Een efficiënt fok- en microinjectieprotocol voor genetische modificatie van de stalvlieg, Stomoxys calcitrans

Summary

Dit protocol beschrijft een betrouwbare embryo-microinjectiemethode om vreemd genetisch materiaal te integreren in het genoom van de stabiele vlieg, een fluorescerend screeningssysteem voor het monitoren van de embryonale ontwikkeling na injectie, en een larvale kweeksubstraat bestaande uit met actieve koolstof aangevuld met eidooieragar gevaccineerd met Escherichia coli , dat de ontwikkeling van ei tot volwassene ondersteunt.

Abstract

Stalvliegen zijn bloedvoedende plagen van vee, gezelschapsdieren en mensen, en komen voor op alle continenten behalve Antarctica. De pijnlijke beten van zowel mannelijke als vrouwelijke volwassenen veroorzaken stressgerelateerd gedrag bij vee, wat leidt tot gewichtsverlies en aanzienlijke economische verliezen voor producenten. Zowel mannelijke als vrouwelijke stalvliegen zijn verplichte bloedvoeders, wat een uitdaging vormt voor de steriele insectentechniek en andere plaagbestrijdingsstrategieën die massale vrijlating van mannetjes vereisen. De huidige strategieën voor het bestrijden van stabiele vliegen slagen er vaak niet in om vliegpopulaties adequaat te beheersen. Hoewel er talrijke genetische manipulatiemethoden zijn ontwikkeld voor het introduceren van exogeen genetisch materiaal of het induceren van genknockouts voor muggen, Drosophila en andere modelinsectengroepen, blijven methoden voor de genetische transformatie van stabiele vliegen beperkt. Dit protocol beschrijft een betrouwbare en verbeterde aanpak voor het introduceren van vreemd genetisch materiaal in stabiele vliegen met behulp van een hyperactieve variant van de piggyBac-transposase en een nieuw vast voedmedium voor larvale dieren dat larvale herstel, uitkomst, voeding en fluorescerende screening na embryonale micro-injectie ondersteunt.

Introduction

Stalvliegen (Stomoxys calcitrans L., 1758) zijn economisch belangrijke plagen en ziektevectoren van vee ^1,2,3 en hebben wereldwijd een kosmopolitische verspreiding. Geïntegreerde plaagbestrijdingsstrategieën (IPM) slagen er vaak niet in om stabiele vliegpopulaties voldoende te beheersen ^2,3, wat resulteert in jaarlijkse verliezen die alleen al in de Verenigde Staten naar schatting meer dan 2 miljard USD bedragen³. Daarnaast is er resistentie tegen insecticiden gedocumenteerd in stabiele vliegpopulaties in Europa ^4,5 en ook gerapporteerd in de^{Verenigde Staten.} Daardoor vormen genetische controlebenaderingen zoals de steriele insectentechniek (SIT) en genaandrijfsystemen wenselijke toevoegingen aan traditionele IPM-programma's.

Eerdere pogingen om genetische controlemethoden te ontwikkelen bij stabiele vliegen, waaronder de generatie van genetische geslachtsdelingsstammen voor SIT, waren gebaseerd op selectieve fokkerij en door straling geïnduceerde translocatie ^7,8. Deze benaderingen zijn arbeidsintensief en beperkt tot niet-transgene modificaties. Vervolgens werden O'Brochta et al.⁹ toonde aan dat het gebruik van het Hermes-transposasesysteem transgenen in S. calcitrans kon integreren; het protocol leverde echter een lage transformatie-efficiëntie op, waarbij ongeveer 0,11% van de geïnjecteerde embryo's transgene nakomelingen produceerde, en een zwakke expressie van de versterkte groene fluorescerende eiwit (eGFP) marker onder controle van een exogene promotor⁹.

Andere genetische manipulatiemethoden, waaronder CRISPR-Cas-systemen, zijn nog niet breed toegepast bij stabiele vliegen, deels vanwege de moeilijkheid om de veerkrachtige chorion van stabiele vliegembryo's te doordringen. Het harde buitenste chorion is vergelijkbaar met dat van andere muscide vliegen ^10,11. Pogingen om het chorion te injecteren met kwartsnaalden of het chorion te verwijderen met dubbelzijdig lijmtape waren mislukt, waardoor behandeling met een oxiderende oplossing (3% natriumhypochloriet, NaOCl) noodzakelijk was, wat de uitkomstsnelheid van eieren vermindert.

Stabiele vliegen kunnen langdurig onder laboratoriumomstandigheden worden onderhouden, en jonge stadia worden meestal grootgebracht in gefermenteerde cellulosische substraten zoals houtsnippers, tarwezemel of stro aangevuld met stikstofbronnen, waaronder kalfsproteïnesupplementen of visvlokken¹². Deze substraten vertonen echter verschillende nadelen wanneer ze worden gebruikt voor het grootbrengen van geïnjecteerde embryo's. Hun ondoorzichtigheid en hoge autofluorescentie maken het moeilijk om GFP-positieve larven te identificeren na het uitkomen en het graven in het substraat. Bovendien, hoewel enige bacteriële aanwezigheid vereist is voor larvale overleving^, introduceren gefermenteerde media onvoorspelbare bacteriële en schimmelgemeenschappen die embryo's kunnen beschadigen of consumeren voordat ze uitkomen. Deze beperkingen verhinderden het herstel van getransformeerde larven met eerder beschreven injectie- en grootvoedingsmethoden⁹, wat de noodzaak benadrukt van een betrouwbaarder injectieprotocol dat ook fluorescerende screening tijdens de ontwikkeling mogelijk maakt.

