Klinische interpretatie van varianten met de Integrative Genomics Viewer (IGV) voor moleculaire pathologen

Samenvatting

De software van de integrative genomics viewer (IGV) biedt een uitgebreid, intuïtief venster op de onderliggende gegevens voor klinische variant-calling. Hier presenteren we vijf vignettes die aantonen hoe een snelle differentiatie kan worden gemaakt tussen werkelijke pathogene gebeurtenissen en artefacten, waardoor uiteindelijk het diagnostische vertrouwen wordt versterkt voor praktijkbeoefenaren die betrokken zijn bij de moleculaire rapportage van next-generation sequencing-assays.

Samenvatting

De Integrative Genomics Viewer (IGV) is een cruciaal instrument in de klinische genomica, dat de visualisatie en interpretatie van complexe sequentiegegevens mogelijk maakt. Het combineren van klinische kennis met de visuele evaluatie van sequentieresultaten is de primaire methode waarmee moleculaire pathologen en andere professionals casussen beoordelen en afronden. Diverse softwaretools kunnen hierbij ondersteunen, maar hun relatie tot de onderliggende gegevens moet systematisch worden begrepen en toegepast. Deze studie bevat essentiële achtergrondinformatie over bestandstypen van next-generation sequencing (NGS) gegevens (bijv. FASTQ, BAM, VCF), inclusief een bespreking van hun formaat en doel. Vervolgens beschrijven we de functies van IGV die nuances uit deze bestanden afleiden. We maken gebruik van een reeks gecureerde praktijkcasussen op basis van klinische vignetten, via welke de lezer zal interageren met klinische NGS-sequentiegegevens middels de IGV-software om diverse typen klinisch relevante varianten te beoordelen ten opzichte van het menselijk referentiegenoom. Deze klinische vignetten zijn samengesteld om voorbeelden te geven van enkele complexiteiten bij de interpretatie van genomische gegevens, en hoe het gebruik van IGV als onderdeel van een routinematige workflow aanvullende interpretatieve informatie kan bieden voor varianten, verdergaand dan de standaard variant calls van bioinformatische softwarealgoritmen. De visuele inspectie van genomische varianten met behulp van de tools in IGV kan subtiele contextuele aanwijzingen onthullen (zoals variant allele frequency, strand bias, weefselspecifieke context) die de interpretatie van genomische varianten kunnen beïnvloeden. Hoewel deze studie zich richt op het gebruik van IGV voor de detectie en interpretatie van somatische varianten, kunnen de beschreven toepassingen worden geëxtrapoleerd naar de kiemlijnsetting, inclusief de analyse van complexe varianten en de detectie van mosaicisme.

Inleiding

De oncologische zorg is de afgelopen jaren getransformeerd door het gebruik van next-generation sequencing (NGS)-technologieën om diagnoses, prognoses en de keuze van therapieën te onderbouwen¹. NGS-testen zijn de standaardzorg geworden bij meerdere tumortypen voor 1) het vaststellen van de diagnose van een moleculair gedefinieerde tumor, 2) het gebruik van tumortype-agnostische biomarkerresultaten voor therapiebeslissingen en 3) het bepalen van de risicostratificatie voor specifieke tumortypen^2,3. Nauwkeurige en tijdige resultaten van NGS en andere biomarkertesten zijn een cruciaal onderdeel geworden van de patiëntenzorg en de behandelplanning in de oncologie.

NGS-testen worden doorgaans uitgevoerd in grote referentielaboratoria of in ziekenhuis- of academische laboratoria, wanneer instellingen over voldoende expertise en middelen beschikken om dergelijke testen te ontwikkelen en te onderhouden. De organisatie Genomics Organization for Academic Laboratories (GOAL) is opgezet als een collaboratief netwerk, gericht op het delen van academische kennis en reagenskosten⁴. Een aanzienlijk onderdeel van de inspanningen van het GOAL-consortium bestond uit trainingssessies voor kritieke componenten bij de beoordeling en rapportage van klinische studies. Deze zijn ontwikkeld als praktische instructiesessies en omvatten een interactieve workshop over de integrative genomics viewer (IGV) om de basis- en geavanceerde functies ervan in de genomische geneeskunde te demonstreren.

IGV is een datavisualisatietool die is ontworpen om gebruikers in staat te stellen NGS-gegevens en andere grote datasets eenvoudig te beoordelen, aangezien de meeste NGS-gegevens enorm en onhandelbaar zijn zonder een grafische gebruikersinterface⁵. IGV was aanvankelijk niet ontworpen voor klinische variantanalyse. Vanwege het gebruiksgemak voor alle moleculaire professionals, ongeacht hun ervaring met bio-informatica, is het echter door veel laboratoria breed geadopteerd als onderdeel van de complexe workflow voor gegevensbeoordeling⁶. Deze studie is opgezet als een mechanisme om deze informatie te verspreiden onder de bredere gemeenschap van professionals in genomische laboratoria.

De klinische noodzaak voor het gebruik van IGV als onderdeel van een klinische workflow omvat het detecteren van sequentiefouten, het omgaan met complexiteiten bij het vaststellen van genomische varianten (variant calling) en andere recurrente alteraties waarbij aanvullende visualisatie kan helpen bij een adequate interpretatie van de gegevens.⁷Het gebruik van IGV vereist standaard bio-informatica-bestanden afkomstig uit een NGS-studie.⁸De kernfuncties van de IGV-software maken de visualisatie van sequeneringsgegevens mogelijk en vereisen het configureren van een reeks voorkeuren en opties voor klinische variantinterpretatie (Aanvullend bestand 1).

