Een op microcarrier bead gebaseerd driedimensionaal angiogenesemodel met behulp van menselijke navelvenendotheelcellen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een op microcarrier bead gebaseerd driedimensionaal angiogenesemodel met behulp van menselijke navelvenendotheelcellen. De assay maakt directe visualisatie van endotheliale ontkieming en de vorming van lumenachtige structuren mogelijk en kan worden toegepast op studies van angiogene mechanismen en therapeutische interventies.

Samenvatting

Angiogenese is een meerstaps biologisch proces waarbij endotheelcellen worden geactiveerd, migreren, verlengd, lumenvorming, vertakking en anastomose worden gebruikt. Conventionele tweedimensionale kweeksystemen zijn nuttig voor de voorlopige evaluatie van geneesmiddelen, genen of kweekomstandigheden, maar ze geven de ruimtelijke organisatie van endotheelmorfogenese binnen een driedimensionale extracellulaire matrix niet adequaat weer in een ruimtelijke organisatie. Het huidige protocol beschrijft een op microcarrier bead gebaseerde driedimensionale angiogenese-assay met behulp van menselijke navelvenendotheelcellen (HUVECs). De HUVEC's worden eerst gezaaid op microcarrier-kralen met chemisch gekoppelde, zuur-gedenatureerde varkenscollageen type I en vervolgens ingesloten in een basalmembraanmatrix. Mondslijmvliesfibroblasten worden vervolgens bovenop de gel geplant om paracriene ondersteuning te bieden voor endotheliale kiemen en de vorming van vaatachtige structuren. Het kweekmedium wordt elke 2 dagen vervangen en het kiemgedrag en de angiogene fenotypen worden gemonitord met omgekeerde microscopie. Onder geschikte kweekomstandigheden ontstaan endotheeluitlopers binnen enkele dagen, gevolgd door de vorming van lumenachtige structuren en verbindingen tussen de kiemen. Deze methode biedt een handig en reproduceerbaar platform voor in vitrostudies van endotheelmorfogenese en kan verder worden toegepast op onderzoek naar genmanipulatie, farmacologische interventie en ziektemodellering.

Inleiding

Endotheliale kiemvorming is een belangrijk evenement in angiogenese en omvat het ontstaan, migreren, proliferatie en uitlijnen van endotheelcellen uit bestaande vaatstructuren, gevolgd door de vorming van lumen en het vestigen van onderling verbonden vasculaire netwerken ^1,2. Hoewel conventionele tweedimensionale kweeksystemen en gel-gebaseerde buisvormingsassays technisch eenvoudig zijn, zijn ze beperkt in hun vermogen om de ruimtelijke hermodellering van endotheelcellen binnen een driedimensionale microomgeving^te recapituleren ^3,4. De klassieke driedimensionale kiemtest gebaseerd op microcarrierkralen reproduceert verschillende stadia van angiogenese in vitro, waaronder endotheelontkieming, verlenging, lumenvorming en netwerkassemblage, en is daardoor een veelgebruikte methode geworden voor angiogeneseonderzoek.

