Een split-luciferase-complementatietest voor temporeel opgeloste meting van tau-clearance in microglia

Samenvatting

We beschrijven een gevoelig, tijdsopgelost kwantitatief platform om de clearance van extracellulaire tau te meten in humane geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC)-afgeleide microglia met behulp van een op microplaat gebaseerd luminescentiesysteem. Deze benadering maakt een gevoelige detectie van tau-degradatiekinetiek in een microwell-formaat mogelijk, waardoor een high-throughput ondervraging van tau-behandeling onder diverse experimentele omstandigheden mogelijk is.

Samenvatting

Als de aanwezige immuuncellen van het centrale zenuwstelsel zijn microglia centrale regulatoren van de hersenhomeostase en belangrijke mediatoren van neurodegeneratieve ziekten. Deze cellen onderzoeken continu de neurale omgeving en spelen een cruciale rol bij het herkennen, internaliseren en afbreken van extracellulaire substraten, waaronder verkeerd gevouwen en geaggregeerde eiwitten zoals pathologische tau. Ondanks groeiend bewijs dat microglia betrokken is bij tau-clearance, missen bestaande methoden om tau-opname en -degradatie te meten de temporele resolutie en gevoeligheid die nodig zijn om deze dynamische processen volledig vast te leggen. Hier ontwikkelden we een luminescentie-gebaseerde assay om de tau-clearance kwantitatief te monitoren in door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC)-afgeleide microglia. Dit platform maakt gebruik van een op split-luciferase gebaseerd complementatiesysteem om zeer gevoelige, realtime detectie van tau in levende cellen mogelijk te maken, waardoor de intracellulaire verwerking nauwkeurig kan worden gevolgd. Deze test is schaalbaar en aanpasbaar over meerdere celtypen, en biedt een veelzijdig hulpmiddel om endolysosomale routes en cellulaire mechanismen die tau-omgang beheersen bij neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer, te onderzoeken.

Inleiding

Tauopathien, waaronder de ziekte van Alzheimer (AD), worden gekenmerkt door de aggregatie en verspreiding van microtubuli-geassocieerd eiwit tau over neurale circuits ^1,2. Glia worden steeds meer gewaardeerd als regulatoren van de dynamiek van tau-ziekten, waaronder opname, degradatie en verspreiding 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Het begrijpen hoe glia bijdragen aan tauopathieën is een dringende zorg om belangrijke ziektedynamieken op te lossen, waaronder neuro-inflammatie en verspreiding van tau. Onder gliale populaties zijn microglia - de residente fagocyten van de hersenen - uniek gepositioneerd om tau-clearance te bemiddelen.

Ondanks de dringende noodzaak om mechanismen van tau-behandeling in microglia te verduidelijken, blijft het veld beperkt in de resolutie en doorvoer van beschikbare assays. Belangrijke vragen over tau-internalisatie, intracellulaire handel en cellulaire clearance blijven onopgelost. Elk van deze stappen vertegenwoordigt een mechanistisch onderscheiden proces: opname verwijst naar de internalisatie van extracellulaire tau bij het plasmamembraan; Handel omvat het sorteren en transporteren van geïnternaliseerde tau via endosomale, lysosomale en andere intracellulaire compartimenten; en degradatie duidt op de proteolytische afbraak van tau, voornamelijk via lysosomale en proteasomale banen. Hoewel deze stappen sequentieel zijn voor extracellulaire tau-verwerking, omdat geïnternaliseerde tau intracellulaire compartimenten moeten passeren voordat ze degradatieve machines bereiken, worden ze onafhankelijk gereguleerd en kan een bepaalde experimentele verstoring één stap beïnvloeden zonder andere te veranderen. Een vermindering van het intracellulaire tau-signaal kan bijvoorbeeld leiden tot een verminderde opname, verkeerd wegleiden van degradatieve compartimenten of een verhoogde degradatie. Het oplossen van deze processen vereist nieuwe assayplatforms die eiwitaanwezigheid kunnen detecteren en gekoppeld kunnen worden aan bestaande metingen om het lot van eiwitten in de loop van de tijd te bepalen.