Hier wordt een reproduceerbaar micro-injectieprotocol gepresenteerd dat verbeteringen in transposaseselectie, injectiemethodiek en screenings- en grootvoedingsmedia bevat. Deze modificaties vergemakkelijken de ontwikkeling van genetisch gemodificeerde stalvliegen voor toepassingen zoals genetische geslachtsdelingsstammen voor SIT, gen-drives en CRISPR-Cas-gemedieerde gen-knockouts. Belangrijke verbeteringen zijn onder andere het gebruik van hyperactieve piggyBac-transposase¹⁴ onder controle van de stabiele vlieg hitteschokproteïne (HSP)83-promotor, het uitdrogen van embryo's om oplasmaverlies na injectie te minimaliseren, en het elimineren van kleefband en halocarbonolie tijdens embryo-injectie.

Het herstel van geïnjecteerde embryo's werd verder verbeterd door bulkkweekmedia te vervangen door platte, gepigmenteerde nutriëntagarplaten die werden geïnëntificeerd met een gazon van Escherichia coli. Deze agarformulering biedt twee belangrijke voordelen. Ten eerste levert het een voorspelbare monogene bacteriële voedselbron voor de larvale ontwikkeling. Ten tweede biedt het een hoogcontrast, laag-autofluorescentie achtergrond die de waarneming van morfologie, ontwikkeling en GFP-expressie in eerstegeneratie (G0) larven vergemakkelijkt. Huisvliegen en stalvliegen ontwikkelen zich en verpoppen normaal op E. coli-geïnënteerde agarplaten op basis van eidooier^13,15. De hier beschreven formulering bevat geactiveerd koolstofpoeder als een niet-reactief, voedselveilig additief om de achtergrondfluorescentie verder te verminderen.

Protocol

Alle experimenten en operaties werden uitgevoerd met goedkeuring van het Institutional Biosafety Committee van Texas A&M (protocol IBC2019-081). De reagentia, chemicaliën en gereedschappen die in dit protocol worden gebruikt, staan vermeld in de Materiaallijst.

