Een gedefinieerde hydrogel-gebaseerde methode voor het genereren van driedimensionale menselijke borstorganoïden die mammaire morfogenese recapituleren

Summary

Dit protocol beschrijft een gedefinieerde hydrogel-gebaseerde methode om menselijke borstorganoïden te genereren die belangrijke kenmerken van mammariummorfogenese recapituleren in een gecontroleerd driedimensionaal kweeksysteem.

Abstract

De ontwikkeling van fysiologisch relevante menselijke modelsystemen die weefselarchitectuur en cel-toestanddynamiek recapituleren, blijft een grote uitdaging bij het bestuderen van borstontwikkeling en vroege gebeurtenissen in carcinogenese. Conventionele tweedimensionale culturen en veel driedimensionale systemen slagen er niet in de structurele organisatie en micro-omgevingssignalen die de menselijke melkklier definiëren, te vangen. Hier beschrijven we een reproduceerbare methode om driedimensionale menselijke borstorganoïden te genereren uit primaire epiteelcellen die zijn ingebed in een gedefinieerde hydrogelmatrix bestaande uit type I collageen, laminine, fibronectine en hyaluronzuur. Dit systeem ondersteunt de progressie van enkele cellen door belangrijke stadia van mammaire morfogenese, waaronder de uitbreiding van de voorloper, epitheelpatroon en de vorming van terminale ductale lobulaire eenheidsstructuren, evenals het ontstaan van een mesenchymachtig compartiment, gedurende een kweekperiode van 21 dagen. Wij bieden een stapsgewijs protocol voor hydrogelvoorbereiding, celzaaiing en kweekomstandigheden. De methode is compatibel met hoog-inhoud beeldvorming en kwantitatieve analyse van het aantal organoïden, de grootteverdeling en de architecturale complexiteit. Dit platform maakt mechanistische studies mogelijk van epitheliale plasticiteit en omgevingsverstoringen, en biedt een schaalbaar en biologisch relevant systeem voor het onderzoeken van vroege veranderingen op weefselniveau die samenhangen met borstkankerrisico.

Introduction

Het begrijpen van de ontwikkeling van de menselijke melkklier en de vroege gebeurtenissen die weefsel vatbaar maken voor kwaadaardige transformatie, vereist experimentele systemen die de weefselarchitectuur, cellulaire hiërarchie en micro-omgevingssignalering nauwkeurig reproduceren. Hoewel tweedimensionale epitheelculturen belangrijke mechanistische inzichten hebben opgeleverd, ontbreekt het aan de structurele context die nodig is om epitheelorganisatie en morfogenese^te modelleren. Bestaande driedimensionale kweeksystemen, inclusief die gebaseerd op basalmembraanextracten, hebben het veld vooruit gebracht maar blijven beperkt door variabele samenstelling, onvolledige controle over extracellulaire matrixcomponenten en inconsistente ondersteuning van hogere-orde weefselarchitectuur¹. Daarnaast zijn veel organoïde systemen gebaseerd op basale membraanextracten beperkt doordat ze niet consistent de opkomst van weefselachtige organisatie¹ kunnen ondersteunen. In het bijzonder vertrouwen veel systemen op exogene stromale componenten in plaats van de endogene ontwikkeling van ondersteunende microomgevingen mogelijk te maken, waardoor hun vermogen om epitheliale–mesenchymale interacties te modelleren die centraal staan bij weefselontwikkeling en ziekte worden beperkt. Deze beperkingen beperken de reproduceerbare studie van ontwikkelingsprocessen, epitheelplasticiteit en de effecten van omgevings- of moleculaire verstoringen op weefselorganisatie.

Om deze beperkingen aan te pakken, hebben we een gedefinieerd hydrogel-gebaseerd driedimensionaal menselijk borstorganoïdemodel ontwikkeld dat primaire epitheelcellen in staat stelt georganiseerde structuren te genereren binnen een gedefinieerde extracellulaire matrix 2,3,4,5,8. De hydrogel bestaat uit type I collageen, laminine, fibronectine en hyaluronzuur, componenten geselecteerd op basis van hun vastgestelde rol in de ontwikkeling van de melkklier en de epitheelmorfogenese. Deze extracellulaire matrixmoleculen betrekken verschillende cellulaire receptoren, waaronder integrines, discoidine-domeinreceptoren, CD44 en RHAMM, en staan bekend om het reguleren van epitheelpolariteit, vertakkende morfogenese, stamcelonderhoud, mechanotransductie en weefselorganisatie in de melkklier ^6,7. Eerdere studies die dit hydrogelsysteem beschreven, toonden aan dat de opname van deze extracellulaire matrixcomponenten de ductale-lobulaire morfogenese en epitelrijping aanzienlijk verbeterde vergeleken met collageen-only of matrigel-gebaseerde aandoeningen ^3,8. Daarnaast werden de fysische eigenschappen van deze hydrogelformulering eerder gekarakteriseerd door atomaire krachtmicroscopie, waaruit bleek dat de samengestelde extracellulaire matrixhydrogel een lagere stijfheid en verhoogde zwelling vertoonde ten opzichte van collageen-only gels (Young's modulus: 256,7 ± 20,0 Pa versus respectievelijk 559,2 ± 204,0 Pa), wat consistent is met een zachtere en meer gehydrateerde matrixomgeving⁸.