In het huidige protocol is een driedimensionaal microcarrier-kraalmodel opgebouwd met gebruikmaking van normale menselijke navelvenendotheelcellen. Gebaseerd op eerder gerapporteerde endotheliale microcarrier bead spruitingsassays ^5,6,7, behoudt deze methode het basiskader van endotheelcelcoating op microcarrier-korrels, inbedding in een driedimensionale matrix en fibroblast-overlaycultuur, terwijl een basale membraanmatrix wordt vervangen door conventionele fibrinegel om het proces te vereenvoudigen en routinematige beeldvorming te vergemakkelijken. De basalmembraanmatrix werd in dit aangepaste protocol om verschillende praktische en biologische redenen gekozen. Experimenteel biedt het een kant-en-klare driedimensionale matrix die snelle gelvorming, eenvoudige kraalinbedding en handige routinematige microscopische observatie mogelijk maakt zonder de extra polymerisatiestappen die nodig zijn voor de voorbereiding van fibrinegel. Biologisch bevat de basale membraanmatrix extracellulaire matrixcomponenten die endotheelceladhesie, migratie, uitspruituitbreiding en de vorming van lumenachtige structuren ondersteunen. Daarom is deze modificatie geschikt voor studies die directe visualisatie van endotheliale kiemgedrag, vergelijking van angiogene fenotypes en evaluatie van farmacologische of genetische interventies in een driedimensionale kweekomgeving vereisen. Omdat de basale membraanmatrix echter verschilt van fibrinegel in matrixsamenstelling, mechanische eigenschappen, afbreekbaarheid en bioactieve aanwijzingen, moet de huidige assay worden geïnterpreteerd als een gemodificeerd microcarrier-kraal-gebaseerd ontkiemingsmodel in plaats van een directe vervanging van de klassieke fibrine-gebaseerde assay. Deze matrix-gerelateerde verschillen kunnen invloed hebben op de kiemkinetiek, de stabiliteit van het lumen en de netwerkmorfologie, en moeten worden meegewogen bij het vergelijken van resultaten tussen verschillende driedimensionale angiogenesesystemen. Dit model is geschikt om endotheliale spruitgedrag in drie dimensies te observeren en kan verder worden toegepast op studies naar farmacologische interventie, genmanipulatie en angiogene mechanismen.

Protocol

Menselijke navelvenendotheelcellen die in dit protocol worden gebruikt, werden geïsoleerd en gekweekt uit menselijke navelstrengweefsels verzameld van de afdeling Verloskunde van het First People's Hospital van de provincie Yunnan. Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle donoren voorafgaand aan de monsterafname. Alle procedures met betrekking tot menselijk afgeleide materialen zijn goedgekeurd door de Medische Ethische Commissie van het Eerste Volksziekenhuis van de provincie Yunnan (goedkeuringsnummer KHLL2023-KY198). Menselijke orale mucosale fibroblasten (HOMF's) werden vriendelijk geleverd door de onderzoeksgroep van Dr. Jiemei Zhai van het Affiliated Stomatological Hospital van de Kunming Medical University. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Celvoorbereiding

1. Kweek menselijke navelvenendotheelcellen (HUVECs) in een endotheelcellengroeimedium, aangevuld met extra foetaal rundserum (FBS) tot een uiteindelijke concentratie van 10% bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO₂. Cellen die voor de assay worden gebruikt, moeten vrij zijn van besmetting, stabiele groei vertonen en zich in de logaritmische groeifase bevinden. Gebruik cellen bij passage 4–6.
2. Kweek menselijke orale mucosale fibroblasten (HOMF's) in een basaal medium met een hoog glucosegehalte aangevuld met 10% foetaal rundserum (FBS) bij 37 °C in een bevochtigde broedmachine met 5% CO₂. Gebruik cellen bij passage 4–6.
3. Controleer voordat je microcarrier bead coating op een geschikte confluence zit. Vermijd overconfluente culturen of overmatige enzymatische spijsvertering, omdat deze de volgende kieming negatief kunnen beïnvloeden.

2. Bereiding van microcarrier-kralen

1. Hydrateer 0,5 g droge microcarrier-kralen in 50 ml PBS gedurende minstens 3 uur. Na het wassen worden de kralen opnieuw opgehangen in 50 mL PBS om een 10 mg/mL microcarrier-korrelsuspensie te verkrijgen, ongeveer 3 × 10⁴ kralen/mL.
2. Breng de suspensatie over in een siliconenglazen fles, steriliseer deze door te autoclaveren bij 115 °C gedurende 15 minuten, en bewaar het op 4 °C tot gebruik.
3. Verwijder vóór het coaten van endotheelcellen de opslagoplossing en was de kralen met steriele PBS. Evenwicht de kralen in het endotheelcellengroeimedium bij 37 °C gedurende minstens 30 minuten.
4. Suspendeer de gebalanceerde kralen voorzichtig direct voor gebruik om sedimentatie en ballenophoping te voorkomen.
5. Voordat je de celcoating aanbrengt, bekijk je een kleine aliquot van de kraal-suspensie onder een omgekeerde microscoop. Ga alleen verder wanneer de kralen volledig gehydrateerd, gelijkmatig zijn gesuspendeerd en vrij van zichtbare aggregaten of gefragmenteerde deeltjes.

