

OPMERKING: Deze instelling is onmisbaar voor het detecteren van grotere structurele varianten, zoals genreorganisaties, kopie-aantalveranderingen of gecombineerde insertie-deletiegebeurtenissen. De geavanceerde vignettes — zoals die gericht op EGFR-amplificaties en -deleties — laten zien hoe soft-clipped reads de aanwezigheid van structurele varianten kunnen bevestigen die anders mogelijk over het hoofd zouden worden gezien door standaardvariant-callingsmethoden.

  1. Schakel soft-clips in: Klik in het bovenmenu op View > Preferences en selecteer het tabblad Alignments. Scroll naar beneden naar het vak Show soft-clipped bases en zorg dat dit is aangevinkt (Supplementary File 1) om gedeeltelijk uitgelijnde reads zichtbaar te maken—reads waarvan de randen niet nauwkeurig op de referentie passen en worden "clipped" (afgeknipt).

5. Klinische casussen

  1. Vignet #1: Onderscheid een echte pathogene KRAS (Kirsten rat sarcoma virus oncogene homoloog) variant van een sequentie-artefact.
    OPMERKING: Casus A betreft een man van 65 jaar met een recent gediagnosticeerd longadenocarcinoom, waarbij de histologische beoordeling ongeveer 80% tumor schatte. NGS-profilering identificeerde een KRAS NM_004985.5 c.34G>T (p.G12C) variant, wat een bekende drivermutatie is bij niet-kleincellig longcarcinoom (NSCLC). De resulterende missense-variant KRAS c.34G>T (p.G12C) komt voor in ~13% van de longadenocarcinomen en maakt de patiënt in aanmerking voor doelgerichte therapieën9. Casus B betreft een vrouw van 54 jaar met een bekend sarcoom (geschatte 50% tumor en 50% normaal weefsel). De identieke KRAS c.34G>T (p.G12C) variant werd in dit monster geïdentificeerd. Omdat KRAS c.34G>T (p.G12C) echter zelden wordt gerapporteerd bij sarcomen, roept de aanwezigheid ervan het vermoeden op van een mogelijk sequentie-artefact. 
    1. IGV-workflow (Sessiebestand KRAS.xml)             
      1. Gegevens laden: Selecteer Hg19 in het dropdownmenu voor het genoom en laad het bam-bestand, kras2A_fixed_backbone_2A_new_final_sorted.bam, en navigeer naar chr12:25,398,281–25,403,833 om in te zoomen op de KRAS-genregio. Let erop dat het indexbestand (dezelfde naam als het bam-bestand, maar eindigend op .bai) in dezelfde map als het bam-bestand moet staan.  
      2. Coverage en VAF onderzoeken: Beoordeel codon 12 in Exon 2 (NM_004985.5) en klik op de variantpositie in het coverage-spoor om de read-diepte op die positie weer te geven. Merk een G→T substitutie op (transversie-event), met een VAF van 35%–40%, wat zeer consistent is met een heterozygote, clonale drivermutatie (Figuur 2A), vooral in de context van een tumorcellulariteit van ongeveer 80%.   
      3. Controleren op StrandBias: Kleurcodeer per strand (zie Aanvullend Bestand 1, Stap 4) om een nagenoeg 50:50 forward (rood): reverse (blauw) distributie in het longmonster te onthullen.  
      4. Herhaal stappen 5.1.1.1–5.1.1.3 voor casus B, het sarcoommonster: Laad het bam-bestand, kras2B_fixed_backbone_2B_new_final_sorted.bam, en merk de <1% VAF en nagenoeg exclusieve forward strand-ondersteuning op, wat wijst op een PCR/alignment-artefact (Figuur 2B).
