Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

ELISpot-assay voor het kwantificeren van antigeenspecifieke en totale antilichaam-secreterende cellen in het bloed en beenmerg van geïmmuniseerde rhesusmacaken

59 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/71836

⸱

21 augustus 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Comparative Medicine, Michale E. Keeling Center for Comparative Medicine and Research, University of Texas, 2New Iberia Research Center, University of Louisiana at Lafayette, 3Department of Immunology and Microbiology, Scripps Research Institute

In dit artikel

Samenvatting

B-cel ELISpot is een gevalideerde methode voor het kwantificeren van de omvang en duurzaamheid van antigeenspecifieke IgG-, IgM- en IgA-langlevende plasmacellen, evenals het totaal aantal antilichaam-secreterende cellen (ASC's), in zowel bloed (wat kortlevende plasmablasten na immunisatie weerspiegelt) als meer duurzame ASC's in het beenmerg.

Samenvatting

De evaluatie van nieuwe vaccinantigenen en adjuvantia berust traditioneel op het meten van antilichaamtiters, die tijd nodig hebben om zich te ontwikkelen na immunisatie. De kwantificering van antilichaam-secreterende cellen (ASC's) na primaire en booster-immunisaties biedt een eerdere, mechanistisch informatieve maat voor vaccin-geïnduceerde humorale immuniteit en kan de optimalisatie van vaccinformuleringen en immunisatiestrategieën faciliteren. Hier wordt een protocol beschreven voor het tellen van ASC's uit perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) en beenmergcellen (BM) van rhesusmacaquen; rhesusmacaquen zijn een belangrijk preklinisch model voor HIV-vaccinonderzoek. Deze enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay maakt de kwantificering mogelijk van zowel antigeenspecifieke als totale IgG, IgM en IgA ASC's door hun absolute en relatieve frequenties te meten. In perifeer bloed vangt de assay de piekrespons van plasmablasten na immunisatie op, terwijl deze in het beenmerg de accumulatie van antigeenspecifieke plasmacellen van verschillende isotypes detecteert, waardoor de duurzaamheid van langlevende ASC's kan worden beoordeeld. Dit protocol biedt een robuuste en reproduceerbare aanpak voor het evalueren van immunogeen- en adjuvantcombinaties in preklinische vaccinstudies en levert waardevolle gegevens om de translatie van veelbelovende vaccinkandidaten naar klinische ontwikkeling te ondersteunen.

Inleiding

Antilichaam-secreterende cellen (ASC's) zijn cruciale componenten van de adaptieve immuniteit en omvatten zowel kortlevende plasmablasten, die snel worden gegenereerd na immunisatie, als langlevende plasmacellen, die verantwoordelijk zijn voor een aanhoudende antilichaamproductie. Plasmablasten zijn tijdelijk detecteerbaar in perifeer bloed en secundaire lymfoïde organen, waarbij ze piekfrequenties bereiken op specifieke tijdstippen na immunisatie die variëren afhankelijk van de vaccinformulering en de gastheersoort (typisch dag 4–5 bij rhesusapen en ongeveer dag 7 bij mensen). Daarentegen zijn volwassen plasmacellen langlevend en bevinden zij zich primair in secundaire lymfoïde weefsels en het beenmerg (BM). Een effectief vaccin moet zowel robuuste humorale als celgemedieerde immuunresponsen opwekken. De meting van recall-responsen, weerspiegeld door de snelle expansie van plasmablasten in perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) na een booster-immunisatie, biedt waardevolle inzichten in de omvang van de door het vaccin geïnduceerde immuunrespons. Het algemene doel van dit protocol is om een robuuste methode te bieden voor het kwantificeren van vroege plasmablast- en langlevende plasmacelresponsen na Env-specifieke immunisatie bij rhesusapen.