3. Het coaten van endotheelcellen op microdragerkorrels

1. Koppel HUVEC's af met trypsine en laat de cellen opnieuw ophangen in het endotheelcelgroeimedium.
2. Bedek de microdragerkralen met een dichtheid van 1.500 cellen per kraal. Meng 3 × 10 6 HUVECs met 2.000 microcarrierkralen in 1,5 mL endotheelcelgroeimedium.
3. Breng het cel-kraalmengsel over in een microcentrifugebuis en incubeer 12 uur in een celkweekincubator. Gedurende de volledige 12 uur durende incubatieperiode keer je de buis voorzichtig eens in de 20 minuten om voldoende contact tussen de cellen en de kralen te behouden en om uniforme endotheelcelhechting te bevorderen.
4. Na 12 uur wordt de gecoate kralen overgebracht in een 25^cm celkwekelkolf met 4 ml endotheelcelgroeimedium en wordt de incubatie 's nachts voortgezet om de endotheelcellen stevig aan het oppervlak van de microdragerkorrel vast te zetten.
5. Voordat je inzet, bekijk representatieve gecoate kralen onder een omgekeerde microscoop. Ga alleen over tot matrix-inbedding wanneer meer dan 80% van de onderzochte kralen een continue en relatief uniforme endotheelcellaag op het kraaloppervlak vertoont, met minimale vrij zwevende cellen, geen duidelijke celklonten en geen ernstige korrelaggregatie. Kralen met ongelijke coating, grote celclusters of uitgebreide aggregatie mogen niet worden gebruikt voor inbedding.
6. Als de kralen aan de onderkant van de kolf blijven plakken, schud dan voorzichtig de fles om ze los te laten. Vermijd intensief pipetteren, dat kan leiden tot korrelvorming of celloslating.

4. Het inbedden van de gecoate kralen in een driedimensionale matrix

1. Breng de met endotheelcellen bedekte microdragerparels over in een centrifugebuis van 15 mL en laat de kralen door de zwaartekracht zakken. Verwijder het overtollige medium en voeg een passende hoeveelheid verse medium toe.
2. Meng de microcarrier-korrelsuspensie met voorgekoelde basalmembraanmatrix in een verhouding van 1:1 (v/v) om een eindkorrelconcentratie van 500 korrels/ml te verkrijgen.
3. Voeg 100 μL van de matrix-korrel suspensie toe aan het midden van elke put van een 24-put plaat, zodat het mengsel een enkele koepelvormige geldruppel kan vormen zonder contact te maken met de wand van de put. Meng de suspensie voorzichtig direct voor het doseeren en vermijd het toevoegen van luchtbellen.
4. Laat de 24-well-plaat 5 minuten op kamertemperatuur staan om de initiële gelatie en stabilisatie van de geldruppel mogelijk te maken. Daarna incubeer je de plaat rechtop bij 37 °C in 5% CO₂ gedurende 15 minuten, gevolgd door nog eens 15 minuten incubatie in omgekeerde positie om volledige gelatie en correcte gelvorming te garanderen.
5. Nadat de gel volledig is gestold, ga je direct over tot fibroblast-overlay-kweek.