Huidige methoden om tau-internalisatie en -degradatie op te lossen, vertrouwen op immunocytochemie, flowcytometrie, western blotting en fluorescentielabeling-benaderingen om opname, subcellulaire lokalisatie en intracellulaire verwerking van tau-soorten ^te kwantificeren.. Echter, elk van deze benaderingen kent fundamentele beperkingen wanneer ze worden toegepast op de studie van eiwitverwijderingsdynamiek. Immunocytochemie en western blotting missen de gevoeligheid om tau-soorten met lage abundantie te detecteren en zijn arbeidsintensief. Flowcytometrie en fluorescentie-gebaseerde assays rapporteren niet getrouw over eiwitverwijdering omdat fluoroforen kunnen blijven bestaan nadat het geconjugeerde eiwit^{is afgebroken 19}, waardoor het fluorescerende signaal wordt losgekoppeld van het daadwerkelijke lot van het eiwit van belang. Samen zorgen deze beperkingen voor een kritieke kloof zonder dat er een bestaande methode is die tegelijkertijd de gevoeligheid, temporele resolutie en schaalbaarheid biedt die nodig zijn om de dynamiek van tau-clearance kwantitatief te volgen. Daarom is een grote hindernis voor vooruitgang in het begrijpen van tau-hanteringsdynamiek in microglia het gebrek aan kwantitatieve, tijdsgebonden, hoogdoorvoer-assays om tau-clearance in levende cellen te meten.

Om het ontbreken van een kwantitatief platform om live tau-dynamiek te monitoren aan te pakken, hebben we een op gevoelige luminescentie gebaseerde assay ontwikkeld die kan worden gebruikt om intracellulaire tau-eiwitdynamica te detecteren. Deze benadering maakt gebruik van een split-luciferase-gebaseerd complementatiesysteem, waarbij een kleine peptidetag (High Affinity Binary Technology of HiBiT) aan tau wordt samengevoegd, waardoor kinetische metingen in levende cellen mogelijk zijn. Bij interactie met zijn complementaire bindingspartner (Large Binary Technology of LgBiT) reconstrueert het getagde eiwit een actief luciferase-enzym, wat een kwantitatief bioluminescent signaal 20,21,22 genereert. Dit luminescente signaal levert een directe, gevoelige uitlezing van de eiwitabundantie, waardoor veranderingen in intracellulaire niveaus in de loop van de tijd dynamisch gevolgd kunnen worden. Als gevolg hiervan kan luminescentie worden gebruikt als een robuuste rapportage van eiwitaanwezigheid of -verlies, zoals bij intracellulaire afbraak. Samen maakt dit platform een nauwkeurige, tijdelijk afgesloten meting van tau-hantering mogelijk en biedt het een breed toepasbare strategie voor het bestuderen van de eiwitvernieuwing.

Protocol

Alle cellulaire experimenten werden uitgevoerd in een geschikt Biosafety Level 2-laboratorium, goedgekeurd door de Environmental and Health Services van de University of Massachusetts Amherst.

1. Expressie, zuivering en endotoxineverwijdering van Tau-SLP eiwit

1. Voeg het split-luciferase-peptide of SLP-tag (VSGWRLFKKIS) toe aan een Tau-construct om een getagd construct (Tau-SLP) te creëren met standaard kloonmethoden, zoals Gibson-assembly²³.
   OPMERKING: De complementatie van de split-luciferase peptidetag genereert een robuust signaal wanneer deze wordt geplaatst bij de C-terminal, N-terminal of in de interne domeinen van 2N4R Tau²⁴.
2. Druk Tau-SLP uit en zuiver met de eerder beschreven methoden ^25,26 en zorg voor zuiverheid met SDS-PAGE en immunoblotting.
3. Voor gebruik met microgliale cellen moet je gepubliceerde protocollen volgen om bacteriële endotoxine na Tau-SLP-zuivering te verwijderen om confounding reactiviteit^{te beperken 27}.
4. Kwantificeer de Tau-SLP eiwitconcentratie met een standaard bicinchonininezuurassay (BCA) of Bradford assay^28,29.
5. Indien gewenst, aggregeer Tau-SLP volgens eerder beschreven protocollen²⁴.
6. Valideer de functionele luminescentie van Tau-SLP door een standaardcurve te genereren met een commercieel verkrijgbaar luciferasesubstraat en complementatiereagens, volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel).

