Methodenartikel

Bereiding en kwaliteitsevaluatie van rifampicine-geladen liposomen tegen tuberculose

8 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/71858

⸱

1 oktober 2026

 ,  ,  , 
1School of Chemical Engineering and Light Industry, Guangdong University of Technology, 2Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Resources Biorefinery, Guangdong University of Technology

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol heeft tot doel de bereiding van liposomen geladen met antituberculosemiddelen te optimaliseren en een gestandaardiseerd systeem voor kwaliteitsbeoordeling van de liposomale formuleringen vast te stellen.

Samenvatting

Tuberculose (TB), veroorzaakt door Mycobacterium tuberculosis (MTB), blijft een van de belangrijkste infectieuze doodsoorzaken wereldwijd met een zware ziektelast in China, verergerd door de verspreiding van multidrug-/rifampicine-resistente TB en kritieke beperkingen van conventionele chemotherapie—waaronder een slechte drugpenetratie, ernstige systemische toxiciteit en een lage therapietrouw. Liposomale afgiftesystemen bieden unieke voordelen voor anti-TB-therapie, maar de ontwikkeling ervan wordt belemmerd door inconsistente preparatieprocessen, een lage drugloading-efficiëntie en het ontbreken van een gestandaardiseerd kwaliteitsbeoordelingskader. In deze studie werd de dunne-filmhydratatiemethode, gecombineerd met ultrasone behandeling en filtratie, gebruikt om rifampicine-geladen nanoliposomen met verschillende fosfolipide-cholesterolverhoudingen te prepareren. Er is een gevalideerde methode voor hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) opgezet om de encapsulatie-efficiëntie en drugloading te bepalen. Dynamic light scattering en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) werden gebruikt om de partikelgrootte, het zetapotentieel en de microscopische morfologie te karakteriseren, en in vitro drugrelease-profielen werden geanalyseerd via oplosbaarheidstesten. De geoptimaliseerde liposomen vertoonden een hoge encapsulatie-efficiëntie, een ideale drugloading, een uniforme nanometrische partikelgrootte, een goede bewaarstabiliteit en een vertraagde in vitro drugrelease. Dit werk biedt gestandaardiseerde experimentele methoden en een uitgebreid kwaliteitsbeoordelingssysteem voor de ontwikkeling van anti-TB-liposomen, wat de klinische translatie van liposomale afgiftesystemen voor de behandeling van TB ondersteunt.

Inleiding

Tuberculose (TB), een chronische infectieziekte veroorzaakt door Mycobacterium tuberculosis (MTB), blijft de belangrijkste doodsoorzaak onder infectieziekten toegeschreven aan één enkel pathogeen en vormt een aanhoudende en ernstige bedreiging voor zowel de menselijke gezondheid als de wereldwijde veiligheid van de volksgezondheid. Volgens het Global Tuberculosis Report 2025 van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) waren er in 2024 wereldwijd naar schatting 10,7 miljoen nieuwe TB-gevallen en ongeveer 1,23 miljoen TB-gerelateerde sterfgevallen1. Hiervan werden ongeveer 390.000 nieuwe gevallen van multidrugresistente/rifampicine-resistente tuberculose (MDR/RR-TB) gemeld, waarbij slechts 42% van de getroffen personen een behandeling onderging. De voortdurende overdracht van drugresistente TB is een kernobstakel geworden voor de implementatie van de wereldwijde End TB Strategy van de WHO.

Momenteel blijft chemotherapie de hoeksteen van de klinische behandeling van TB. Het standaard eerstelijnsregime bestaat uit een combinatie van isoniazid, rifampicine, pyrazinamide en ethambutol, met een langdurige behandelperiode van 6 tot 9 maanden2. Voor MDR/RR-TB vereist het regime de inclusie van tweedelijns anti-TB-middelen, waardoor de behandelduur wordt verlengd tot 18–24 maanden3, wat gepaard gaat met aanzienlijk hogere kosten en een sterke toename van bijwerkingen4. Hoewel nieuwe anti-TB-middelen—zoals bedaquiline, delamanid en pretomanid—de afgelopen jaren zijn goedgekeurd en nieuwe therapeutische opties bieden voor drug-resistente TB5, hebben zij de fundamentele knelpunten die inherent zijn aan de bestaande anti-TB-therapie nog niet kunnen overwinnen6,7.

Ten eerste is M. tuberculosis een typisch intracellulair pathogeen dat voornamelijk verblijft in de alveolaire macrofagen van de gastheer. Vrije geneesmiddelen vertonen een slechte penetratie door het macrofaagmembraan, wat resulteert in intracellulaire geneesmiddelconcentraties die ver onder de minimale inhiberende concentratie (MIC) liggen8. Het daaruit voortvloeiende onvermogen om intracellulaire persisters te elimineren is een belangrijke drijfveer voor het recidief van TB en het ontstaan van drugresistentie9. Ten tweede vertonen TB-laesies meerdere biologische barrières, waaronder caseuze necrotisch weefsel en fibrotische capsules, die de penetratie van vrije geneesmiddelen in de kern van de laesie belemmeren, wat leidt tot suboptimale lokale geneesmiddelconcentraties en een aangetaste bactericide effectiviteit10,11. Ten derde is langdurige systemische toediening in hoge doses vatbaar voor ernstige bijwerkingen—zoals rifampicine-geïnduceerde hepatotoxiciteit, aminoglycoside-gerelateerde ototoxiciteit en nefrotoxiciteit, en fluoroquinolon-geassocieerde tendinopathie en cardiotoxiciteit—die de belangrijkste oorzaken zijn van behandelonderbreking en slechte therapietrouw van de patiënt12,13. Ten vierde selecteren monotherapie of sequentiële toediening gemakkelijk op drugresistente mutaties in M. tuberculosis, terwijl combinatieregimes met meerdere geneesmiddelen het risico op cumulatieve toxiciteit verder vergroten, wat een hardnekkig klinisch dilemma creëert14.

De ontwikkeling van toedieningssystemen voor nanogeneeskunde biedt een veelbelovende strategie om de bovengenoemde knelpunten in de anti-TB-therapie aan te pakken. Hiervan zijn liposomen — nanoschaal, gesloten vesiculaire dragers die zelf-assembleren uit fosfolipide-dubbellagen — een van de meest klinisch vertaalbare nanodragerplatforms voor anti-infectieuze therapie geworden, dankzij hun uitstekende biocompatibiliteit, biologische afbreekbaarheid, gerichte toedieningscapaciteit en gecontroleerde eigenschappen voor vertraagde afgifte15,16. Vergeleken met vrije anti-TB-geneesmiddelen bieden liposomale toedieningssystemen verschillende onvervangbare voordelen voor de behandeling van TB.

Ten eerste maken ze gerichte verrijking in macrofagen mogelijk. Liposomen worden bij voorkeur opgenomen door fagocyten van het reticulo-endotheliaal systeem (RES), wat leidt tot specifieke accumulatie in belangrijke MTB-bevattende organen zoals de longen, lever en milt. Bovendien penetreren ze efficiënt het macrofaagmembraan17, waardoor de intracellulaire drugconcentraties aanzienlijk toenemen, persistente intracellulaire bacteriën worden geëlimineerd en daarmee TB-recidieven en drugresistentie fundamenteel worden verminderd. Ten tweede vertonen ze een verbeterde penetratie in TB-laesies. Door het aanpassen van de partikelgrootte, oppervlaktelading en oppervlaktemodificaties kunnen liposomen effectief de fibrotische capsule en de caseuze necrotische barrière van TB-laesies passeren, wat de lokale drugconcentraties aanzienlijk verhoogt en de bactericide effectiviteit verbetert18. Ten derde verminderen ze de drugtoxiciteit aanzienlijk. Liposomen veranderen de in vivo biodistributie van drugs, waardoor blootstelling van gezonde weefsels en organen wordt beperkt en daarmee de systemische toxiciteit van anti-TB-middelen significant wordt verminderd. Zo verminderen met aminoglycosiden beladen liposomen de drugaccumulatie in het slakkenhuis en de nieren sterk, waardoor de risico's op ototoxiciteit en nefrotoxiciteit vrijwel worden geëlimineerd19. Ten vierde bieden ze een langdurige vertraagde afgifte. De fosfolipide dubbellaagstructuur maakt een gecontroleerde, langzame drugafgifte mogelijk, waardoor de in vivo circulatiehalfwaardetijd en de duur van de werking worden verlengd, de doseringsfrequentie wordt verlaagd en de therapietrouw van de patiënt aanzienlijk wordt verbeterd20. Ten vijfde maken ze de co-delivery van meerdere drugs mogelijk. Liposomen kunnen gelijktijdig meerdere anti-TB-drugs met verschillende fysisch-chemische eigenschappen inkapselen, waardoor gesynchroniseerde afgifte en synergetische bactericide effecten worden bereikt, wat de opkomst van drugresistente MTB-mutanten effectief onderdrukt21.