De workflow voor short-read sequencing wordt gekenmerkt door bestandsstandaarden voor FASTQ, binary alignment map (BAM) en variant call format (VCF). NGS bereikt een hoge doorvoer door miljoenen short reads parallel te genereren. Hoewel deze strategie de dataproductie sterk versnelt, is elke read slechts een fragment van het oorspronkelijke DNA of RNA. De read wordt via zijn adaptersequentie bevestigd aan een positie op een NGS-flowcell. Informatie over de sequentie en de basekwaliteit uit de optische verwerking wordt vastgelegd in FASTQ-bestanden. Deze ruwe reads bevatten nucleotide-sequenties samen met hun kwaliteitsscores per base. Daarom is een vroege stap in de verwerking van ruwe reads het aligneren van elke read aan een referentiegenoom⁸. Omdat elke read wordt toegewezen aan een specifieke locatie in het referentiegenoom met de hoogste aligneringswaarschijnlijkheid, "stapelen" de reads die overeenkomen met dezelfde locatie zich op bij elke locus. Dergelijke gegevens worden opgeslagen in een BAM-bestand volgens de specificaties voor sequence alignment mapping (SAM) (beschikbaar op https://samtools.github.io/hts-specs/SAMv1.pdf; laatst geverifieerd: 30-09-2025) (Figuur 1A). Deze informatie kan visueel worden geïnspecteerd met een genoomdownloader zoals IGV. Zoals geïllustreerd in Figuur 1B, kan het vergelijken van de reads met elkaar of met de referentiesequentie zelf verschillen of discrepanties tussen de nucleotide-sequenties aan het licht brengen. Samenvattingen van enkel deze "variante" posities over het gehele genoom worden samengesteld in een VCF-bestand. Dit bestand kan daarom veel kleiner zijn dan een BAM-bestand, maar bevat nog steeds veel van de nuttige informatie die nodig is voor de beoordeling van varianten. Om die reden is het VCF-bestand gewoonlijk de uiteindelijke output van variant-calling pipelines (Figuur 1C). Zo bevatten FASTQ-bestanden de ruwe read- en kwaliteitsgegevens, biedt het BAM-bestand inzicht in de mate van zekerheid waarmee deze reads in het genoom zijn geplaatst, en vertegenwoordigt het VCF de verschillen tussen de referentiesequentie en de monstersequentie, wat een veel beter beheersbare hoeveelheid gegevens oplevert voor evaluatie ten behoeve van potentiële rapportage.

De zes klinische casussen in deze studie illustreren veelvoorkomende analytische scenario's die gepaard gaan met de detectie van somatische varianten in moleculaire laboratoria, evenals de problemen die het correcte begrip en de interpretatie van de onderliggende gegevens bemoeilijken. Over het algemeen zijn deze casussen gekozen om steeds complexere interpretatiescenario's te illustreren en om aan te tonen hoe het gebruik van geavanceerde functies in IGV uitgebreide genomische kenmerken beter kan beschrijven. Hoewel deze studie zich richt op de interpretatie van somatische varianten, zijn deze functies ook toepasbaar bij het gebruik van IGV voor de visualisatie en interpretatie van kiembaanalteraties⁶. Merk op dat de in dit artikel gebruikte termen zijn gebaseerd op sequencing-by-synthesis chemie en, waarvan van toepassing, andere analoge termen/concepten voor andere platforms.

Elke klinische casus begint met een zeer beknopte klinische context, gevolgd door instructies over hoe de variant of varianten onderzocht moeten worden om de vraag te beantwoorden: welke aanwezige variant (indien van toepassing) reëel is en welke (indien van toepassing) een artefact is. De klinische context, samen met de details van de sequentiegegevens, is essentieel voor het beantwoorden van die vraag.

Protocol

De hier gepresenteerde gegevens zijn een mengeling van gesimuleerde en echte NGS-gegevens van patiënten. Alle patiëntgegevens zijn echter gedeïdentificeerd door middel van een combinatie van het verwijderen van labels en extractie van reads op een enkele locus. Dit protocol volgt de toepasselijke richtlijnen van de ethische commissies voor mensonderzoek van alle instellingen van de auteurs.

1. Downloaden van de meest recente versie van de Integrative Genomics Viewer (IGV)

OPMERKING: IGV is een gratis downloadbaar programma voor het visualiseren van diverse genomen, waaronder het menselijk genoom (https://igv.org/doc/desktop/#DownloadPage/). IGV wordt periodiek bijgewerkt om nieuwe versies van transcripten, kenmerken en tracks op te nemen, waarbij de meest recente versie doorgaans bovenaan de lijst staat.

1. Download het bestand met de naam 'IGV for Windows, Java Included', beschikbaar via de bovenstaande uniform resource locator (URL), naar het bureaublad; afhankelijk van de instelling kunnen hiervoor beheerdersrechten vereist zijn.
2. Selecteer de menselijke genoomversie (genome build) die in de rapportages zal worden aangeroepen (bijv. hg19 of hg38), welke binnen IGV worden gehost.
   OPMERKING: In deze studie is gebruikgemaakt van IGV 2.19.7. In dit protocol is de versie voor Windows, inclusief Java, gedownload. IGV werd uitgevoerd met de standaardgeheugenallocatie van 8Gb RAM. De instellingen die worden aanbevolen in het voorkeurenstabelblad van IGV en andere secties in IGV zijn geannoteerd in Aanvullend bestand 1.

2. Het begrijpen van de klinische casussen en het downloaden van de benodigde bestanden

1. Navigeer naar de GitHub-repository: Alle bestanden zijn beschikbaar voor download in de GitHub-repository https://github.com/Eitan177/Demo_IGV.
   OPMERKING: In de GitHub-repository bevindt zich voor elke vignette een sessiebestand; het laden van dit sessiebestand maakt het overbodig om bestanden afzonderlijk te laden en naar de betreffende locus te navigeren, aangezien het sessiebestand deze stappen afhandelt.
2. Laad een sessiebestand via het bestandmenu. Klik op Bestand > Sessie openen en selecteer het juiste sessiebestand.

