Een op microcarrier bead gebaseerd driedimensionaal angiogenesemodel met behulp van menselijke navelvenendotheelcellen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een op microcarrier bead gebaseerd driedimensionaal angiogenesemodel met behulp van menselijke navelvenendotheelcellen. De assay maakt directe visualisatie van endotheliale ontkieming en de vorming van lumenachtige structuren mogelijk en kan worden toegepast op studies van angiogene mechanismen en therapeutische interventies.

Samenvatting

Angiogenese is een meerstaps biologisch proces waarbij endotheelcellen worden geactiveerd, migreren, verlengd, lumenvorming, vertakking en anastomose worden gebruikt. Conventionele tweedimensionale kweeksystemen zijn nuttig voor de voorlopige evaluatie van geneesmiddelen, genen of kweekomstandigheden, maar ze geven de ruimtelijke organisatie van endotheelmorfogenese binnen een driedimensionale extracellulaire matrix niet adequaat weer in een ruimtelijke organisatie. Het huidige protocol beschrijft een op microcarrier bead gebaseerde driedimensionale angiogenese-assay met behulp van menselijke navelvenendotheelcellen (HUVECs). De HUVEC's worden eerst gezaaid op microcarrier-kralen met chemisch gekoppelde, zuur-gedenatureerde varkenscollageen type I en vervolgens ingesloten in een basalmembraanmatrix. Mondslijmvliesfibroblasten worden vervolgens bovenop de gel geplant om paracriene ondersteuning te bieden voor endotheliale kiemen en de vorming van vaatachtige structuren. Het kweekmedium wordt elke 2 dagen vervangen en het kiemgedrag en de angiogene fenotypen worden gemonitord met omgekeerde microscopie. Onder geschikte kweekomstandigheden ontstaan endotheeluitlopers binnen enkele dagen, gevolgd door de vorming van lumenachtige structuren en verbindingen tussen de kiemen. Deze methode biedt een handig en reproduceerbaar platform voor in vitrostudies van endotheelmorfogenese en kan verder worden toegepast op onderzoek naar genmanipulatie, farmacologische interventie en ziektemodellering.

Inleiding

Endotheliale kiemvorming is een belangrijk evenement in angiogenese en omvat het ontstaan, migreren, proliferatie en uitlijnen van endotheelcellen uit bestaande vaatstructuren, gevolgd door de vorming van lumen en het vestigen van onderling verbonden vasculaire netwerken ^1,2. Hoewel conventionele tweedimensionale kweeksystemen en gel-gebaseerde buisvormingsassays technisch eenvoudig zijn, zijn ze beperkt in hun vermogen om de ruimtelijke hermodellering van endotheelcellen binnen een driedimensionale microomgeving^te recapituleren ^3,4. De klassieke driedimensionale kiemtest gebaseerd op microcarrierkralen reproduceert verschillende stadia van angiogenese in vitro, waaronder endotheelontkieming, verlenging, lumenvorming en netwerkassemblage, en is daardoor een veelgebruikte methode geworden voor angiogeneseonderzoek.

In het huidige protocol is een driedimensionaal microcarrier-kraalmodel opgebouwd met gebruikmaking van normale menselijke navelvenendotheelcellen. Gebaseerd op eerder gerapporteerde endotheliale microcarrier bead spruitingsassays ^5,6,7, behoudt deze methode het basiskader van endotheelcelcoating op microcarrier-korrels, inbedding in een driedimensionale matrix en fibroblast-overlaycultuur, terwijl een basale membraanmatrix wordt vervangen door conventionele fibrinegel om het proces te vereenvoudigen en routinematige beeldvorming te vergemakkelijken. De basalmembraanmatrix werd in dit aangepaste protocol om verschillende praktische en biologische redenen gekozen. Experimenteel biedt het een kant-en-klare driedimensionale matrix die snelle gelvorming, eenvoudige kraalinbedding en handige routinematige microscopische observatie mogelijk maakt zonder de extra polymerisatiestappen die nodig zijn voor de voorbereiding van fibrinegel. Biologisch bevat de basale membraanmatrix extracellulaire matrixcomponenten die endotheelceladhesie, migratie, uitspruituitbreiding en de vorming van lumenachtige structuren ondersteunen. Daarom is deze modificatie geschikt voor studies die directe visualisatie van endotheliale kiemgedrag, vergelijking van angiogene fenotypes en evaluatie van farmacologische of genetische interventies in een driedimensionale kweekomgeving vereisen. Omdat de basale membraanmatrix echter verschilt van fibrinegel in matrixsamenstelling, mechanische eigenschappen, afbreekbaarheid en bioactieve aanwijzingen, moet de huidige assay worden geïnterpreteerd als een gemodificeerd microcarrier-kraal-gebaseerd ontkiemingsmodel in plaats van een directe vervanging van de klassieke fibrine-gebaseerde assay. Deze matrix-gerelateerde verschillen kunnen invloed hebben op de kiemkinetiek, de stabiliteit van het lumen en de netwerkmorfologie, en moeten worden meegewogen bij het vergelijken van resultaten tussen verschillende driedimensionale angiogenesesystemen. Dit model is geschikt om endotheliale spruitgedrag in drie dimensies te observeren en kan verder worden toegepast op studies naar farmacologische interventie, genmanipulatie en angiogene mechanismen.