Er is aanzienlijke vooruitgang geboekt in de klinische vertaling van liposomale geneesmiddelafgiftesystemen voor anti-TB-therapie. De amikacine liposoom inhalatiesuspensie (ALIS) heeft goedkeuring gekregen van de U.S. Food and Drug Administration (FDA) voor de behandeling van longziekten veroorzaakt door het Mycobacterium avium complex (MAC)22 en is sindsdien opgenomen in behandelingsregimes voor multidrug-resistente tuberculose (MDR-TB) in meerdere landen, wat de klinische waarde en de brede toepassingsperspectieven van liposomale platforms bij het management van TB onderstreept23. Desalniettemin blijven de ontwikkeling en industrialisatie van anti-TB-liposomen geconfronteerd met verschillende kritieke technische knelpunten, waaronder een slechte reproduceerbaarheid van bereidingsprocessen, een lage drug loading capacity en encapsulatie-efficiëntie, een inhomogene deeltjesgrootteverdeling, aggregatie en lekkage van het geneesmiddel tijdens opslag, en een onvoldoende begrepen correlatie tussen het in vitro oplos-/afgiftegedrag en de in vivo effectiviteit. Deze uitdagingen belemmeren het onderzoeks- en ontwikkelingsproces en de klinische vertaling van nieuwe anti-TB liposomale formuleringen ernstig24,25.

Deze studie introduceert een methode van dunne-filmhydratatie–ultrasonificatie–filtratie die geschikt is voor het inkapselen van hydrofobe of zwak lipofiele kleine molecuulmedicijnen (bijv. rifampicine) binnen de fosfolipide dubbellaag. Voor sterk hydrofiele medicijnen levert de conventionele dunne-filmmetode een lage inkapselingsefficiëntie op, tenzij aanvullende optimalisatie (bijv. loading via een ammoniumsulfaatgradiënt) wordt toegepast. De procedure maakt gebruik van standaardapparatuur (rotatieverdamper, ultrasoonreiniger, HPLC, DLS, TEM), waardoor eenvoudige reproductie zonder gespecialiseerde instrumenten mogelijk is. De huidige opstelling op laboratoriumschaal van 10 mL levert een stabiele kwaliteit en een goede batchconsistentie. Opschaling naar industrieel niveau zou optimalisatie vereisen van het verdampingsvacuüm, de rotatiesnelheid, het ultrasone vermogen en de membraanspecificaties. Opmerkelijk is dat liposomen stabiel blijven gedurende 30 dagen bij 4 °C, maar oxidatie, aggregatie en stratificatie vertonen na 60 dagen, wat vriesdrogen of aanpassing van de formulering noodzakelijk maakt voor langdurige bewaring. We hebben de fosfolipide-cholesterolverhouding systematisch geoptimaliseerd, de workflow voor de bereiding gestandaardiseerd en een uitgebreid kwaliteitsbeoordelingssysteem opgezet dat inkapselingsefficiëntie, drug loading, partikelgrootte, zetapotentiaal, morfologie, in vitro release en bewaarstabiliteit omvat. Dit protocol biedt onderzoekers duidelijke richtlijnen om de geschiktheid van de methode voor de afgifte van hydrofobe medicijnen te beoordelen en dient als referentie voor formulatieaanpassing, experimenteel ontwerp en preliminaire exploratie van opschaling.

Protocol

Deze studie omvatte geen menselijke deelnemers of dieren, en ethische goedkeuring was niet vereist.

1. Bereiding van rifampicine-geladen nanoliposomen

OPMERKING: Bereid alle formuleringen in triplikaat voor.

  1. Weeg de liposoomcomponenten af met een analytische balans met een nauwkeurigheid van 0,1 mg. De massaverhoudingen van fosfolipide tot cholesterol werden respectievelijk ingesteld op 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25 en 70:30 (Tabel 1).
  2. Plaats de drie componenten in een auberginevormige kolf van 100 mL die geschikt is voor rotatieverdamping. Los alle lipidcomponenten op in 6 mL chloroform. Sonicate het mengsel in een waterbad (40 kHz, 100 W) gedurende 1 min tot een heldere oplossing is verkregen.
    ​WAARSCHUWING: Chloroform is een vluchtig organisch oplosmiddel dat schadelijk is bij inademing of absorptie via de huid. Voer alle stappen waarbij chloroform wordt gebruikt (1.3–1.5) uit in een gecertificeerde chemische zuurkast. Draag nitrilhandschoenen, een laboratoriumjas en een chemische veiligheidsbril.
  3. Verwijder de chloroform met een rotatieverdamper met de volgende parameters:
    1. Stel de temperatuur van de condensor in op maximaal -5 °C.
    2. Stel de temperatuur van het waterbad in op 37 °C
    3. Stel de rotatiesnelheid in op 60 rpm
    4. Stel het vacuüm in op 330 mbar om het kookpunt van chloroform te verlagen
      WAARSCHUWING: De rotatieverdamper moet in een zuurkast worden bediend. Zorg ervoor dat de koudeval correct is aangesloten om te voorkomen dat oplosmiddeldampen in de vacuümpomp terechtkomen.
  4. Laat het systeem 20 min draaien bij 330 mbar, verhoog vervolgens het vacuüm naar 80 mbar en ga nog 10 min door om het resterende oplosmiddel volledig te verwijderen en een dunne lipidfilm te vormen26.
    OPMERKING: Verzamel het in de condensor gecondenseerde verdampt oplosmiddel als organisch halogeenhoudend afval. Voer al het chloroformafval af in een correct gelabelde container voor gehalogeneerde organische oplosmiddelen. Niet in de gootsteen gieten.
  5. Droog de lipidfilm onder vacuüm (≤ 80 mbar) bij 25 °C gedurende 12 h.
    OPMERKING: De droogstap wordt uitgevoerd in een vacuümdesiccator in een zuurkast om te voorkomen dat er resterend oplosmiddel vrijkomt.
  6. Hydrateer de gedroogde film met 10 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS-buffer). Plaats de kolf op de rotatieverdamper (zonder vacuüm) bij 100 rpm en 37 °C gedurende 1 h totdat de lipidfilm volledig is losgelaten. De uiteindelijke concentratie rifampicine is 1 mg/mL.
  7. Sonicate in een waterbad (40 kHz, 100 W) bij 37 °C gedurende 10 min. Zorg ervoor dat de temperatuur van het waterbad op 37 °C blijft. Het totale volume van het behandelde monster is 10 mL.
  8. Filter de gesonicate suspensie sequentieel. Bevochtig vooraf een PES-spuitfilter van 0,45 µm (13 mm diameter) met 1 mL PBS. Leid met een spuit van 10 mL het volledige monster van 10 mL één keer door het filter van 0,45 µm. Bevochtig vervolgens vooraf een PES-spuitfilter van 0,22 µm (13 mm diameter) en leid het filtraat hier één keer doorheen. Gebruik geen liposoomextruder (Figuur 1).