3. Het instellen van het dekkingstraject

OPMERKING: In IGV bevat het hoofdvenster een "coverage track". In bepaalde contexten kan zelfs een klein fractie van de reads die specifieke kankervarianten bevatten, klinisch significant zijn. Daarom is het cruciaal om een zeer hoge read-diepte te bereiken in de delen van het genoom die worden geanalyseerd. Als slechts 2% van de reads een bepaalde variant bevat, kunnen honderden of duizenden reads nodig zijn om de variant overtuigend aan te tonen – vandaar de term "deep sequencing".

1. Controleer of het dekkingstrak aanwezig is: Klik in het bovenmenu op View > Preferences, en selecteer het tabblad Alignments. Bovenaan het tabblad staat een vakje met het label 'Show coverage track'. Zorg dat dit is aangevinkt.
2. Stel een klinisch significante drempelwaarde in voor varianten op laag niveau: Ga naar het tabblad Alignments zoals beschreven in stap 3.1 en scrol omlaag tot het vakje met het label Coverage allele-fraction zichtbaar is. Stel de waarde in het vak in op 0,01 en klik op Save (het venster met voorkeuren zou moeten sluiten na het klikken op Save).

4. Opzetten van soft-clipped reads

OPMERKING: Deze instelling is onmisbaar voor het detecteren van grotere structurele varianten, zoals genreorganisaties, kopie-aantalveranderingen of gecombineerde insertie-deletiegebeurtenissen. De geavanceerde vignettes — zoals die gericht op EGFR-amplificaties en -deleties — laten zien hoe soft-clipped reads de aanwezigheid van structurele varianten kunnen bevestigen die anders mogelijk over het hoofd zouden worden gezien door standaardvariant-callingsmethoden.

1. Schakel soft-clips in: Klik in het bovenmenu op View > Preferences en selecteer het tabblad Alignments. Scroll naar beneden naar het vak Show soft-clipped bases en zorg dat dit is aangevinkt (Supplementary File 1) om gedeeltelijk uitgelijnde reads zichtbaar te maken—reads waarvan de randen niet nauwkeurig op de referentie passen en worden "clipped" (afgeknipt).

