Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
B-cel ELISpot is een gevalideerde methode voor het kwantificeren van de omvang en duurzaamheid van antigeenspecifieke IgG-, IgM- en IgA-langlevende plasmacellen, evenals het totaal aantal antilichaam-secreterende cellen (ASC's), in zowel bloed (wat kortlevende plasmablasten na immunisatie weerspiegelt) als meer duurzame ASC's in het beenmerg.
De evaluatie van nieuwe vaccinantigenen en adjuvantia berust traditioneel op het meten van antilichaamtiters, die tijd nodig hebben om zich te ontwikkelen na immunisatie. De kwantificering van antilichaam-secreterende cellen (ASC's) na primaire en booster-immunisaties biedt een eerdere, mechanistisch informatieve maat voor vaccin-geïnduceerde humorale immuniteit en kan de optimalisatie van vaccinformuleringen en immunisatiestrategieën faciliteren. Hier wordt een protocol beschreven voor het tellen van ASC's uit perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) en beenmergcellen (BM) van rhesusmacaquen; rhesusmacaquen zijn een belangrijk preklinisch model voor HIV-vaccinonderzoek. Deze enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay maakt de kwantificering mogelijk van zowel antigeenspecifieke als totale IgG, IgM en IgA ASC's door hun absolute en relatieve frequenties te meten. In perifeer bloed vangt de assay de piekrespons van plasmablasten na immunisatie op, terwijl deze in het beenmerg de accumulatie van antigeenspecifieke plasmacellen van verschillende isotypes detecteert, waardoor de duurzaamheid van langlevende ASC's kan worden beoordeeld. Dit protocol biedt een robuuste en reproduceerbare aanpak voor het evalueren van immunogeen- en adjuvantcombinaties in preklinische vaccinstudies en levert waardevolle gegevens om de translatie van veelbelovende vaccinkandidaten naar klinische ontwikkeling te ondersteunen.
Antilichaam-secreterende cellen (ASC's) zijn cruciale componenten van de adaptieve immuniteit en omvatten zowel kortlevende plasmablasten, die snel worden gegenereerd na immunisatie, als langlevende plasmacellen, die verantwoordelijk zijn voor een aanhoudende antilichaamproductie. Plasmablasten zijn tijdelijk detecteerbaar in perifeer bloed en secundaire lymfoïde organen, waarbij ze piekfrequenties bereiken op specifieke tijdstippen na immunisatie die variëren afhankelijk van de vaccinformulering en de gastheersoort (typisch dag 4–5 bij rhesusapen en ongeveer dag 7 bij mensen). Daarentegen zijn volwassen plasmacellen langlevend en bevinden zij zich primair in secundai....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De rhesusmacaquen die in dit protocol zijn gebruikt, waren afkomstig uit de specifiek pathogenenvrije (SPF) kolonies van het New Iberia Research Center en werden gehuisvest in het Michale E. Keeling Center for Comparative Medicine and Research van het University of Texas MD Anderson Cancer Center. De dierenverzorging en alle experimentele procedures waren in overeenstemming met de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van het University of Texas MD Anderson Cancer Center (Protocol #2616RN00).
Dit protocol is een optimalisatie van de techniek die is beschrev....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
In deze B-cel ELISpot-assay werden antilichaam-secreterende cellen (ASC's) gedetecteerd met behulp van CH505 SOSIP, een oplosbaar HIV-1 envelop-glycoproteïne (Env) trimeer, als coating-antigeen in een vaccinestudie gericht op het opwekken van breed neutraliserende antilichamen (bnAbs) tegen HIV-1. Figuur 1 illustreert de indeling van de ELISpot-plaat die is gebruikt om het totaal aantal en de antigeen-specifieke ASC's op afzonderlijke platen te kwantificeren. De indeling identificeert indivi.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
B-cel ELISpot is een gevoelige methode voor het detecteren van totale immunoglobulinen en antigeenspecifieke antilichaam-secreterende cel (ASC) responsen in bloed-, plasma- en beenmergcellen8,9,10,11. Verschillende stappen zijn cruciaal om de reproduceerbaarheid van het protocol te waarborgen. Ten eerste moeten membranen nauwkeurig worden gecoat met de optimale concentratie van het capture-anti.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs hebben geen financieel belang te verklaren.