2. iPSC-afgeleide microglia (iTF-Microglia) cultuur

1. Kweek microgliale cellen in 5%_CO2 bij 37 °C in het juiste kweekmedium.
2. Differentieer een geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) lijn met zes doxycycline-induceerbare transcriptiefactoren om een microgliaal-achtige cel te produceren (geïnduceerde transcriptiefactor microglia-achtige of iTF-Microglia) met behulp van een gevalideerd protocol³⁰ (zie Materiaaltabel).
   OPMERKING: Deze test is niet beperkt tot iTF-Microglia en kan worden gebruikt met elke hechtende cellijn. Optimalisatie voor vrijingstijden kan nodig zijn bij het werken met andere cellijnen.

3. Tau Clearance Assay

1. In een 24-put plaat, plaatcellen met een dichtheid van 1 x 10^{5 cellen} per put, in drievoud per conditie, met kweekmedium (250 μL) en 's nachts incuberen bij 37 °C en 5% CO₍Figuur 1A).
2. Verwijder kweekmedium, was cellen één keer met PBS (250 μL) en vervang door 250 μL kweekmedium.
3. Om de Tau-SLP-clearance tijdelijk te meten, wordt de cellen in een gespreide manier blootgesteld aan Tau-SLP, zodat alle putten gelijktijdig worden geoogst en alleen in clearancetijd verschillen. Bijvoorbeeld, voor 0 h, 2 h en 4 h clearancegroepen, voeg 100 nM Tau-SLP-bevattend medium eerst toe aan de 4 h-groep, daarna 1 uur later aan de 2 h-groep, en tenslotte 1 uur later aan de 0 h-groep (zie Figuur 1B voor timingaanbevelingen). Zodra de definitieve internalisatieperiode is voltooid, hebben alle putten dezelfde Tau-SLP blootstellingsperiode ondergaan, maar verschillen alleen in de vrijmaakduur (Figuur 1B).
4. Neem putten mee die geen Tau-SLP-behandeling krijgen voor achtergrondaftrekking (Figuur 1C).
5. Aan het einde van de internalisatieperiode verwijder je het medium dat Tau-SLP bevat. Was de cellen drie keer met PBS om extracellulaire Tau-SLP te verwijderen en vervang ze met Tau-SLP-vrij kweekmedium.
6. Incubeer de cellen voor de aangewezen vrijheidsperiode (Figuur 1A). De 0 h clearancegroep, direct na de internalisatieperiode, vertegenwoordigt de totale hoeveelheid geïnternaliseerde Tau-SLP aan het begin van de clearancefase.
7. Na alle vrijmaaktijden verwijder je het medium uit putten en was je het met 250μL PBS.
8. Behandel elke bron met 250 μL trypsine-EDTA 0,25% gedurende 5 minuten bij 37 °C. Deze stap verwijdert oppervlaktegebonden tau om te zorgen dat luminescentie geïnternaliseerde Tau-SLP reflecteert. Neutraliseer elke put met een 250 μL trypsinsemmer (5 mg/mL).
9. Verzamel elke put in een correct gelabelde 1,5 mL microcentrifugebuis en pellet via centrifugatie (500 x g, 5 min).
10. Bereid een geschikte hoeveelheid lysisbuffer voor die luciferase-substraat- en complementatiecomponenten bevat (zie Materiaaltabel; 50 μL x # van putten + 10%).
11. Verwijder elk supernatant met een aspirerende pipet en suspendeer de celpellet opnieuw in 50 μL lysisbuffer met luciferase-substraat en complementatiecomponenten. Dit zal een split-luciferase-complementatiecomplex produceren en luminescentie genereren (Figuur 1D).
12. Breng gelyseerde cellen over naar een witte half-volume 96-well plaat.
13. Meet de luminescentie op een microplaatmeter met orbitale schuddingen gedurende 10 seconden bij kamertemperatuur (~23 °C) voordat het afleest om volledige lysis van celpellets te waarborgen.
14. Bepaal de genormaliseerde Tau-SLP-abundantie door eerst de gemiddelde luminescentiewaarde van putten die niet aan Tau-SLP zijn blootgesteld, af te trekken. Normaliseer elke waarde naar het gemiddelde achtergrond-afgetrokken signaal van de 0 h clearancegroep.
15. Plot normaliseerde de Tau-SLP abundantie als functie van de clearancetijd. Een geleidelijke afname van luminescentie duidt op een afname van de intracellulaire Tau-SLP-abundantie en wordt geïnterpreteerd als Tau-SLP-clearance, terwijl stabiele luminescentiewaarden wijzen op een verminderde of vertraagde clearance. Bereken procentuele vrijgave als: % vrijstelling = [1 − (RLUt / RLUt = 0)] x 100.