2. Inkapselingsefficiëntie

OPMERKING: De inkapselingsefficiëntie (EE) werd bepaald via ultrafiltratiecentrifugatie, waarbij het vrije geneesmiddel snel wordt gescheiden van het in liposomen ingesloten geneesmiddel op basis van fysieke retentie. Vervolgens wordt de hoeveelheid geneesmiddel in beide fracties gemeten en wordt de inkapselingsefficiëntie berekend27.

  1. Voeg precies 200 µL liposoomsuspensie toe aan het monsterreservoir van een ultrafiltratiebuis van 0,5 mL (3 kDa MWCO) en centrifugeer vervolgens om het vrije geneesmiddel van de liposomen te scheiden.
  2. Centrifugeer bij 7.000 x g (vasthoekrotor) bij 25 °C gedurende 15 min. Verzamel het filtraat in de opvangbuis en herhaal dit proces gedurende 4–5 cycli.
  3. Combineer al het filtraat en verdun dit tot 10 mL met methanol in een maatkolf. Filtreer dit door een 0,22 µm Nylon66 spuitfilter voor injectie in de HPLC.
  4. Stel de HPLC-condities als volgt in: Kolom: C18-kolom (4,6 mm x 250 mm, 5 µm); Mobiele fase: acetonitril: waterige fosforzuur = 45: 55 (V/V); Detectiegolflengte: 475 nm; Stroomsnelheid: 1,0 mL/min; Kolomtemperatuur: 40 °C; Injectievolume: 20 µL; Looptijd: 20 min
    WAARSCHUWING: Acetonitril is brandbaar en giftig. Bereid en hanteer de mobiele fase in een zuurkast. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM).
  5. Bereken de inkapselings-efficiëntie (EE) met de volgende vergelijking: Inkapselings-efficiëntie (EE, %) = [(Wrfb − Wfree) / Wrfb] × 100%
  6. Bereken de geneesmiddellading (DL) met de volgende vergelijking: Geneesmiddellading (DL, %) = [(Wrfb − Wfree) / Wtotal] × 100%.
    OPMERKING: Wtotal—Het totale gehalte aan toegevoegde fosfolipiden, cholesterol en rifampicine; Wrfb—Het gehalte aan toegevoegde rifampicine; Wfree—Het gehalte aan vrije geneesmiddelen in liposomen.

3. Validatie van de HPLC-methode

OPMERKING: Voer de HPLC-methodevalidatie voor lineariteit, precisie, herhaalbaarheid, stabiliteit, terugwinning en specificiteit als volgt uit.

  1. Bereid rifampicine-standaardoplossingen voor in de mobiele fase met de volgende concentraties: 1,15, 2,3, 4,6, 9,2, 13,8, 18,4 en 23,0 µg/mL. Analyseer elke oplossing via HPLC, noteer de piekoppervlakken en bereken de regressievergelijking en R2.
  2. Meet de piekoppervlakken van rifampicine-oplossingen van 9,2, 13,8 en 18,4 µg/mL. Voer vijf parallelle tests uit op één dag en bereken de RSD.
  3. Bereid vier parallelle rifampicine-oplossingen van 9,2 µg/mL. Meet de piekoppervlakken via HPLC en bereken de RSD van de herhaalbaarheid van de methode.
  4. Bewaar de standaardoplossing van 9,2 µg/mL bij kamertemperatuur. Analyseer de oplossing na 0, 2, 4, 6, 12 en 24 u, noteer de piekoppervlakken en bereken de RSD voor de stabiliteit.
  5. Voeg een bekende hoeveelheid rifampicine-standaard toe aan blanco liposoommatrices. Verwerk de monsters via ultrafiltratie, analyseer deze via HPLC en bereken vervolgens het recoverypercentage en de RSD.
  6. Onderzoek de chromatogrammen op interferentiepieken bij de retentietijd van rifampicine.

4. Deeltjesgrootte en zetapotentiaal

  1. Pipetteer 20 µL liposoom-suspensie in 980 µL ultrapuur water (vooraf gefilterd door 0,22 µm). Vortex 10 s, en soniceren vervolgens in een waterbad gedurende 30 s.
  2. Overbreng het verdunde monster naar een universele cuvet voor de groottemeting, en naar een gevouwen capillaire cel voor de meting van het zetapotentieel.
  3. Stel de parameters als volgt in: dispergeermiddel = water, temperatuur = 25 °C.
  4. Voer ten minste 3 technische herhalingen uit, elk bestaande uit 10–15 runs. Noteer de Z-gemiddelde waarde (intensiteitsgewogen gemiddelde hydrodynamische diameter) en de polydispersiteitsindex (PDI).
  5. Plaats een palladiumelektrode in de cuvet om het zetapotentieel te meten onder dezelfde parameters28.
  6. Verwijder de cuvet en schakel het instrument uit.

5. Morfologische karakterisering (TEM)

  1. Verdun de rifampicine-geladen liposoomsuspensie 50–100 keer met ultrapuur water om een geschikte concentratie voor TEM-observatie te verkrijgen.
  2. Sonicate het verdunde monster in een waterbad met een badsonicator (40 kHz, 100 W) gedurende 30 s.
    WAARSCHUWING: Vermijd overmatige sonicatie om ruptuur van de liposomen te voorkomen.
  3. Plaats een 300-mesh koolstof-gecoat kopergrid op het filterpapier met de koolstofzijde naar boven gericht.
  4. Pipetteer 10 µL van de verdunde liposoomsuspensie op het centrum van het grid. Laat dit 1 min adsorberen.
  5. Blot het overtollige suspensie vanaf de rand van het grid met schoon filterpapier; raak het centrale observatiegebied niet aan.
  6. Negatieve kleuring: Voeg onmiddellijk 10 µL van 2% (w/v) fosfotungstinezuur (pH 7.0) toe op het grid. Blot na 1 min de overtollige kleurstof vanaf de rand weg.
  7. Laat het grid 3 h aan de lucht drogen bij kamertemperatuur. Plaats het gedroogde grid in de TEM-monsterhouder.
  8. Observeer bij een versnellingsspanning van 80–120 kV. Gebruik de low-dose imaging-modus29 en neem beelden op met een CCD-camera (bijv. Gatan OneView) bij nominale vergrotingen van 10.000x, 25.000x en 40.000x.
  9. Selecteer representatieve velden en vermijd gebieden met aggregatie of kleuringsartefacten.

6. In vitro geneesmiddelvrijgave

  1. Snijd een dialysemembraan (MWCO 7 kDa) in geschikte lengtes. Bereid een grote hoeveelheid oplossing van 2% (w/v) natriumbicarbonaat en 1 mmol/L EDTA, ingesteld op pH 8,0.
  2. Kook het dialysemembraan gedurende 10 min in deze oplossing. Was het membraan grondig met gedestilleerd water.
  3. Equilibreer het gewassen membraan in release-medium (0,01 M PBS) gedurende 30 min. Breng 1 mL liposoomsuspensie over in de voorbehandelde dialysezak; sluit beide uiteinden af met dialyseklemmen.
  4. Plaats de dialysezak in een bekerglas van 100 mL met 80 mL voorverwarmd release-medium bij 37 °C, aangevuld met 0,1% ascorbinezuur (w/v) en 0,1 mL Tween 80. Bedek het bekerglas met aluminiumfolie om het tegen licht te beschermen.
  5. Roer in het donker bij 37 °C en 200 rpm met een magneetroerder. Neem 1 mL release-medium af op vooraf bepaalde tijdstippen: 0,5, 1,5, 3, 5, 7, 9, 12, 24 en 48 u.
  6. Voeg met een pipet 1 mL vers, voorverwarmd release-medium (37 °C) toe aan het bekerglas, waarbij de straal voorzichtig tegen de wand van het bekerglas wordt gericht30 (Het systeem is gesloten; correctie voor verdamping is niet nodig).
  7. Filtreer de monsters door een 0,22 µm filter en analyseer deze via HPLC. Analyseer de monsters volgens dezelfde HPLC-condities als beschreven in sectie 2.4.
  8. Bereken Cumulatieve Vrijgave (%) = (Totale hoeveelheid gedetecteerd geneesmiddel op elk tijdstip / Initiële hoeveelheid geladen geneesmiddel) × 100%

7. Evaluatie van de opslagstabiliteit

  1. Bewaar de bereide rifampicine-geladen liposoomsuspensie in een afgesloten glazen flesje bij 4 °C en bescherm deze tegen licht.
  2. Neem monsters af op dag 1, 4 en 30 na opslag. Gooi het afgenomen monster weg (voeg het niet terug toe aan het oorspronkelijke flesje).
  3. Bepaal de partikelgrootte, de polydispersiteitsindex en het zetapotentiaal van de liposomen op elk tijdstip31.
  4. Noteer het visuele uiterlijk en observeer eventuele neerslag of stratificatie van de liposoomsuspensie.
  5. Neem op dag 60 extra monsters af om oxidatie, neerslag en stratificatie van de suspensie visueel te observeren.
    OPMERKING: Alle metingen werden uitgevoerd in drie parallelle experimenten. Experimentele gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie.