  2. Vignet #2: Een onjuiste classificatie van een multi-nucleotide variant (MNV) oplossen.
    OPMERKING: Een vrouw van 50 jaar met metastatisch melanoom ondergaat tumorprofilering op basis van NGS. Analyse identificeert een potentiële BRAF (B-Raf proto-oncogeen, serine/threonine kinase) c.1798_1799delinsAA mutatie. Hoewel BRAF NM_004333.6: c.1799T>A (p.V600E) vaker voorkomt in diverse solide tumoren, is BRAF c.1798_1799delinsAA (p.V600K) relatief specifiek voor melanoom, aangezien UV-licht C > T transities binnen dipyrimidines kan induceren10. Volgens de HGVS-regels moeten twee single-nucleotide varianten (SNV's) in cis worden benoemd als één enkele MNV. In veel gevallen kan een bio-informatica-pipeline deze complexe variant onjuist identificeren als twee aangrenzende SNV's in cis: BRAF c.1798G>A en BRAF c.1799T>A. Vanwege technische (d.w.z. variant caller-gerelateerde) en biologische (cis vs trans onderscheid) overwegingen bestaat de vrees dat de mutatie onjuist gerapporteerd zou kunnen worden bij de definitieve beoordeling, tenzij de gegevens tijdens de klinische review gevisualiseerd worden.      
    1. IGV-workflow (Sessiebestand BRAF.xml)           
      1. Gegevens laden: Selecteer Hg38 in het dropdownmenu voor het genoom en laad het bam-bestand, kras2B_fixed_backbone_2B_new_final_sorted.bam, en navigeer naar chr7:140,453,136–140,753,336. Let erop dat het indexbestand (dezelfde naam als het bam-bestand, maar eindigend op .bai) in dezelfde map als het bam-bestand moet staan.
      2. Inzoomen op codon 600 van BRAF: Merk een GT→AA dinucleotide verandering op op basis van aangrenzende posities in het coverage-spoor die groen en blauw zijn in plaats van grijs, wat consistent is met p.V600K. 
      3. Scannen op twee individuele SNV's om te bepalen of ze in cis of trans staan: Merk op dat beide SNV's in dezelfde reads zijn gemapt en in cis staan.  
      4. Strand en coverage onderzoeken: Kleurcodeer reads om een ongeveer gelijkmatige forward/reverse ondersteuning te tonen (zie Aanvullend Bestand 1, Stap 4), en een VAF die 50% overschrijdt, wat consistent is met een clonale driver. Een drempelwaarde van 0,01 in het coverage-spoor (zie Aanvullend Bestand 1, Stap 3 voor de configuratie) zorgt ervoor dat gedeeltelijke subclonen (indien aanwezig) zichtbaar blijven (Figuur 2C).  
      5. Context en MNV-nomenclatuur opmerken: De twee nucleotideveranderingen liggen direct naast elkaar. Op basis van de expertconsensus worden SNV's binnen een afstand van 50 bp die op dezelfde sequentie-read zijn gemapt, aangemerkt als één enkele "complexe" of "delins" variant11. 
  3. Vignet #3: Onderzoek naar een KIT (KIT proto-oncogeen, receptor tyrosine kinase) exon 9 insertie in een gastro-intestinale stromale tumor (GIST)
    OPMERKING: Een mannelijke patiënt van 58 jaar met een gastro-intestinale stromale tumor ondergaat een resectie, en er wordt NGS-testen aangevraagd. Resultaten tonen een mogelijke variant in KIT. KIT-mutaties zijn een frequente driver in GIST's, komend voor in ongeveer 75% van de gevallen, en zijn targetbaar. Na activerende mutaties in exon 11 zijn activerende mutaties in KIT exon 9 de meest voorkomende geïdentificeerde drivers, hoewel GIST's met exon 9 mutaties en GIST's met exon 11 mutaties verschillend reageren wat betreft de gevoeligheid voor tyrosinekinaseremmers12. 
    1. IGV-workflow (Sessiebestand KIT.xml)
      1. Gegevens laden: Selecteer het Hg19-genoom en laad het BAM-bestand, KITdupmod2.bam en zorg dat het indexbestand (dezelfde naam als de bam, maar eindigend op .bai) in dezelfde map staat. Navigeer naar chr4:55,592,144-55,592,257, wat overeenkomt met een deel van exon 9 van het KIT-gen.
      2. Weergave compact maken: Klik met de rechtermuisknop op het alignment-spoor en selecteer Squished  om de weergave te condenseren (Figuur 3A).
      3. De insertie lokaliseren: Identificeer de insertiemarkering, in de vorm van een pijlpunt, direct boven het coverage-spoor, gelegen tussen posities 55,592,178 en 55,592,179, wat wijst op een korte insertie (Figuur 3B,C).