Bij een enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay worden ASC's gekweekt in 96-wells platen met een bodem van polyvinylidengfluoride (PVDF) of gemengde cellulose-ester (MCE) membraan, gecoat met antigeen (Ag), waardoor levensvatbare cellen eiwitten kunnen uitscheiden die direct op het membraanoppervlak worden opgevangen. De opgevangen eiwitten worden vervolgens gedetecteerd met behulp van antilichamen in een conventioneel sandwich-immunoassay-formaat. Bij chromogene ELISpot-assays worden spots gegenereerd door de omzetting van het substraat 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) door mierikwortelperoxidase (HRP) in een onoplosbaar gekleurd precipitaat, wat de visualisatie en telling van individuele ASC's mogelijk maakt. ELISpot biedt verschillende belangrijke voordelen, waaronder de mogelijkheid om antigeenspecifieke responsen ex vivo te detecteren, een zeer gevoelige functionele beoordeling van individuele immuuncellen en kwantitatieve monitoring van T- en B-cel immuunresponsen in zowel preklinische als klinische studies1,2,3.

Hier wordt een B-cel ELISpot-protocol beschreven voor het kwantificeren van totale en antigeenspecifieke IgG, IgM en IgA ASC's in PBMC's en BM cellen van rhesusmacaquen. Het protocol beschrijft alle kritieke stappen, waaronder het coaten van de plaat, blokkeren, het uitplaten van cellen, assay-ontwikkeling, spot-enumeratie en data-analyse, om de kinetiek van totale en Env-specifieke plasmablast- en plasmacelresponsen te karakteriseren. Deze methode biedt een reproduceerbare aanpak voor het evalueren en vergelijken van de immunogeniciteit van verschillende antigeen- en adjuvansformuleringen in preklinische vaccinstudies en ondersteunt de optimalisatie van vaccinstrategieën voor daaropvolgende klinische translatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De rhesusmacaquen die in dit protocol zijn gebruikt, waren afkomstig uit de specifiek pathogenenvrije (SPF) kolonies van het New Iberia Research Center en werden gehuisvest in het Michale E. Keeling Center for Comparative Medicine and Research van het University of Texas MD Anderson Cancer Center. De dierenverzorging en alle experimentele procedures waren in overeenstemming met de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van het University of Texas MD Anderson Cancer Center (Protocol #2616RN00).

Dit protocol is een optimalisatie van de techniek die is beschreven in eerdere preklinische immunisatiiestudies4,5,6,7, ontwikkeld om ASC-responsen te detecteren. Het onderstaande protocol beschrijft de ELISpot-procedure met gebruik van verse PBMCs en BM -celpreparaten van rhesusmacaquen die deelnamen aan een experimenteel HIV-vaccinprotocol.

LET OP: Voer alle procedures uit secties 1–4 uit in een gecertificeerde Class II veiligheidskast voor biologische agentia met gebruik van aseptische technieken. Gebruik indien mogelijk meerkanaals pipetten.