Belangrijk is dat dit model het ontstaan ondersteunt van een mesenchymachtig compartiment dat naast epitheelstructuren ontstaat en endogene structurele en signaalondersteuning biedt die nauwer aansluit bij de organisatie van het native weefsel³. De fysiologische relevantie van dit hydrogelsysteem is geëvalueerd door directe vergelijkingen met conventionele matrigel-gebaseerde organoïde culturen, waarbij zowel morfologische als transcriptomische analyses worden gebruikt. Eerdere studies toonden aan dat hydrogelculturen een meer georganiseerde ductaal-lobulaire weefselvorming en multilineagedifferentiatie ondersteunden dan matrigel-gebaseerde culturen, terwijl ze ook hormoonrespons^{behielden 8}. Meer recentelijk toonden geïntegreerde single-cell RNA-sequencinganalyses die hydrogel-afgeleide organoïden, matrigelgekweekte organoïden en primair menselijk borstweefsel vergeleken, aan dat hydrogel-gekweekte organoïden de epitheelhiërarchie, cellulaire diversiteit en epitheel–mesenchymale interacties die aanwezig zijn in het native menselijke borstweefsel^nauwkeuriger recapituleren 3. Daarentegen waren organoïden gekweekt door matrigel verrijkt voor proliferatieve hybride basale toestanden en misten ze stromaalachtige populaties, wat consistent is met epitheliale zelfassemblage in plaats van gerichte organogenese.

Het hier beschreven protocol biedt een reproduceerbare en schaalbare methode om organoïden te genereren uit primair menselijk weefsel, met optionele stappen voor fibroblastafname en dissociatie naar enkele cellen. Omdat dit platform compatibel is met live beeldvorming, high-content imaging, kwantitatieve morfometrische analyse, celtracking en genetische perturbatiestudies, kan het worden geïntegreerd met downstreambenaderingen die het aantal organoïden, de grootte, de architectuur en de groeidynamiek beoordelen. Dit platform biedt daarom een biologisch relevant systeem voor het bestuderen van de ontwikkeling van menselijke borsten, epitheliale plasticiteit, epitheel-microomgevingsinteracties en weefselreacties op ontwikkelings-, moleculaire of omgevingsverstoringen.

Een schematisch overzicht van de workflow, inclusief weefselverwerking, hydrogelvoorbereiding, organoïdekweek, ontwikkelingsprogressie en downstream-analyses, wordt gegeven in Figuur 1, terwijl representatieve organoïde morfologieën die met dit platform zijn gegenereerd, in Figuur 2 worden weergegeven.

Figuur 1. Overzicht van de hydrogel-gebaseerde organoïdegeneratieworkflow. (A) Stroomdiagram dat de protocolworkflow samenvat, inclusief weefselverzameling, weefselverwerking, cryopreservatie, herstel en optionele celvoorbereiding, hydrogelvoorbereiding, organoïdecultuur, ontwikkeling van organoïden en downstream analytische toepassingen. (B) Visueel schema dat de belangrijkste fasen van het hydrogel-gebaseerde organoïdegeneratieprotocol weergeeft, waaronder weefselverwerking en -voorbereiding, herstel en optionele celvoorbereiding, en hydrogelvoorbereiding en organoïdezaaiing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Representatieve organoïde morfologieën gegenereerd in het gedefinieerde hydrogelsysteem. Representatieve brightfield-beelden van organoïden afkomstig van verschillende menselijke weefsels die zijn gekweekt in de gedefinieerde hydrogelmatrix. Borstorganoïden die werden gegenereerd door reductie van mammoplastiek-afgeleide enkele epitheelcellen werden op dag 21 van de kweek gefotografeerd. Patiëntafgeleide xenograftorganoïden, gegenereerd uit tumorfragmenten, werden op dag 16 van de kweek gefotografeerd. Speekselklierorganoïden die zijn gegenereerd uit epitheelfragmenten werden op dag 3 van de kweek gefotografeerd. Nierorganoïden die uit epitheelfragmenten worden gegenereerd, werden op dag 17 van de kweek gefotografeerd. Schaalbalken = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

Primaire weefsels die anders als medisch afval na een operatie zouden zijn afgevoerd, zijn verkregen in overeenstemming met alle relevante wetten met behulp van protocollen goedgekeurd door de institutionele beoordelingscommissies van het Maine Medical Center en Tufts Medical Center. Alle weefsels werden vóór de overdracht geanonimiseerd en konden niet worden teruggevoerd naar specifieke patiënten. Om deze reden kreeg dit onderzoek een vrijstellingsstatus van het Committee on the Use of Humans as Experimental Subjects aan het Massachusetts Institute of Technology en aan Tufts University Health Sciences (IRB #13521). Alle patiënten die aan deze studie deelnamen, ondertekenden een formulier voor geïnformeerde toestemming, waarin ze instemden met deelname aan de studie en de publicatie van de resultaten.

1. Weefselverwerking en -voorbereiding

OPMERKING: Voer alle procedures met menselijk weefsel uit in overeenstemming met institutionele bioveiligheids- en ethische richtlijnen. Raadpleeg de workflowschema's in Figuur 1A en 1B voor een visueel overzicht van de protocolstappen en de organoïdevoorbereidingsworkflow voordat de procedure begint.