      4. Interactie met de insertie: Klik op de pijlpunt om de weergave uit te breiden en klik op een van de reads waarbij basen de gap opvullen om de details in een pop-up te bekijken. Vergelijk de geïnserte sequentie met de referentiesequentie om te bepalen of het een duplicatie is (Figuur 3D,E).
      5. Kijken naar de coverage: Klik op het coverage-spoor direct naast de insertie-pijlpunt om het aantal ondersteunende reads weer te geven, wat vergeleken kan worden met het totale aantal reads om de geschatte variant allele frequency (VAF) te bepalen, in dit geval ~28%.
      6. Controleren op strand bias: Sorteer reads op read-strand en bekijk soft-clipped basen (zie Aanvullend Bestand 1, sectie 3) om een regio van interesse naast de insertie in de reverse reads te tonen (Figuur 3F).
  4. Vignet #4: Onderzoek naar een EGFR (epidermale groeifactorreceptor) Exon 19 deletie bij niet-kleincellig longcarcinoom (NSCLC).
    OPMERKING: Een vrouw van 70 jaar met recent gediagnosticeerd NSCLC ondergaat chirurgische resectie van de massa. NGS wordt aangevraagd op een sectie weefsel met voldoende tumorzuiverheid, en resultaten tonen een mogelijke variant in EGFR. Veel EGFR-mutaties zijn gevoelig voor tyrosinekinaseremmers, en deze variant kan een impact hebben op de therapie en prognose voor de patiënt13.
    1. IGV-workflow (Sessiebestand EGFR.xml)
      1. Gegevens laden: Selecteer het Hg19-genoom, laad het bam-bestand EGFRE746_A750delmod.bam, zorg dat het indexbestand (dezelfde naam als de bam, maar eindigend op .bai) in dezelfde map staat, en navigeer naar chr7:55,242,420-55,242,513, wat overeenkomt met een deel van exon 19 van het EGFR-gen.
      2. Deletie onderzoeken met behulp van het coverage-spoor: Beoordeel het coverage-spoor om een klein gebied met lagere coverage te identificeren dat niet aan de uiteinden van de reads is gepositioneerd (Figuur 4A,B). Onderzoek van het coverage-spoor toont een lagere coverage over een klein deel van exon 19.
      3. Deletie onderzoeken met behulp van de reads: Breid de alignment-weergave uit om reads met een alignment-gap te tonen, weergegeven als een zwarte lijn binnen de read (Figuur 4C,D).
      4. Genomische context overwegen: Onderzoek de nucleotidesequentie van de referentie die betrokken is bij en in de directe omgeving van de deletie. Beoordeel de deletie-call in de context van de positie binnen de referentiesequentie, aangezien deleties in homopolymeer- of repetitieve regio's een sequentie-artefact kunnen zijn, vooral wanneer ze aanwezig zijn bij een lage variant allele frequency. Zie het gedeelte Een kleine deletie bekijken van Aanvullend Bestand 2 voor een gedetailleerde beschrijving van de workflow.
  5. Vignet #5: Onderzoek naar EGFR-alteraties bij een patiënt met glioblastoom.
    OPMERKING: Een vrouw van 77 jaar met IDH wild-type glioblastoom ondergaat next-generation sequencing (NGS) testen. Haar resultaten duiden op een potentiële EGFR copy number gain en een potentiële EGFRvIII rearrangerment (deletie van exonen 2–7). Zowel de EGFR-amplificatie als de EGFRvIII-alteraties hebben prognostische en therapeutische betekenis bij glioblastoom. Daarnaast komen deze twee alteraties vaak samen voor, wat betekent dat de aanwezigheid van de één de validiteit van de ander kan ondersteunen wanneer deze op lage niveaus worden gedetecteerd.
    1. IGV-workflow (Sessiebestand copynumber.xml):
      1. Gegevens laden: Selecteer het Hg38-genoom, laad het segmentbestand, proband.seg, en comparator-monsters,  c1.seg-c9.seg, door ze in het IGV-venster te slepen en neer te zetten. Navigeer naar Chr7.
