Een gedefinieerde hydrogel-gebaseerde methode voor het genereren van driedimensionale menselijke borstorganoïden die mammaire morfogenese recapituleren

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een gedefinieerde hydrogel-gebaseerde methode om menselijke borstorganoïden te genereren die belangrijke kenmerken van mammariummorfogenese recapituleren in een gecontroleerd driedimensionaal kweeksysteem.

Samenvatting

De ontwikkeling van fysiologisch relevante menselijke modelsystemen die weefselarchitectuur en cel-toestanddynamiek recapituleren, blijft een grote uitdaging bij het bestuderen van borstontwikkeling en vroege gebeurtenissen in carcinogenese. Conventionele tweedimensionale culturen en veel driedimensionale systemen slagen er niet in de structurele organisatie en micro-omgevingssignalen die de menselijke melkklier definiëren, te vangen. Hier beschrijven we een reproduceerbare methode om driedimensionale menselijke borstorganoïden te genereren uit primaire epiteelcellen die zijn ingebed in een gedefinieerde hydrogelmatrix bestaande uit type I collageen, laminine, fibronectine en hyaluronzuur. Dit systeem ondersteunt de progressie van enkele cellen door belangrijke stadia van mammaire morfogenese, waaronder de uitbreiding van de voorloper, epitheelpatroon en de vorming van terminale ductale lobulaire eenheidsstructuren, evenals het ontstaan van een mesenchymachtig compartiment, gedurende een kweekperiode van 21 dagen. Wij bieden een stapsgewijs protocol voor hydrogelvoorbereiding, celzaaiing en kweekomstandigheden. De methode is compatibel met hoog-inhoud beeldvorming en kwantitatieve analyse van het aantal organoïden, de grootteverdeling en de architecturale complexiteit. Dit platform maakt mechanistische studies mogelijk van epitheliale plasticiteit en omgevingsverstoringen, en biedt een schaalbaar en biologisch relevant systeem voor het onderzoeken van vroege veranderingen op weefselniveau die samenhangen met borstkankerrisico.

Inleiding

Het begrijpen van de ontwikkeling van de menselijke melkklier en de vroege gebeurtenissen die weefsel vatbaar maken voor kwaadaardige transformatie, vereist experimentele systemen die de weefselarchitectuur, cellulaire hiërarchie en micro-omgevingssignalering nauwkeurig reproduceren. Hoewel tweedimensionale epitheelculturen belangrijke mechanistische inzichten hebben opgeleverd, ontbreekt het aan de structurele context die nodig is om epitheelorganisatie en morfogenese^te modelleren. Bestaande driedimensionale kweeksystemen, inclusief die gebaseerd op basalmembraanextracten, hebben het veld vooruit gebracht maar blijven beperkt door variabele samenstelling, onvolledige controle over extracellulaire matrixcomponenten en inconsistente ondersteuning van hogere-orde weefselarchitectuur¹. Daarnaast zijn veel organoïde systemen gebaseerd op basale membraanextracten beperkt doordat ze niet consistent de opkomst van weefselachtige organisatie¹ kunnen ondersteunen. In het bijzonder vertrouwen veel systemen op exogene stromale componenten in plaats van de endogene ontwikkeling van ondersteunende microomgevingen mogelijk te maken, waardoor hun vermogen om epitheliale–mesenchymale interacties te modelleren die centraal staan bij weefselontwikkeling en ziekte worden beperkt. Deze beperkingen beperken de reproduceerbare studie van ontwikkelingsprocessen, epitheelplasticiteit en de effecten van omgevings- of moleculaire verstoringen op weefselorganisatie.