1. Het grootbrengen van vliegen voor eierproductie

1. Volwassen kooien voorbereiden
   1. Stel de thermostaat van een broedkamer in op 28°C en meng 3 kg natriumchloride met ~5 L kraanwater in een pan van 10 L, waarbij ~50% van het zout wordt opgelost.
   2. Plaats deze onbedekte pekelpan op de bodem van de broedkamer om een luchtvochtigheid van ongeveer 80% RH te behouden. Houd een dag-nachtcyclus van 16:8 aan in de kamer of kamer.
   3. Bekleed de bodem van insectenkooien (30 x 30 x 30 cm roestvrije/aluminium kooien met gaasnet) met twee lagen keukenpapier en plaats een 45 mL wegwerpbeker met keukensuiker bovenop de papieren handdoeklaag (Figuur 1A).
      OPMERKING: De papieren handdoeken helpen vliegendeeltjes op te nemen, en de suiker vormt een voedselbron vóór het bloedeten.
   4. Vul een 250 mL Griffin-beker met ongeveer 100 mL kraanwater op kamertemperatuur en pak een 20 cm x 20 cm vierkant zwart katoenen stof (gesneden uit een eenvoudige zwarte kussensloop of lakens) in het water totdat de stof vochtig is. Stel de zwarte stof zo aan dat de randen 1-2 cm voorbij de rand van de beker uitsteken (Figuur 1B).
      OPMERKING: Deze vochtige doek biedt zowel vloeibaar water als een eileggingsoppervlak voor volwassen vliegen. Sterfte kan snel optreden als volwassen dieren geen toegang hebben tot een vochtbron.
   5. Breng 500-1.500 stalvliegenpoppen over in een klein schaaltje of bekerglas en plaats ze in de insectenkooi. Plaats de volwassen kooi in de vochtige opvoedingskamer (stap 1.1.1) en houd dagelijks in de gaten op de eclosie. Zodra de volwassen dieren tevoorschijn komen, begin je dagelijks te voeden met gecitreerd rundvleesbloed (sectie 1.2).
2. Volwassen vliegen voeren
   1. Bereid gecitreerd rundvleesbloed voor door een uiteindelijke concentratie van 10,9 mM trinatriumcitraat dihydraat toe te voegen aan vers verzameld rundvleesbloed.
   2. Kort gezegd, suspendeer ~12,8 gram citratzout in een minimale hoeveelheid gedeïoniseerd water en voeg het toe aan 4 liter bloed dat in het lokale slachthuis wordt verzameld.
      OPMERKING: Bloedcontainers moeten een schroefdeksel hebben (bijvoorbeeld vierkante, brede flessen met een 4L grip) en worden grondig schoongemaakt met warme zeep en water voor gebruik. In het slachthuis moet u voorkomen dat u de eerste ~1 liter rundvleesbloed van een geslacht dier verzamelt om besmetting met haar, zweet, vuil en andere stollingsmiddelen te minimaliseren.
   3. Bevries geciteerd rundvleesbloed in 200 mL aliquots en ontdooi indien nodig, waarbij ontdooide aliquots tot een week gekoeld worden op 4°C gekoeld.
   4. Geef ~40 ml bloed op kamertemperatuur per 600 vliegen aan elke volwassen kooi.
   5. Bloed kan worden aangeboden in een smaakpot of beker, en een gevouwen, niet-steriele katoenen gaasspons moet in het vat worden ingebracht om het bloed te ontvoeren. Beweeg de lont tot de katoen volledig verzadigd is en plaats deze in de kooi.
      OPMERKING: Het bloed moet dagelijks worden ververs, beginnend 24 uur na de eclosie.
3. Eierverzameling
   1. Zodra eieren op de zwarte katoenen stof zijn waargenomen, haal je de doek van de beker en was je de eieren in een aparte ~700 mL ondiepe plastic container met een wasfles (Figuur 2A). Eilegging vindt meestal plaats wanneer de vliegen 7-10 dagen oud zijn.
      OPMERKING: Controleer ook bloedbekers op eieren en verzamel eventuele losse eieren die daar kunnen worden achtergelaten.
   2. Verzamel eieren op filterpapier via vacuümfiltratie. Dit gebeurt door een zwart filterpapier in een Buchner-trechter te plaatsen, een vacuüm toe te passen en vervolgens de eieren uit stap 1.3.1. over de opstelling te gieten.
   3. Daarna breng je eieren over naar een gegradueerde cilinder of een gegradueerde 1,7 mL microcentrifugebuis met behulp van een wasfles en registreer je het volume verzamelde eieren (Figuur 2B).
      OPMERKING: Vermijd langdurige onderdompeling van eieren in water, omdat de sterfte ~10 minuten na onderdompeling toeneemt.
4. Bereiding van bulk-larvale media
   1. Verzamel materialen voor bulklarvale media (Figuur 3A), zoals weergegeven in Tabel 1.
   2. Voeg in een 1000 mL beker het kalfsproteïnesupplement en al het kraanwater toe. Laat het een nacht hydrateren op kamertemperatuur.
   3. Voeg de tarwezemelen en vermiculiet toe aan een aparte, grotere mengbak.
   4. Na een nacht rehydrateren roer je het gerehydrateerde kalfssupplement grondig om klonten los te maken, en giet het mengsel vervolgens in de pot met tarwezemels en vermiculiet. Meng grondig tot het homogeen is en alle tarwezemels zijn bedekt met de kalksupplementsslurry.
   5. Breng het bulkmedium over in een polypropyleen voedselopslagcontainer in een ~8 cm diepe laag die de hele bodem van de container bedekt (Figuur 3B).
   6. Voeg ~1.000 embryo's toe (ongeveer 0,2 ml eicellen per 2,2 L bulkmedia) door embryo's te verzamelen via .vacuümfiltratie op een rond filterpapier met een diameter van 90 mm diameter en vervolgens het filterpapier met eieren met de afbeelding naar beneden in het midden van de mediabak leggen (Figuur 3B, C).
   7. Bedek het filterpapier met ~1 cm medium om vocht vast te houden (Figuur 3C) en bedek de container met een oversized rechthoek van zwarte katoenen doek, met 5 cm overhangende katoenen doek die voorbij de rand van de container steekt.
   8. Maak een groot gat (~12 cm in diameter) in het deksel van de voedselcontainer om gasuitwisseling mogelijk te maken en klik het deksel op de mediabak terwijl je de zwarte katoenen doek tussen de container en het deksel vasthoudt (Figuur 3D).
      OPMERKING: Dit dient als een pakking, die voorkomt dat de opening tussen deksel en container larven van het^{eerste stadium in} condensatiedruppels vasthoudt.
   9. Plaats de afgewerkte mediabak in de grootkweekkamer tot de verpopping en houd de larvale ontwikkeling in de gaten (Figuur 4) (verpopping vindt plaats over ~10 dagen, afhankelijk van de mediatemperatuur en larvale dichtheid).
      OPMERKING: De doek moet fijn genoeg zijn om te voorkomen dat larven van het eerste stadium erdoorheen gaan, maar doorlatend genoeg om condensatie op de binnenwanden van de mediabakken te voorkomen, die larven kan vangen en verdrinken.
5. Poppenscheiding
   1. Verwijder de doek van de poppenbakken en verzamel poppen met een lepel of schep.
      OPMERKING: Stalle vliegpoppen verschijnen als niet-beweeglijke roodbruine cilinders, 4-7 mm lang, in tegenstelling tot de mobiele geelwitte larven. Poppen hopen zich meestal op aan de buitenrand van de containerwanden of op vochtige, verhoogde posities in hun mediabak wanneer de vliegen beginnen met de metamorfose van larven naar poppen en volwassen dieren.
   2. Leg 500-1.500 poppen ~1 cm diep op een schaal en plaats ze in een nieuwe schone kooi zoals beschreven in sectie 1.1 om de volgende generatie voort te planten.