1. Voorbereiding van ELISpot-platen

  1. Coat de ELISpot-platen
    1. Coat de platen voor totaal immunoglobuline (Ig) 1 en 3 met 100 µL/well van 5 µg/mL ongeconjugeerd geiten anti-apen IgG + IgM + IgA verdund in steriel DPBS. Incubeer de platen gedurende ten minste 8 u bij 4 °C, bij voorkeur overnight (Figuur 1A,C).
    2. Coat de antigeenspecifieke platen 2 en 4 met 100 µL/well van 20 µg/mL Galanthus nivalis lectine (GNL) verdund in DPBS. Incubeer de platen gedurende ten minste 8 u bij 4 °C, bij voorkeur overnight (Figuur 1B,D).
    3. Bewaar de gecoate platen bij 4 °C tot gebruik.
  2. Was en blokkeer de platen voor totaal immunoglobuline
    1. Verwijder de coatingoplossing uit platen 1 en 3 door elke plaat snel om te keren boven een afvalbak. Tik de omgekeerde plaat stevig op absorberend papier om resterende vloeistof te verwijderen.
    2. Was elke plaat tweemaal met 200 µL/well PBS bevattende 0,05% Tween 20. Was de platen vervolgens tweemaal met 200 µL/well DPBS om resterend detergent te verwijderen.
      OPMERKING: Tween 20 is cytotoxisch. Verwijder dit volledig voordat de cellen worden gezaaid.
    3. Voeg 200 µL/well RPMI-10 toe aan elke well. Incubeer de platen gedurende 2 u bij 37 °C in een bevochtigde incubator.
  3. Was en blokkeer de antigeenspecifieke platen
    1. Verwijder de GNL-coatingoplossing uit platen 2 en 4 door elke plaat snel om te keren boven een afvalbak. Tik de omgekeerde platen stevig op absorberend papier om resterende vloeistof te verwijderen.
    2. Was elke plaat viermaal met 200 µL/well DPBS.
      OPMERKING: Gebruik geen PBS bevattende Tween 20 voor GNL-gecoate platen.
    3. Voeg 200 µL/well RPMI-10 toe aan elke well. Incubeer de platen gedurende 2 u bij 37 °C in een bevochtigde incubator.
    4. Giet de blokkeringsoplossing af. Was elke plaat viermaal met 200 µL/well DPBS.
    5. Voeg 100 µL/well CH505 SOSIP-antigeen toe tot een eindconcentratie van 5 µg/mL. Incubeer de platen gedurende 2 u bij 37 °C.
    6. Giet de antigeenoplossing af en was elke plaat viermaal met steriel DPBS.
      OPMERKING: Laat DPBS in de wells achter na de laatste wasbeurt om te voorkomen dat het MCE-membraan uitdroogt vóór het zaaien van de cellen.

2. Voorbereiding van monsters: Isolatie van PBMCs en mononucleaire cellen uit beenmerg

  1. Isoleren van PBMC's uit volbloed
    1. Centrifugeer 10 mL EDTA-bloedbuisjes bij 450 x g gedurende 20 min bij kamertemperatuur zonder gebruik van de rem.
    2. Verwijder het plasma en voeg 4 mL DPBS zonder Ca2+ en Mg2+ toe. Meng voorzichtig met een serologische pipette van 10 mL.
    3. Breng het verdunde bloed voorzichtig in lagen aan over 4 mL Ficoll in een centrifugebuis van 15 mL. Centrifugeer bij 800 x g gedurende 30 min bij kamertemperatuur met een langzame acceleratie en deceleratie.
    4. Overbreng de buffy coat die mononucleaire cellen uit perifeer bloed bevat naar een nieuwe buis van 15 mL. Voeg 8–10 mL DPBS toe en centrifugeer bij 450 x g gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
    5. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet voorzichtig.
    6. Voeg 2 mL ammoniumchloride kalium (ACK) lysisbuffer toe aan de celsuspensie. Incubeer gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
      WAARSCHUWING: Overschrijd de incubatieperiode van 5 min niet, aangezien langdurige blootstelling aan ACK lysisbuffer de cellevensvatbaarheid vermindert.
    7. Stop de erytrocytenlysis door 10 mL DPBS met 2% foetaal kalfsserum (FBS) toe te voegen. Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
    8. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in RPMI-10.
    9. Tel de PBMC's met een geschikte telmethode en zorg ervoor dat de levensvatbaarheid >90% is, bijv. via trypaanblauwkleuring.
    10. Stel één aliquot in op 5 × 106 cellen/mL voor antigeenspecifieke ELISpot-assays. Stel een tweede aliquot in op 1 × 106 cellen/mL voor totale immunoglobuline ELISpot-assays.
  2. Isoleren van mononucleaire cellen uit beenmerg
    1. Plaats een celzeef van 70 µm in een centrifugebuis van 50 mL. Bevochtig de zeef vooraf met 1 mL DPBS.
    2. Voeg 4 mL DPBS toe aan 1 mL beenmergaspiraat. Meng grondig met een serologische pipette.
    3. Keed de beenmergsuspensie door de celzeef van 70 µm. Spoel de zeef met 2 mL DPBS voordat u deze weggooit.
    4. Breng de gefilterde suspensie in lagen aan over 4 mL Ficoll in een centrifugebuis van 15 mL. Centrifugeer bij 800 x g gedurende 30 min bij kamertemperatuur met een langzame acceleratie en deceleratie.
    5. Overbreng de mononucleaire cellaag naar een nieuwe buis van 15 mL. Voeg 8–10 mL DPBS toe en centrifugeer bij 450 x g gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
    6. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet voorzichtig.
    7. Voeg 2 mL ACK lysisbuffer toe aan de celsuspensie. Incubeer gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
      WAARSCHUWING: Overschrijd de aanbevolen lystijd niet om de cellevensvatbaarheid te behouden.
    8. Stop de erytrocytenlysis door 10 mL DPBS met 2% FBS toe te voegen. Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
    9. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in RPMI-10.
    10. Tel de mononucleaire cellen uit het beenmerg met een geschikte telmethode en zorg ervoor dat de levensvatbaarheid >90% is, bijv. via trypaanblauwkleuring.
    11. Stel één aliquot in op 5 × 106 cellen/mL voor antigeenspecifieke ELISpot-assays. Stel een tweede aliquot in op 1 × 106 cellen/mL voor totale immunoglobuline ELISpot-assays.