Om deze beperkingen aan te pakken, hebben we een gedefinieerd hydrogel-gebaseerd driedimensionaal menselijk borstorganoïdemodel ontwikkeld dat primaire epitheelcellen in staat stelt georganiseerde structuren te genereren binnen een gedefinieerde extracellulaire matrix 2,3,4,5,8. De hydrogel bestaat uit type I collageen, laminine, fibronectine en hyaluronzuur, componenten geselecteerd op basis van hun vastgestelde rol in de ontwikkeling van de melkklier en de epitheelmorfogenese. Deze extracellulaire matrixmoleculen betrekken verschillende cellulaire receptoren, waaronder integrines, discoidine-domeinreceptoren, CD44 en RHAMM, en staan bekend om het reguleren van epitheelpolariteit, vertakkende morfogenese, stamcelonderhoud, mechanotransductie en weefselorganisatie in de melkklier ^6,7. Eerdere studies die dit hydrogelsysteem beschreven, toonden aan dat de opname van deze extracellulaire matrixcomponenten de ductale-lobulaire morfogenese en epitelrijping aanzienlijk verbeterde vergeleken met collageen-only of matrigel-gebaseerde aandoeningen ^3,8. Daarnaast werden de fysische eigenschappen van deze hydrogelformulering eerder gekarakteriseerd door atomaire krachtmicroscopie, waaruit bleek dat de samengestelde extracellulaire matrixhydrogel een lagere stijfheid en verhoogde zwelling vertoonde ten opzichte van collageen-only gels (Young's modulus: 256,7 ± 20,0 Pa versus respectievelijk 559,2 ± 204,0 Pa), wat consistent is met een zachtere en meer gehydrateerde matrixomgeving⁸.

Belangrijk is dat dit model het ontstaan ondersteunt van een mesenchymachtig compartiment dat naast epitheelstructuren ontstaat en endogene structurele en signaalondersteuning biedt die nauwer aansluit bij de organisatie van het native weefsel³. De fysiologische relevantie van dit hydrogelsysteem is geëvalueerd door directe vergelijkingen met conventionele matrigel-gebaseerde organoïde culturen, waarbij zowel morfologische als transcriptomische analyses worden gebruikt. Eerdere studies toonden aan dat hydrogelculturen een meer georganiseerde ductaal-lobulaire weefselvorming en multilineagedifferentiatie ondersteunden dan matrigel-gebaseerde culturen, terwijl ze ook hormoonrespons^{behielden 8}. Meer recentelijk toonden geïntegreerde single-cell RNA-sequencinganalyses die hydrogel-afgeleide organoïden, matrigelgekweekte organoïden en primair menselijk borstweefsel vergeleken, aan dat hydrogel-gekweekte organoïden de epitheelhiërarchie, cellulaire diversiteit en epitheel–mesenchymale interacties die aanwezig zijn in het native menselijke borstweefsel^nauwkeuriger recapituleren 3. Daarentegen waren organoïden gekweekt door matrigel verrijkt voor proliferatieve hybride basale toestanden en misten ze stromaalachtige populaties, wat consistent is met epitheliale zelfassemblage in plaats van gerichte organogenese.

Het hier beschreven protocol biedt een reproduceerbare en schaalbare methode om organoïden te genereren uit primair menselijk weefsel, met optionele stappen voor fibroblastafname en dissociatie naar enkele cellen. Omdat dit platform compatibel is met live beeldvorming, high-content imaging, kwantitatieve morfometrische analyse, celtracking en genetische perturbatiestudies, kan het worden geïntegreerd met downstreambenaderingen die het aantal organoïden, de grootte, de architectuur en de groeidynamiek beoordelen. Dit platform biedt daarom een biologisch relevant systeem voor het bestuderen van de ontwikkeling van menselijke borsten, epitheliale plasticiteit, epitheel-microomgevingsinteracties en weefselreacties op ontwikkelings-, moleculaire of omgevingsverstoringen.

Een schematisch overzicht van de workflow, inclusief weefselverwerking, hydrogelvoorbereiding, organoïdekweek, ontwikkelingsprogressie en downstream-analyses, wordt gegeven in Figuur 1, terwijl representatieve organoïde morfologieën die met dit platform zijn gegenereerd, in Figuur 2 worden weergegeven.