1. Bereid MEGM voor met behulp van het basale subzaal medium van het melkepitel, aangevuld met 52 μg/mL extract van de bovine hypofyse, 10 ng/mL menselijke epidermale groeifactor, 5 μg/mL insuline, 500 ng/mL hydrocortison, 1% (v/v) GlutaMAX en 1% (v/v) antibioticum-antimycoticum (100X).
2. Bereid het dissociatiemedium voor door 1,5 mg/mL collagenase A (opgeslagen bij −20°C) en 100 U/mL hyaluronidase (opgeslagen bij 4°C) toe te voegen aan het melkepitheliale groeimedium (MEGM).
3. Ontvang menselijk borstweefsel verkregen door profylactische mastectomieën en reductiemammoplastieken binnen 24 uur na excisie, niet gefixeerd in fosfaatgeborrelde zoutoplossing (PBS), en gehandhaafd op 4°C. Weeg het weefsel nauwkeurig op een balans om het totale weefselgewicht te bepalen.
4. Plaats het weefsel in een steriele bioveiligheidskast. Het weefsel wordt mechanisch gehakt in fragmenten van 3–^{5 mm met} behulp van steriele scalpels. Breng ongeveer 2–3 g gehakt weefsel over in een 15 mL kegelvormige buis. Voeg 10 mL dissociatiemedium toe aan elke buis.
5. Incubeer de buisjes bij 37°C op een orbitale rotator bij 8 toeren per minuut gedurende 12–18 uur om het weefsel enzymatisch te verteren. Beschouw de vertering als voltooid wanneer er geen grote weefselfragmenten meer zijn en een homogene suspensie van gelijkmatig gefragmenteerd materiaal zichtbaar is in het hele medium.
6. Laat epitheelfragmenten door de zwaartekracht 5 minuten neerzetten. Bevestig dat er geen zichtbare fragmenten in het medium zijn opgehangen en dat er een duidelijk pelletje aanwezig is. Geef voorzichtig de supernatant over en gooi het supernatant weg zonder het pelletje te verstoren.
   OPMERKING: Het supernatant bevat stromale cellen en matrixcomponenten, en kan worden gewassen en gebruikt of bewaard voor andere studies.
7. Suspensieer de pellet opnieuw in 10 mL wasmedium bestaande uit 5% foetaal rundserum (FBS) in PBS. Centrifugeer op 250 × g gedurende 5 minuten in een swing-bucket centrifuge op kamertemperatuur.
8. Herhaal de wasstap nog drie keer of totdat het supernatant vrij is en vrij van zichtbaar vuil.
9. Sussion de uiteindelijke pellet opnieuw in een vriesmedium bestaande uit 10% dimethylsulfoxide (DMSO) in MEGM met een volume van 1 mL per gram initiële weefselgewicht.
   VOORZICHTIG: DMSO is schadelijk bij contact of inademing. Gebruik passende persoonlijke beschermingsmiddelen en werk met een chemische veiligheidskap indien vereist door de instelling.
10. Geef 1 mL van de suspensie in elke cryovial. Plaats de cryovialen op −80°C in een vriescontainer voordat ze ze langdurig in vloeibare stikstof bewaren.
    OPMERKING: Deze stap vertegenwoordigt een pauzepunt. Bewaar monsters bij −80°C voordat ze worden overgeplaatst naar langdurige opslagomstandigheden.