5. Klinische casussen

1. Vignet #1: Onderscheid een echte pathogene KRAS (Kirsten rat sarcoma virus oncogene homoloog) variant van een sequentie-artefact.
   OPMERKING: Casus A betreft een man van 65 jaar met een recent gediagnosticeerd longadenocarcinoom, waarbij de histologische beoordeling ongeveer 80% tumor schatte. NGS-profilering identificeerde een KRAS NM_004985.5 c.34G>T (p.G12C) variant, wat een bekende drivermutatie is bij niet-kleincellig longcarcinoom (NSCLC). De resulterende missense-variant KRAS c.34G>T (p.G12C) komt voor in ~13% van de longadenocarcinomen en maakt de patiënt in aanmerking voor doelgerichte therapieën⁹. Casus B betreft een vrouw van 54 jaar met een bekend sarcoom (geschatte 50% tumor en 50% normaal weefsel). De identieke KRAS c.34G>T (p.G12C) variant werd in dit monster geïdentificeerd. Omdat KRAS c.34G>T (p.G12C) echter zelden wordt gerapporteerd bij sarcomen, roept de aanwezigheid ervan het vermoeden op van een mogelijk sequentie-artefact. 
   1. IGV-workflow (Sessiebestand KRAS.xml)             
      1. Gegevens laden: Selecteer Hg19 in het dropdownmenu voor het genoom en laad het bam-bestand, kras2A_fixed_backbone_2A_new_final_sorted.bam, en navigeer naar chr12:25,398,281–25,403,833 om in te zoomen op de KRAS-genregio. Let erop dat het indexbestand (dezelfde naam als het bam-bestand, maar eindigend op .bai) in dezelfde map als het bam-bestand moet staan.  
      2. Coverage en VAF onderzoeken: Beoordeel codon 12 in Exon 2 (NM_004985.5) en klik op de variantpositie in het coverage-spoor om de read-diepte op die positie weer te geven. Merk een G→T substitutie op (transversie-event), met een VAF van 35%–40%, wat zeer consistent is met een heterozygote, clonale drivermutatie (Figuur 2A), vooral in de context van een tumorcellulariteit van ongeveer 80%.   
      3. Controleren op StrandBias: Kleurcodeer per strand (zie Aanvullend Bestand 1, Stap 4) om een nagenoeg 50:50 forward (rood): reverse (blauw) distributie in het longmonster te onthullen.  
      4. Herhaal stappen 5.1.1.1–5.1.1.3 voor casus B, het sarcoommonster: Laad het bam-bestand, kras2B_fixed_backbone_2B_new_final_sorted.bam, en merk de <1% VAF en nagenoeg exclusieve forward strand-ondersteuning op, wat wijst op een PCR/alignment-artefact (Figuur 2B).
2. Vignet #2: Een onjuiste classificatie van een multi-nucleotide variant (MNV) oplossen.
   OPMERKING: Een vrouw van 50 jaar met metastatisch melanoom ondergaat tumorprofilering op basis van NGS. Analyse identificeert een potentiële BRAF (B-Raf proto-oncogeen, serine/threonine kinase) c.1798_1799delinsAA mutatie. Hoewel BRAF NM_004333.6: c.1799T>A (p.V600E) vaker voorkomt in diverse solide tumoren, is BRAF c.1798_1799delinsAA (p.V600K) relatief specifiek voor melanoom, aangezien UV-licht C > T transities binnen dipyrimidines kan induceren¹⁰. Volgens de HGVS-regels moeten twee single-nucleotide varianten (SNV's) in cis worden benoemd als één enkele MNV. In veel gevallen kan een bio-informatica-pipeline deze complexe variant onjuist identificeren als twee aangrenzende SNV's in cis: BRAF c.1798G>A en BRAF c.1799T>A. Vanwege technische (d.w.z. variant caller-gerelateerde) en biologische (cis vs trans onderscheid) overwegingen bestaat de vrees dat de mutatie onjuist gerapporteerd zou kunnen worden bij de definitieve beoordeling, tenzij de gegevens tijdens de klinische review gevisualiseerd worden.      
   1. IGV-workflow (Sessiebestand BRAF.xml)           
      1. Gegevens laden: Selecteer Hg38 in het dropdownmenu voor het genoom en laad het bam-bestand, kras2B_fixed_backbone_2B_new_final_sorted.bam, en navigeer naar chr7:140,453,136–140,753,336. Let erop dat het indexbestand (dezelfde naam als het bam-bestand, maar eindigend op .bai) in dezelfde map als het bam-bestand moet staan.
      2. Inzoomen op codon 600 van BRAF: Merk een GT→AA dinucleotide verandering op op basis van aangrenzende posities in het coverage-spoor die groen en blauw zijn in plaats van grijs, wat consistent is met p.V600K. 
      3. Scannen op twee individuele SNV's om te bepalen of ze in cis of trans staan: Merk op dat beide SNV's in dezelfde reads zijn gemapt en in cis staan.  
      4. Strand en coverage onderzoeken: Kleurcodeer reads om een ongeveer gelijkmatige forward/reverse ondersteuning te tonen (zie Aanvullend Bestand 1, Stap 4), en een VAF die 50% overschrijdt, wat consistent is met een clonale driver. Een drempelwaarde van 0,01 in het coverage-spoor (zie Aanvullend Bestand 1, Stap 3 voor de configuratie) zorgt ervoor dat gedeeltelijke subclonen (indien aanwezig) zichtbaar blijven (Figuur 2C).  
      5. Context en MNV-nomenclatuur opmerken: De twee nucleotideveranderingen liggen direct naast elkaar. Op basis van de expertconsensus worden SNV's binnen een afstand van 50 bp die op dezelfde sequentie-read zijn gemapt, aangemerkt als één enkele "complexe" of "delins" variant¹¹. 
3. Vignet #3: Onderzoek naar een KIT (KIT proto-oncogeen, receptor tyrosine kinase) exon 9 insertie in een gastro-intestinale stromale tumor (GIST)
   OPMERKING: Een mannelijke patiënt van 58 jaar met een gastro-intestinale stromale tumor ondergaat een resectie, en er wordt NGS-testen aangevraagd. Resultaten tonen een mogelijke variant in KIT. KIT-mutaties zijn een frequente driver in GIST's, komend voor in ongeveer 75% van de gevallen, en zijn targetbaar. Na activerende mutaties in exon 11 zijn activerende mutaties in KIT exon 9 de meest voorkomende geïdentificeerde drivers, hoewel GIST's met exon 9 mutaties en GIST's met exon 11 mutaties verschillend reageren wat betreft de gevoeligheid voor tyrosinekinaseremmers¹². 
   1. IGV-workflow (Sessiebestand KIT.xml)
      1. Gegevens laden: Selecteer het Hg19-genoom en laad het BAM-bestand, KITdupmod2.bam en zorg dat het indexbestand (dezelfde naam als de bam, maar eindigend op .bai) in dezelfde map staat. Navigeer naar chr4:55,592,144-55,592,257, wat overeenkomt met een deel van exon 9 van het KIT-gen.
      2. Weergave compact maken: Klik met de rechtermuisknop op het alignment-spoor en selecteer Squished  om de weergave te condenseren (Figuur 3A).
      3. De insertie lokaliseren: Identificeer de insertiemarkering, in de vorm van een pijlpunt, direct boven het coverage-spoor, gelegen tussen posities 55,592,178 en 55,592,179, wat wijst op een korte insertie (Figuur 3B,C).
      4. Interactie met de insertie: Klik op de pijlpunt om de weergave uit te breiden en klik op een van de reads waarbij basen de gap opvullen om de details in een pop-up te bekijken. Vergelijk de geïnserte sequentie met de referentiesequentie om te bepalen of het een duplicatie is (Figuur 3D,E).