Figuur 1. Overzicht van de hydrogel-gebaseerde organoïdegeneratieworkflow. (A) Stroomdiagram dat de protocolworkflow samenvat, inclusief weefselverzameling, weefselverwerking, cryopreservatie, herstel en optionele celvoorbereiding, hydrogelvoorbereiding, organoïdecultuur, ontwikkeling van organoïden en downstream analytische toepassingen. (B) Visueel schema dat de belangrijkste fasen van het hydrogel-gebaseerde organoïdegeneratieprotocol weergeeft, waaronder weefselverwerking en -voorbereiding, herstel en optionele celvoorbereiding, en hydrogelvoorbereiding en organoïdezaaiing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Representatieve organoïde morfologieën gegenereerd in het gedefinieerde hydrogelsysteem. Representatieve brightfield-beelden van organoïden afkomstig van verschillende menselijke weefsels die zijn gekweekt in de gedefinieerde hydrogelmatrix. Borstorganoïden die werden gegenereerd door reductie van mammoplastiek-afgeleide enkele epitheelcellen werden op dag 21 van de kweek gefotografeerd. Patiëntafgeleide xenograftorganoïden, gegenereerd uit tumorfragmenten, werden op dag 16 van de kweek gefotografeerd. Speekselklierorganoïden die zijn gegenereerd uit epitheelfragmenten werden op dag 3 van de kweek gefotografeerd. Nierorganoïden die uit epitheelfragmenten worden gegenereerd, werden op dag 17 van de kweek gefotografeerd. Schaalbalken = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

Primaire weefsels die anders als medisch afval na een operatie zouden zijn afgevoerd, zijn verkregen in overeenstemming met alle relevante wetten met behulp van protocollen goedgekeurd door de institutionele beoordelingscommissies van het Maine Medical Center en Tufts Medical Center. Alle weefsels werden vóór de overdracht geanonimiseerd en konden niet worden teruggevoerd naar specifieke patiënten. Om deze reden kreeg dit onderzoek een vrijstellingsstatus van het Committee on the Use of Humans as Experimental Subjects aan het Massachusetts Institute of Technology en aan Tufts University Health Sciences (IRB #13521). Alle patiënten die aan deze studie deelnamen, ondertekenden een formulier voor geïnformeerde toestemming, waarin ze instemden met deelname aan de studie en de publicatie van de resultaten.

1. Weefselverwerking en -voorbereiding

OPMERKING: Voer alle procedures met menselijk weefsel uit in overeenstemming met institutionele bioveiligheids- en ethische richtlijnen. Raadpleeg de workflowschema's in Figuur 1A en 1B voor een visueel overzicht van de protocolstappen en de organoïdevoorbereidingsworkflow voordat de procedure begint.