5. Fibroblast-overlaycultuur

1. Suspendeer 3 × 10⁴ menselijke orale mucosale fibroblasten (HOMF's) opnieuw in 1 ml endotheelcelgroeimedium en voeg de celsuspensie voorzichtig toe langs de wand van elke put, zodat de cellen zich over het geloppervlak kunnen verspreiden zonder de gelkoepel direct te verstoren.
2. Blijf incuberen in een endotheelcelgroeimedium bij 37 °C in een bevochtigde broedmachine met 5% CO₂. Menselijke orale mucosale fibroblasten worden gebruikt als ondersteunende cellen omdat ze stromale paracriene signalen leveren die endotheliale spruiten, stabilisatie en vaatachtige remodellering in het driedimensionale kweeksysteem bevorderen.

6. Kweekbehoud en microscopische observatie

1. Vervang het kweekmedium elke 2 dagen. Tijdens het wisselen van medium aspireer je het gebruikte medium langzaam en voeg je vers kweekmedium toe langs de wand van de put om verstoring van de gel te voorkomen.
2. Bekijk de culturen dagelijks of om de dag onder een omgekeerde microscoop met behulp van brightfield- of fasecontrastmodus. Voor longitudinale kwantitatieve analyse selecteer je meerdere gezichtsvelden in elke put op dag 7 en fotografeer je dezelfde vooraf gedefinieerde velden op dag 9 en 11.
3. Onder optimale kweekomstandigheden wordt duidelijke endotheliale kiemvorming meestal waargenomen op dag 4–6, luminenachtige structuren verschijnen op dag 5–7, en ontstaan na dag 7 geleidelijk verbonden microvasculaire netwerken.
4. Definieer succesvolle ontkieming als de aanwezigheid van meerdere endotheeluitbreidingen die radiaal van het kraaloppervlak naar de omliggende driedimensionale matrix groeien. Een spruit mag alleen worden geteld wanneer deze duidelijk voorbij het kraaloppervlak uitsteekt en verbonden blijft met de kraal-geassocieerde endotheelcellaag.
5. Definieer de vorming van lumenachtige structuren als het verschijnen van langgerekte endotheelstructuren met een zichtbare centrale heldere ruimte of buisvormige morfologie. Verbindingen tussen kiemen worden gedefinieerd als directe contacten of continue structuren die gevormd worden tussen aangrenzende kiemen.
6. Culturen met uitgebreide celdood, ernstige korrelaggregatie, verstoorde gelstructuur, overvloedige bellen, matrixinzakking of slechts korte, onregelmatige celuitstulpingen moeten als suboptimaal worden beschouwd en uitgesloten worden van kwantitatieve analyse.

7. Beeldverwerving en kwantitatieve analyse

1. Selecteer meerdere gezichtsvelden in elke put op dag 7 en verkrijg afbeeldingen uit dezelfde vooraf gedefinieerde velden op dag 9 en 11. Beelden moeten op elk moment worden verzameld met identieke vergroting, belichtingsinstellingen en beeldomstandigheden.
2. Kwantificeer het aantal spruiten per microcarrier-kraal en het vasculariseerde gebied.
   1. Voor het meten van een vasculariserend gebied gebruik je open-source beeldanalysesoftware. Open de gemaakte afbeelding en zet handmatig de grens van het vascularisatiegebied van belang (ROI) af met behulp van het polygon- of vrijhandselectiegereedschap. Voeg de geselecteerde ROI toe aan de ROI-manager.
   2. Voor visualisatie gebruik je een regio-van-interesse visualisatieplugin om de omschreven ROI weer te geven. Schakel oppervlaktemeting in de meetinstellingen in en meet de geselecteerde ROI om het vasculariseerde gebied te verkrijgen. Pas dezelfde analyse-instellingen toe op alle afbeeldingen.
   3. Voor de analyse van de angiogene snelheid gebruik je het vascularisatiegebied op dag 7 als basislijn en bereken je de relatieve verandering in het vascularisatiegebied op dag 9 en 11.
3. Tel het aantal individuele spruiten onafhankelijk door drie waarnemers en gebruik de gemiddelde waarde voor de analyse.