      5. Kijken naar de coverage: Klik op het coverage-spoor direct naast de insertie-pijlpunt om het aantal ondersteunende reads weer te geven, wat vergeleken kan worden met het totale aantal reads om de geschatte variant allele frequency (VAF) te bepalen, in dit geval ~28%.
      6. Controleren op strand bias: Sorteer reads op read-strand en bekijk soft-clipped basen (zie Aanvullend Bestand 1, sectie 3) om een regio van interesse naast de insertie in de reverse reads te tonen (Figuur 3F).
4. Vignet #4: Onderzoek naar een EGFR (epidermale groeifactorreceptor) Exon 19 deletie bij niet-kleincellig longcarcinoom (NSCLC).
   OPMERKING: Een vrouw van 70 jaar met recent gediagnosticeerd NSCLC ondergaat chirurgische resectie van de massa. NGS wordt aangevraagd op een sectie weefsel met voldoende tumorzuiverheid, en resultaten tonen een mogelijke variant in EGFR. Veel EGFR-mutaties zijn gevoelig voor tyrosinekinaseremmers, en deze variant kan een impact hebben op de therapie en prognose voor de patiënt¹³.
   1. IGV-workflow (Sessiebestand EGFR.xml)
      1. Gegevens laden: Selecteer het Hg19-genoom, laad het bam-bestand EGFRE746_A750delmod.bam, zorg dat het indexbestand (dezelfde naam als de bam, maar eindigend op .bai) in dezelfde map staat, en navigeer naar chr7:55,242,420-55,242,513, wat overeenkomt met een deel van exon 19 van het EGFR-gen.
      2. Deletie onderzoeken met behulp van het coverage-spoor: Beoordeel het coverage-spoor om een klein gebied met lagere coverage te identificeren dat niet aan de uiteinden van de reads is gepositioneerd (Figuur 4A,B). Onderzoek van het coverage-spoor toont een lagere coverage over een klein deel van exon 19.
      3. Deletie onderzoeken met behulp van de reads: Breid de alignment-weergave uit om reads met een alignment-gap te tonen, weergegeven als een zwarte lijn binnen de read (Figuur 4C,D).
      4. Genomische context overwegen: Onderzoek de nucleotidesequentie van de referentie die betrokken is bij en in de directe omgeving van de deletie. Beoordeel de deletie-call in de context van de positie binnen de referentiesequentie, aangezien deleties in homopolymeer- of repetitieve regio's een sequentie-artefact kunnen zijn, vooral wanneer ze aanwezig zijn bij een lage variant allele frequency. Zie het gedeelte Een kleine deletie bekijken van Aanvullend Bestand 2 voor een gedetailleerde beschrijving van de workflow.
5. Vignet #5: Onderzoek naar EGFR-alteraties bij een patiënt met glioblastoom.
   OPMERKING: Een vrouw van 77 jaar met IDH wild-type glioblastoom ondergaat next-generation sequencing (NGS) testen. Haar resultaten duiden op een potentiële EGFR copy number gain en een potentiële EGFRvIII rearrangerment (deletie van exonen 2–7). Zowel de EGFR-amplificatie als de EGFRvIII-alteraties hebben prognostische en therapeutische betekenis bij glioblastoom. Daarnaast komen deze twee alteraties vaak samen voor, wat betekent dat de aanwezigheid van de één de validiteit van de ander kan ondersteunen wanneer deze op lage niveaus worden gedetecteerd.
   1. IGV-workflow (Sessiebestand copynumber.xml):
      1. Gegevens laden: Selecteer het Hg38-genoom, laad het segmentbestand, proband.seg, en comparator-monsters,  c1.seg-c9.seg, door ze in het IGV-venster te slepen en neer te zetten. Navigeer naar Chr7.
         OPMERKING: De segmentatiebestanden gegenereerd met CNVKit zijn beschikbaar voor download. De volledige workflow voor het gebruik van CNVKit om copy number quantificatie te genereren valt buiten de scope van deze studie. Kort samengevat is echter CNVKit versie 0.9.9 (beschikbaar voor download via https://github.com/etal/cnvkit) gebruikt met een vooraf gemaakte gepoolde referentie bestaande uit normale, euploïde specimens. De input bestaat uit een bed-bestand met 9.144 CNV backbone probe locaties, verspreid over het genoom. Een belangrijke overweging hier is dat de details van de copy number pipeline inputs en parameters minder belangrijk zijn dan het feit dat de monsters zijn verwerkt met een setup die voor alle monsters in een run gelijk is. Dit vergemakkelijkt de herkenning van systematische bias.
      2. De heatmap evalueren: Vergelijk de relatieve kleurintensiteit tussen het monster van belang (lokaliseer de rij van de heatmap die bij dit monster hoort, gelabeld proband) en andere monsters (c1-9) om echte copy number-veranderingen te onderscheiden van artefacten.
         OPMERKING: Verticale visuele vergelijking van een locus over alle monsters is de manier om anomalieën te identificeren (kwalitatieve verschillen op basis van kleurverschillen tussen rijen in plaats van kwantitatieve verschillen) op een gegeven locus in elk monster ten opzichte van de achtergrond. Raadpleeg Figuur 5 en de sectie Copy number veranderingen bekijken van Aanvullend Bestand 2 voor gedetailleerde stappen.
6. Vignet #6: Onderzoek naar EGFRvIII bij een patiënt met glioblastoom.
   OPMERKING: Dezelfde patiënt vertoont ook bewijs van een EGFRvIII rearrangerment (deletie van exonen 2–7). Zowel de EGFR-amplificatie als de EGFRvIII-alteraties hebben prognostische en therapeutische betekenis bij glioblastoom. Daarnaast komen deze twee alteraties vaak samen voor, wat betekent dat de aanwezigheid van de één de validiteit van de ander kan ondersteunen wanneer deze op lage niveaus worden gedetecteerd.
   1. IGV-workflow (Sessiebestand egfr_vIII.xml):
      1. Gegevens laden: Selecteer het Hg19-genoom, laad het bam-bestand van de patiënt, proband.bam, zorg dat het indexbestand (dezelfde naam als de bam, maar eindigend op .bai) in dezelfde map staat, en navigeer naar het EGFR-gen.
      2. Breekpunten van EGFRvIII visualiseren: Pas de weergave aan om kandidaat-breekpunten individueel te onderzoeken (stroomopwaarts van exon 2 en stroomafwaarts van exon 7 voor EGFRvIII), en voer 'sort-by-base' uit  (of gebruik sneltoets Ctrl-s op Windows/Linux of Cmd-s op Mac) bij de breekpunten om pile-ups van soft-clipped reads te visualiseren.
      3. Reads BLAT-alignen: Klik met de rechtermuisknop op een soft-clipped sequentie en selecteer BLAT sequence (IGV gebruikt standaardwaarden van UCSC, zie https://ucsc.crg.eu/FAQ/FAQblat.html voor BLAT standaardparameters). Klik op de eerste rij en observeer het Blat-spoor dat onderaan het IGV-spoorgedeelte verschijnt.
         OPMERKING: Zelfs een enkele read die aligneert met de junctie van exon 1/intron 1 en met de junctie van intron 6/exon 7 kan voldoende bewijs zijn voor EGFRvIII, zolang kruisbesmetting van een ander monster als reden voor deze read is uitgesloten. Raadpleeg Figuur 6 en de sectie Structurele rearrangerment bekijken van Aanvullend Bestand 2 voor gedetailleerde stappen.