Figuur 1: Materiaal voor het grootbrengen van volwassen vliegen. (A) Volwassen vliegenopvoedingskooi met de sucrosebeker (S) en de eierleggingsbeker (O). (B) Eileggingsbeker, voorbereid met waterverzadigd zwart katoenen doek dat iets voorbij de rand van het bekerglas uitsteekt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Eierverzameling. (A) Verzameling van eieren uit de eileggingsdoek met behulp van een wasfles. (B) Terugwinning van eieren door vacuümfiltratie op hoogcontrast filterpapier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Materialen voor bulk-larvale media
Reagens	Massa (g)
Water	900
Tarwe zemelen	230
Kalfsupplement	100
Vermiculiet (A4 grof)	70
Materialen voor De-chorionatieoplossingen
Oplossing	Samenstelling
Oxiderend bad	3% natriumhypochloriet in gedeïoniseerd water
Wasbad	Triton X-100 0,02% oplossing in gedeïoniseerd water
Spoel af	Gedeïoniseerd water
Materialen voor zwarte agar afscherming en opkweekplaten
Reagens	Massa (g)
Water	500
Poedervormige eidooiers	18
Geactiveerde houtskool	4
Natriumchloride	1

Tabel 1: Reagentia voor bulk-larvale media, dechorionatieoplossingen en zwarte agarplaten. Reagentia die worden gebruikt voor de bereiding van bulk-larvale media voor kolonieonderhoud, evenals de samenstelling van oplossingen die worden gebruikt om het chorion uit stabiele vliegembryo's te verzwakken en te verwijderen, en materialen die nodig zijn om 500 mL zwart agar-screenings- en kweekmedium te bereiden.

Figuur 3: Bereiding van bulk-larvale media. (A) Materialen gebruikt voor bulk-larvale mediabereiding: kalfsproteïnesupplement (CM), tarwezemelen (WB), vermiculiet (VM), opslagcontainer (SC), deksel (L) en stoffen pakking (FG). (B) Grondige menging van mediacomponenten. (C) Plaatsing van met eier bedekt filterpapier (EP) met de afbeelding naar beneden op het mediaoppervlak en het bedekken met extra media om uitdroging te voorkomen. (D) Installatie van de katoenen stoffen pakking tussen de container en het deksel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Larvale ontwikkeling in bulkmedia. Transparante containers maken het mogelijk om de larvale ontwikkeling en de conditie van het medium te monitoren. Larven (L) zijn zichtbaar op de wanden van de container, het deksel en in het medium. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Voorbereiding op injectie: de-chorionatie en uitdroging

1. Leg een bevochtigde zwarte katoenen doek in een beker zoals beschreven in stap 1.1.4 en breng deze 25 minuten in een volwassen kooi om eieren te verzamelen. Spoel de eieren af op een 106 μm roestvrijstalen zeef met een wasfles.
   OPMERKING: Een verzamelperiode van 25 minuten levert doorgaans ongeveer 400 eieren op.
2. Laat de embryo's nog eens 30 minuten onaangeroerd op de zeef rusten.
3. Terwijl de embryo's verouderen, bereid je 150 mL van de oxiderende, was- en spoeloplossingen die zijn beschreven in de sectie "Materialen voor Dechorionatieoplossingen" in Tabel 1 (Figuur 5). Gebruik voldoende volume om de embryo's met ongeveer 1 cm oplossing te bedekken.
4. Dompel het zeef met embryo's 2 minuten onder in het oxiderende bad en beweeg de embryo's voorzichtig met een Pasteur-pipet (Figuur 6A).
   OPMERKING: Herhaald aspiratie en het doseren van oplossing om een cirkelvormige vortex te creëren, helpt de embryo's in het midden van de zeef te concentreren en voorkomt dat vers gedechorioneerde embryo's aan de zeefwanden hechten.
5. Haal de zeef uit het oxiderende bad en tap overtollige oplossing af. Doe de zeef over in de wasoplossing en roer door aspiratie en doseering gedurende 2 minuten.
6. Breng de zeef met embryo's over in de spoeloplossing en roer zoals beschreven in stap 2.4 gedurende 2 minuten. Haal de zeef uit de spoeloplossing en tap overtollig water af.
7. Plaats een steriele glazen deklaag op de zeef en gebruik onder een dissectiemicroscoop een fijnpuntige nylon verfkwast om embryo's (Figuur 6B) van de zeef naar de rand van de deklaag te verplaatsen. Plaats embryo's dicht bij elkaar zonder dat ze elkaar raken, waarbij de bredere achterpool naar de rand van de deklaag is gericht. Vermijd het buigen, vervormen of scheuren van embryo's tijdens de overdracht.
8. Bereid een uitdroogkamer voor door de bodem van een 1 L kolf te bedekken met 100 ml calciumsulfaatdroogmiddel en de fles af te sluiten met een rubberen stop.
   OPMERKING: Na 24 uur evenwicht bereikt de uitdrogingskamer doorgaans een relatieve luchtvochtigheid van <5% bij 23 °C.
9. Verwijder overtollig water uit de dekfolie en plaats de dekfolie met gedechorioneerde embryo's op de droogmiddel. Sluit de kolf weer af met een rubberen stop en droog de embryo's 8 minuten uit.
10. Haal de deklaag uit de uitdrogingskamer en plaats deze op het microscooppodium onder een 20× objectief voor micro-injectie.