2. Herstel en optionele celvoorbereiding

1. Ontdooien en Eerste Herstel
   1. Verwijder cryopgeserveerd weefsel uit de opslag van −80°C na het invriezen gedurende minstens 24 uur, of uit de vloeibare stikstof voor langdurige opslag. Dompel het cryovial onmiddellijk onder tot aan de kap in een waterbad van 37°C en ontdooi het snel gedurende 1 minuut om celdood te minimaliseren.
      OPMERKING: Beweeg de cryovial voorzichtig tijdens het ontdooien om een uniforme verwarming te garanderen.
   2. Zodra het volledig is ontdooid, breng je de inhoud van het cryovial onmiddellijk over in een 15 mL conische buis met 10 mL MEGM. Centrifugeer op 250 × g gedurende 5 minuten.
2. Optionele fibroblastafname
   OPMERKING: Fibroblastendepletie door pre-plating is een optionele verrijkingsstap die wordt gebruikt om snel hechtende stromale of fibroblastpopulaties te verminderen wanneer een meer epitheliale startpopulatie wenselijk is. Deze stap is niet vereist voor organoïdevorming en kan worden aangepast afhankelijk van het experimentele doel.
   1. Susser de pellet opnieuw in 10 mL MEGM.
   2. Breng het resuspendeerde weefsel over in een celkweekschaal van 10 cm. Incubeer bij 37°C in een bevochtigde broedmachine met 5% CO₂ gedurende 90 minuten om fibroblast-hechting mogelijk te maken.
      OPMERKING: Verstoor de kweekschotel niet tijdens de incubatie om een efficiënte hechting van fibroblasten te waarborgen.
   3. Verzamel de supernatant met niet-hechtende cellen met een 10 mL serologische pipet, terwijl je de kweekschotel voorzichtig tot ongeveer 45° kantelt. Spoel het bord voorzichtig af met 5 ml PBS en meng de spoeling met het verzamelde supernatant.
   4. Centrifugeer de gecombineerde suspensie op 250 × g gedurende 5 minuten om epitheelverrijkt materiaal terug te winnen.
      OPMERKING: Cellen die aan de plaat hechten, zijn verrijkt voor fibroblasten van de melkklier en kunnen afzonderlijk worden vermeerderd door middel van DMEM + 10% FBS en antibiotica toe te voegen.
3. Optionele dissociatie naar enkele cellen
   1. Suspendeer de pellet opnieuw in 500 μL voorverwarmde (37°C) dissociatie-enzymoplossing bestaande uit 0,25% trypsine. Alternatieve dissociatiereagentia kunnen optimalisatie vereisen. Breng de suspensie over in een 1,5 mL microcentrifugebuis. Tritureer het monster 20 keer met een P1000-pipet om dissociatie te bevorderen.
      WAARSCHUWING: Enzymatische dissociatiereagentia kunnen schadelijk zijn. Gebruik geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen en vermijd huid- of oogcontact.
   2. Incubeer de buis op 37°C gedurende 3-5 minuten. Onmiddellijk na de incubatie dissocieer je het monster mechanisch door 20 keer te tritureren met een P1000-pipet.
   3. Voeg 1 mL serumhoudend wasmedium toe om de enzymatische reactie te neutraliseren. Centrifugeer op 500 × g gedurende 5 minuten.
   4. Susse de pellet opnieuw in een dispaseoplossing van 300 μL (5 U/mL) en een 30 μL DNase-oplossing (1 mg/mL). Broeden 3–5 minuten op 37°C.
   5. Dissocieer het monster mechanisch door 15–20 keer te pipetten. Voeg 700 μL serumhoudend wasmedium toe aan de suspensie.
   6. Filter de celsuspensie door een 40 μm celfilter in een schone buis. Er kan een standaard 40 μm celzeef of een Flowmi-pipetpuntzeef worden gebruikt. Flowmi-zeven kunnen het monsterverlies verminderen bij gebruik van beperkte cellen.
   7. Bepaal het levensvatbare celnummer met behulp van trypan blue exclusion. Meng 10 μL van de celsuspensie met trypanblauw in een verhouding van 1:1 en laad 10 μL van het mengsel in een celtelkamer of telslide. Bepaal de levensvatbaarheid van cellen met behulp van een geautomatiseerde celteller of hemocytometer.
   8. Centrifugeer de suspensie op 500 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
   9. Susstrueer de celpellet opnieuw in MEGM bij de gewenste concentratie voor hydrogelzaaien.
      OPMERKING: Voor experimenten met zaaien met één cel variëren typische inputs van ongeveer 1.000–5.000 cellen per 200 μL hydrogel, afhankelijk van het experimentele doel en de eigenschappen van het donormonster. Lagere zaaddichtheden worden over het algemeen gebruikt voor live beeldvorming en morfogenesestudies om het volgen van de ontwikkeling van individuele organoïden te vergemakkelijken, terwijl hogere dichtheden vaak worden gebruikt voor moleculaire eindpuntanalyses, waaronder RNA- en eiwitverzameling.

3. Hydrogel-bereiding en organoïde zaaien

1. Voorraadvoorbereiding en volumeberekeningen
   1. Plaats laminineoplossing (1,18 mg/mL), hyaluronzuuroplossing (1 mg/mL in steriel water), fibronectineoplossing (2 mg/mL in steriel water) en PBS 1× op ijs vóór gebruik. Bewaar laminine en fibronectine aliquot bij −80°C en bewaar hyaluronzuuroplossing bij 4°C. Ontdooi bevroren componenten langzaam op ijs bij 0°C–4°C vóór gebruik.
   2. Maak een 25× extracellulaire matrix supplementvoorraad. Om 1 ml te bereiden, combineer je 425 μL laminine, 250 μL hyaluronzuur, 250 μL fibronectine en 75 μL PBS in een buisje dat op ijs wordt gehouden. Meng voorzichtig door de buis 3–4 keer om te draaien. Bewaar de oplossing tot 1 maand op 4°C.
   3. Bepaal het gewenste uiteindelijke hydrogelvolume en de samenstelling voordat je het voorbereidt. Bereid minstens 20% overtollig volume voor om materiaalverlies tijdens pipetten en overdracht te compenseren.
      OPMERKING: De hydrogelformulering bestaat uit collageen I, een eindconcentratie van 1× extracellulaire matrixsupplementen (uit een voorraad van 25×), en 12,5% (v/v) 0,1 N natriumhydroxide ten opzichte van het collageen I-volume voor pH-neutralisatie en polymerisatie.
      OPMERKING: De uiteindelijke hydrogelconcentraties zijn 1,7 mg/mL collageen I, 20 μg/mL laminine, 20 μg/mL fibronectine en 10 μg/mL hyaluronzuur.
   4. Bereken het vereiste volume collageen I (_V-collageen) met de volgende formule:
      