3. Uitzaaien en incuberen van cellen

  1. Zaai de platen voor totaal immunoglobuline uit
    1. Verwijder het blokkeringsmedium uit platen 1 en 3 door elke plaat snel om te keren boven een afvalbak. Tik de omgekeerde platen stevig op absorberend papier om resterend medium te verwijderen.
    2. Voeg 100 µL RPMI-10 toe aan elke put in de eerste rij en 133 µL RPMI-10 aan elke put in de tweede en derde rij. Deze worden in technische duplicaten uitgevoerd.
    3. Voeg 100 µL PBMC-suspensie (1 × 106 cellen/mL) toe aan de eerste put van elke kolom in plaat 1. Plaats de monsters volgens de plaatindeling [bijv. putten A1–A6 voor rhesusaap 1 (RM1) en A7–A12 voor rhesusaap 2 (RM2)].
    4. Voeg 100 µL beenmergcel-suspensie (1 × 106 cellen/mL) toe aan de eerste put van elke kolom in plaat 3. Plaats de monsters volgens de plaatindeling.
    5. Bereid drievoudige seriële verdunningen voor door 67 µL van de ene put naar de volgende over te brengen en na elke overdracht grondig te mengen. Zet de seriële verdunning voort in de aangewezen putten en gooi vervolgens de laatste 67 µL weg om een eindvolume van 133 µL per put te behouden.
    6. Incubeer de platen overnight bij 37 °C in een bevochtigte incubator met 5% CO2.
      ​OPMERKING: Vermijd het verplaatsen of verstoren van de platen tijdens de incubatie om dubbele vlekken te voorkomen.
  2. Zaai de antigeenspecifieke platen uit
    1. Verwijder de DPBS uit platen 2 en 4 door elke plaat snel om te keren boven een afvalbak. Tik de omgekeerde platen stevig op absorberend papier om resterende buffer te verwijderen.
    2. Voeg 100 µL RPMI-10 toe aan elke put in de eerste rij en 133 µL RPMI-10 aan elke put in de tweede en derde rij.
    3. Voeg 100 µL PBMC-suspensie (5 × 106 cellen/mL) toe aan de eerste put van elke kolom in plaat 2. Voeg de monsters toe volgens de plaatindeling.
    4. Voeg 100 µL beenmergcel-suspensie (5 × 106 cellen/mL) toe aan de eerste put van elke kolom in plaat 4. Voeg de monsters toe volgens de plaatindeling.
    5. Bereid drievoudige seriële verdunningen voor door 67 µL van de ene put naar de volgende over te brengen en na elke overdracht grondig te mengen. Zet de seriële verdunning voort in de aangewezen putten en gooi vervolgens de laatste 67 µL weg om een eindvolume van 133 µL per put te behouden.
    6. Incubeer de platen overnight bij 37 °C in een bevochtigte incubator met 5% CO2.
      OPMERKING: Vermijd het verstoren van de incubator tijdens de incubatie, aangezien trillingen dubbele vlekken of comet-tail-artefacten kunnen veroorzaken.