Resultaten

Er is een gevalideerde HPLC-methode ontwikkeld voor de kwantificering van rifampicine. Representatieve chromatogrammen van rifampicine-standaardoplossingen zijn weergegeven in Figuur 2A. De hoofdpiek van rifampicine verscheen bij een retentietijd van 14,13 min, met een goede piekvorm en zonder significante interferentie van andere pieken. De ijklijn vertoonde een goede lineariteit over het concentratiebereik van 1,15–23 µg/mL, met de regressievergelijking Y = 12729,5X-4778,6 en een determinatiecoëfficiënt R2=0,9995. Een R2 ≥ 0,999 wordt over het algemeen als acceptabel beschouwd voor kwantitatieve analyse in farmaceutische laboratoria; de verkregen waarde van 0,9995 bewijst daarom dat de methode zeer lineair is over het geteste bereik. Zwarte vierkantjes representeren de gemeten datapunten en de doorgetrokken lijn representeert de gefitte lineaire regressie (Figuur 2B).

Precisietesten werden uitgevoerd bij drie rifampicine-concentraties (9,2, 13,8 en 18,4 µg/mL). De waarden van de relatieve standaarddeviatie (RSD) van de piekoppervlakken waren allen lager dan 1%, wat een hoge instrumentele precisie bevestigt (Tabel 2). De reproduceerbaarheidstest (n = 4) leverde een RSD op van 0,32%, wat wijst op een betrouwbare reproduceerbaarheid (Tabel 3). De stabiliteitstest, uitgevoerd gedurende 24 u bij kamertemperatuur, toonde een RSD van 0,59% aan, waaruit blijkt dat de rifampicine-oplossing onder deze omstandigheden stabiel bleef (Tabel 4). De gemiddelde terugwinningsgraad was 98,12%, wat de nauwkeurigheid van de methode voor het analyseren van rifampicine in liposoommonsters bevestigt. Deze resultaten verifieerden gezamenlijk dat de HPLC-methode geschikt is voor de kwantitatieve bepaling van rifampicine in deze studie. Deze rigoureuze validatie waarborgt dat daaropvolgende metingen van de inkapselingsefficiëntie, genezingslading en afgifteprofielen betrouwbaar en reproduceerbaar zijn over verschillende experimentele batches.

Vrij geneesmiddel en in liposomen ingekapseld geneesmiddel werden gescheiden door ultrafiltratiecentrifugatie. Kwantitatieve analyse via vloeistofchromatografie met hoge druk (HPLC) toonde aan dat bij een cholesterolgehalte van 20%, de inkapselingsefficiëntie van rifampicine-geladen liposomen een maximum bereikte van 68,54 ± 2,19, en de drug-loading rate 11,42 ± 0,37 bedroeg (Figuur 3). Wanneer cholesterol in overmaat aanwezig is, nemen de inkapselingsefficiëntie en de drug-loading rate van de liposomen significant af (Tabel 5). Deze resultaten tonen aan dat een cholesterol-fosfolipideratio van 20% optimaal is voor het balanceren van membraanrigiditeit en vloeibaarheid, en voor het behouden van rifampicine binnen de dubbellaag. De kleine standaarddeviaties (allemaal <2,2% voor EE en <0,4% voor DL over drie preparaties) bevestigen dat het preparatieprotocol een consistente formulatiekwaliteit oplevert met een goede reproduceerbaarheid tussen batches.

De liposomen die met de geoptimaliseerde methode waren bereid, vertoonden een smalle grootteverdeling (Figuur 4), met een gemiddelde grootte van 185 nm. Een PDI-waarde <0,3 wordt algemeen aanvaard als indicatief voor een monodisperse populatie; de verkregen PDI van 0,153 bevestigt daarom dat de liposomen zeer uniform zijn in grootte. Een absolute zetapotentiaal >30 mV zorgt over het algemeen voor voldoende elektrostatische afstoting om aggregatie te voorkomen. De gemeten waarde van −38 mV voorspelt dus een goede colloïdale stabiliteit32. De lage standaarddeviaties over triplaat monsters (bijv. grootte 185,41 ± 0,72 nm bij 20% cholesterol) tonen verder de hoge reproduceerbaarheid van de bereidingsprocedure aan. Deze resultaten laten zien dat het protocol van dunne-filmhydratatie-ultrasonificatie-filtratie betrouwbaar nanoschaal-liposomen produceert met een smalle grootteverdeling en een adequate oppervlaktelading, waardoor de stabiliteit op lange termijn wordt gewaarborgd.

De bereide liposomen vertoonden een duidelijk Tyndall-effect. Figuur 5A illustreert het Tyndall-effect van het liposoom33. De morfologische kenmerken van de met rifampicine geladen nanoliposomen werden geëvalueerd via TEM en dynamische lichtverstrooiing (DLS). Zoals getoond in Figuur 4, vertoonden de intensiteitsgewogen grootteverdelingscurven van de liposomen via DLS een enkele, smalle piek, zonder zichtbare grote deeltjes of aggregaten, wat duidt op een goede homogeniteit en monodispersiteit van de bereide formulering (Figuur 5B). Bij lage vergroting werden sferische liposomale vesikels waargenomen; er werd echter enige lokale aggregatie opgemerkt (Figuur 5C), wat toegeschreven kan worden aan onvolledige dispersie tijdens de monstervoorbereiding, alsmede mogelijke vesikelfusie tijdens het drogen. Bij hoge vergroting (50.000×, Figuur 5D) waren duidelijke contrastverschillen zichtbaar: de donkere centrale regio komt overeen met de drug-bevattende waterige kern, terwijl de lichtere buitenring de lipide dubbellaag vertegenwoordigt, een typisch kenmerk van negatief gekleurde liposomen34.

De partikelgrootte waargenomen via TEM was kleiner dan de hydrodynamische diameter bepaald via DLS. Dit verschil vloeit voort uit de verschillende principes van de twee technieken: TEM meet de diameter van de gedehydrateerde kern onder vacuüm, terwijl DLS de gehydrateerde diameter detecteert, inclusief de hydratatielaag aan het oppervlak, wat een bekend kenmerk is van liposomale nanodeeltjes35.

Er was geen duidelijke burst-release in de eerste drie liposoomgroepen (de cumulatieve afgiftesnelheid bij 0,5 u was <40% in alle groepen). Een burst-release van <40% binnen het eerste uur wordt over het algemeen als veilig beschouwd voor langwerkende antituberculosepreparaten, omdat dit het risico op acute systemische toxiciteit minimaliseert. De specifieke afgiftefasen kunnen als volgt worden onderverdeeld:

Snelle afgifteperiode (0,5–12 u): Het geneesmiddel diffundeerde langzaam vanuit de oppervlaktelaag of het gebied nabij het membraan van de liposomen, en de afgiftesnelheid was relatief hoog. De cumulatieve afgiftesnelheid van de eerste drie groepen was na 12 u dicht bij de 90% (Figuur 6).