Protocol

Menselijke navelvenendotheelcellen die in dit protocol worden gebruikt, werden geïsoleerd en gekweekt uit menselijke navelstrengweefsels verzameld van de afdeling Verloskunde van het First People's Hospital van de provincie Yunnan. Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle donoren voorafgaand aan de monsterafname. Alle procedures met betrekking tot menselijk afgeleide materialen zijn goedgekeurd door de Medische Ethische Commissie van het Eerste Volksziekenhuis van de provincie Yunnan (goedkeuringsnummer KHLL2023-KY198). Menselijke orale mucosale fibroblasten (HOMF's) werden vriendelijk geleverd door de onderzoeksgroep van Dr. Jiemei Zhai van het Affiliated Stomatological Hospital van de Kunming Medical University. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Celvoorbereiding

1. Kweek menselijke navelvenendotheelcellen (HUVECs) in een endotheelcellengroeimedium, aangevuld met extra foetaal rundserum (FBS) tot een uiteindelijke concentratie van 10% bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO₂. Cellen die voor de assay worden gebruikt, moeten vrij zijn van besmetting, stabiele groei vertonen en zich in de logaritmische groeifase bevinden. Gebruik cellen bij passage 4–6.
2. Kweek menselijke orale mucosale fibroblasten (HOMF's) in een basaal medium met een hoog glucosegehalte aangevuld met 10% foetaal rundserum (FBS) bij 37 °C in een bevochtigde broedmachine met 5% CO₂. Gebruik cellen bij passage 4–6.
3. Controleer voordat je microcarrier bead coating op een geschikte confluence zit. Vermijd overconfluente culturen of overmatige enzymatische spijsvertering, omdat deze de volgende kieming negatief kunnen beïnvloeden.

2. Bereiding van microcarrier-kralen

1. Hydrateer 0,5 g droge microcarrier-kralen in 50 ml PBS gedurende minstens 3 uur. Na het wassen worden de kralen opnieuw opgehangen in 50 mL PBS om een 10 mg/mL microcarrier-korrelsuspensie te verkrijgen, ongeveer 3 × 10⁴ kralen/mL.
2. Breng de suspensatie over in een siliconenglazen fles, steriliseer deze door te autoclaveren bij 115 °C gedurende 15 minuten, en bewaar het op 4 °C tot gebruik.
3. Verwijder vóór het coaten van endotheelcellen de opslagoplossing en was de kralen met steriele PBS. Evenwicht de kralen in het endotheelcellengroeimedium bij 37 °C gedurende minstens 30 minuten.
4. Suspendeer de gebalanceerde kralen voorzichtig direct voor gebruik om sedimentatie en ballenophoping te voorkomen.
5. Voordat je de celcoating aanbrengt, bekijk je een kleine aliquot van de kraal-suspensie onder een omgekeerde microscoop. Ga alleen verder wanneer de kralen volledig gehydrateerd, gelijkmatig zijn gesuspendeerd en vrij van zichtbare aggregaten of gefragmenteerde deeltjes.