        OPMERKING: De segmentatiebestanden gegenereerd met CNVKit zijn beschikbaar voor download. De volledige workflow voor het gebruik van CNVKit om copy number quantificatie te genereren valt buiten de scope van deze studie. Kort samengevat is echter CNVKit versie 0.9.9 (beschikbaar voor download via https://github.com/etal/cnvkit) gebruikt met een vooraf gemaakte gepoolde referentie bestaande uit normale, euploïde specimens. De input bestaat uit een bed-bestand met 9.144 CNV backbone probe locaties, verspreid over het genoom. Een belangrijke overweging hier is dat de details van de copy number pipeline inputs en parameters minder belangrijk zijn dan het feit dat de monsters zijn verwerkt met een setup die voor alle monsters in een run gelijk is. Dit vergemakkelijkt de herkenning van systematische bias.
      2. De heatmap evalueren: Vergelijk de relatieve kleurintensiteit tussen het monster van belang (lokaliseer de rij van de heatmap die bij dit monster hoort, gelabeld proband) en andere monsters (c1-9) om echte copy number-veranderingen te onderscheiden van artefacten.
        OPMERKING: Verticale visuele vergelijking van een locus over alle monsters is de manier om anomalieën te identificeren (kwalitatieve verschillen op basis van kleurverschillen tussen rijen in plaats van kwantitatieve verschillen) op een gegeven locus in elk monster ten opzichte van de achtergrond. Raadpleeg Figuur 5 en de sectie Copy number veranderingen bekijken van Aanvullend Bestand 2 voor gedetailleerde stappen.
  6. Vignet #6: Onderzoek naar EGFRvIII bij een patiënt met glioblastoom.
    OPMERKING: Dezelfde patiënt vertoont ook bewijs van een EGFRvIII rearrangerment (deletie van exonen 2–7). Zowel de EGFR-amplificatie als de EGFRvIII-alteraties hebben prognostische en therapeutische betekenis bij glioblastoom. Daarnaast komen deze twee alteraties vaak samen voor, wat betekent dat de aanwezigheid van de één de validiteit van de ander kan ondersteunen wanneer deze op lage niveaus worden gedetecteerd.
    1. IGV-workflow (Sessiebestand egfr_vIII.xml):
      1. Gegevens laden: Selecteer het Hg19-genoom, laad het bam-bestand van de patiënt, proband.bam, zorg dat het indexbestand (dezelfde naam als de bam, maar eindigend op .bai) in dezelfde map staat, en navigeer naar het EGFR-gen.
      2. Breekpunten van EGFRvIII visualiseren: Pas de weergave aan om kandidaat-breekpunten individueel te onderzoeken (stroomopwaarts van exon 2 en stroomafwaarts van exon 7 voor EGFRvIII), en voer 'sort-by-base' uit  (of gebruik sneltoets Ctrl-s op Windows/Linux of Cmd-s op Mac) bij de breekpunten om pile-ups van soft-clipped reads te visualiseren.
      3. Reads BLAT-alignen: Klik met de rechtermuisknop op een soft-clipped sequentie en selecteer BLAT sequence (IGV gebruikt standaardwaarden van UCSC, zie https://ucsc.crg.eu/FAQ/FAQblat.html voor BLAT standaardparameters). Klik op de eerste rij en observeer het Blat-spoor dat onderaan het IGV-spoorgedeelte verschijnt.
        OPMERKING: Zelfs een enkele read die aligneert met de junctie van exon 1/intron 1 en met de junctie van intron 6/exon 7 kan voldoende bewijs zijn voor EGFRvIII, zolang kruisbesmetting van een ander monster als reden voor deze read is uitgesloten. Raadpleeg Figuur 6 en de sectie Structurele rearrangerment bekijken van Aanvullend Bestand 2 voor gedetailleerde stappen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het is belangrijk op te merken dat deze studie zich richt op het beschrijven van de nuances van variantbeoordeling in IGV voor klinische rapportage. De uiteindelijke klinische rapportage dient afhankelijk te zijn van de gevalideerde pijplijn, de kwaliteits criteria en het rapportagebeleid van elk individueel laboratorium. Een volledige bespreking van dit belangrijke onderwerp valt buiten de reikwijdte van de huidige studie; er zijn echter aanbevolen standaarden en richtlijnen opgesteld door het American College of Medica...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Een nauwkeurige variantbeoordeling voor klinische rapportage is afhankelijk van complexe bio-informatische algoritmen en de integratie van visuele beoordeling van complexe varianten met behulp van IGV5,6. Deze studie is ontworpen om een beknopte bron van aanbevolen instellingen samen te stellen voor het visualiseren van eenvoudige en complexe genomische alteraties in IGV (Aanvullend Bestand 1). Deze studie richt zich op veelvoorkomende somatische...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Alle auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten hebben.