1. Bereid MEGM voor met behulp van het basale subzaal medium van het melkepitel, aangevuld met 52 μg/mL extract van de bovine hypofyse, 10 ng/mL menselijke epidermale groeifactor, 5 μg/mL insuline, 500 ng/mL hydrocortison, 1% (v/v) GlutaMAX en 1% (v/v) antibioticum-antimycoticum (100X).
2. Bereid het dissociatiemedium voor door 1,5 mg/mL collagenase A (opgeslagen bij −20°C) en 100 U/mL hyaluronidase (opgeslagen bij 4°C) toe te voegen aan het melkepitheliale groeimedium (MEGM).
3. Ontvang menselijk borstweefsel verkregen door profylactische mastectomieën en reductiemammoplastieken binnen 24 uur na excisie, niet gefixeerd in fosfaatgeborrelde zoutoplossing (PBS), en gehandhaafd op 4°C. Weeg het weefsel nauwkeurig op een balans om het totale weefselgewicht te bepalen.
4. Plaats het weefsel in een steriele bioveiligheidskast. Het weefsel wordt mechanisch gehakt in fragmenten van 3–^{5 mm met} behulp van steriele scalpels. Breng ongeveer 2–3 g gehakt weefsel over in een 15 mL kegelvormige buis. Voeg 10 mL dissociatiemedium toe aan elke buis.
5. Incubeer de buisjes bij 37°C op een orbitale rotator bij 8 toeren per minuut gedurende 12–18 uur om het weefsel enzymatisch te verteren. Beschouw de vertering als voltooid wanneer er geen grote weefselfragmenten meer zijn en een homogene suspensie van gelijkmatig gefragmenteerd materiaal zichtbaar is in het hele medium.
6. Laat epitheelfragmenten door de zwaartekracht 5 minuten neerzetten. Bevestig dat er geen zichtbare fragmenten in het medium zijn opgehangen en dat er een duidelijk pelletje aanwezig is. Geef voorzichtig de supernatant over en gooi het supernatant weg zonder het pelletje te verstoren.
   OPMERKING: Het supernatant bevat stromale cellen en matrixcomponenten, en kan worden gewassen en gebruikt of bewaard voor andere studies.
7. Suspensieer de pellet opnieuw in 10 mL wasmedium bestaande uit 5% foetaal rundserum (FBS) in PBS. Centrifugeer op 250 × g gedurende 5 minuten in een swing-bucket centrifuge op kamertemperatuur.
8. Herhaal de wasstap nog drie keer of totdat het supernatant vrij is en vrij van zichtbaar vuil.
9. Sussion de uiteindelijke pellet opnieuw in een vriesmedium bestaande uit 10% dimethylsulfoxide (DMSO) in MEGM met een volume van 1 mL per gram initiële weefselgewicht.
   VOORZICHTIG: DMSO is schadelijk bij contact of inademing. Gebruik passende persoonlijke beschermingsmiddelen en werk met een chemische veiligheidskap indien vereist door de instelling.
10. Geef 1 mL van de suspensie in elke cryovial. Plaats de cryovialen op −80°C in een vriescontainer voordat ze ze langdurig in vloeibare stikstof bewaren.
    OPMERKING: Deze stap vertegenwoordigt een pauzepunt. Bewaar monsters bij −80°C voordat ze worden overgeplaatst naar langdurige opslagomstandigheden.