Resultaten

Met behulp van deze op gevoelige luminescentie gebaseerde assay kon de intracellulaire Tau-SLP-abundantie over tijd worden gemonitord na een gesynchroniseerde opnameperiode in humane iPSC-afgeleide microglia. Na de uitspoeling van Tau-SLP nam de luminescentie gestaag af, wat overeenkomt met intracellulaire Tau-SLP clearance. Dit platform was voldoende gevoelig om verschillen te detecteren in de behandeling van monomere en fibrillaire Tau-SLP-soorten door microglia. Monomere Tau-SLP werd volledig verwijderd in iTF-Microglia binnen 60 minuten, terwijl fibrillaire Tau-SLP langer dan 240 minuten bleef bestaan (Figuur 2A). Daarnaast hebben we de test uitgevoerd met mutant tau (bijv. N279K) om de clearance-kinetiek te beoordelen en hebben we vastgesteld dat TauN279K-SLP significant verminderde clearance-kinetica vertoont bij slechts korte clearance-momenten (15 min) (Figuur 2B). Deze resultaten suggereren dat de waargenomen degradatie mogelijk alleen zichtbaar is door de hoge gevoeligheid van deze assay. We hebben het Tau-SLP-afbraakexperiment uitgevoerd met het kleine molecuul L-Leucyl-L-Leucine methylester (LLOMe) om de lysosomale betrokkenheid te bevestigen. LLOMe is een cathepsine C-substraat dat lysosomale membranen permeabiliseert en de lysosomale activiteit^{verstoort 31}. Bij LLOMe-behandeling hebben we significant verhoogde steady state-niveaus van Tau-SLP bij t=0 waargenomen (Figuur 3A) en een significant verminderde degradatiesnelheid (Figuur 3B) met een 4-voudige toename van Tau-SLP die overblijft na een clearancetijd van 60 minuten. Tot slot hebben we de Tau-SLP clearance assay uitgevoerd in iPSC-afgeleide neuronen om assaycompatibiliteit tussen celtypen te bevestigen. Hier hebben we gevonden dat iPSC-afgeleide neuronen een verminderde clearancekinetiek hebben voor zowel monomere (Figuur 4A) als fibrille vormen (Figuur 4B) van Tau-SLP. Het meest opvallend is dat de Tau-SLP fibrillenniveaus stabiel blijven op ~100% over een clearance van 240 minuten, terwijl in dezelfde periode de Tau-SLP fibrillenniveaus onder de 50% zijn gedaald in iTF-Microglia. Deze resultaten tonen aan dat ons op split-luciferase-gebaseerde complementatieplatform een robuuste en betrouwbare detectie biedt van intracellulaire endolysosomale clearance van Tau-SLP en een zeer aanpasbaar assay-ontwerp toont dat op tal van andere eiwitten of celtypen kan worden toegepast.