Dankbetuigingen

Wij zijn dankbaar aan alle ontwikkelaars van de IGV-software en aan de NIH-beurs die momenteel de ontwikkeling van IGV financiert: U24CA258406. Er is geen financiering ontvangen voor de ontwikkeling van deze studie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BLATBLAT Search Genomehttps://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlatZelfstandige BLAT-webpagina. De BLAT-API is beschikbaar binnen IGV, er is geen aanvullende installatie vereist
CNVKitGitHubhttps://github.com/etal/cnvkitOpenbare GitHub-repository met gratis downloadbare CNVKit. Instructies voor het downloaden/uitvoeren van CNVKit zijn hier ook beschikbaar.
Comparator segmentbestand #1 voor vignette #5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c1.segKopie-aantalkbestanden
Comparator segmentbestand #2 voor vignette #5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c2.segKopie-aantalkbestanden
Comparator segmentbestand #3 voor vignette #5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c4.segKopie-aantalkbestanden
Comparator segmentbestand #4 voor vignette #5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c5.segKopie-aantalkbestanden
Comparator segmentbestand #5 voor vignette #5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c6.segKopie-aantalkbestanden
Comparator segmentbestand #6 voor vignette #5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c7.segKopie-aantalkbestanden
Comparator segmentbestand #7 voor vignette #5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c8.segKopie-aantalkbestanden
Comparator segmentbestand #8 voor vignette #5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c9.segKopie-aantalkbestanden
Comparator segmentbestand voor vignette #5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c3.segKopie-aantalkbestanden
Menselijke genoomsequentieMenselijke genoomsequentiehttps://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg38/bigZips/latest/hg38.fa.gzDownloadbaar fasta-bestand met de Hg38-versie van het menselijk genoom.  Deze is beschikbaar binnen IGV, er is geen aanvullende download vereist
Menselijke genoomsequentieMenselijke genoomsequentiehttps://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/latest/hg19.fa.gzDownloadbaar fasta-bestand met de Hg19-versie van het menselijk genoom. Deze is beschikbaar binnen IGV, er is geen aanvullende download vereist
IGV-softwarebundelIGV-softwarehttps://data.broadinstitute.org/igv/projects/downloads/2.19/IGV_Win_2.19.7-WithJava-installer.exeIGV-software versie 2.19.7 met Java (JDK 21), gratis te downloaden. De link hier is voor Windows, hoewel er ook links voor Linux en Mac beschikbaar zijn.