Na 24 u werd vermoed dat rifampicine onderging aan oxidatieve degradatie en hydrolytische degradatie, wat resulteerde in een abnormale afname van de cumulatieve afgiftesnelheid36. Wanneer het cholesterolgehalte 30% bedroeg, was de cumulatieve afgiftesnelheid na 0,5 u >40%, wat niet voldeed aan de standaard voor vertraagde afgifte.

Daarom zijn formuleringen met 5–15% cholesterol acceptabel, en voldoet 20% eveneens aan het criterium voor burst-release. De geringe variabiliteit tussen batches (Figuur 6) bevestigt de reproduceerbaarheid van de methode voor het testen van de release.

De afgiftegegevens voor de eerste drie groepen werden gefit aan gangbare kinetische modellen (nulde-orde, eerste-orde, Higuchi en Ritger-Peppas) (Figuur 7). De resultaten toonden aan dat het kinetische model van de eerste orde de hoogste fit-kwaliteit behaalde (R2= 0,987), wat significant superieur was aan de nulde-orde (R2= 0,246), Higuchi (R2= 0,544) en Ritger-Peppas (R2 = 0,926) modellen. Dit geeft aan dat het afgiftegedrag van het geneesmiddel uit liposomen de eerste-orde kinetiek volgt. De afgiftesnelheid is positief gecorreleerd met de resterende geneesmiddelconcentratie in de liposomen, waarbij een typisch kenmerk van "initiële burst-afgifte - daaropvolgende vertraagde afgifte" zichtbaar is, wat het mechanisme verder bevestigt waarmee cholesterol de diffusiesnelheid beïnvloedt door de membraanstructuur te reguleren37.

De met rifampicine geladen liposomen vertoonden een goede stabiliteit op korte termijn tijdens 30 dagen bewaring bij 4 °C. Gedurende de evaluatieperiode van 1, 4 en 30 dagen nam de partikelgrootte licht toe, terwijl een uitstekende homogeniteit in grootte (PDI < 0,15) en een gunstige colloïdale stabiliteit (absoluut zetapotentieel > 24 mV) behouden bleven (Tabel 6). Op dag 60 werden duidelijke oxidatie en flocculen waargenomen, wat duidt op een slechte stabiliteit van de formulering op lange termijn. Dit resultaat benadrukt de noodzaak van vriesdrogen of aanpassing van de formulering (bijv. toevoeging van antioxidanten of lyoprotectanten) voor bewaring op lange termijn – een belangrijk praktisch inzicht voor onderzoekers die dit protocol gebruiken.

figure-results-1
Figuur 1. Bereiding van rifampicine-geladen liposomen via dunne-filmhydratatie. Schematische workflow die de bereiding van rifampicine-geladen liposomen illustreert. Lipidecomponenten werden opgelost in een organisch oplosmiddel, gevolgd door dunne-filmvorming via rotatieverdamping, vacuümdrogen, hydratatie en sonicatie om de uiteindelijke liposomale formulering te produceren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2. HPLC-identificatie en kalibratie van rifampicine. (A) Representatief HPLC-chromatogram van rifampicine waarop de karakteristieke retentiepiek te zien is die wordt gebruikt voor kwantitatieve analyse. (B) Kalibratiecurve gegenereerd door de piekoppervlakte uit te zetten tegen de rifampicineconcentratie (1.15–23.0 µg/mL). De regressievergelijking en correlatiecoëfficiënt (R2 = 0.9995) tonen een uitstekende lineariteit over het geteste concentratiebereik. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3. Inkapselingsefficiëntie en geneesmiddellading van rifampicine-geladen liposomen. Inkapselingsefficiëntie (EE) en geneesmiddellading (DL) van liposomen geprepareerd met variërende cholesterolgehaltes. De hoogste EE (68,5%) en DL (11,4%) werden waargenomen bij 20% cholesterol, wat aangeeft dat het cholesterolgehalte de inkapseling en lading van het geneesmiddel significant beïnvloedt. Foutenbalken representeren gemiddelde × SD (n = 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4. Deeltjesgrootteverdeling van rifampicine-geladen liposomen. Deeltjesgrootteverdelingsprofielen van rifampicine-geladen liposomen bereid met verschillende fosfolipide-cholesterolverhoudingen. De geoptimaliseerde formulering vertoonde een Z-gemiddelde diameter van 185 nm en een polydispersiteitsindex (PDI) van 0,153, wat duidt op een nauwe grootteverdeling en een goede homogeniteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5. Fysisch-chemische karakterisering van rifampicine-geladen liposomen. (A) Het Tyndall-effect waargenomen in de rifampicine-geladen liposomensuspensie duidt op de aanwezigheid van nanodeeltjes. (B) Deeltjesgrootteverdelingscurven van drie parallelle replica's van de geoptimaliseerde liposoomformulering. (C) Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) beeld waarop meerdere sferische liposomale vesikels te zien zijn. (D) Representatief TEM-beeld met hoge vergroting van een individuele liposomale vesikel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6. In vitro afgifteprofielen van rifampicine uit liposomen. Cumulatieve afgifteprofielen van rifampicine uit liposomen die zijn geprepareerd met verschillende fosfolipide-cholesterolverhoudingen over de studieperiode. Het afgiftegedrag varieerde met het cholesterolgehalte, wat de invloed ervan op de afgiftekenmerken van het geneesmiddel aantoont. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7. Kinetische modellering van de rifampicine-afgifte uit liposomen. Afgiftegegevens voor de geoptimaliseerde formulering (20% cholesterol) gefit op (A) nulde-orde, (B) eerste-orde, (C) Higuchi en (D) Ritger-Peppas kinetische modellen. Het eerste-orde model vertoonde de hoogste goodness-of-fit (R2 = 0,987), wat wijst op de beste overeenstemming met de experimentele afgiftegegevens. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

LiposoomcomponentenLecithineCholesterolRifampicine
5%47.5 mg2.5 mg10 mg
10%45 mg5 mg10 mg
15%42.5 mg7.5 mg10 mg
20%40 mg10 mg10 mg
25%37.5 mg12.5 mg10 mg
30%35 mg15 mg10 mg
Eindvolume10 mL

Tabel 1: Samenstelling van rifampicine-geladen liposoomformuleringen. Lecithine, cholesterol en rifampicine werden gebruikt om liposomen te bereiden met verschillende fosfolipide-cholesterolverhoudingen, waarbij een eindvolume van 10 mL werd aangehouden.

Concentratie (µg/mL)`X±SRSD(%)
9.2114012.75 ± 502.420.44
13.8171412.50 ± 493.900.29
18.4232334.00 ± 1358.420.59

Tabel 2: HPLC-kwantificeringsprecisie bij verschillende rifampicine-concentraties. Piekmetingen werden verkregen voor rifampicine-standaardoplossingen bij concentraties van 9,2, 13,8 en 18,4 µg/mL. De resultaten worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD), waarbij de waarden voor de relatieve standaarddeviatie (RSD) een hoge analytische precisie aantonen.

Nr.1234RSD (%)
Piekoppervlak1145031141251139691145390.32

Tabel 3: Instrumentprecisie van de HPLC-methode. Precisie-evaluatie op basis van vier opeenvolgende injecties van dezelfde rifampicine-standaardoplossing. Piekareawaarden en de relatieve standaarddeviatie (RSD) worden gerapporteerd om de herhaalbaarheid van het instrument te beoordelen.

Tijd (h)024681224RSD (%)
Piekoppervlak1145031143251145161139781138941136381125760.59%

Tabel 4: Stabiliteit van de rifampicine-standaardoplossing. Stabiliteitsbeoordeling van een 9,2 µg/mL rifampicine-standaardoplossing bewaard bij kamertemperatuur en geanalyseerd na 0, 2, 4, 6, 8, 12 en 24 u. Piekareawaarden en de relatieve standaarddeviatie (RSD) worden gerapporteerd om de stabiliteit van de oplossing over de testperiode te evalueren.