2. Herstel en optionele celvoorbereiding

1. Ontdooien en Eerste Herstel
   1. Verwijder cryopgeserveerd weefsel uit de opslag van −80°C na het invriezen gedurende minstens 24 uur, of uit de vloeibare stikstof voor langdurige opslag. Dompel het cryovial onmiddellijk onder tot aan de kap in een waterbad van 37°C en ontdooi het snel gedurende 1 minuut om celdood te minimaliseren.
      OPMERKING: Beweeg de cryovial voorzichtig tijdens het ontdooien om een uniforme verwarming te garanderen.
   2. Zodra het volledig is ontdooid, breng je de inhoud van het cryovial onmiddellijk over in een 15 mL conische buis met 10 mL MEGM. Centrifugeer op 250 × g gedurende 5 minuten.
2. Optionele fibroblastafname
   OPMERKING: Fibroblastendepletie door pre-plating is een optionele verrijkingsstap die wordt gebruikt om snel hechtende stromale of fibroblastpopulaties te verminderen wanneer een meer epitheliale startpopulatie wenselijk is. Deze stap is niet vereist voor organoïdevorming en kan worden aangepast afhankelijk van het experimentele doel.
   1. Susser de pellet opnieuw in 10 mL MEGM.
   2. Breng het resuspendeerde weefsel over in een celkweekschaal van 10 cm. Incubeer bij 37°C in een bevochtigde broedmachine met 5% CO₂ gedurende 90 minuten om fibroblast-hechting mogelijk te maken.
      OPMERKING: Verstoor de kweekschotel niet tijdens de incubatie om een efficiënte hechting van fibroblasten te waarborgen.
   3. Verzamel de supernatant met niet-hechtende cellen met een 10 mL serologische pipet, terwijl je de kweekschotel voorzichtig tot ongeveer 45° kantelt. Spoel het bord voorzichtig af met 5 ml PBS en meng de spoeling met het verzamelde supernatant.
   4. Centrifugeer de gecombineerde suspensie op 250 × g gedurende 5 minuten om epitheelverrijkt materiaal terug te winnen.
      OPMERKING: Cellen die aan de plaat hechten, zijn verrijkt voor fibroblasten van de melkklier en kunnen afzonderlijk worden vermeerderd door middel van DMEM + 10% FBS en antibiotica toe te voegen.
3. Optionele dissociatie naar enkele cellen
   1. Suspendeer de pellet opnieuw in 500 μL voorverwarmde (37°C) dissociatie-enzymoplossing bestaande uit 0,25% trypsine. Alternatieve dissociatiereagentia kunnen optimalisatie vereisen. Breng de suspensie over in een 1,5 mL microcentrifugebuis. Tritureer het monster 20 keer met een P1000-pipet om dissociatie te bevorderen.
      WAARSCHUWING: Enzymatische dissociatiereagentia kunnen schadelijk zijn. Gebruik geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen en vermijd huid- of oogcontact.
   2. Incubeer de buis op 37°C gedurende 3-5 minuten. Onmiddellijk na de incubatie dissocieer je het monster mechanisch door 20 keer te tritureren met een P1000-pipet.
   3. Voeg 1 mL serumhoudend wasmedium toe om de enzymatische reactie te neutraliseren. Centrifugeer op 500 × g gedurende 5 minuten.
   4. Susse de pellet opnieuw in een dispaseoplossing van 300 μL (5 U/mL) en een 30 μL DNase-oplossing (1 mg/mL). Broeden 3–5 minuten op 37°C.
   5. Dissocieer het monster mechanisch door 15–20 keer te pipetten. Voeg 700 μL serumhoudend wasmedium toe aan de suspensie.
   6. Filter de celsuspensie door een 40 μm celfilter in een schone buis. Er kan een standaard 40 μm celzeef of een Flowmi-pipetpuntzeef worden gebruikt. Flowmi-zeven kunnen het monsterverlies verminderen bij gebruik van beperkte cellen.
   7. Bepaal het levensvatbare celnummer met behulp van trypan blue exclusion. Meng 10 μL van de celsuspensie met trypanblauw in een verhouding van 1:1 en laad 10 μL van het mengsel in een celtelkamer of telslide. Bepaal de levensvatbaarheid van cellen met behulp van een geautomatiseerde celteller of hemocytometer.
   8. Centrifugeer de suspensie op 500 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
   9. Susstrueer de celpellet opnieuw in MEGM bij de gewenste concentratie voor hydrogelzaaien.
      OPMERKING: Voor experimenten met zaaien met één cel variëren typische inputs van ongeveer 1.000–5.000 cellen per 200 μL hydrogel, afhankelijk van het experimentele doel en de eigenschappen van het donormonster. Lagere zaaddichtheden worden over het algemeen gebruikt voor live beeldvorming en morfogenesestudies om het volgen van de ontwikkeling van individuele organoïden te vergemakkelijken, terwijl hogere dichtheden vaak worden gebruikt voor moleculaire eindpuntanalyses, waaronder RNA- en eiwitverzameling.