3. Het coaten van endotheelcellen op microdragerkorrels

1. Koppel HUVEC's af met trypsine en laat de cellen opnieuw ophangen in het endotheelcelgroeimedium.
2. Bedek de microdragerkralen met een dichtheid van 1.500 cellen per kraal. Meng 3 × 10 6 HUVECs met 2.000 microcarrierkralen in 1,5 mL endotheelcelgroeimedium.
3. Breng het cel-kraalmengsel over in een microcentrifugebuis en incubeer 12 uur in een celkweekincubator. Gedurende de volledige 12 uur durende incubatieperiode keer je de buis voorzichtig eens in de 20 minuten om voldoende contact tussen de cellen en de kralen te behouden en om uniforme endotheelcelhechting te bevorderen.
4. Na 12 uur wordt de gecoate kralen overgebracht in een 25^cm celkwekelkolf met 4 ml endotheelcelgroeimedium en wordt de incubatie 's nachts voortgezet om de endotheelcellen stevig aan het oppervlak van de microdragerkorrel vast te zetten.
5. Voordat je inzet, bekijk representatieve gecoate kralen onder een omgekeerde microscoop. Ga alleen over tot matrix-inbedding wanneer meer dan 80% van de onderzochte kralen een continue en relatief uniforme endotheelcellaag op het kraaloppervlak vertoont, met minimale vrij zwevende cellen, geen duidelijke celklonten en geen ernstige korrelaggregatie. Kralen met ongelijke coating, grote celclusters of uitgebreide aggregatie mogen niet worden gebruikt voor inbedding.
6. Als de kralen aan de onderkant van de kolf blijven plakken, schud dan voorzichtig de fles om ze los te laten. Vermijd intensief pipetteren, dat kan leiden tot korrelvorming of celloslating.

4. Het inbedden van de gecoate kralen in een driedimensionale matrix

1. Breng de met endotheelcellen bedekte microdragerparels over in een centrifugebuis van 15 mL en laat de kralen door de zwaartekracht zakken. Verwijder het overtollige medium en voeg een passende hoeveelheid verse medium toe.
2. Meng de microcarrier-korrelsuspensie met voorgekoelde basalmembraanmatrix in een verhouding van 1:1 (v/v) om een eindkorrelconcentratie van 500 korrels/ml te verkrijgen.
3. Voeg 100 μL van de matrix-korrel suspensie toe aan het midden van elke put van een 24-put plaat, zodat het mengsel een enkele koepelvormige geldruppel kan vormen zonder contact te maken met de wand van de put. Meng de suspensie voorzichtig direct voor het doseeren en vermijd het toevoegen van luchtbellen.
4. Laat de 24-well-plaat 5 minuten op kamertemperatuur staan om de initiële gelatie en stabilisatie van de geldruppel mogelijk te maken. Daarna incubeer je de plaat rechtop bij 37 °C in 5% CO₂ gedurende 15 minuten, gevolgd door nog eens 15 minuten incubatie in omgekeerde positie om volledige gelatie en correcte gelvorming te garanderen.
5. Nadat de gel volledig is gestold, ga je direct over tot fibroblast-overlay-kweek.

5. Fibroblast-overlaycultuur

1. Suspendeer 3 × 10⁴ menselijke orale mucosale fibroblasten (HOMF's) opnieuw in 1 ml endotheelcelgroeimedium en voeg de celsuspensie voorzichtig toe langs de wand van elke put, zodat de cellen zich over het geloppervlak kunnen verspreiden zonder de gelkoepel direct te verstoren.
2. Blijf incuberen in een endotheelcelgroeimedium bij 37 °C in een bevochtigde broedmachine met 5% CO₂. Menselijke orale mucosale fibroblasten worden gebruikt als ondersteunende cellen omdat ze stromale paracriene signalen leveren die endotheliale spruiten, stabilisatie en vaatachtige remodellering in het driedimensionale kweeksysteem bevorderen.