CholesterolGrootte (nm)PDIZetapotentiaal (mV)EE (%)DL (%)
5%206.27±1.140.240±0.004-42.72±0.2664.09±1.3010.68±0.22
10%183.87±2.540.149±0.004-24.80±1.0464.70±0.3010.78±0.05
15%202.06±3.160.131±0.007-27.90±1.0465.11±1.6210.85±0.27
20%185.41±0.720.164±0.044-37.74±1.4468.54±2.1911.42±0.37
25%181.58±1.310.100±0.008-19.96±0.1649.38±2.528.23±0.42
30%178.78±0.820.074±0.014-40.25±0.3348.24±2.068.04±0.34 

Tabel 5: Fysisch-chemische kenmerken van rifampicine-geladen liposomen. Deeltjesgrootte, polydispersiteitsindex (PDI), zetapotentieel, inkapselingsrendement (EE) en geneesmiddellading (DL) van liposomen geprepareerd met verschillende cholesterolgehaltes. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD (n = 3).

1 dag4 dagen30 dagen 
Grootte (nm)183.87±2.54212.42±3.12273.57±4.38
PDI0.149±0.0040.106±0.0020.126±0.009
Zetapotentiaal (mV)-24.80±1.04-57.12±1.49-55.38±2.50

Tabel 6: Opslagstabiliteit van rifampicine-geladen liposomen bij 4 °C. Veranderingen in partikelgrootte, polydispersiteitsindex (PDI) en zetapotentiaal van rifampicine-geladen liposomen na opslag gedurende 1, 4 en 30 dagen bij 4 °C. De resultaten werden gebruikt om de fysieke stabiliteit van de liposomale formulering tijdens de opslag te evalueren.

Discussie

Rifampicine blijft een hoeksteen van de eerstelijns chemotherapie tegen tuberculose, maar de klinische bruikbaarheid ervan wordt ernstig beperkt door dosisafhankelijke hepatotoxiciteit, een slechte intracellulaire penetratie in macrofagen waarin Mycobacterium tuberculosis (MTB) zich bevindt, en het snelle ontstaan van geneesmiddelresistentie bij subtherapeutische blootstelling. Om aan deze onvervulde klinische behoeften tegemoet te komen, heeft deze studie een robuust dunne-film hydratatieprotocol opgezet en geoptimaliseerd, gekoppeld aan ultrasonificatie en filtratie, voor de vervaardiging van rifampicine-geladen liposomen. De geoptimaliseerde formulering vertoonde een uniforme nanopartikelgrootte, een intacte vesiculaire morfologie, een hoge inkapselingsefficiëntie van het geneesmiddel en een vertraagd in vitro afgifteprofiel, waarbij uitgebreide fysisch-chemische karakterisering is uitgevoerd via dynamische lichtverstrooiing (DLS), transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) en in vitro oplosbaarheidstesten.

Verschillende protocolstappen hebben een kritieke invloed op de kwaliteit en reproduceerbaarheid van de liposomen. Ten eerste is de verhouding fosfolipide-tot-cholesterol van essentieel belang. De optimale verhouding van 80:20 resulteert in een EE = 68,5% en DL = 11,4%; afwijkingen naar 75:25 of 70:30 veroorzaken een verlies van >30% EE. Nauwkeurig wegen met een analytische balans is verplicht. Ten tweede vereist hydratatie (sectie 1.6) rotatie bij 100 rpm, 37 °C gedurende 1 h op een rotatieverdamper zonder vacuüm. Statische incubatie of handmatig schudden leidt tot een slechte reproduceerbaarheid. Ten derde ultrasonicatie (sectie 1.7): 40 kHz, 100 W, 10 min bij 37 °C resulteert in een Z-gemiddelde van 185 nm en een PDI < 0,2. Kortere sonicatie (5 min) resulteert in >300 nm en een PDI > 0,3; langere sonicatie (20 min) brengt het risico op degradatie van het geneesmiddel met zich mee. Houd de temperatuur op 37 °C omdat rifampicine hittegevoelig is. Ten vierde, voor sequentiële filtratie (0,45 µm en daarna 0,22 µm), moeten de filters vooraf worden bevochtigd met PBS en moet er één rustige passage worden gebruikt. Het forceren door droge filters of het gebruik van een kleine spuit kan de vesikels doen scheuren. Ten vijfde, ultrafiltratie voor EE (secties 2.1–2.3): exact 200 µL, 4 cycli bij 7.000 × g, 25 °C, waarbij alle filtraten na elke cyclus worden opgevangen en samengevoegd. Onvolledige cycli leiden tot een overschatting van de EE. Ten zesde, TEM-negatiefkleuring (sectie 5.6): 2% fosfotungstinezuur, pH 7,0, onmiddellijk blotten. Vertraging of een onjuiste pH doet de vesikels inklappen. Het consequent volgen van deze zes stappen resulteert in liposomen die voldoen aan de acceptatiecriteria, zoals blijkt uit de lage standaarddeviaties over triplicaten.

Cholesterol is een kritisch structureel onderdeel van liposomale dubbellagen, met goed gedocumenteerde dubbele effecten op de membraanvloeibaarheid, mechanische stabiliteit en de retentie van lipofiele geneesmiddelen. In deze studie hebben we systematisch de impact van de molaire ratio cholesterol op de prestaties van de formulering geëvalueerd en stelden we vast dat de maximale inkapselingsefficiëntie van 68,5% werd bereikt bij een cholesterolgehalte van 20% (mass ratio). Er wordt verondersteld dat deze optimale ratio een balans vormt tussen het behoud van de geordende lamellaire structuur van de fosfolipiden-dubbellaag om lekkage van het geneesmiddel te minimaliseren en het handhaven van voldoende membraanvloeibaarheid om lipofiele rifampicine-moleculen in de hydrofobe kern van de dubbellaag te accommoderen. Omgekeerd leidde een cholesterolgehalte van meer dan 20% tot overmatige verstijving van de lipide-dubbellaag, verstoring van de regelmatige lamellaire rangschikking en daaropvolgende significante afnames van zowel de inkapselingsefficiëntie als de drug loading capacity. Deze bevindingen komen overeen met het gevestigde mechanistische begrip van de rol van cholesterol bij liposomale membraanengineering. Daarom zijn nauwkeurig afwegen van lipiden (met gebruik van een analytische balans met een nauwkeurigheid van 0,1 mg) en strikte naleving van de 20% cholesterol mass ratio verplicht voor het bereiken van een hoge drug loading.

De geoptimaliseerde rifampicine-geladen liposomen vertoonden een gemiddelde hydrodynamische diameter van 185 nm met een polydispersiteitsindex (PDI) van 0,164 ± 0,044, wat wijst op een zeer uniforme deeltjesgrootteverdeling. Deze nanometerschaal (< 200 nm) is niet alleen compatibel met het enhanced permeability and retention (EPR)-effect voor passieve targeting van ontstoken pulmonale tuberculose-laesies, maar is ook optimaal voor efficiënte fagocytose door alveolaire macrofagen — de primaire intracellulaire niche van MTB. Dit ontwerp van de deeltjesgrootte heeft het potentieel om de kernbeperking van vrije rifampicine aan te pakken, die er niet in slaagt om therapeutische concentraties binnen MTB-geïnfecteerde macrofagen te bereiken. Het zetapotentieel van −38 mV voor de geoptimaliseerde formulering zorgt voor een sterke elektrostatische afstoting tussen de deeltjes, waardoor aggregatie, fusie en sedimentatie van de vesicles tijdens kortstondige bewaring effectief worden voorkomen, wat een uitstekende colloïdale stabiliteit garandeert. Opvallend is dat de kerndeeltjesgrootte gemeten via TEM kleiner was dan de hydrodynamische diameter verkregen via DLS, een goed gedocumenteerd fenomeen bij de karakterisering van liposomen: DLS kwantificeert de diameter van de gehydrateerde vesicle, inclusief de omringende waterige hydratatielaag, terwijl TEM-beeldvorming de gedehydrateerde lipidkern vastlegt onder hoog vacuüm. Dit verschil is daarom een verwachte en fysisch-chemisch rationele bevinding, en geen inconsistentie in de karakterisering.