3. Hydrogel-bereiding en organoïde zaaien

1. Voorraadvoorbereiding en volumeberekeningen
   1. Plaats laminineoplossing (1,18 mg/mL), hyaluronzuuroplossing (1 mg/mL in steriel water), fibronectineoplossing (2 mg/mL in steriel water) en PBS 1× op ijs vóór gebruik. Bewaar laminine en fibronectine aliquot bij −80°C en bewaar hyaluronzuuroplossing bij 4°C. Ontdooi bevroren componenten langzaam op ijs bij 0°C–4°C vóór gebruik.
   2. Maak een 25× extracellulaire matrix supplementvoorraad. Om 1 ml te bereiden, combineer je 425 μL laminine, 250 μL hyaluronzuur, 250 μL fibronectine en 75 μL PBS in een buisje dat op ijs wordt gehouden. Meng voorzichtig door de buis 3–4 keer om te draaien. Bewaar de oplossing tot 1 maand op 4°C.
   3. Bepaal het gewenste uiteindelijke hydrogelvolume en de samenstelling voordat je het voorbereidt. Bereid minstens 20% overtollig volume voor om materiaalverlies tijdens pipetten en overdracht te compenseren.
      OPMERKING: De hydrogelformulering bestaat uit collageen I, een eindconcentratie van 1× extracellulaire matrixsupplementen (uit een voorraad van 25×), en 12,5% (v/v) 0,1 N natriumhydroxide ten opzichte van het collageen I-volume voor pH-neutralisatie en polymerisatie.
      OPMERKING: De uiteindelijke hydrogelconcentraties zijn 1,7 mg/mL collageen I, 20 μg/mL laminine, 20 μg/mL fibronectine en 10 μg/mL hyaluronzuur.
   4. Bereken het vereiste volume collageen I (_V-collageen) met de volgende formule:
      
      Hier is C_final  = 1,7 mg/mL, V_totaal is het gewenste uiteindelijke hydrogelvolume, en _C-stock is de concentratie van de collageenvoorraadoplossing. Gebruik collageenconcentraties tussen 2–12 mg/mL.
      OPMERKING: De concentratie van collageenvoorraad kan variëren tussen batches. Hogere concentraties verhogen de viscositeit en moeten langzaam worden gepipeteerd.
   5. Bereken het volume van 0,1 N natriumhydroxide (V_NaOH) met de volgende formule:
      V_NaOH = 0,125 x V_collageen
      Bereid een werkoplossing van 0,1 N natriumhydroxide door 1 N natriumhydroxide te verdunnen in steriel water.
   6. Bereken het volume van de extracellulaire matrixaanvulling (V_ES) met de volgende formule:
      