Figuur 5: Dechorionatieoplossingen. Van links naar rechts: roestvrijstalen zeef, oxiderende oplossing, wasoplossing en spoeloplossing voor embryo-dechorionatie. Natriumhypochloriet wordt behouden als een 6% voorraadoplossing die beschermd is tegen licht, en Triton X-100 wordt bewaard als een 10× voorraadoplossing en verdund tot een uiteindelijke concentratie van 0,02% vóór gebruik. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Embryo-dechorionatie. (A) Voorzichtige aspiratie en afgifte van oplossing creëren een vortex die embryo's in het midden van de zeef concentreert en de adhesie aan de zeefwanden vermindert. (B) Gedechorioneerd embryo dat na het spoelen uit het doorschijnende chorion tevoorschijn komt. De voorste pool (smallere uiteinde) komt meestal naar buiten vóór de achterpool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Micro-injectie

1. Haal kwarts microinjectienaalden uit 100 mm filamentglazen capillairen (I.D. 0,7 mm, O.D. 1,0 mm) met behulp van de parameters die in Tabel 2 zijn vermeld. Bewaar de naalden op een stofvrije plek tot gebruik.
   OPMERKING: Borosilicaatnaalden met vergelijkbare geometrie kunnen ook worden gebruikt.
2. Bereid injectiebuffer voor (0,1% w/v fenolrood in fosfaatgebuffte zoutoplossing (PBS), pH 7,4) en filter met een 0,22 μm spuitfilter.
3. Bereid 20 μL injectiemengsel voor door elk 10 μg piggyBac helperplasmide en donorplasmide, dat de genetische lading tussen de linker- en rechter piggyBac omgekeerde terminale herhalingen bevat, te combineren met 4 μL injectiebuffer. Verdun tot een uiteindelijke concentratie van 500 ng/μL met nucleasevrij water.
   OPMERKING: Het helperplasmide bestaat uit de 3,1 kb hsp83 promotorsequentie stroomopwaarts van het hsp83. startcodon en de hyperactieve piggyBac transposase-coderingssequentie.
4. Breng het injectiemengsel over naar een laagvolume 0,20 μm PTFE-spuitfilter en plaats het filter in de opening van een 0,5 mL microcentrifugebuis (Figuur 7A). Centrifugeer op ≥11.000 x g. gedurende 10 minuten of totdat alle injectiemix door het filter is gegaan. Bewaar ongebruikt injectiemengsel bij -20 °C.
5. Vul een kwarts microinjectienaald met ongeveer 2 μL injectiemengsel met behulp van een microgel-ladende pipettip (Figuur 7B). Vermijd het toevoegen van luchtbellen tijdens het laden.
   OPMERKING: Oriënteer de microinjectienaald parallel aan de lange as van het embryo en behoud geen horizontale en verticale hoekverschuiving om scheuren en afschuiving te minimaliseren.
6. Tik voorzichtig met de naaldtip tegen de rand van een glazen glaasje totdat het injectiemengsel door de naaldpunt stroomt (Figuur 7C).
   OPMERKING: Doorbreek de naaldpunt geleidelijk om de kleinste, scherpste opening te creëren die nog steeds injectie-mix doorstroming toelaat.
7. Injecteer het embryo direct na het uitdrogen via de achterpool met ongeveer 700 hPa injectiedruk en 300 hPa tegendruk.
8. Steek het embryo voorzichtig door en injecteer ongeveer een tiende van het embryovolume met het injectiemengsel (Figuur 7D–F).
   OPMERKING: Minimaliseer naaldpenetratie om verstoring van het vitellinemembraan te verminderen en verlies van oplasma tijdens het terugtrekken van de naald te voorkomen.
9. Breng het dekfolie direct na injectie over in een petrischaal bekleed met een steriel, bevochtigd 90 mm zwart filterpapier en laat het 48 uur op kamertemperatuur incuberen.
   OPMERKING: Voltooi alle injecties binnen 2 uur na de eicel om doelembryo's vóór het syncytiale stadium te bereiken.
10. Onderzoek embryo's op uitkomen elke 12–16 uur. Breng pas uitgekomen larven en de glazen deklaag over naar een geïnënt en geconditioneerd agarplaat, voorbereid zoals beschreven in sectie 4.

Parameter	Warmte	Fil	Vel	Del	Trek
Waarde	825	5	60	150	175

Tabel 2: Parameters voor naaldtrekken. Parameters die worden gebruikt om kwarts microinjectienaalden te genereren.

Figuur 7: Embryo-microinjectie. (A) Filtratie van injectiemengsel met behulp van een spuitfilter genest in een 0,5 mL microcentrifugebuis. (B) Laden van gefilterd injectiemengsel in een microinjectienaald met behulp van een gel-ladende pipetpunt. (C) Terminalgeometrie van een kwarts-microinjectienaald. (D) Uitlijning van de naald met de achterpool van het embryo. (E) Penetratie van het embryooppervlak terwijl verstoring van het vitellienmembraan wordt geminimaliseerd. (F) Injectie van ongeveer een tiende van het embryovolume gevolgd door naaldtrekking. Verhoogde transparantie duidt op verplaatsing van oplasma door het injectiemengsel. Schaalbalk = 400 μm (D–F) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Voorbereiding van behandelde platen