De auteurs willen de dieren en het verzorgingspersoneel van het Keeling Center for Comparative Medicine and Research bedanken voor hun zorg, evenals vele voormalige teamleden en samenwerkingspartners voor de opeenvolgende verbeteringen aan de procedure. De financiering voor dit NHP HIV-vaccinproject werd verstrekt via NIH-beurzen 5R01AI183472 aan MBZ en R24OD010947 aan FJV.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| ACK Lysis | Quality Biological | 118-156-101 | 500 ml |
| 70µm zeef | Fisher | 22363548 | Steriele celzeef, geschikt voor 50 mL conische buizen |
| AEC werksubstraten | BD Biosciences | 551951 | Reagentia voor 10 plaat(en) |
| Analyse: Excel | Microsoft office | Version 2508 Build 16.0.19127.20678 | Microsoft Excel voor Microsoft 365 |
| Analyse: GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | Version 10.6.1 (892) | GraphPad Prism 10 |
| Anti Rhesus IgA biotin | NHPRR | AB-3086851 | geliofileerd |
| Anti-aap IgG biotin | Rockland | P/N 617-106-012 | geliofileerd |
| Anti-aap IgM biotin | Rockland | P/N 617-106-007 | geliofileerd |
| Blokkeermedium | In het lab bereide reagentia | in-house geformuleerd | RPMI-10 |
| Buffer voor verdunning van het secundaire antilichaam en HRP | In het lab bereide reagentia | in-house geformuleerd | 1X DPBS met 1% FBS |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004521 | Sorvall Legend XTR, Jaar: 2013, TX-750 rotor en 75003608 (ronde emmer) |
| Coatingbuffer | In het lab bereide reagentia | in-house geformuleerd | 1X DPBS |
| DPBS | Gibco | 14190-136 | 1X |
| ELISpot-platen | Millipore Sigma | MSHAN4B50 | verpakking van 50 platen |
| Foetaal kalfsserum (FBS) | Omega Scientific | FB-01 | 1X |
| Ficoll | STEMCELL Technologies | 18061 | 500 ml |
| GNL niet-geconjugeerd | Vector Laboratories | L-1240-5 | geliofileerd |
| mierikswortelperoxidase (HRP) - Avidine | Vector Laboratories | A-2004 | 5mg/ml klaar voor gebruik |
| Mabtech IRIS Fluorospot/ELISpot-lezer | Mabtech AB | P/N: 2000 | Geautomatiseerde beeldvorming en analyse voor ELISpot- en Flurospot-assays |
| Penicilline/Streptomycine | Gibco | 15140-122 | 100X |
| Platenwasser | BioTek Instruments, Inc. | REF# 405TSRS | 405 TS microplaatwasser |
| RPMI-10 | In het lab bereide reagentia | in-house geformuleerd | RPMI-1640 + 10% foetaal kalfsserum en 1% penicilline/streptomycine |
| RPMI-1640 | Gibco | 22400-071 | 1X |
| Tween20 | Sigma Life sciences | P7949 | 500ml |
| Niet-geconjugeerd polyklonaal geit anti-aap IgG+IgA+IgM-antilichaam IgG/IgM/IgA | LS-Bio | C347340 | geliofileerd |
| Wasbuffer (antigeenspecifieke platen) | In het lab bereide reagentia | in-house geformuleerd | (alleen 1X DPBS) |
| Wasbuffer (totale Ig-platen) | In het lab bereide reagentia | in-house geformuleerd | (1X DPBS + 0,05% Tween 20) |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dit artikel is gepubliceerd
Video binnenkort beschikbaar