   7. Bereken het resterende volume dat gevuld moet worden met groeimedium met de volgende formule:
      V_groeimedium = V_totaal - (V_collageen + V_NaOH + V_ES + V_{cellen/weefsel})
      OPMERKING: Bepaal het volume van cellen of weefselfragmenten voor elk experiment individueel. Gebruik een typisch bereik van 10–100 μL binnen het toegestane volume. Precieze fragmenttelling wordt niet uitgevoerd omdat fragmentgrootte en samenstelling aanzienlijk variëren tussen de voorbereidingen. Standaardiseer zaaien door visuele beoordeling van fragmentenhoeveelheid en verspreiding.
2. Bereiding van Hydrogel Master Mix
   1. Plaats collageen I, extracellulair matrixsupplement, natriumhydroxide (0,1 N) en groeimedium op ijs bij 0°C–4°C. Houd alle componenten op lage temperatuur om voortijdige polymerisatie te voorkomen.
   2. Voeg het berekende volume collageen I toe aan een gekoelde microcentrifugebuis.
   3. Voeg het berekende volume van voorgekoeld groeimedium toe aan de collageenoplossing.
   4. Voeg het berekende volume van 0,1 N natriumhydroxide toe om de oplossing te neutraliseren.
      OPMERKING: Eerdere optimalisatie stelde vast dat deze voorwaarden de juiste gel-pH opleveren; daarom is routinematige pH-meting van het hydrogelmengsel niet vereist.
      OPMERKING: Voer alle volgende stappen snel uit om voortijdige collageenpolymerisatie te voorkomen.
   5. Meng de oplossing door de buis krachtig te schudden met ongeveer één schudbeurt per seconde gedurende minstens 6 schudden.
   6. Voeg het berekende volume extracellulaire matrixaanvulling toe aan het mengsel.
   7. Tel het berekende volume van losse cellen of weefselfragmenten op met behulp van een P1000-pipet of breed-boring pipetpunt. Meng direct door te schudden zoals beschreven in Stap 3.2.5 en ga direct door naar de volgende stap.
3. Hydrogelafzetting
   1. Pipette het hydrogelmengsel in kweekvaten met het gewenste volume per put. Gebruik 200 μL hydrogel per put voor 4-put kamerslides, 100 μL per put voor 8-well chamberslides, en 20 μL per put voor 96-well platen.
   2. Breng de hydrogel uit tot een dunne mat over het oppervlak bij het gebruik van chamber slides. Plaats de pipettip aan de bovenrand van de kamer en sleep de tip over het oppervlak terwijl je de gel doseert om een gelijkmatig kussen te creëren. Voor platen met 96 putplaten plaats je de pipettip in het midden van de put terwijl je contact houdt met het oppervlak en doseer je de gel centraal om een koepelstructuur te behouden. Vermijd het pipetteren van lucht in de gel, want dit veroorzaakt bellen.
   3. Incubeer de kweekvaten bij 37°C in een bevochtigde broedmachine met 5%_CO2 gedurende 60 minuten om volledige polymerisatie mogelijk te maken.
      OPMERKING: De hier beschreven polymerisatiecondities zijn geoptimaliseerd voor de kweekformaten die in deze studie worden gebruikt. Kleine aanpassingen in de polymerisatietijd kunnen nodig zijn, afhankelijk van de geometrie van het kweekvat, het hydrogelvolume en de incubatieomstandigheden.
4. Cultuur en onderhoud
   1. Voeg voorverwarmde MEGM toe aan elke put. Pas het volume aan volgens het gebruikte cultuurformaat.
   2. Haal de hydrogel voorzichtig los van het kweekoppervlak met een pipettip zodat de gel kan drijven. Schuif de pipettip rond de rand van de gel en til voorzichtig onder de gepolymeriseerde hydrogel om deze van het oppervlak te halen.
   3. Vervang de MEGM twee keer per week door vers vooropgewarmd medium. Houd culturen ongeveer 3–4 weken in een bevochtigde broedmachine met 5% CO₂ en beëindig de kweken voordat de volledige hydrogel-instorting plaatsvindt. Identificeer ingestorte hydrogels aan de hand van het uiterlijk van dichte, ondoorzichtige, plug-achtige structuren die ontstaan door uitgebreide cellulaire uitgroei binnen de gel (zie representatieve voorbeelden in aanvullende figuur 1).

Resultaten

Succesvolle uitvoering van dit protocol resulteert in de vorming van driedimensionale organoïde structuren die georganiseerde epitheelmorfologie en weefselspecifieke architecturale kenmerken vertonen. Organoïden beginnen zich binnen 3–7 dagen na het zaaien te vormen en blijven zich ontwikkelen gedurende de kweekperiode. Eerdere karakterisering van dit hydrogel-organoïdesysteem toonde reproduceerbare organoïdevorming aan bij meerdere onafhankelijke primaire menselijke donoren