Resultaten

Het is belangrijk op te merken dat deze studie zich richt op het beschrijven van de nuances van variantbeoordeling in IGV voor klinische rapportage. De uiteindelijke klinische rapportage moet afhangen van de gevalideerde pipeline, kwaliteitscriteria en het rapportagebeleid van het individuele laboratorium. Een volledige bespreking van dit belangrijke onderwerp valt buiten de reikwijdte van de huidige studie; echter zijn er aanbevolen standaarden en richtlijnen opgesteld door het American College of Medical Genetics and Genomics en de Association for Molecular Pathology⁷, die regelmatig worden geïmplementeerd in klinische laboratoria.

Interpretatie van klinische casus #1:

Gezien de hoge VAF, de gebalanceerde stranddistributie en de bekende incidentie van KRAS c.34G>T (p.G12C) bij longkanker (Figuur 2A), kan de variant in casus A leiden tot gerichte therapie en is het daarom klinisch essentieel om deze te rapporteren. Ondanks een positieve call voor dezelfde KRAS c.34 G>T variant in de tweede (sarcoma) casus (Figuur 2B), zijn er meerdere waarschuwingssignalen aanwezig voor een fout-positieve call: (1) de gerapporteerde variant allelfractie (VAF) is ~1%, wat ver onder ligt bij wat men zou verwachten voor een driver event in een monster met een geschatte tumorcellulariteit, zelfs bij een lage waarde (20%), en (2) de reads die deze variant ondersteunen vertonen strand bias, aangezien ze bijna uitsluitend op de forward-strand voorkomen. Samen met het gebrek aan biologische plausibiliteit voor dit type kanker, wijzen de bewijzen erop dat de bevinding in casus B een artefact is.

Interpretatie van klinische casus #2:

Deze vignet illustreert meerdere verschillende fouten waar clinici zich bewust van moeten zijn. Ten eerste kunnen variant callers aangrenzende genetische varianten terecht of onterecht aanmerken als twee SNV's of als een enkele MNV (Figuur 2C). Dit komt door het verschil in de implementatie van het haplotype-bewuste variant calling-algoritme in somatische variant callers. Slechts enkele, recenter gepubliceerde variant callers bevatten deze functie^14,15. Ten tweede worden technische en op nomenclatuur gebaseerde variaties zoals deze door sequencingcentra via verschillende bio-informatische pipelines in externe databases gevoed. Deze kunnen daarom meerdere verschillende verslagen bevatten van wat als één enkele genetische variant vermeld zou moeten worden. Tenzij er periodiek database phasing plaatsvindt, kan dit diverse ongewenste effecten hebben voor de klinische interpretatie stroomafwaarts. Samen kunnen deze mogelijke foutenbronnen ertoe leiden dat er een onjuist patiëntenrapport wordt opgesteld. Dit complexe scenario onderstreept de waarde van variant-visualisatie met behulp van hoogwaardige software zoals IGV.

Interpretatie van klinische casus #3:

Gezien de ondersteuning door meerdere reads voor de duplicatie en het bekende mechanisme van constitutieve activering van KIT bij exon 9-duplicaties in GIST, kunnen we concluderen dat deze KIT c.1504_1509dup (p.A502_Y503dup) variant reëel is en geen artefact (Figuur 3). KIT-mutaties zijn frequente drivers in GISTs en komen in ongeveer 90% van de gevallen voor. Een nauwkeurige karakterisering van de variant is hier cruciaal, omdat exon 11-activerende mutaties weliswaar het meest voorkomen, maar GISTs met een gemuteerd exon 9 anders reageren wat betreft de gevoeligheid voor tyrosinekinaseremmers, waardoor de therapeutische aanpak verandert. Gezien het klinische belang van KIT-mutaties bij GISTs, moet deze variant in het definitieve rapport worden opgenomen.

Interpretatie van klinische casus #4:

Gezien het coverage-spoor, het stereotypische uiterlijk van de korte deletie, de ondersteuning door de reads en het bekende mechanisme van constitutieve activatie van EGFR exon 19-deleties bij NSCLC, kunnen we concluderen dat deze EGFR c.2235_2249del (p.E746_A750del) variant reëel is en geen artefact (Figuur 4). Veel EGFR-mutaties, inclusief deze bekende exon 19-deletie, zijn zeer gevoelig voor tyrosinekinaseremmers. Gezien het klinische belang van EGFR-mutaties bij NSCLC's, moet deze variant in het eindrapport worden opgenomen.

Interpretatie van klinische vignet #5 en vignet #6:

De heatmaps bevestigen de EGFR-amplificatie en de breakpoint-junction tussen exon 1 en 8; evaluatie met BLAT bevestigt beide bevindingen bij deze patiënt (Figuur 5 en Figuur 6). EGFR-amplificatie wordt over het algemeen beschouwd als een prognostische factor voor een agressiever ziekteverloop, en EGFRvIII-genrearrangement is een GBM-specifieke biomarker die potentieel targetbaar is^16,17.

Geselecteerde workflows kunnen worden gereproduceerd met behulp van bestanden die zijn opgeslagen in de main branch van de GitHub-repository https://github.com/Eitan177/Demo_IGV (bijgewerkt op 9-6-2026), welke zes sessiebestanden bevat (één voor elke vignette), vijf paren bam- en bai-bestanden (één voor elke vignette die een alignment-bestand gebruikt) en 10 seg-bestanden voor vignette vijf, die segmentbestanden in plaats van alignment-bestanden gebruikt.