TEM-beeldvorming valideerde verder de morfologische kenmerken van de geoptimaliseerde liposomen, die grotendeels uniform, sferisch en intacte unilamellaire blaasjes bleken te zijn, met slechts geringe lokale aggregatie en geen duidelijke fusie of membraanruptuur. Deze bevindingen bevestigen dat het gecombineerde proces van ultrasonicatie en filtratie een nauwkeurige controle over de morfologie en lamellariteit van de blaasjes mogelijk maakt, terwijl de structurele integriteit van de liposomale dubbellaag behouden blijft. Structurele integriteit is een kritisch kwaliteitskenmerk voor liposomale formuleringen, aangezien dit direct correleert met de retentie van het geneesmiddel tijdens opslag, de stabiliteit van de in vivo circulatie en de prestaties van de doelgerichte aflevering. Daarnaast bevestigde het prominente Tyndall-effect dat werd waargenomen in de liposomensuspensie verder de colloïdale aard van de nanostructurele blaasjesdispersie.

In vitro drug-releaseonderzoeken toonden aan dat de geoptimaliseerde rifampicine-geladen liposomen geen significante burst-release vertoonden binnen de eerste 0,5 h, een cruciaal kenmerk dat het risico op acute systemische toxiciteit vermindert dat gepaard gaat met snelle piekplasmaconcentraties van vrije rifampicine. Kinetische modellering van de drug-release onthulde dat het releaseprofiel het best paste bij een kinetisch model van eerste orde, wat aangeeft dat de release van rifampicine uit de liposomale dubbellaag hoofdzakelijk werd bepaald door passieve diffusie in plaats van erosie van de lipidematrix. Dit door diffusie gecontroleerde patroon van vertraagde afgifte is zeer wenselijk voor antituberculosebehandelingen, omdat het een langdurige instandhouding van effectieve therapeutische drugconcentraties mogelijk maakt, waardoor het risico op subtherapeutische blootstelling die leidt tot het ontstaan van drugresistentie wordt verminderd. Een lichte afname in de cumulatieve drug-release werd waargenomen na 24 h, wat zeer waarschijnlijk toe te schrijven is aan de oxidatieve en hydrolytische degradatie van niet-ingekapselde rifampicine in het waterige releasemedium, een bevinding die consistent is met eerder gepubliceerde stabiliteitsgegevens voor rifampicine in waterige omgevingen38. Belangrijk is dat de liposomale dubbellaag een beschermende micro-omgeving biedt voor de ingekapselde drug, waardoor de blootstelling aan degradatieve condities wordt verminderd in vergelijking met vrije rifampicine.

De geoptimaliseerde liposomale formulering geladen met rifampicine die in deze studie is ontwikkeld, biedt meerdere duidelijke voordelen voor de anti-tuberculosebehandeling en pakt direct de belangrijkste beperkingen van conventionele rifampicine-chemotherapie aan. Ten eerste vormt de liposomale dubbellaag een beschermende barrière tegen voortijdige afbraak van het geneesmiddel in waterige en biologische omgevingen, waardoor de antimicrobiële activiteit van rifampicine behouden blijft. Ten tweede verlengt het vertraagde, diffusie-gecontroleerde afgifteprofiel de systemische circulatiehalfwaardetijd van het geneesmiddel, wat een lagere doseringsfrequentie en een verbeterde therapietrouw van de patiënt mogelijk maakt — een grote uitdaging bij langdurige tuberculose-chemotherapie. Ten derde vergemakkelijkt de geoptimaliseerde nanometerschaal-deeltjesgrootte zowel passieve targeting naar ontstoken tuberculeuze laesies via het EPR-effect als een efficiënte opname door MTB-geïnfecteerde alveolaire macrofagen, waardoor hoge intracellulaire geneesmiddelconcentraties worden bereikt die met vrije rifampicine niet haalbaar zijn39,40. Ten slotte is de formulering opgebouwd uit biocompatibele, natuurlijk afgeleide fosfolipiden en cholesterol, waardoor het risico op immunogeniteit of systemische toxiciteit geassocieerd met het afgiftevoertuig zelf wordt geminimaliseerd.

Opmerkelijk is dat deze studie verschillende beperkingen heeft die in toekomstig onderzoek moeten worden aangepakt. Hoewel de in vitro fysisch-chemische karakterisering en het vrijgaveprofiel een veelbelovende prestatie van de formulering aantonen, zijn verdere in vivo studies vereist om het farmacokinetische gedrag, de weefseldistributie, de antituberculose-effectiviteit en de systemische toxiciteit van de rifampicine-geladen liposomen in relevante diermodellen te evalueren. Daarnaast verdient de schaalbaarheid van het geoptimaliseerde preparatieprotocol voor productie op industriële schaal verdere validatie.

Concluderend heeft deze studie een eenvoudig, zeer reproduceerbaar en robuust protocol voor dunne-film hydratatie-ultrasonisatie-filtratie vastgesteld voor de fabricage van rifampicine-geladen liposomen. Systematische optimalisatie van de formulering identificeerde de kritieke rol van het cholesterolgehalte bij het bepalen van de inkapselingsefficiëntie en membraanstabiliteit, waarbij de geoptimaliseerde formulering ideale fysisch-chemische eigenschappen, een hoge inkapselingsefficiëntie van het geneesmiddel, een uitstekende colloïdale stabiliteit en een gecontroleerde, vertraagde in vitro afgifte van het geneesmiddel vertoonde. Dit gestandaardiseerde protocol biedt een betrouwbaar methodologisch kader voor de ontwikkeling en karakterisering van liposomale drug-delivery systemen voor antituberculosemiddelen en legt een solide basis voor daaropvolgende preklinische evaluatie van liposomale rifampicine voor de behandeling van zowel medicijngevoelige als medicijnresistente tuberculose.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Nr. 21977019).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
L-α-Fosfatidylcholine (soja)RHAWNR024502≥90% zuiverheid, 25 g/fles, CAS: 97281-47-5
1× PBS-bufferSolarbioP1038500 mL, 0,01 mol/L, pH 6,5
1× PBS-buffer, pH 7,4ThermoFisher Scientific (Gibco)C10010500BT-1500 mL, pH 7,4
ChloroformGuangzhou BrandGD10-AR-2.5LAR-kwaliteit, 500 mL/fles, CAS: 67-66-3
CholesterolAladdinC104028-5g AR-kwaliteit, ≥95% (HPLC), 5 g/fles, CAS 57-88-5
Dialysemembranen (MD25, 7000 Da)SolarbioYA1081-5m7000 Da MWCO, 5 m lengte, niet-metallisch materiaal
Hoge-prestatie vloeistofchromatografie (HPLC)-systeem, LC-20AShimadzu Corporation, JapanLC-20AHet systeem is uitgerust met een SPD-20A UV-detector, een CBM-20A quaternaire pomp, een LC-20AT online ontgasser, een SIL-20A autosampler, een CTO-20A kolomoven en LC-solution workstation-software. Het werd gebruikt voor de kwantitatieve bepaling van rifampicine.
Snelcentrifuge voor op het laboratoriumtafelShanghai Anting Scientific Instrument FactoryTGL-16BGebruikt voor het centrifugeren van monsters
L-ascorbinezuurMacklinA80029699,99% zuiverheid, 100 g/fles, CAS: 50-81-7
Omni deeltjesgrootte- en zetapotentiaalanalyserBrookhaven Instruments Corporation, USA173PIGebruikt voor de bepaling van de deeltjesgrootte, de polydispersiteitsindex (PDI) en het zetapotentiaal van liposomen
RifampicineMacklinR81723797% zuiverheid, 250 mg/flesje, CAS: 13292-46-1
Transmissie-elektronenmicroscoop (TEM)Hitachi, Ltd., JapanHT7700Gebruikt voor morfologische observatie van liposomen
Tween 80EnergiechemieE0807391000-A01AR-kwaliteit, 100 mL/fles, CAS: 9005-65-6
Centrifugale ultrafiltratie-filtreenheden (0,5 ml, 3 kDa)Merck MilliporeUFC5003963 kDa MWCO, 0,5 mL volume, kunststof materiaal