Resultaten

Angiogenese in het driedimensionale HUVEC-model

In succesvol gevestigde culturen zijn endotheelcellen gelijkmatig verdeeld over het oppervlak van de microdragerkralen, en wordt er geen duidelijke korrelaggregatie waargenomen. Dynamische observatie toonde progressieve endotheelontkieming en vorming van microvasculair vergelijkbaar netwerk op dag 7, 9 en 11 (Figuur 1A). Kwantitatieve analyse bevestigde verder de pro...

Discussie

Het huidige protocol beschrijft een aangepast driedimensionaal endotheliaal ontkiemingsmodel gebaseerd op microcarrierkralen. Figuur 3 geeft een schematisch overzicht van de experimentele workflow. Het protocol is aangepast van de klassieke angiogenese-assay gerapporteerd door Nakatsu en Hughes en geoptimaliseerd om te voldoen aan de doelstellingen van de huidige studie ^8,9. In het klassieke ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1.5 mL microcentrifuge tube	Beyotime	FTUB306	Duidelijk, nuclease-vrij
15 mL centrifuge tube	Haier	311005	Conische bodem, steriele, zakverpakking
24-well cell culture plate	Haier	612003	Vlakbodem, weefselkweekbehandeld, afzonderlijk verpakt, voor adhesieve celkweek
Automated cell counting slide	Countstar	12-0005-50	Wegwerpslide voor geautomatiseerde celteller, 50 slides/doos
CO2 cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific	3110	Gebruikt voor celkweek bij 37 °C met 5% CO2
Cytodex 3 microcarriers	Cytiva	17048503	Droge poeder; collageen-gecoate dextran microcarrier korrels
Dotted Line plugin	N/A	N/A	Plugin voor visualisatie van geïnteresseerde regio's die wordt gebruikt voor het weergeven van omlijnde gevasculariseerde gebieden
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose	EvaCell (EVA Life Sciences)	E2102	DMEM basic (1×), bevat 4,5 g/L D-glucose, L-glutamine en 110 mg/L natriumpyruvaat, 500 mL
Endothelial Cell Medium (ECM)	ScienCell Research Laboratories	1001	Weefselkweekmedium voor endotheelcellen, aangevuld met extra FBS tot een uiteindelijke concentratie van 10% voor gebruik
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10099141C	Gekwalificeerd, single-use formaat, Australische oorsprong, 500 mL
Human oral mucosal fibroblasts (HOMFs)	Jiemei Zhai onderzoeksgroep, The Affiliated Stomatological Hospital of Kunming Medical University	N/A	Primaire fibroblasten geïsoleerd uit menselijke orale mucosa; vriendelijk ter beschikking gesteld door een ander laboratorium
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)	In-house	N/A	Primaire endotheelcellen geïsoleerd uit menselijke navelstrengsaders; geen catalogusnummer
ImageJ software	National Institutes of Health (NIH), USA	N/A	Open-source software; versie 1.54p
Inverted microscope	Olympus, Japan	N/A	Voor helderveld, fasecontrast en fluorescentie beeldvorming
Laser scanning confocal microscope	Nikon, Japan	N/A	Voor confocale beeldvorming; model niet gespecificeerd
Matrigel basement membrane matrix	Corning	354262	Hoge concentratie (HC), fenol rood-vrij, LDEV-vrij, 10 mL
Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep)	Gibco	15140-122	Penicilline-streptomycine oplossing voor celkweek, 100×, 100 mL
Phosphate-buffered saline (PBS)	LiJi Bio	AC08L011	1×, steriele, 500 mL
T25 cell culture flask	ABCBIO	ABC707008	T25, geventileerde dop, weefselkweekbehandeld, voor adhesieve celkweek
Trypsin-EDTA (0,25%)	Gibco	25200-056	0,25% trypsine-EDTA oplossing, 100 mL