4. Verwerk de ELISpot-platen

  1. Verwerk de platen voor totale immunoglobulinen
    1. Haal de platen na ongeveer 18 u incubatie uit de incubator.
    2. Verwijder de cellen en het kweekmedium door elke plaat snel om te keren boven een afvalbak met 10% bleekmiddel. Tik de omgekeerde platen stevig op absorberend papier om resterende vloeistof te verwijderen.
      OPMERKING: Voer de overige verwerkingsstappen onder niet-steriele omstandigheden uit.
    3. Was elke plaat vier keer met 200 µL/well DPBS met 0,05% Tween 20.
      OPMERKING: Laat de laatste wasbuffer in de wells achter om te voorkomen dat de membranen uitdrogen.
    4. Als alternatief kunnen de platen met een automatische microplate-wasser worden gewassen bij het verwerken van grote aantallen platen.
    5. Bereid de detectie-antilichaamoplossing door gebiotineerde anti-aap IgG- en IgM-antilichamen 1:1.000 en gebiotineerd anti-aap IgA-antilichaam 1:500 te verdunnen in DPBS met 0,05% Tween 20 en 1% FBS.
    6. Verwijder de laatste wasbuffer door de platen op absorberend papier te tikken. Voeg 100 µL/well verdund anti-IgG-antilichaam toe aan kolommen 1 en 2, 7 en 8, anti-IgM-antilichaam aan kolommen 3 en 4, 9 en 10, en anti-IgA-antilichaam aan kolommen 5 en 6, 11 en 12.
      OPMERKING: Verwerk één plaat per keer om te voorkomen dat de membranen uitdrogen.
    7. Incubeer de platen gedurende 2 u bij kamertemperatuur.
    8. Verwijder de detectie-antilichaamoplossing en was de platen vier keer met DPBS met 0,05% Tween 20.
    9. Bereid het enzymconjugaat door HRP-avidine 1:1.000 te verdunnen in DPBS met 0,05% Tween 20 en 1% FBS.
    10. Voeg 100 µL/well verdunde HRP-avidine toe aan elke well. Incubeer de platen gedurende 2 u bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
    11. Verwijder de HRP-avidine-oplossing en was de platen vier keer met DPBS met 0,05% Tween-20.
      ​OPMERKING: Laat de laatste wasbuffer in de wells achter tot de substraatontwikkeling voltooid is.
  2. Verwerk de antigenspecifieke platen
    OPMERKING: De procedure is vergelijkbaar met die voor de platen voor totale immunoglobulinen. Voer echter alle wasstappen uit met DPBS zonder Tween 20 om de GNL-coating te behouden.
    1. Haal de platen na ongeveer 18 u incubatie uit de incubator.
    2. Verwijder de cellen en het kweekmedium door elke plaat snel om te keren boven een afvalbak met 10% bleekmiddel. Tik de omgekeerde platen stevig op absorberend papier om resterende vloeistof te verwijderen.
      OPMERKING: Voer de overige verwerkingsstappen onder niet-steriele omstandigheden uit.
    3. Was elke plaat vier keer met 200 µL/well DPBS.
      OPMERKING: Laat de laatste wasbuffer in de wells achter om te voorkomen dat de membranen uitdrogen.
    4. Bereid de detectie-antilichaamoplossing door gebiotineerde anti-aap IgG- en IgM-antilichamen 1:1.000 en gebiotineerd anti-aap IgA-antilichaam 1:500 te verdunnen in DPBS met 1% FBS.
    5. Verwijder de laatste wasbuffer door de platen op absorberend papier te tikken. Voeg 100 µL/well verdund anti-IgG-antilichaam toe aan kolommen 1 en 2, 7 en 8, anti-IgM-antilichaam aan kolommen 3 en 4, 9 en 10, en anti-IgA-antilichaam aan kolommen 5 en 6, 11 en 12.
      OPMERKING: Verwerk één plaat per keer om te voorkomen dat de membranen uitdrogen.
    6. Incubeer de platen gedurende 2 u bij kamertemperatuur.
    7. Verwijder de detectie-antilichaamoplossing en was de platen vier keer met 200 µL/well DPBS.
    8. Bereid het enzymconjugaat door HRP-avidine 1:1.000 te verdunnen in DPBS met 1% FBS.
    9. Voeg 100 µL/well verdunde HRP-avidine toe aan elke well. Incubeer de platen gedurende 2 u bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
    10. Verwijder de HRP-avidine-oplossing en was de platen vier keer met 200 µL/well DPBS.
      OPMERKING: Laat de laatste wasbuffer in de wells achter tot de substraatontwikkeling voltooid is.
  3. Voer automatisch wassen uit (Optioneel)
    1. Prime de automatische microplate-wasser met DPBS volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Selecteer het vooraf gedefinieerde ELISpot-wasprogramma en voer alle wasstappen uit met DPBS.
      OPMERKING: Gebruik DPBS voor alle automatische wasbeurten om herhaaldelijk primen van het instrument met verschillende wasbuffers te voorkomen.
    3. Gebruik de washer-instellingen vermeld in Tabel 1 voor de microplate-wasser.