Segmentbestand voor casus vignette #5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.segKopie-aantalkbestanden
Tutorial GitHub-repositoryGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/tree/mainOpenbare GitHub-repository met alle benodigde bestanden om de zes vignettes te reproduceren
Vignette #1GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KRAS.xmlSessiebestanden
Vignette #1 Casus A bai-indexGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2A_fixed_backbone_
2A_new_final_sorted.bam.bai		Alignmentbestanden
Vignette #1 Casus A bam-alignmentbestandGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2A_fixed_backbone_
2A_new_final_sorted.bam		Alignmentbestanden
Vignette #1 Casus B bai-indexGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2B_fixed_backbone_
2B_new_final_sorted.bam.bai		Alignmentbestanden
Vignette #1 Casus B bam-alignmentbestandGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2B_fixed_backbone_
2B_new_final_sorted.bam		Alignmentbestanden
Vignette #2GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/BRAF.xmlSessiebestanden
Vignette #2  bai-indexGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/fig2C_braf_v600k_2bp_
backbone_2CD_new_final_sorted.bam.bai		Alignmentbestanden
Vignette #2  bam-alignmentbestandGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/fig2C_braf_v600k_2bp_
backbone_2CD_new_final_sorted.bam		Alignmentbestanden
Vignette #3GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KIT.xmlSessiebestanden
Vignette #3 bai-indexbestandGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KITdupmod2.baiAlignmentbestanden
Vignette #3 bam-alignmentbestandGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KITdupmod2.bamAlignmentbestanden
Vignette #4GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFR.xmlSessiebestanden
Vignette #4 alignmentbestandGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFRE746_A750delmod.bamAlignmentbestanden
Vignette #4 bai-indexGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFRE746_A750delmod.baiAlignmentbestanden
Vignette #5GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/copynumber.xmlSessiebestanden
Vignette #6GitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/egfr_vIII.xmlSessiebestanden
Vignette #6 bai-indexGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.baiAlignmentbestanden
Vignette #6 bam-alignmentbestandGitHubhttps://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.bamAlignmentbestanden

Referenties

  1. Tjota MY, Segal JP, Wang P. Clinical utility and benefits of comprehensive genomic profiling in cancer. J Appl Lab Med. 2024;9(1):76-91.
  2. Freedman AN, et al. Use of next-generation sequencing tests to guide cancer treatment: results from a nationally representative survey of oncologists in the United States. JCO Precis Oncol. 2018;2:PO.18.00169.
  3. Ghoreyshi N, et al. Next-generation sequencing in cancer diagnosis and treatment: clinical applications and future directions. Discov Oncol. 2025;16:578.
  4. Aisner DL, et al. The Genomics Organization for Academic Laboratories (GOAL): A vision for a genomics future for academic pathology. Acad Pathol. 2023;10(3):100090.
  5. Robinson JT, Thorvaldsdóttir H, Wenger AM, Zehir A, Mesirov JP. Variant review with the Integrative Genomics Viewer (IGV). Cancer Res. 2017;77(21):e31-e34.
  6. Thorvaldsdóttir H, Robinson JT, Mesirov JP. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Brief Bioinform. 2013;14(2):178-192.
  7. Richards S, et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 2015;17(5):405-424.
  8. Larson NB, Oberg AL, Adjei AA, Wang L. A clinician's guide to bioinformatics for next-generation sequencing. J Thorac Oncol. 2023;18(2):143-157.
  9. Jänne PA, et al. Adagrasib in non-small-cell lung cancer harboring a KRAS G12C mutation. N Engl J Med. 2022;387(2):120-131.
  10. Vandenberg BN, et al. Contributions of replicative and translesion DNA polymerases to mutagenic bypass of canonical and atypical UV photoproducts. Nat Commun. 2023;14(1):2576.
  11. Dunn T, Narayanasamy S. vcfdist: accurately benchmarking phased small variant calls in human genomes. Nat Commun. 2023;14(1):8149.
  12. Trent JC. Toward personalized, targeted therapy of gastrointestinal stromal tumor. Gastrointest Cancer Res. 2008;2(5):256-257.
  13. Xu CW, et al. Molecular characteristics and clinical outcomes of EGFR Exon 19 C-helix deletion in non-small cell lung cancer and response to EGFR TKIs. Transl Oncol. 2020;13(9):100791.
  14. Guille A, et al. A benchmarking study of individual somatic variant callers and voting-based ensembles for whole-exome sequencing. Brief Bioinform. 2024;26(1):bbae697.
  15. Cooke DP, Wedge DC, Lunter G. A unified haplotype-based method for accurate and comprehensive variant calling. Nat Biotechnol. 2021;39(7):885-892.
  16. Ezzati S, Salib S, Balasubramaniam M, Aboud O. Epidermal Growth Factor Receptor inhibitors in glioblastoma: current status and future possibilities. Int J Mol Sci. 2024;25(4):2316.
  17. Vivanco I, et al. Differential sensitivity of glioma- versus lung cancer-specific EGFR mutations to EGFR kinase inhibitors. Cancer Discov. 2012;2(5):458-471.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Next-generation sequencingvisualisatie van sequencinggegevensdetectie van genomische variantensomatische variantanalyseVCF-bestandsformaatBAM-bestandsformaatvariantallelfrequentie

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.