      Hier is C_final  = 1,7 mg/mL, V_totaal is het gewenste uiteindelijke hydrogelvolume, en _C-stock is de concentratie van de collageenvoorraadoplossing. Gebruik collageenconcentraties tussen 2–12 mg/mL.
      OPMERKING: De concentratie van collageenvoorraad kan variëren tussen batches. Hogere concentraties verhogen de viscositeit en moeten langzaam worden gepipeteerd.
   5. Bereken het volume van 0,1 N natriumhydroxide (V_NaOH) met de volgende formule:
      V_NaOH = 0,125 x V_collageen
      Bereid een werkoplossing van 0,1 N natriumhydroxide door 1 N natriumhydroxide te verdunnen in steriel water.
   6. Bereken het volume van de extracellulaire matrixaanvulling (V_ES) met de volgende formule:
      
   7. Bereken het resterende volume dat gevuld moet worden met groeimedium met de volgende formule:
      V_groeimedium = V_totaal - (V_collageen + V_NaOH + V_ES + V_{cellen/weefsel})
      OPMERKING: Bepaal het volume van cellen of weefselfragmenten voor elk experiment individueel. Gebruik een typisch bereik van 10–100 μL binnen het toegestane volume. Precieze fragmenttelling wordt niet uitgevoerd omdat fragmentgrootte en samenstelling aanzienlijk variëren tussen de voorbereidingen. Standaardiseer zaaien door visuele beoordeling van fragmentenhoeveelheid en verspreiding.
2. Bereiding van Hydrogel Master Mix
   1. Plaats collageen I, extracellulair matrixsupplement, natriumhydroxide (0,1 N) en groeimedium op ijs bij 0°C–4°C. Houd alle componenten op lage temperatuur om voortijdige polymerisatie te voorkomen.
   2. Voeg het berekende volume collageen I toe aan een gekoelde microcentrifugebuis.
   3. Voeg het berekende volume van voorgekoeld groeimedium toe aan de collageenoplossing.
   4. Voeg het berekende volume van 0,1 N natriumhydroxide toe om de oplossing te neutraliseren.
      OPMERKING: Eerdere optimalisatie stelde vast dat deze voorwaarden de juiste gel-pH opleveren; daarom is routinematige pH-meting van het hydrogelmengsel niet vereist.
      OPMERKING: Voer alle volgende stappen snel uit om voortijdige collageenpolymerisatie te voorkomen.
   5. Meng de oplossing door de buis krachtig te schudden met ongeveer één schudbeurt per seconde gedurende minstens 6 schudden.
   6. Voeg het berekende volume extracellulaire matrixaanvulling toe aan het mengsel.
   7. Tel het berekende volume van losse cellen of weefselfragmenten op met behulp van een P1000-pipet of breed-boring pipetpunt. Meng direct door te schudden zoals beschreven in Stap 3.2.5 en ga direct door naar de volgende stap.
3. Hydrogelafzetting
   1. Pipette het hydrogelmengsel in kweekvaten met het gewenste volume per put. Gebruik 200 μL hydrogel per put voor 4-put kamerslides, 100 μL per put voor 8-well chamberslides, en 20 μL per put voor 96-well platen.
   2. Breng de hydrogel uit tot een dunne mat over het oppervlak bij het gebruik van chamber slides. Plaats de pipettip aan de bovenrand van de kamer en sleep de tip over het oppervlak terwijl je de gel doseert om een gelijkmatig kussen te creëren. Voor platen met 96 putplaten plaats je de pipettip in het midden van de put terwijl je contact houdt met het oppervlak en doseer je de gel centraal om een koepelstructuur te behouden. Vermijd het pipetteren van lucht in de gel, want dit veroorzaakt bellen.
   3. Incubeer de kweekvaten bij 37°C in een bevochtigde broedmachine met 5%_CO2 gedurende 60 minuten om volledige polymerisatie mogelijk te maken.
      OPMERKING: De hier beschreven polymerisatiecondities zijn geoptimaliseerd voor de kweekformaten die in deze studie worden gebruikt. Kleine aanpassingen in de polymerisatietijd kunnen nodig zijn, afhankelijk van de geometrie van het kweekvat, het hydrogelvolume en de incubatieomstandigheden.
4. Cultuur en onderhoud
   1. Voeg voorverwarmde MEGM toe aan elke put. Pas het volume aan volgens het gebruikte cultuurformaat.
   2. Haal de hydrogel voorzichtig los van het kweekoppervlak met een pipettip zodat de gel kan drijven. Schuif de pipettip rond de rand van de gel en til voorzichtig onder de gepolymeriseerde hydrogel om deze van het oppervlak te halen.
   3. Vervang de MEGM twee keer per week door vers vooropgewarmd medium. Houd culturen ongeveer 3–4 weken in een bevochtigde broedmachine met 5% CO₂ en beëindig de kweken voordat de volledige hydrogel-instorting plaatsvindt. Identificeer ingestorte hydrogels aan de hand van het uiterlijk van dichte, ondoorzichtige, plug-achtige structuren die ontstaan door uitgebreide cellulaire uitgroei binnen de gel (zie representatieve voorbeelden in aanvullende figuur 1).