5. Detectie

  1. Bereid de substraatoplossing voor
    1. Bereid het AEC-werksubstraat vlak voor gebruik door één druppel chromogeenoplossing toe te voegen aan elke 1 mL substraatoplossing. Meng grondig door te vortexen.
      OPMERKING: Bereid ongeveer 40 mL werksubstraat voor voor vier 96-well platen.
  2. Ontwikkel de ELISpot-platen bij kamertemperatuur
    1. Verwerk één plaat per keer. Verwijder de laatste wasbuffer en voeg onmiddellijk 100 µL/well AEC-werksubstraat toe.
    2. Controleer de spotontwikkeling visueel totdat er duidelijke rode spots zichtbaar worden, meestal binnen 2–4 min.
      WAARSCHUWING: Ontwikkel de platen niet te lang, aangezien overmatige ontwikkeling de achtergrondkleuring verhoogt en de spotresolutie verslechtert.
    3. Stop de enzymatische reactie door de plaat grondig af te spoelen onder stromend kraanwater.
    4. Was de plaat vier tot vijf keer met kraanwater. Verwijder overtollig water met absorberende papieren handdoeken.
    5. Verwijder de onderafvoer van de plaat en laat de platen ongeveer 24 h aan de lucht drogen voordat de spots worden geteld.
      OPMERKING: Stop de reactie zodra er spots zichtbaar worden in wells met de hoogste celconcentraties om overontwikkeling te voorkomen.
    6. Herhaal stappen 5.2.1–5.2.5 voor elke resterende plaat.

6. Kwantificering van spots

  1. ELISpot-beelden verkrijgen
    1. Scan elke plaat met een ELISpot-reader die is uitgerust met software voor beeldacquisitie.
    2. Selecteer het juiste plaatmodel, definieer de te analyseren wells en verkrijg de beelden volgens de instructies van de software.
    3. Sla de ruwe gegevens op en exporteer de plaatbeelden in TIFF-formaat voor archivering.
  2. Antilichaam-secreterende cellen tellen
    1. Beoordeel de geautomatiseerde spot-tellingen voor elke well.
    2. Verifieer elke well handmatig om onjuist samengevoegde of gesplitste spots te identificeren. Markeer indien nodig individuele spots handmatig om nauwkeurige tellingen te verkrijgen.
      OPMERKING: Handmatige verificatie wordt aanbevolen omdat grote spots door geautomatiseerde analysesoftware meerdere keren geteld kunnen worden.
    3. Noteer de spot-tellingen samen met de bijbehorende verdunningsfactoren in een spreadsheet, zoals beschreven in Tabel 2.
    4. Analyseer dubbele wells afzonderlijk voor IgG, IgM en IgA voordat het gemiddelde aantal spots per verdunning wordt berekend.
    5. Bereken het aantal antilichaam-secreterende cellen per miljoen inputcellen door het gemiddelde aantal spots te vermenigvuldigen met de bijbehorende verdunningsfactor.
      OPMERKING: Gebruik verdunningsfactoren van 15×, 45× en 135× voor totale immunoglobuline-assays en 3×, 9× en 27× voor antigeenspecifieke assays.
    6. Voer alle berekeningen uit in spreadsheetsoftware en genereer grafieken met statistische grafieksoftware.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In deze B-cel ELISpot-assay werden antilichaam-secreterende cellen (ASC's) gedetecteerd met behulp van CH505 SOSIP, een oplosbaar HIV-1 envelop-glycoproteïne (Env) trimeer, als coating-antigeen in een vaccinestudie gericht op het opwekken van breed neutraliserende antilichamen (bnAbs) tegen HIV-1. Figuur 1 illustreert de indeling van de ELISpot-plaat die is gebruikt om het totaal aantal en de antigeen-specifieke ASC's op afzonderlijke platen te kwantificeren. De indeling identificeert indivi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