1. Agarmediumformulering
   1. Bereid het medium voor dat wordt beschreven in de sectie "Materialen voor zwarte agar screening en opvoedplaten" van Tabel 1 en autoclaaf gedurende 15 minuten bij 121 °C. Giet de agar op 40 °C of bewaar het op kamertemperatuur voordat je het opnieuw verwarmt en in 90 mm petrischalen giet.
      OPMERKING: Draai krachtig voordat je het uitgiet om vaste deeltjes weer te laten ophangen.
2. Plaatinoculatie
   1. Verdun een 24 uur lange cultuur van K12 Escherichia coli tot OD600 = 0,200 in Luria-Bertani-bouillon en doseer 200 μL op een gekoelde, gestolde agarplaat. Verspreid de cultuur gelijkmatig met steriele glaskralen of een glasspreider en laat de plaat overtollig vocht opnemen (Figuur 8A, B).
      OPMERKING: Gebruik agarplaten binnen 1 maand na het gieten of gooi ze weg om betrouwbare bacteriële en larvale groei te garanderen.
3. Plaatconditionering
   1. Vouw 6 × 6 cm zwarte filterpapieren om 6-10 golfplaten te maken en steriliseer door te bakken of autoclaveren. Plaats een steriel gegolfd filterpapier aseptisch op de geïënt petrischaal en bevochtig deze met meerdere druppels steriel water (Figuur 8C).
   2. Onbehandelde, niet-geïnjecteerde wildtype (WT) larven van het eerste stadium aan het oppervlak steriliseren en 10 larven overbrengen naar het bevochtigde filterpapier.
      OPMERKING: Steriliseer WT-embryo's door ze 1 minuut lang onder te dompelen in 10% bleekmiddel (0,6% NaOCl), gevolgd door 2 minuten spoelen in steriel gedeïoniseerd water.
   3. Plaats een 90 mm filterpapier tussen het deksel en de romp van de Petrischaal om als pakking te dienen.
   4. Laat WT-larven de platen 24 uur conditioneren voordat geïnjecteerde embryo's op glazen dekmantels worden geplaatst (Figuur 8C). Verwijder de WT-larven nadat de eerste geïnjecteerde embryo's zijn uitgekomen.

Figuur 8: Voorbereiding van agarplaten en herstel na injectie. (A) Inoculatie van agarplaten met een OD600 = 0,2 kweek van Escherichia coli met steriele glaskralen. (B) Absorptie van overtollig oppervlaktevocht vóór embryotransfer. (C) Plaatsing van een 90 mm filterpapierpakking tussen het deksel en het lichaam van de petrischaal. (D) Screening van larven op fluorescerende markers op geconditioneerde agarplaten. Geïnjecteerde embryo's worden teruggevonden op een gedeïoniseerd waterverzadigd 90 mm filterpapier, geplaatst in het deksel van een omgekeerde petrischaal en 48 uur geïncubeerd voordat het wordt overgebracht naar screeningsplaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Results

Met dit protocol werden 431 embryo's van stabiele vliegen gedechorioneerd en geïnjecteerd met piggyBac-Hsp83 donorplasmide en Hsp83 helperplasmide bij een uiteindelijke concentratie van 500 ng/μL. Van de 431 geïnjecteerde embryo's kwamen 18 ZsGreen-positieve larven (4,2%) en 8 ZsGreen-negatieve larven (1,9%) 48-76 uur na injectie uit bij screening op zwarte koolstofagarplaten (Tabel 3). In totaal kwamen 26 van de 431 geïnjecteerde embryo's uit (6,0%), en 16 van de 26 uitgekomen larven overleefden de volwassenheid (61,5%).

Soorten	Type injectie	Constructie	# geïnjecteerd	ZsGreen(+) L1	ZsGreen(-) L1	ZsGreen(+) Poppen	ZsGreen(-) poppen	ZsGreen(+) Volwassenen	ZsGreen(-) volwassen dieren	# Volwassen kinderen die ZsGreen(+) nakomelingen produceren
Stomoxys calcitrans	Transposase-insertie	Hsp83:hy-pBac (helper, 500 ng/uL) Hsp83: zsGreen (donor, 500 ng/uL)	226	5	8	5	6	3	6	1
Stomoxys calcitrans	Transposase-insertie	Hsp83:hy-pBac (helper, 500 ng/uL) Hsp83: zsGreen (donor, 500 ng/uL)	205	13	0	7	0	7	0	5

Tabel 3: Injectiestatistieken. Overlevings-, transformatie- en herstelpercentages na embryo-microinjectie.

Van de 18 ZsGreen-positieve G0-larven overleefden er 12 de verpoping (66,7%) en 10 werden als volwassen dieren opgesloten. Zes ZsGreen-positieve volwassenen (1,4% van de geïnjecteerde embryo's, 60% van de vruchtbare G0-overlevenden) kregen ZsGreen-positieve nakomelingen. Deze nakomelingen (Figuur 9A–E) waren zelfgekruist en behielden fluorescentie gedurende zes generaties op het moment van schrijven.

Van de acht ZsGreen-negatieve larven overleefden er zes de volwassenheid (75%). Geen van de niet-fluorescerende volwassen exemplaren kreeg fluorescerende nakomelingen.

Figuur 9: Fluorescerende screening van transgene vliegen. (A) Vergelijking van ZsGreen-expressieve F1-larven en WT-larven. (B) Fluorescentie zichtbaar via de pupalkuticulus, waardoor transgene screening in het popstadium mogelijk is. (C,D) Vergelijking van drie Zs-Groene expressieve larven en poppen (links) met drie WT-larven en poppen (rechts) onder witte lichtverlichting (C) en fluorescentie (D). (E) Volwassen transgene F1-vlieg die ZsGreen uitdrukt (links) vergeleken met een volwassen vlieg met WT (rechts). Schaalbalken = 1 mm (A), 2 mm (B,E) en 3 mm (C,D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

De genetische transformatie van niet-modelinsectensoorten blijft een belangrijke bottleneck in de ontwikkeling en evaluatie van genetische bestrijdingsstrategieën voor geleedpotige plagen en vectoren.