Figuur 1: Representatief experimenteel ontwerp van Tau-SLP clearance assay. (A) Representatief brightfieldbeeld van iTF-Microglia dat voor deze assay wordt gebruikt (schaalbalk = 100μm) (B) Menselijke microglia (iTF-Microglia) worden op een gefaseerde manier blootgesteld aan recombinant 2N4R-SLP, wat robuuste luminescentie-gebaseerde detectie mogelijk maakt. Na een incubatie van 1 uur wordt extracellulaire tau verwijderd door middel van media-uitwisseling en worden cellen gewassen met PBS. Cellen worden in basale media bewaard tijdens hun respectievelijke clearanceperiode (0 uur, 2 uur, 4 uur) vóór de oogst. Aan het eindpunt worden cellen gelyseerd en wordt luminescentie gemeten. (C) Voorgesteld plaatontwerp voor het meten van Tau-SLP-speling door monomeer en fibrillair afbraak te vergelijken. (D) Het Tau-SLP-eiwit wordt geïnternaliseerd in cellen en geleid voor lysosomale afbraak. Toevoeging van LgBiT levert een kwantitatieve weergave op van de hoeveelheid Tau-SLP die in de cel achterblijft door complementatie en productie van luminescentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: iTF-Microglia cleare extracellulaire Tau-SLP. (A) iTF-Microglia werden blootgesteld aan monomere Tau-SLP (100nM) of fibrillaire Tau-SLP (50nM), monsters werden genormaliseerd naar respectievelijke initiële opname (t = 0; 100%) en naar cellen die niet aan Tau-SLP waren blootgesteld (0%) (gemiddelde ± SD; n = 9 uit drie onafhankelijke differentiaties). (B) iTF-Microglia werden geïncubeerd met het monomere Tau-SLP of TauN279K-SLP (100nM), en monsters werden genormaliseerd naar respectievelijke initiële opname (t = 0; 100%) en cellen die niet waren blootgesteld aan Tau-SLP (0%) (gemiddelde ± SD; n ≥ 7 uit drie onafhankelijke differentiaties; ∗ p < 0,05 met behulp van de ongepaarde Welch's t-test). Gegevens herdrukt van Shultz et al., 2025²⁴, en gebruikt onder een Creative Commons Attribution (CC BY 4.0) licentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Lysosomale remming belemmert de uitruiming van Tau-SLP. (A) Behandeling met 1mM lysosomale remmer L-Leucyl-L-Leucine methylester (LLOMe) gedurende 24 uur verhoogde de initiële Tau-SLP-opname (t = 0) in H4-neurogliomcellen (gemiddelde ± SD; n = 9 onafhankelijke culturen; ∗ p < 0,05 met behulp van ongepaarde Welch's t-test). (B) Behandeling met LLOMe (1 mM) gedurende 24 uur verhoogde het percentage genormaliseerde Tau-SLP RLU na een clearancetijd van 60 minuten (t = 60 minuten) vergeleken met het voertuig (DMSO). Het luminescente signaal wordt genormaliseerd naar respectievelijke initiële opnameniveaus (100%) en cellen die niet aan Tau-SLP zijn blootgesteld (0%) (gemiddelde ± SD; n = 9 onafhankelijke culturen; ∗∗∗∗ p < 0,0001, ∗ p < 0,05 met behulp van ongepaarde Welch's t-test). Gegevens herdrukt van Shultz et al., 2025²⁴, en gebruikt onder een Creative Commons Attribution (CC BY 4.0) licentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: iTF-Microglia en iNeuronen tonen verschillen in Tau-SLP clearance. (A) iTF-Microglia of iNeuronen werden geïncubeerd met monomere Tau-SLP (100nM), monsters werden genormaliseerd naar respectievelijke initiële opname (t=0; 100%) en cellen die niet aan Tau-SLP waren blootgesteld (0%) (gemiddelde±SD; n ≥ 6 uit twee-drie onafhankelijke differentiaties; ∗∗ p < 0,01, ∗∗∗∗ p < 0,0001 met behulp van een tweerichtings-ANOVA; tijd: F(1, 28) = 7,489, p = 0,0107; celtype: F(1, 28) = 46,61, p < 0,0001; interactie: F(1, 28) = 3,229, p = 0,0831; Sidaks meervoudige vergelijkingstest, p-waarden aangeduid op de figuur, t=0 waarden worden als referentie getoond maar zijn uitgesloten van de statistische analyse). (B) iTF-microglia of iNeuronen werden geïncubeerd met fibrillaire Tau-SLP (50nM), monsters werden genormaliseerd naar respectievelijke initiële opname (t=0; 100%) en cellen die niet aan Tau-SLP waren blootgesteld (0%) (gemiddelde±SD; n ≥ 6 van twee tot drie onafhankelijke differentiaties; ∗∗ p < 0,01, ∗∗∗∗ p < 0,0001 met behulp van een tweerichtings-ANOVA; tijd: F(1, 26) = 0,3888, p = 0,5384; celtype: F(1, 26) = 43,09, p < 0,0001; interactie: F(1, 26) = 1,209, p = 0,2816; Sidaks meervoudige vergelijkingstest, p-waarden aangeduid op de figuur, t=0 waarden worden als referentie getoond maar zijn uitgesloten van de statistische analyse). Gegevens herdrukt van Shultz et al., 2025²⁴, en gebruikt onder een Creative Commons Attribution (CC BY 4.0) licentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Deze assay biedt een schaalbaar en kwantitatief platform om de extracellulaire Tau-SLP-clearance door microglia te meten met hoge gevoeligheid en temporele resolutie. In tegenstelling tot traditionele beeldvormingsbenaderingen, die vaak arbeidsintensieve monsterverwerking vereisen en beperkt zijn in doorvoer en temporele bemonstering, maakt dit luminescentie-gebaseerde systeem directe, populatieniveau kwantificering van tau-behandeling in een microplaatformaat mogelijk. De resulterende meting geeft een kwantitatieve meting van de Tau-SLP-clearance na blootstelling aan extracellulaire tau. Omdat metingen herhaaldelijk over meerdere tijdspunten en met langere incubatieperiodes kunnen worden verkregen, maakt de assay een hoge-doorvoer, kinetisch opgeloste analyse van tau-opname en -clearance-dynamiek mogelijk. Daarnaast zijn veranderingen in luminescentie in de loop van de tijd consistent met veranderingen in de intracellulaire Tau-SLP-abundantie, maar maken ze geen onderscheid tussen trafficking, degradatie of secretie zonder complementaire benaderingen. Hoewel Tau-SLP-tagging de opname of aggregatie van tau in onze companion-studie²⁴ niet significant veranderde, kunnen exogene tags het gedrag van andere eiwitten beïnvloeden. Daarom moeten assaybevindingen worden aangevuld met orthogonale benaderingen en, waar mogelijk, worden vergeleken met ongetagde tau-preparaten. Een extra beperking is dat deze test gebruikmaakt van recombinante Tau-SLP-soorten in plaats van endogene tau- of patiëntafgeleide pathologische tau-aggregaten. Hoewel recombinant 2N4R tau een reproduceerbaar experimenteel substraat biedt, reproduceert het niet volledig de endogene heterogeniteit (d.w.z. post-translationele modificaties) van tau-soorten die uit menselijke patiëntenhersenen zijn geïsoleerd. Er bestaan veel protocollen voor in vitro fosforylering van recombinant tau-eiwit en kunnen eenvoudig in deze workflow worden opgenomen. Dit platform zou ook kunnen worden aangepast om endogene tau te bestuderen; dit zou genetische engineering vereisen om een SLP-tagsequentie op de tau (MAPT) locus te integreren.