B-cel ELISpot is een gevoelige methode voor het detecteren van totale immunoglobulinen en antigeenspecifieke antilichaam-secreterende cel (ASC) responsen in bloed-, plasma- en beenmergcellen8,9,10,11. Verschillende stappen zijn cruciaal om de reproduceerbaarheid van het protocol te waarborgen. Ten eerste moeten membranen nauwkeurig worden gecoat met de optimale concentratie van het capture-anti...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen financieel belang te verklaren.

Dankbetuigingen

De auteurs willen de dieren en het verzorgingspersoneel van het Keeling Center for Comparative Medicine and Research bedanken voor hun zorg, evenals vele voormalige teamleden en samenwerkingspartners voor de opeenvolgende verbeteringen aan de procedure. De financiering voor dit NHP HIV-vaccinproject werd verstrekt via NIH-beurzen 5R01AI183472 aan MBZ en R24OD010947 aan FJV.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
ACK LysisQuality Biological118-156-101500 ml
70µm zeefFisher22363548Steriele celzeef, geschikt voor 50 mL conische buizen
AEC werksubstratenBD Biosciences551951Reagentia voor 10 plaat(en)
Analyse: ExcelMicrosoft officeVersion 2508 Build 16.0.19127.20678Microsoft Excel voor Microsoft 365
Analyse: GraphPad PrismGraphPad Software, LLCVersion 10.6.1 (892) GraphPad Prism 10
Anti Rhesus IgA biotinNHPRRAB-3086851geliofileerd
Anti-aap IgG biotinRocklandP/N 617-106-012geliofileerd
Anti-aap IgM biotinRocklandP/N 617-106-007geliofileerd
BlokkeermediumIn het lab bereide reagentiain-house geformuleerdRPMI-10
Buffer voor verdunning van het secundaire antilichaam en HRPIn het lab bereide reagentiain-house geformuleerd1X DPBS met 1% FBS
Centrifuge Thermo Scientific75004521Sorvall Legend XTR, Jaar: 2013, TX-750 rotor en 75003608 (ronde emmer)
CoatingbufferIn het lab bereide reagentiain-house geformuleerd1X DPBS
DPBSGibco14190-1361X
ELISpot-platenMillipore SigmaMSHAN4B50verpakking van 50 platen
Foetaal kalfsserum (FBS)Omega ScientificFB-011X
FicollSTEMCELL Technologies18061500 ml
GNL niet-geconjugeerdVector LaboratoriesL-1240-5geliofileerd
mierikswortelperoxidase (HRP) - AvidineVector LaboratoriesA-20045mg/ml klaar voor gebruik
Mabtech IRIS Fluorospot/ELISpot-lezerMabtech ABP/N: 2000Geautomatiseerde beeldvorming en analyse voor ELISpot- en Flurospot-assays
Penicilline/StreptomycineGibco15140-122100X
PlatenwasserBioTek Instruments, Inc.REF# 405TSRS405 TS microplaatwasser
RPMI-10In het lab bereide reagentiain-house geformuleerdRPMI-1640 + 10% foetaal kalfsserum en 1% penicilline/streptomycine 
RPMI-1640Gibco22400-0711X
Tween20Sigma Life sciencesP7949500ml
Niet-geconjugeerd polyklonaal geit anti-aap IgG+IgA+IgM-antilichaam IgG/IgM/IgALS-BioC347340geliofileerd
Wasbuffer (antigeenspecifieke platen)In het lab bereide reagentiain-house geformuleerd(alleen 1X DPBS)
Wasbuffer (totale Ig-platen)In het lab bereide reagentiain-house geformuleerd(1X DPBS + 0,05% Tween 20)