Referenties

  1. World Health Organization. Global tuberculosis report 2025. Geneva: World Health Organization; 2025.
  2. Wei X, Yue L, Zhao B, Jiang N, Lei H, Zhai X. Recent advances and challenges of revolutionizing drug-resistant tuberculosis treatment. Eur J Med Chem. 2024;277:116785.
  3. World Health Organization. Consolidated guidelines on tuberculosis: module 4: treatment and care. Geneva: World Health Organization; 2022.
  4. Singh V. Tuberculosis treatment-shortening. Drug Discov Today. 2024;29(5):103955.
  5. Li SY, et al. Next-generation diarylquinolines improve sterilizing activity of regimens with pretomanid and the novel oxazolidinone TBI-223 in a mouse tuberculosis model. Antimicrob Agents Chemother. 2023;67(4).
  6. Timm J, et al. Baseline and acquired resistance to bedaquiline, linezolid and pretomanid, and impact on treatment outcomes in four tuberculosis clinical trials containing pretomanid. PLOS Glob Public Health. 2023;3(10).
  7. Chesov E, et al. Emergence of bedaquiline resistance in a high tuberculosis burden country. Eur Respir J. 2022;59(3):2100621.
  8. Dhillon J, Mitchison DA. Activity and penetration of antituberculosis drugs in mouse peritoneal macrophages infected with Mycobacterium microti OV254. Antimicrob Agents Chemother. 1989;33(8):1255-9.
  9. Ge Z, Wang Z, Wei M. Measurement of the concentration of three antituberculosis drugs in the focus of spinal tuberculosis. Eur Spine J. 2008;17(11):1482-7.
  10. Parbhoo T, Schurz H, Mouton JM, Sampson SL. Persistence of Mycobacterium tuberculosis in response to infection burden and host-induced stressors. Front Cell Infect Microbiol. 2022;12:981827.
  11. Sarathy JP, et al. Prediction of drug penetration in tuberculosis lesions. ACS Infect Dis. 2016;2(8):552-63.
  12. Fountain FF, Tolley EA, Jacobs AR, Self TH. Rifampin hepatotoxicity associated with treatment of latent tuberculosis infection. Am J Med Sci. 2009;337(5):317-20.
  13. Chen X, et al. Acquired resistance during short-course treatment for rifampicin-resistant tuberculosis. Clin Microbiol Infect. 2026;32(2):315-22.
  14. Singh V, Chibale K. Strategies to combat multi-drug resistance in tuberculosis. Acc Chem Res. 2021;54(10):2361-76.
  15. Pinto-Alphandary H, Andremont A, Couvreur P. Targeted delivery of antibiotics using liposomes and nanoparticles: research and applications. Int J Antimicrob Agents. 2000;13:155-68.
  16. Drulis-Kawa Z, Dorotkiewicz-Jach A. Liposomes as delivery systems for antibiotics. Int J Pharm. 2010;387(1-2):187-98.
  17. Singh SR, et al. Advancing tuberculosis chemotherapy: targeted nanomedicines for the mycobacterium TB granuloma. Small. 2025;21(49).
  18. Ferreira M, et al. Liposomes as antibiotic delivery systems: a promising nanotechnological strategy against antimicrobial resistance. Molecules. 2021;26(7):2047.
  19. Zweijpfenning SMH, et al. Safety and outcomes of amikacin liposome inhalation suspension for Mycobacterium abscessus pulmonary disease: a NTM-NET study. Chest. 2022;162(1):76-81.
  20. Allen TM, Cullis PR. Liposomal drug delivery systems: from concept to clinical applications. Adv Drug Deliv Rev. 2013;65(1):36-48.
  21. Truzzi E, et al. Drugs/lamellae interface influences the inner structure of double-loaded liposomes for inhaled anti-TB therapy: an in-depth small-angle neutron scattering investigation. J Colloid Interface Sci. 2019;541:399-406.
  22. U.S. Food and Drug Administration. ARIKAYCE (amikacin liposome inhalation suspension) [prescribing information]. Silver Spring (MD): U.S. Food and Drug Administration; 2018.
  23. Yıldırım M, Düzgüneş N. Liposome-encapsulated antibiotics for the therapy of mycobacterial infections. Antibiotics (Basel). 2025;14(7):728.
  24. Yun Y, et al. Recent advances in functional lipid-based nanomedicines as drug carriers for organ-specific delivery. Nanoscale. 2025;17(13):7617-38.
  25. Farooque F, Mughees MM, Wasi M. Liposomes as drug delivery system: an updated review. J Drug Deliv Ther. 2021;11(5 Suppl):149-58.
  26. Wang Z, Liu L, Yin W, Liu Z, Shi L, Tang M. A novel drug delivery system: the encapsulation of naringenin in metal-organic frameworks into liposomes. AAPS PharmSciTech. 2021;22(2):61.
  27. Niu NK, et al. Preparation and characterization of HRZ triple anti-tuberculosis drugs/TGF-β1 siRNA nanoliposomes. Orthop J China. 2018;26(23):2177-82.
  28. Wang Y, et al. Formulation and pharmacokinetic evaluation of a paclitaxel nanosuspension for intravenous delivery. Int J Nanomedicine. 2011;6:1497-507.
  29. Mishra M, et al. Mycobacterial lipid-derived immunomodulatory drug-liposome conjugate eradicates endosome-localized mycobacteria. J Control Release. 2023;360:578-90.
  30. Yoshizawa Y, Kono Y, Ogawara KI, Kimura T, Higaki K. PEG liposomalization of paclitaxel improved its in vivo disposition and anti-tumor efficacy. Int J Pharm. 2011;412(1-2):132-41.
  31. Guo LN, et al. Liposome and exosome pre-treatment for transmission electron microscopy and morphological observation. Acta Sci Nat Univ Sunyatseni. 2025;64(4):62-68.
  32. Crommelin DJA, van Bommel EMG. Stability of liposomes on storage: freeze dried, frozen or as an aqueous dispersion. Pharm Res. 1984;1(4):159-63.
  33. Wang F, et al. Nanoliposome-encapsulated brinzolamide-hydropropyl-β-cyclodextrin inclusion complex: a potential therapeutic ocular drug-delivery system. Front Pharmacol. 2018;9:91.
  34. Ubhe AS. Imaging of liposomes by negative-stain transmission electron microscopy and cryo-transmission electron microscopy. Methods Mol Biol. 2023;2633:245-51.
  35. Filippov SK, et al. Dynamic light scattering and transmission electron microscopy in drug delivery: a roadmap for correct characterization of nanoparticles and interpretation of results. Mater Horiz. 2023;10:2023-42.
  36. Wallenwein CM, et al. How wound environments trigger the release from rifampicin-loaded liposomes. Int J Pharm. 2023;633:122606.
  37. Forte J, et al. Mucoadhesive rifampicin-liposomes for the treatment of pulmonary infection by Mycobacterium abscessus: chitosan or ε-poly-L-lysine decoration. Biomolecules. 2023;13(6):924.
  38. Sorokoumova GM, et al. Bacteriostatic activity and decomposition products of rifampicin in aqueous solution and liposomal composition. Pharm Chem J. 2008;42:475-8.
  39. Fenaroli F, et al. Enhanced permeability and retention-like extravasation of nanoparticles from the vasculature into tuberculosis granulomas in zebrafish and mouse models. ACS Nano. 2018;12(8):8646-61.
  40. Hamed A, Osman R, Al-Jamal KT, Holayel SM, Geneidi AS. Enhanced antitubercular activity, alveolar deposition and macrophage uptake of mannosylated stable nanoliposomes. J Drug Deliv Sci Technol. 2019;51:513-23.

Herprints en machtigingen

Tags

Rifampicine-liposomenantituberculosebehandelingliposomale geneesmiddelentoedieningdunne-filmhydratatieinkapselingsefficiëntiehogedrukvloeistofchromatografiedynamische lichtverstrooiingtransmissie-elektronenmicroscopiein vitro geneesmiddelafgifte
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.