Results

Succesvolle uitvoering van dit protocol resulteert in de vorming van driedimensionale organoïde structuren die georganiseerde epitheelmorfologie en weefselspecifieke architecturale kenmerken vertonen. Organoïden beginnen zich binnen 3–7 dagen na het zaaien te vormen en blijven zich ontwikkelen gedurende de kweekperiode. Eerdere karakterisering van dit hydrogel-organoïdesysteem toonde reproduceerbare organoïdevorming aan bij meerdere onafhankelijke primaire menselijke donoren³. In die studie werden primaire epitheelcellen geïsoleerd uit 12 ziektevrije mammoplastiekdonoren geëvalueerd, en 11 van de 12 donormonsters genereerden met succes organoïden onder de beschreven kweekomstandigheden. Tussen donoren was het mediane aantal organoïde structuren gevormd per 100 gezaaide cellen 1,775 (95% BI: 0,45–4,10). Hoewel aanzienlijke variabiliteit tussen donoren in de efficiëntie van organoïdevorming en groeidynamiek werd waargenomen, werden complexe ductale-lobulaire en acinaire morfologieën reproduceerbaar gegenereerd tussen donoren.

Borstorganoïden afkomstig van enkele epitheelcellen vertonen progressieve morfogenese en vormen vertakkingsstructuren op dag 21 van de kweek (Figuur 2). Deze structuren worden gekenmerkt door verlengde projecties en meercellige organisatie. Organoïden vertoonden geprojecteerde oppervlakten variërend van 10.000–90.000 μm^² op dag 18, met circulariteitswaarden onder 0,3, berekend als 4π × (Oppervlakte/Omtrek²)^3,9. Organoïden afkomstig van weefselfragmenten vormden doorgaans structuren van meer dan 90.000 μm^² tegen dag 18, terwijl organoïden afkomstig van tumorfragmenten dichtere en onregelmatigere structuren vormden met verminderde organisatie en verhoogde radiale projecties, wat consistent is met veranderd groeigedrag.

Organoïden afkomstig van speekselklier- en nierepitheelfragmenten vertonen ook verschillende morfologieën onder dezelfde hydrogelomstandigheden (Figuur 2). Speekselklierorganoïden vormen compacte structuren op vroege tijdstippen (dag 3), terwijl nierorganoïden tegen dag 17 langgerekte en asymmetrische morfologieën ontwikkelen. Deze waarnemingen zijn opgenomen om de bredere aanpassingsvermogen van het hydrogel-gebaseerde organoïde systeem buiten melkweefsel aan te tonen en illustreren het vermogen om organoïdevorming uit meerdere epitheelweefselbronnen te ondersteunen.

Immunokleuring en moleculaire analyses die eerder ^{3,5,8 uitvoerden}, toonden de aanwezigheid aan van epitheliale lijnmarkers, waaronder de luminale markers KRT8, KRT18, KRT19, E-cadherine, GATA3, JAG1, Notch1 en MUC1, evenals de basale of myoepitheliale markers KRT5, KRT14, Slug, SOX9 en TP63, wat wijst op behoud van epitheliale heterogeniteit binnen de organoïden. Structurele kenmerken die overeenkomen met terminale ductale lobulaire eenheid-achtige organisatie werden waargenomen met confocale microscopie en driedimensionale reconstructie en werden gedefinieerd als structuren met langgerekte ductale gebieden verbonden met terminale lobule- of alveolaire knoppen die lijken op de organisatie van inheemse menselijke terminale ductale lobulaire eenheden. Deze structuren vertoonden ook gelaagde epitheelorganisatie met luminale en basale celpatronen, consistent met eerder gepubliceerde analyses van dit platform³.

Een mesenchymachtig compartiment werd waargenomen in associatie met en tussen epitheelstructuren en werd gekenmerkt door migratiegedrag en expressie van markers waaronder VIM, SNAI1, ZEB1, S100A, CD90 en FAPα. Samen met timelapse-microscopieanalyses ondersteunen deze waarnemingen het ontstaan van een ondersteunende microomgeving binnen het kweeksysteem³.

Belangrijk is dat dit protocol bedoeld is om een breed aanpasbaar methodologisch kader te bieden in plaats van een enkele vaste biologische benchmark vast te stellen. Kwantitatieve uitkomsten, waaronder efficiëntie van organoïdevorming, grootte, vertakkingscomplexiteit en cellulaire samenstelling, kunnen variëren afhankelijk van donorbron, menopauzale status, uitgangsmateriaal (bijv. weefselfragmenten versus individuele cellen) en experimentele omstandigheden.

Suboptimale uitkomsten zijn onder andere verminderde efficiëntie van organoïdevorming (<1 organoïde per 500 gezaaide cellen), overmatig cellulair afval, falen van collageenpolymerisatie of het niet vestigen van georganiseerde structuren. Deze uitkomsten worden vaak geassocieerd met een lage levensvatbaarheid van cellen, onvolledige weefseldissociatie, verkeerde samenstelling van hydrogel of onjuiste pH-neutralisatie.

Kwantitatieve analyse van organoïdeontwikkeling kan worden uitgevoerd met live imaging en high-content imaging benaderingen om het aantal organoïden, grootteverdeling, vertakkingsgedrag, structurele complexiteit en celdynamiek te meten. Eerdere studies met dit platform voerden longitudinale live beeldvorming, celtracking, morfometrische analyses en genetische verstoringsstudies uit om de groeidynamiek van organoïden en het gedrag van de afstammingslijn over tijd^te kwantificeren ^3,5. Beeldvorming werd uitgevoerd met confocale microscopie en beeldanalyse werd uitgevoerd met NIS-Elements software.