Referenties

  1. Hwai H, Chen YY, Tzeng SJ. B-Cell ELISpot Assay to Quantify Antigen-Specific Antibody-Secreting Cells in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells. Methods Mol Biol. 2018;1808:133-141.
  2. Haralambieva IH, Ovsyannikova IG, Kennedy RB, Poland GA. Detection and Quantification of Influenza A/H1N1 Virus-Specific Memory B Cells in Human PBMCs Using ELISpot Assay. Methods Mol Biol. 2018;1808:221-236.
  3. Sahay B, Aranyos AM, McAvoy A, Yamamoto JK. Utilization of Feline ELISpot to Evaluate the Immunogenicity of a T Cell-Based FIV MAP Vaccine. Methods Mol Biol. 2018;1808:197-219.
  4. Silveira EL, et al. Vaccine-induced plasmablast responses in rhesus macaques: Phenotypic characterization and a source for generating antigen-specific monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 2015;416:69-83.
  5. Arunachalam PS, et al. A comparative immunological assessment of multiple clinical-stage adjuvants for the R21 malaria vaccine in nonhuman primates. Sci Transl Med. 2024;16(758):eadn6605.
  6. Kasturi SP, et al. 3M-052, a synthetic TLR-7/8 agonist, induces durable HIV-1 envelope-specific plasma cells and humoral immunity in nonhuman primates. Sci Immunol. 2020;5(48):eabb1025.
  7. Kasturi SP, et al. Adjuvanting a Simian Immunodeficiency Virus Vaccine with Toll-Like Receptor Ligands Encapsulated in Nanoparticles Induces Persistent Antibody Responses and Enhanced Protection in TRIM5alpha Restrictive Macaques. J Virol. 2017;91(4):e01844-16.
  8. Shah HB, Koelsch KA. B-Cell ELISPOT: For the Identification of Antigen-Specific Antibody-Secreting Cells. Methods Mol Biol. 2015;1312:419-426.
  9. Czerkinsky CC, et al. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. J Immunol Methods. 1983;65(1-2):109-121.
  10. Saletti G, et al. Enzyme-linked immunospot assays for direct ex vivo measurement of vaccine-induced human humoral immune responses in blood. Nat Protoc. 2013;8(6):1073-1087.
  11. Walsh PN, et al. Optimization and qualification of a memory B-cell ELISpot for the detection of vaccine-induced memory responses in HIV vaccine trials. J Immunol Methods. 2013;394(1-2):84-93.
  12. Brunner C, et al. Cell-based ELISpot protocol to detect and quantify antigen-specific antibody-secreting cells in murine whole-organ single-cell suspensions. STAR Protoc. 2025;6(3):103797.
  13. Rouers A, Tay MZ, Ng LFP, Renia L. B-cell ELISpot assay to analyze human memory B cell and plasmablast responses specific to SARS-CoV-2 receptor-binding domain. STAR Protoc. 2023;4(1):102130.
  14. Tian C, et al. Use of ELISpot assay to study HBs-specific B cell responses in vaccinated and HBV-infected humans. Emerg Microbes Infect. 2018;7(1):16.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Perifeer bloedvaccinimmunogeniciteitplasmablastresponsplasmacellenimmunisatiestrategiepreklinische vaccinstudies

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.