Figuur 1: NGS-bestandstandaarden en sequencing-workflow. (A) Korte reads die op een flowcell worden gegenereerd, worden bijgehouden via optische metingen en opgeslagen in FASTQ-formaat, wat zowel sequentiegegevens als kwaliteitsscores per base bevat. Deze reads worden vervolgens gesorteerd en uitgelijnd met een referentiegenoom, wat resulteert in een BAM-bestand waarbij elke read is "opgestapeld" op de overeenkomstige locus. (B) Verschillen tussen de referentie en de reads (bijv. puntmutaties, kleine indels) worden geïdentificeerd door variant-calling-algoritmen. (C) Ten slotte worden deze gedetecteerde varianten samengesteld in een VCF-bestand, waarin hun posities, referentie-/alternatieve bases en andere annotatiegegevens worden samengevat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: IGV-gebaseerde visualisatie van KRAS c.34G>T (p.G12C) en BRAF c.1798_1799delinsAA (p.V600K). (A) Visualisatie van een reële variant (KRAS c.34G>T (p.G12C)) in IGV, waarbij een hoge read-diepte (duizenden reads) en ~35–40% van de reads met een G→T-verandering wordt aangetoond. Forward (rood) en reverse (blauw) reads zijn in balans, wat wijst op een ware heterozygote mutatie. (B) Vermoedelijk artefact in niet-relevant weefsel waarbij een variant met minimale read-ondersteuning (1% VAF) zichtbaar is. De meeste variant-reads verschijnen op de forward-streng (rood), wat duidt op strand bias. (C) Een complexe variant BRAF c.1798_1799delinsAA (p.V600K) gezien in IGV, die een twee-basen substitutie (GT→AA) in cis onthult. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Visualisatie van een kleine insertie. (A) De "Squished"-weergave van KIT exon 9 in IGV helpt bij het identificeren van het gebied van belang. (B) Gebied van belang (rood kader) geïdentificeerd door visualisatie van de insertiebalk en soft clipped bases. (C) De "Expanded"-weergave in IGV instellen om visualisatie van de insertie mogelijk te maken. (D) Klikken op de insertiebalk (rood kader) toont de geïnserteerde sequentie. (E) De geïnserteerde sequentie wordt vergeleken met de referentiesequentie om de gedupliceerde basen te identificeren. (F) Het sorteren van de reads op read-strand laat zien dat de soft clipped bases overeenkomen met de insertie in de reverse reads. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Visualisatie van een kleine deletie. (A) "Samengeperst" overzicht van EGFR exon 19 waarin de deletie zichtbaar is in talrijke reads. (B) Gebruik van het dekkingstraject (coverage track) om het aantal reads te beoordelen op posities binnen en direct naast de deletie. (C) "Uitgeklapt" overzicht waarin de deletie wordt getoond en het aantal verwijderde basen wordt vastgesteld. (D) Vergelijking met de referentievolgorde (rood kader) identificeert de verwijderde basen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Visualisatie van een toename van het kopiegetal. (A) Er zijn zes kolommen in een seg-bestand: monster-ID, chromosoom, begin, einde, markers in het segment en het gemiddelde van het segment. (B) Het direct laden van de seg-bestanden in IGV maakt een handige visualisatie mogelijk. (C) Visualisatie van de gegevens in een genoombreed overzicht. Elk monster verschijnt als een rij gegevens, waarbij kleuren de waarden specificeren: rood voor >0 en blauw voor <0, waarbij intensere kleuren waarden reflecteren die verder van 0 afliggen. Na het openen van het monster van belang en negen willekeurige monsters uit dezelfde run, zijn de resultaten zichtbaar in een multi-monster heatmap met tien rijen. Het monster van belang is onderaan in het rode kader gemarkeerd. (D) Bij het versmallen van het overzicht naar de EGFR-locus is in het monster van belang onderaan een rode balk te zien, en witte of blauwe balken voor de willekeurige monsters. Dit kleurverschil tussen het monster van belang en de willekeurige monsters in andere rijen demonstreert dat de amplificatie-call in het monster van belang boven de achtergrond of ruis op deze locus ligt. (E) Bij het uitzoomen naar chr7 is een contrast opgemerkt tussen de locus die EGFR bevat in ons monster en niet in de willekeurige monsters. De EGFR-amplificatie verschijnt als een rood streepje in het onderste monster. (F) Bij het versmallen van het overzicht naar de MET-locus is de MET-amplificatie in variërende mate gereproduceerd in de negen willekeurige monsters samen met het monster van belang, wat suggereert dat deze amplificatie-call een artefact is. Dit benadrukt het verschil in uiterlijk tussen een werkelijke call van het kopiegetal op de EGFR-locus en een artefact. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Visualisatie van een EGFRvIII-genrearrangement.Voordat u met deze casus begint, dient u ervoor te zorgen dat de visualisatie van soft-clipped bases is ingesteld (zie Aanvullend Bestand 1 voor meer details). (A) Navigeer naar de eerste kandidaat-junction en stel de weergave van het alignment-track in op "Squished". (B) Verplaats u over de locus en pas herhaaldelijk de sneltoets voor sorteren op base toe, "control-s", totdat een pileup van vergelijkbare soft-clipped reads zichtbaar wordt aan de bovenkant van het alignment-track. Hoe groter de hoeveelheid vergelijkbare soft-clipped reads (rood kader) in de pileup, des te groter de zekerheid van een structureel rearrangement. (C) De BLAT-tool haalt de sequentie van de soft-clipped bases op en identificeert waar in het genoom die sequentie aanwezig is, samen met een kwantitatieve score die meet hoe nauwkeurig de sequentie overeenkomt met een specifieke sequentie in een doeldatabase. Selectie van een specifieke rij navigeert naar die locatie. (D) Door opnieuw de "control-s" functie voor sorteren op base te gebruiken, wordt opnieuw een soft-clip pileup aangetoond, ditmaal aan de tegenovergestelde zijde van de reads. Om te bevestigen dat er geen extra bases in het monster aanwezig zijn ten opzichte van de hg38 referentie, klikt u met de rechtermuisknop op een read met een reeks soft-clipped bases en voert u opnieuw een BLAT uit op de soft-clip bases. De resulterende tabel toont het eerste breekpunt van de junction, de locus die aanvankelijk werd gevisualiseerd, de exon 1-intron 1 junction. (E) Selectie van de bovenste rij keert terug naar het eerste breekpunt. De bases bij de junction van de BLAT referentie-alignment zijn identiek aan de soft-clipped bases die als query werden gebruikt, wat aangeeft dat de volledige reeks soft-clipped reads is opgenomen in de referentie-sequentie alignment. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand 1: Aanbevolen IGV-instellingen.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Samengevatte workflows.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Een nauwkeurige variantbeoordeling voor klinische rapportage is afhankelijk van complexe bio-informatische algoritmen en de integratie van visuele beoordeling van complexe varianten met behulp van IGV^5,6. Deze studie is ontworpen om een beknopte bron van aanbevolen instellingen samen te stellen voor het visualiseren van eenvoudige en complexe genomische alteraties in IGV (Aanvullend Bestand 1). Deze studie richt zich op veelvoorkomende somatische alteraties en de wijze waarop deze in IGV beoordeeld kunnen worden.