Discussie

Het hier beschreven protocol maakt de reproduceerbare generatie van driedimensionale menselijke borstorganoïden mogelijk binnen een gedefinieerde hydrogel-microomgeving die belangrijke kenmerken van mammaire morfogenese³ ondersteunt. Verschillende stappen zijn cruciaal voor het succes van deze methode. Ten eerste moeten weefselverwerking en enzymatische dissociatie zorgvuldig worden gecontroleerd om de epitheliale levensvatbaarheid te behouden en oververtering te ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
15 mL conische buizen	VWR	89039-664	Steriele buizen voor weefselbewerking en centrifugatie
40 μm celzeef	VWR	732-2757	Filtratieapparaat voor bereiding van eencellen suspensie
40 μm celzeef voor lage volumes	Bel-Art	136800040	Filtratieapparaat voor bereiding van eencellen suspensie
Automatische celteller	Bio-Rad	1450102	Apparaat gebruikt om cellen te tellen en levensvatbaarheid te bepalen
Runderhypofyse-extract	Thermo Scientific	13028014	Supplement voor epitheelcel media
Celtellingsdia's	Bio-Rad	145-0011	Dubbelkamer dia's gebruikt voor celtelling
Centrifuge	N/A	N/A	Tabeltop centrifuge/s moeten minimaal 500 x g snelheidscapaciteit hebben en ruimte voor 15 mL en 1,5 mL buizen.
Collageen I	Millipore Sigma	08-115	Extracellulair matrixeiwit gebruikt voor hydrogelvorming
Collagenase A	Sigma-Aldrich	11088793001	Enzym gebruikt voor weefseldissociatie
Cryovials	Corning	976171	Steriele vials voor cryogene opslag van monsters
Kweekvaten (bijv. kamerdia's, multiwell platen)	Corning	354104 354108 3603	Platforms voor hydrogel depositie en organoïd cultuur.
Dimethylsulfoxide	Millipore Sigma	317275	Cryoprotector gebruikt in bevriezingsmedium
Dispase II	Roche	4942078001	Enzym gebruikt voor secundaire weefseldissociatie
DNase I	Roche	10104159001	Enzym gebruikt tijdens celdissociatie.
Fetaal runder serum	Gibco	10437	Serumsupplement gebruikt in was- en neutralisatiemedia
Fibronectine	Sigma-Aldrich	F2006	Extracellulair matrixeiwitcomponent
GlutaMAX	Thermo Scientific	35050061	Supplement voor epitheelcel media
Humaan epidermale groeifactor	Sigma-Aldrich	E9644	Supplement voor epitheelcel media
Hydrocortison	Sigma-Aldrich	H0888	Supplement voor epitheelcel media
Hyaluronzuur	Millipore Sigma	385908	Extracellulair matrixcomponent voor hydrogel formulering
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506	Enzym gebruikt voor weefseldissociatie
Incubator	Thermo Scientific	3598	Apparaat gebruikt voor weefselcultuur incubatie
Insuline	Sigma-Aldrich	I9278	Supplement voor epitheelcel media
Laminine	Gibco	23017-015	Extracellulair matrixeiwitcomponent
Mammary epitheel basaal medium	Thermo Scientific	M171500	Groeimedium voor epitheelcellen
Microcentrifugebuizen (1,5 mL)	Thermo Scientific	3451	Buizen gebruikt voor reacties met kleine volumes
Orbitale rotator	Thermo Scientific	400110	Rotator gebruikt voor weefseldispersie tijdens enzymatische dissociatie
P1000 pipet	Gilson	P1000	Apparaat gebruikt om volumes tot 1.000 μL te mengen en over te brengen
Penicilline-streptomycine	Thermo Scientific	15140122	Antibioticumsupplement voor epitheelcel media
Fosfaatgebufferde zoutoplossing	Gibco	20012-027	Bufferoplossing gebruikt voor wassen en spoelen
Precisiebalans	Mettler Toledo	ML303E	Balans gebruikt voor weefselweging
Serologische pipet	Nunc	170356N	Pipet gebruikt voor het oogsten van niet-adherente epitheelcellen
Natriumhydroxide (1 N)	Fisher Chemical	SS261	Reagens gebruikt voor collageen neutralisatie
Steriele scalpels	Bard-Parker	372615	Gereedschap gebruikt voor mechanisch weefselsnijden
Trypanblauw oplossing	Gibco	15250061	Kleurstof gebruikt voor cellevensvatbaarheidsbeoordeling
Trypsine (0,25%)	Gibco	25200056	Enzymatische reagentia gebruikt voor celdissociatie
Waterbad (37 °C)	VWR	10LA	Apparaat gebruikt voor gecontroleerd ontdooien van monsters