Aanvullende Figuur 1. Representatief voorbeeld van een ingezakte hydrogel tijdens langdurige organoïdekweek op dag 18. Ingestorte hydrogels verschijnen als dichte, ondoorzichtige, plugachtige structuren als gevolg van uitgebreide cellulaire uitgroei en samentrekking van de matrix. Deze morfologische kenmerken werden gebruikt als criteria om culturen te beëindigen vóór volledige hydrogel-instorting. Schaalbalk = 500 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Het hier beschreven protocol maakt de reproduceerbare generatie van driedimensionale menselijke borstorganoïden mogelijk binnen een gedefinieerde hydrogel-microomgeving die belangrijke kenmerken van mammaire morfogenese³ ondersteunt. Verschillende stappen zijn cruciaal voor het succes van deze methode. Ten eerste moeten weefselverwerking en enzymatische dissociatie zorgvuldig worden gecontroleerd om de epitheliale levensvatbaarheid te behouden en oververtering te minimaliseren, wat de celopbrengst kan verminderen en de daaropvolgende morfogenese^kan belemmeren. In het bijzonder zijn korte en sequentiële enzymatische behandelingen, gecombineerd met zachte mechanische dissociatie, essentieel voor het behouden van functionele epitheelpopulaties. Ten tweede vereist hydrogelbereiding nauwkeurige controle van de collageenconcentratie, pH en timing¹¹. Neutralisatie van collageen initieert polymerisatie; Daarom moeten alle stappen na toevoeging van natriumhydroxide snel en op ijs worden uitgevoerd om een consistente gelvorming te garanderen. Onvolledige of vertraagde polymerisatie kan resulteren in slecht gestructureerde of ingezakte hydrogels die de ontwikkeling van organoïden niet ondersteunen. Ten slotte moet de zaaidichtheid empirisch worden geoptimaliseerd voor elk donormonster, omdat overmatige weefsel- of celbelasting kan leiden tot snelle gelcontractie en verlies van structurele integriteit¹².

Verschillende overwegingen voor probleemoplossing kunnen de reproduceerbaarheid verbeteren. Slechte organoïdevorming kan het gevolg zijn van een lage levensvatbaarheid van cellen, een suboptimale samenstelling van hydrogel of onjuiste gelbehandeling tijdens depositie¹³. Het is essentieel om ervoor te zorgen dat collageenvoorraden op 4°C blijven en geen voortijdige polymerisatie hebben ondergaan voor een consistente gelkwaliteit¹¹. Daarnaast dient het succesvol loslaten van hydrogels van het kweekoppervlak na polymerisatie als indicator voor een juiste gelvorming; Niet loslaten weerspiegelt doorgaans onvolledige polymerisatie of ongeschikte oppervlaktecondities¹⁴. Variabiliteit in organoïde grootte en morfologie wordt verwacht tussen donormonsters en weerspiegelt biologische heterogeniteit in plaats van technisch falen. Eerdere studies met dit platform toonden reproduceerbare organoïdevorming aan bij een breed scala van onafhankelijke primaire menselijke donoren, ondanks aanzienlijke variabiliteit tussen donoren in de efficiëntie van organoïde vorming en morfogenese³.

Deze methode heeft verschillende beperkingen. Hoewel het model het ontstaan van een mesenchymachtig compartiment naast epitheelstructuren ondersteunt, herhaalt het niet volledig de complexiteit van de in vivo stromale, immuun- en vasculaire micro-omgeving. De samenstelling van de hydrogel, hoewel gedefinieerd, vertegenwoordigt een vereenvoudigde extracellulaire matrix en vangt mogelijk niet alle biomechanische of biochemische signalen vast die aanwezig zijn in het native weefsel^15,16. Daarnaast kan donor-tot-donor variabiliteit invloed hebben op de groeidynamiek en morfologie van organoïden, waardoor empirische optimalisatie voor specifieke toepassingen noodzakelijk is. Ondanks deze beperkingen vertegenwoordigt het vermogen van dit systeem om zelforganisatie en endogene epitheel–mesenchymale interacties te ondersteunen een aanzienlijke vooruitgang ten opzichte van veel bestaande cultuurmodellen³.

In vergelijking met veelgebruikte basementmembraanextract-gebaseerde systemen biedt deze aanpak meer controle over de samenstelling van extracellulaire matrixen en vermindert het de variabiliteit die samenhangt met ongedefinieerde materialen¹⁷. Eerdere studies die dit hydrogelplatform direct vergeleken met matrigel-gebaseerde organoïde systemen toonden aanzienlijke verschillen in weefselorganisatie en cellulaire samenstelling ^3,8. Organoïden gekweekt in hydrogel leken meer op het inheemse menselijke borstweefsel op zowel morfologisch als transcriptomisch niveau, waardoor multilineage epitheliale populaties behouden bleven, waaronder luminale, basale, voorloper- en mesenchymale-achtige compartimenten, terwijl organoïden die in matrigel werden gekweekt werden gedomineerd door proliferatieve hybride basale toestanden en geen stromale populaties hadden. Bovendien maakt dit model, in tegenstelling tot co-cultuursystemen die afhankelijk zijn van de toevoeging van exogene stromale cellen, de intrinsieke ontstaan mogelijk van een ondersteunend mesenchymachtig compartiment, waardoor de bestudering van epitheel-microomgevinginteracties in een fysiologisch relevantere en minder kunstmatig gemanipuleerde context mogelijk is. Opkomende mesenchymale populaties binnen de hydrogels werden eerder gevalideerd door complementaire live imaging, immunokleuring en single-cell transcriptomische analyses³. Deze studies toonden het ontstaan aan van sterk beweeglijke, stromale cellen die mesenchymale en epitheliale–mesenchymale overgangsmarkers tot expressie brengen, waaronder Vimentin, THY1/CD90, FAP, S100A4, ZEB1 en Snail, samen met wederkerige epitheel–mesenchymale signaalinteracties die werden vastgesteld via ligand–receptor analyses. Deze kenmerken maken het systeem bijzonder geschikt voor het onderzoeken van processen die afhankelijk zijn van weefselarchitectuur en cel-cel communicatie, waaronder morfogenese, epitheliale plasticiteit en vroege weefselremodellering ^4,5.