6. Kweekbehoud en microscopische observatie

1. Vervang het kweekmedium elke 2 dagen. Tijdens het wisselen van medium aspireer je het gebruikte medium langzaam en voeg je vers kweekmedium toe langs de wand van de put om verstoring van de gel te voorkomen.
2. Bekijk de culturen dagelijks of om de dag onder een omgekeerde microscoop met behulp van brightfield- of fasecontrastmodus. Voor longitudinale kwantitatieve analyse selecteer je meerdere gezichtsvelden in elke put op dag 7 en fotografeer je dezelfde vooraf gedefinieerde velden op dag 9 en 11.
3. Onder optimale kweekomstandigheden wordt duidelijke endotheliale kiemvorming meestal waargenomen op dag 4–6, luminenachtige structuren verschijnen op dag 5–7, en ontstaan na dag 7 geleidelijk verbonden microvasculaire netwerken.
4. Definieer succesvolle ontkieming als de aanwezigheid van meerdere endotheeluitbreidingen die radiaal van het kraaloppervlak naar de omliggende driedimensionale matrix groeien. Een spruit mag alleen worden geteld wanneer deze duidelijk voorbij het kraaloppervlak uitsteekt en verbonden blijft met de kraal-geassocieerde endotheelcellaag.
5. Definieer de vorming van lumenachtige structuren als het verschijnen van langgerekte endotheelstructuren met een zichtbare centrale heldere ruimte of buisvormige morfologie. Verbindingen tussen kiemen worden gedefinieerd als directe contacten of continue structuren die gevormd worden tussen aangrenzende kiemen.
6. Culturen met uitgebreide celdood, ernstige korrelaggregatie, verstoorde gelstructuur, overvloedige bellen, matrixinzakking of slechts korte, onregelmatige celuitstulpingen moeten als suboptimaal worden beschouwd en uitgesloten worden van kwantitatieve analyse.

7. Beeldverwerving en kwantitatieve analyse

1. Selecteer meerdere gezichtsvelden in elke put op dag 7 en verkrijg afbeeldingen uit dezelfde vooraf gedefinieerde velden op dag 9 en 11. Beelden moeten op elk moment worden verzameld met identieke vergroting, belichtingsinstellingen en beeldomstandigheden.
2. Kwantificeer het aantal spruiten per microcarrier-kraal en het vasculariseerde gebied.
   1. Voor het meten van een vasculariserend gebied gebruik je open-source beeldanalysesoftware. Open de gemaakte afbeelding en zet handmatig de grens van het vascularisatiegebied van belang (ROI) af met behulp van het polygon- of vrijhandselectiegereedschap. Voeg de geselecteerde ROI toe aan de ROI-manager.
   2. Voor visualisatie gebruik je een regio-van-interesse visualisatieplugin om de omschreven ROI weer te geven. Schakel oppervlaktemeting in de meetinstellingen in en meet de geselecteerde ROI om het vasculariseerde gebied te verkrijgen. Pas dezelfde analyse-instellingen toe op alle afbeeldingen.
   3. Voor de analyse van de angiogene snelheid gebruik je het vascularisatiegebied op dag 7 als basislijn en bereken je de relatieve verandering in het vascularisatiegebied op dag 9 en 11.
3. Tel het aantal individuele spruiten onafhankelijk door drie waarnemers en gebruik de gemiddelde waarde voor de analyse.

Resultaten

Angiogenese in het driedimensionale HUVEC-model

In succesvol gevestigde culturen zijn endotheelcellen gelijkmatig verdeeld over het oppervlak van de microdragerkralen, en wordt er geen duidelijke korrelaggregatie waargenomen. Dynamische observatie toonde progressieve endotheelontkieming en vorming van microvasculair vergelijkbaar netwerk op dag 7, 9 en 11 (Figuur 1A). Kwantitatieve analyse bevestigde verder de progressieve angiogene respons in dit model. Met dag 7 als uitgangspunt werd het angiogene percentage op dag 7 op 0% gezet en bereikte het 66,94% ± 18,49% op dag 9 en 169,51% ± 100,83% op dag 11, wat wijst op een progressieve uitbreiding van het vasculariseerde gebied tijdens de teelt (Figuur 1B). Representatieve brightfield-beeldvorming toonde aan dat endotheelkiemen radiaal van het kraaloppervlak naar de omringende driedimensionale matrix kwamen na 7 dagen kweek (Figuur 1C). Daarnaast gaf confocale microscopie een overzicht van de grove morfologie en ruimtelijke organisatie van het driedimensionale cultuursysteem (Figuur 1D). Het gemiddelde aantal spruiten per microcarrierkraal was 31,3 spruiten per kraal, gebaseerd op onafhankelijke tellingen van drie waarnemers (Figuur 1E). Deze bevindingen geven aan dat het model endotheliale spruiting, verlenging, lumenachtige morfologie en vasculair-achtige hervorming ondersteunt in een driedimensionale omgeving.