Het protocol begint met het beoordelen van een eenvoudige substitutiemutatie (Figuur 2A) en een complexe substitutiemutatie (Figuur 2C) met bijzondere aandacht voor het bepalen of de geïdentificeerde bevinding reëel is of een artefact. Vervolgens volgt een eenvoudige insertie (Figuur 3) en eenvoudige deletie (Figuur 4), waarbij wordt toegelicht hoe deze veranderingen eruitzien in IGV. Tot slot worden complexe genomische alteraties besproken, inclusief kopiegetalvariaties (Figuur 5) en structurele herschikkingen (Figuur 6). Samengevatte workflows waarin de belangrijkste stappen voor elk van deze kenmerken worden benadrukt, zijn weergegeven in Aanvullend bestand 2Deze studie heeft tot doel de lezer bekend te maken met de wijze waarop verschillende genomische alteraties verschijnen in IGV.⁵.

Het is belangrijk op te merken dat IGV niet wordt gebruikt als een pijplijntool om onafhankelijk varianten te detecteren. Hoewel dit buiten de reikwijdte van dit manuscript valt, wordt sterk aanbevolen voor onderzoekslaboratoria en is het vereist voor klinische laboratoria^1,7 dat laboratoriumrichtlijnen en -procedures ingaan op rapporteerbare varianten op basis van assay-validatielimieten voor de variant-allelfractie en dekkingdiepte, of er onder bepaalde omstandigheden orthogonale bevestiging van varianten is vereist, complexiteiten met betrekking tot versiebeheer van bio-informati 소프트웨어 en interobservervariatie bij visuele interpretatie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
BLAT	BLAT Search Genome	https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat	Zelfstandige BLAT-webpagina. De BLAT-API is beschikbaar binnen IGV, er is geen aanvullende installatie vereist
CNVKit	GitHub	https://github.com/etal/cnvkit	Openbare GitHub-repository met gratis downloadbare CNVKit. Instructies voor het downloaden/uitvoeren van CNVKit zijn hier ook beschikbaar.
Comparator segmentbestand #1 voor vignette #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c1.seg	Kopie-aantalkbestanden
Comparator segmentbestand #2 voor vignette #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c2.seg	Kopie-aantalkbestanden
Comparator segmentbestand #3 voor vignette #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c4.seg	Kopie-aantalkbestanden
Comparator segmentbestand #4 voor vignette #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c5.seg	Kopie-aantalkbestanden
Comparator segmentbestand #5 voor vignette #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c6.seg	Kopie-aantalkbestanden
Comparator segmentbestand #6 voor vignette #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c7.seg	Kopie-aantalkbestanden
Comparator segmentbestand #7 voor vignette #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c8.seg	Kopie-aantalkbestanden
Comparator segmentbestand #8 voor vignette #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c9.seg	Kopie-aantalkbestanden
Comparator segmentbestand voor vignette #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c3.seg	Kopie-aantalkbestanden
Menselijke genoomsequentie	Menselijke genoomsequentie	https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg38/bigZips/latest/hg38.fa.gz	Downloadbaar fasta-bestand met de Hg38-versie van het menselijk genoom.  Deze is beschikbaar binnen IGV, er is geen aanvullende download vereist
Menselijke genoomsequentie	Menselijke genoomsequentie	https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/latest/hg19.fa.gz	Downloadbaar fasta-bestand met de Hg19-versie van het menselijk genoom. Deze is beschikbaar binnen IGV, er is geen aanvullende download vereist
IGV-softwarebundel	IGV-software	https://data.broadinstitute.org/igv/projects/downloads/2.19/IGV_Win_2.19.7-WithJava-installer.exe	IGV-software versie 2.19.7 met Java (JDK 21), gratis te downloaden. De link hier is voor Windows, hoewel er ook links voor Linux en Mac beschikbaar zijn.
Segmentbestand voor casus vignette #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.seg	Kopie-aantalkbestanden
Tutorial GitHub-repository	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/tree/main	Openbare GitHub-repository met alle benodigde bestanden om de zes vignettes te reproduceren
Vignette #1	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KRAS.xml	Sessiebestanden
Vignette #1 Casus A bai-index	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2A_fixed_backbone_ 2A_new_final_sorted.bam.bai	Alignmentbestanden
Vignette #1 Casus A bam-alignmentbestand	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2A_fixed_backbone_ 2A_new_final_sorted.bam	Alignmentbestanden
Vignette #1 Casus B bai-index	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2B_fixed_backbone_ 2B_new_final_sorted.bam.bai	Alignmentbestanden
Vignette #1 Casus B bam-alignmentbestand	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2B_fixed_backbone_ 2B_new_final_sorted.bam	Alignmentbestanden
Vignette #2	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/BRAF.xml	Sessiebestanden
Vignette #2  bai-index	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/fig2C_braf_v600k_2bp_ backbone_2CD_new_final_sorted.bam.bai	Alignmentbestanden
Vignette #2  bam-alignmentbestand	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/fig2C_braf_v600k_2bp_ backbone_2CD_new_final_sorted.bam	Alignmentbestanden
Vignette #3	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KIT.xml	Sessiebestanden
Vignette #3 bai-indexbestand	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KITdupmod2.bai	Alignmentbestanden
Vignette #3 bam-alignmentbestand	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KITdupmod2.bam	Alignmentbestanden
Vignette #4	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFR.xml	Sessiebestanden
Vignette #4 alignmentbestand	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFRE746_A750delmod.bam	Alignmentbestanden
Vignette #4 bai-index	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFRE746_A750delmod.bai	Alignmentbestanden
Vignette #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/copynumber.xml	Sessiebestanden
Vignette #6	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/egfr_vIII.xml	Sessiebestanden
Vignette #6 bai-index	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.bai	Alignmentbestanden
Vignette #6 bam-alignmentbestand	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.bam	Alignmentbestanden