Belangrijk is dat de interpretatie van signaalreductie als degradatie afhankelijk is van de effectieve verwijdering van extracellulaire en oppervlaktegebonden tau, bijvoorbeeld via trypsinisatie of equivalente strippingstappen. Vals-negatieve resultaten kunnen optreden als er geen effectieve verwijdering wordt bereikt. Schijnbaar signaalverlies dat als een vals-positief tau-degradatie wordt geïnterpreteerd, is ook mogelijk. Dit kan ontstaan door celloskoppeling of -dood, secretie van Tau-SLP, of proteolytische splitsing die SLP van tau scheidt zonder het eiwit af te breken. Daarom moeten afnames in luminescentie worden geïnterpreteerd als verminderingen in de intracellulaire Tau-SLP-abundantie in plaats van directe metingen van lysosomale afbraak. Om signaalveranderingen definitiever toe te schrijven aan lysosomale degradatie, worden orthogonale validatiestrategieën aanbevolen. Deze kunnen farmacologische verstoring van de lysosomale functie omvatten, zoals behandeling met bafilomycine A1 of LLOMe (Figuur 3), evenals pulse-chase experimentele ontwerpen om opname- versus degradatiekinetiek te onderscheiden.

De flexibiliteit van deze assay maakt het zeer geschikt voor het onderzoeken van mechanismen die tau-opname, intracellulaire handel en degradatie regelen, evenals voor het screenen van farmacologische of genetische modulatoren van tau-clearance in menselijke cellulaire systemen. Hoewel hier aangetoond in iPSC-afgeleide microglia, is het platform gemakkelijk aan te passen aan andere celtypen (Figuur 4), waardoor brede toepassing mogelijk is in modellen van tau-biologie en neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer en andere primaire en secundaire tauopathieën. Omdat deze test afhankelijk is van de extracellulaire blootstelling van Tau-SLP en luminescentie-gebaseerde detectie, zou hij gemakkelijk aanpasbaar moeten zijn aan astrocyten, oligodendrocyten of veelgebruikte cellijnen, hoewel optimalisatie van opnamecondities noodzakelijk kan zijn. Gezamenlijk biedt deze benadering een krachtig hulpmiddel om cellulaire routes die betrokken zijn bij proteostase te ontleden en het mechanistisch begrip van neurodegeneratieve ziekteprocessen te bevorderen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Accutase	Thermo Scientific	A1110501
Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-268
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free	Corning	356231
DMEM/F-12, HEPES	Thermo Scientific	11330057
Doxycycline	Clontech	631311
DPBS	Thermo Scientific	14-190-250
GlutaMAX	Thermo Scientific	35050061
Graphing Software	GraphPad Prism (of soortgelijk)	n/a
Human GM-CSF	Thermo Scientific	300-03
KnockOut DMEM	Thermo Scientific	10829018
Luminescent Plate Reader	SpectraMax i3x (of soortgelijk) - Molecular Devices	n/a
Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	02-682-002
Microplate, 96 Well, PS, Half-area, White	Greiner	675075
mTeSR Plus	STEMCELL Technologies	100-0276
Nano-Glo HiBiT Lytic Detection System	Promega	N3030
Poly-L-Lysine hydrobromide	Fisher Scientific	ICN15017750
Recombinant Human IL-34	Thermo Scientific	200-34
Recombinant Human M-CSF	Thermo Scientific	300-25
Recombinant Human TGF-β1	Thermo Scientific	100-21C
Surface Treated Sterile Tissue Culture Plates	Fisher Scientific	FB012927
Tau-HiBiT protein	In house	n/a	Tau-eiwit met een VSGWRLFKKIS-peptide-tag
Trypsin Inhibitor	Sigma Aldrich	T9128
Trypsin-EDTA	Thermo Scientific	5-200-072
Y-27632 dihydrochloride	Bio-techne	1254