Het beschreven platform heeft brede toepassingen in fundamenteel en translationeel onderzoek. Het kan worden gebruikt om de ontwikkeling van menselijke borsten te bestuderen, vroege gebeurtenissen bij het ontstaan van de ziekte te modelleren en de effecten van moleculaire of omgevingsverstoringen op weefselorganisatie te evalueren. Eerdere studies met dit platform toonden aan dat functionele verstoring van ontwikkelingsregulatoren zoals DDR1 en RUNX1 de differentiatie van afstamming, epitheelorganisatie en ductaal-lobulaire morfogenese in driedimensionale cultuur^{verandert 5,18}. Compatibiliteit met kwantitatieve beeldvorming en analyse van hoge inhoud maakt verder systematische onderzoeken van fenotypische uitkomsten mogelijk, waaronder veranderingen in organoïde grootte, structuur en complexiteit. Als zodanig biedt deze methode een schaalbaar en biologisch relevant platform voor het bestuderen van de organisatie van menselijk weefsel en de verstoring daarvan in ziekte-relevante contexten.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical tubes	VWR	89039-664	Sterile tubes for tissue processing and centrifugation
40 μm cell strainer	VWR	732-2757	Filtration device for single-cell suspension preparation
40 μm cell strainer for low volumes	Bel-Art	136800040	Filtration device for single-cell suspension preparation
Automated cell counter	Bio-Rad	1450102	Device used to count cells and determine viability
Bovine pituitary extract	Thermo Scientific	13028014	Supplement for epithelial cell media
Cell counting slides	Bio-Rad	145-0011	Dual-chamber slides used for cell counting
Centrifuge	N/A	N/A	Benchtop centrifuge/s need to have at least 500 x g speed capability and accommodation of 15 mL and 1.5 mL tubes.
Collagen I	Millipore Sigma	08-115	Extracellular matrix protein used for hydrogel formation
Collagenase A	Sigma-Aldrich	11088793001	Enzyme used for tissue dissociation
Cryovials	Corning	976171	Sterile vials for cryogenic storage of samples
Culture vessels (e.g., chamber slides, multiwell plates)	Corning	354104 354108 3603	Platforms for hydrogel deposition and organoid culture.
Dimethyl sulfoxide	Millipore Sigma	317275	Cryoprotectant used in freezing medium
Dispase II	Roche	4942078001	Enzyme used for secondary tissue dissociation
DNase I	Roche	10104159001	Enzyme used during cell dissociation.
Fetal bovine serum	Gibco	10437	Serum supplement used in wash and neutralization media
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F2006	Extracellular matrix protein component
GlutaMAX	Thermo Scientific	35050061	Supplement for epithelial cell media
Human epidermal growth factor	Sigma-Aldrich	E9644	Supplement for epithelial cell media
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	Supplement for epithelial cell media
Hyaluronic acid	Millipore Sigma	385908	Extracellular matrix component for hydrogel formulation
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506	Enzyme used for tissue dissociation
Incubator	Thermo Scientific	3598	Device used for tissue culture incubation
Insulin	Sigma-Aldrich	I9278	Supplement for epithelial cell media
Laminin	Gibco	23017-015	Extracellular matrix protein component
Mammary epithelial basal medium	Thermo Scientific	M171500	Growth medium for epithelial cells
Microcentrifuge tubes (1.5 mL)	Thermo Scientific	3451	Tubes used for small-volume reactions
Orbital rotator	Thermo Scientific	400110	Rotator used for tissue dispersion during enzymatic dissociation
P1000 pipette	Gilson	P1000	Device used to mix and transfer volumes up to 1,000 μL
Penicillin-streptomycin	Thermo Scientific	15140122	Antibiotic supplement for epithelial cell media
Phosphate-buffered saline	Gibco	20012-027	Buffer solution used for washing and rinsing
Precision balance	Mettler Toledo	ML303E	Balance used for tissue weighing
Serological pipette	Nunc	170356N	Pipette used for harvesting non-adherent epithelial cells
Sodium hydroxide (1 N)	Fisher Chemical	SS261	Reagent used for collagen neutralization
Sterile scalpels	Bard-Parker	372615	Tools used for mechanical tissue mincing
Trypan blue solution	Gibco	15250061	Dye used for cell viability assessment
Trypsin (0.25%)	Gibco	25200056	Enzymatic reagent used for cell dissociation
Water bath (37 °C)	VWR	10LA	Device used for controlled thawing of samples