Voor stabiele vliegen vermindert het hier beschreven protocol de tijd, middelen, arbeid en variabiliteit die gepaard gaan met het injecteren en grootbrengen van G0-vliegen na de microinjectie van het embryo. Daarnaast maakt het gebruik van zwarte agar-screeningsplaten directe observatie van de ontwikkeling gedurende de hele levenscyclus mogelijk, waardoor problemen die ontstaan tijdens injectie, herstel en larvale opvoeding worden geïdentificeerd en gecorrigeerd. Met behulp van de plasmideconstructies die in deze studie werden geëvalueerd, genereerde het protocol transgene stabiele vlieglijnen met minder geïnjecteerde embryo's dan eerder gerapporteerde methoden⁹. Hoewel buiten het kader van dit methodeartikel, kunnen bevestiging en lokalisatie van transgen-insertieplaatsen worden uitgevoerd met gevestigde methoden zoals inverse PCR en splinkerette PCR.

Een efficiënt injectieprotocol faciliteert ook toekomstige studies in functionele genomica, waaronder karakterisering van promotoren met behulp van fluorescentiereporters; vectorcompetentie, via omgekeerde genetische analyses van genen die geassocieerd zijn met pathogene overdracht; nucleasekarakterisering, inclusief evaluatie van CRISPR-Cas9 en andere programmeerbare nucleasen in stabiele vliegen; onderzoek naar insecticideresistentie door modificatie van kandidaatresistentie-allelen; en onderzoeken naar basisbiologie, inclusief genen die betrokken zijn bij bloedvoeding, paring en ontwikkeling. Ons protocol elimineert ook de noodzaak voor olie-ondergedompelde embryo-injecties en zuurstofrijke vochtige kamers voor embryo-herstel na injectie, zoals gedocumenteerd in eerdere Musca huis- en Lucilia cuprina piggyBac-transformatieliteratuur^16,17.

Verschillende parameters zijn cruciaal voor succesvolle transgenese. Het uitdrogen van embryo's en het tijdstip van injectie zijn bijzonder belangrijk omdat plasmide-DNA vóór cellularisatie moet worden ingebracht om opname in kiemlijnvoorlopers te waarborgen. De precieze timing van syncytiumvorming in stabiele vliegembryo's is echter onbekend. Daarnaast wordt de embryonale ontwikkelingssnelheid beïnvloed door temperatuur, en is de ontwikkelingstijdlijn van stabiele vliegembryo's onder verschillende omgevingsomstandigheden niet volledig gekarakteriseerd. Toekomstig onderzoek naar de ontwikkelingssnelheden en embryogenese van stabiele vlieg-laboratoriumstammen kan inzicht geven in het optimaliseren van microinjectie- en transformatieprotocollen, waardoor de efficiëntie en reproduceerbaarheid verder toeneemt. Tot die tijd blijft het bepalen van het optimale injectievenster echter een methodologische beperking die de transformatie-efficiëntie kan beïnvloeden. Wanneer de overlevingskansen laag zijn, kan probleemoplossing worden uitgevoerd door uitkomst- en volwassen overlevingspercentages te vergelijken tussen onbehandelde embryo's, gedechorioneerde embryo's, embryo's geïnjecteerd met filtergesteriliseerd PBS, en WT-embryo's die op agarplaten zijn opgevoed. Eerdere literatuur die de transformatie van Musca huiselijk beschrijft, leverde 14 integratiegebeurtenissen op van de 1.668 injecties (0,84% van de geïnjecteerde)¹⁶, en de transformatie van het schapenplaag Lucilia cuprina stelde 3 transgene lijnen vast uit ongeveer 900 embryo-injecties (0,33% van de geïnjecteerde)¹⁷, wat suggereert dat het stabiele vliegtransformatieprotocol zoals beschreven in dit protocol (6 integratiegebeurtenissen in 431 injecties), 1,4% van de geïnjecteerde) biedt een verbetering van de injectie-efficiëntie ten opzichte van andere soorten van plaagdipteren in de literatuur.

De stabiele vlieg hsp83 constitutieve promotor leverde robuuste expressie van ZsGreen gedurende de hele ontwikkeling en ondersteunde expressie van de hyperactieve piggyBac-transposase tijdens de vroege embryogenese, waardoor de zichtbaarheid van fluorescentiemarkers en transformatie-efficiëntie verbeterde vergeleken met een eerder gerapporteerd stabiele vliegtransformatieprotocol⁹. Het hulpplasmide dat in deze studie werd gebruikt, werd gegenereerd door 3,1 kb genomisch DNA direct stroomopwaarts van het hsp83-startcodon te subkloneren in een minimale plasmidevector stroomopwaarts van de hyperactieve piggyBac-transposasecoderingssequentie. De hulp-tot-lading plasmidverhouding werd empirisch vastgesteld op 1:1 per massa en werd gedurende het hele onderzoek gebruikt. Hoewel er geen aanvullende plasmidverhoudingen zijn geëvalueerd, kunnen alternatieve verhoudingen ook effectief blijken.

De hier beschreven verbeteringen kunnen toepasbaar zijn op transgeneseprotocollen voor andere geleedpotigen. Daarnaast wordt het agar-gebaseerde screening- en grootkweeksysteem momenteel toegepast op de injectie en screening van zwarte soldaatvlieg (Hermetia illucens). Het protocol kan bijzonder nuttig zijn voor transgenese-inspanningen bij andere muscide vliegen, waaronder Musca domestica en Haematobia irritans, vanwege hun vergelijkbare larvale ecologie en ontwikkeling bij ontbindende vezelige substraten. Het gebruik van Escherichia coli-geïnënfecteerde agarplaten kan een praktische aanpak bieden voor monitoring na injectie, terwijl onderzoekers de embryonale ontwikkeling, larvale morfologie, markerexpressie, uitkomstpercentages en het algehele herstel kunnen evalueren. Het aanpassen van het bacteriële component van het medium aan de biologie van de doelsoort kan het nut van deze aanpak voor het ontwikkelen en optimaliseren van transgeneseprotocollen verder vergroten.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L flacon met rubber stopper (uitdrogingskamer)	VWR	214-1134	Uitdrogingskamer
Bacto Agar	Difco	281230	Agar voor zwarte agar platen
Zwarte kussensloop	Aisawate	3.45496E+11	Zwarte katoenen doek voor ei-verzamelbekers en stoffen afdichting voor kweekbakken voor larven
Calciumsulfaat uitdrogingsmiddel	Drierite	21001	Uitdrogingsmiddel voor uitdrogingskamer
Calf Manna Prestatiesupplement	Manna Pro	095668940010	Bulk kweekmedium voor larven
Compound microscoop	Leica Microsystems	DM750M	Injectie microscoop
Gedroogd ei-geel	Judee’s From Scratch	B098SP2LTV	Voedingsbron voor zwarte agar platen
E. coli	New England Biolabs	C2987H	Bacterie gebruikt op zwarte agar platen
Femtojet 4i micro-injectiedrukbron	Eppendorf	5252000021	Micro-injectiedrukbron
Fijne nylon penseel	Transon	7.42298E+11	Overbrengen van embryo's
Vuur gepolijste kwarts capillairen met filament, OD 1,0 mm, ID 0,70 mm, 10 cm lengte	World Precision Instruments	QF100-70-10	Capillairen voor het trekken van naalden
Pincet	Fine Science tools	11251-20	Monsterbehandeling
Volledige hoogte zeef, 3” dia, Nr. 140 ASTM-E11 Standaard testzeef (106 μm)	Cole-Parmer	UX-59987-24	Houdt embryo's vast tijdens dechorionation
Germicidal Ultra Bleach (6% natriumhypochloriet)	Pure Bright	59647-21014	Bleekoplossing om chorion te verwijderen
GladWare Family Size Food Opslag Containers, XL 104 oz	Glad	012587701294	Bulk kweekmedium container
Grade 8613, 9cm Zwarte kwalitatieve filterpapieren	Ahlstrom	8613-0550	Verzamelen van embryo's
LB Bouillon	BD Difco	DF0446-17-3	LB bouillon voor E.coli kweek
M60 zoom stereo dissecting microscoop met Leica Ergo Tubes	Leica Microsystems	SP-M60-TS	Microscoop voor het verplaatsen en opstellen van embryo's
Microloader tips 0,5-20 uL 100mm	Calibre Scientific	EPE 930001007	Gebruikt om injectiemix in naalden te laden
Micromanipulator	Leica Microsystems	11520137	Micromanipulator voor injectie
Millex Spuitfilter, Hydrofiel PTFE, 0,2 μm	MilliporeSigma	SLLGR04NL	Gebruikt om injectiemix te filteren
Nuclease-vrij water	Corning	46-000-CM	Injectiebuffer
Organische kokos geactiveerde houtskool poeder	Belle Chemical	B073BSNLJ3	Pigment voor zwarte agar platen
P-2000 Laser-based pipet aanhaalapparaat	Sutter Instruments	P-2000/G	Apparaat voor het trekken van naalden uit capillairen
PBS, pH 7,4	Gibco	10-010-023	Injectiebuffer
Petri platen	VWR	391-0609	Petri schotels voor agar zwarte eierplaten
Fenol rood, CAS:143-74-8	Thermo scientific	B21710.09	Kleurstof voor injectie
Rubber stoppers	Stony Lab	NY-RubberStoppers-HI-5PK-#12	Uitdrogingskamer plug
Zachte tarwezemelen (zachte rode wintertarwe) 50 lb	Siemer	55600050500000	Bulk kweekmedium voor larven
Vierkante glazen deksels, 18X18mm	Alkali Scientific	SM1818	Glazen deksels voor micro-injectie
Stereo microscoop fluorescentie adapter	Nightsea	SFA-RB	Fluorescentielamp en filters voor het screenen van larven
Steriele glazen kralen	VWR	1.04016.0500	Bacterieën verspreiden op platen
Overdracht Pipet Wegwerp 5mL	LabAid	BP1200	Embryo's wassen tijdens dechorionation
Triton X-100	Sigma-Aldritch	T8787-50ML	Dechorionating embryo's
Wasfles	Safetyware	Z423335	Embryo's wassen van oppervlakken