Suboptimale uitkomsten in het driedimensionale HUVEC-model

In mislukte of suboptimale culturen kunnen verschillende karakteristieke afwijkingen worden waargenomen, waaronder celdood (Figuur 2A), ruptuur van de microdragerkralen (Figuur 2B), abnormale celaggregatie op het kraaloppervlak (Figuur 2C), uitgebreide bubbelvorming binnen de gel (Figuur 2D), lokale instorting van de matrix (Figuur 2E), een buitensporig hoge kraaldichtheid (Figuur 2F), ongelijke celcoating op de microdragerkralen (Figuur 2G)), kralenaggregatie (Figuur 2H), en ofwel geen duidelijke kiemvorming of slechts beperkte ontkiemvorming (Figuur 2I,J). Deze afwijkingen suggereren dat succesvolle vestiging van het model mogelijk wordt beïnvloed door onvoldoende cellenlevensvatbaarheid, onvoldoende celcoating, onjuiste temperatuurregeling van de basale membraanmatrix, te krachtige resuspendering of verstoring van de gel tijdens mediumvervanging.

Figuur 1: Angiogenese in het driedimensionale HUVEC-model. (A) Dynamische beoordeling van angiogenese in het driedimensionale HUVEC-model op dag 7, 9 en 11. Beelden werden gemaakt met 20× vergroting. Schaalbalk = 10 μm. (B) Kwantitatieve analyse van de angiogene snelheid. De angiogene snelheid werd gedefinieerd als de relatieve verandering in het vasculariste gebied over de tijd op dag 7, 9 en 11, waarbij dag 7 als uitgangspunt diende. Het werd berekend als: angiogene snelheid = [(vasculariseerd gebied op het aangegeven tijdstip − vasculariseerd gebied op dag 7) / vasculariseerd gebied op dag 7] × 100%. Angiogene snelheidsgegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD uit drie onafhankelijke experimenten. (C) Representatief beeld van endotheelkiemen in HUVECs na 7 dagen kweek. Het beeld werd verkregen met 20× vergroting. Schaalbalk = 10 μm. (D) Confocale overzichtsafbeelding die de grove morfologie van het driedimensionale kweeksysteem toont. De afbeelding werd gemaakt met een 4× scan. Schaalbalk = 500 μm. (E) Kwantitatieve analyse van het kiemgetal in HUVECs. Het aantal spruiten werd onafhankelijk geteld door drie waarnemers, en de gemiddelde waarde werd gebruikt voor de analyse. Voor deze beschrijvende kwantitatieve analyses werd geen statistische vergelijking uitgevoerd. De endotheelontkiemstructuren die in deze figuur worden getoond, zijn afgeleid van HUVEC-gecoate microdragerkralen; HOMF's werden gebruikt als overlay-ondersteunende cellen en waren niet specifiek gelabeld in de afbeeldingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Suboptimale uitkomsten in het driedimensionale HUVEC-model. (A) Celdood. Zoals aangegeven door de witte pijl, verschijnen de cellen als punctate puin, en wordt het oppervlak van de microcarrier-kraal glad. Schaalbalk = 50 μm. (B) Ruptuur van de microdragerkraal, zoals aangegeven door de witte pijl. Schubbalk = 50 μm. (C) Celaggregatie op het oppervlak van de microcarrier-kraal. Zoals aangegeven door de witte pijl, vertonen de cellen een kraalachtig, geclusterd uiterlijk. Schaalbalk = 50 μm. (D) Uitgebreide bubbelvorming binnen de gel, zoals aangegeven door de witte pijl. Schaalbalk = 100 μm. (E) Lokale inzinking van de matrix, zoals aangegeven door de witte pijl. Schaalstaaf = 10 μm. (F) Buitensporig hoge microcarrier-kraaldichtheid. Schaalbalk = 10 μm. (G) Ongelijke celcoating op de microcarrier-kraal. Zoals aangegeven door de witte pijl, blijft één kant van het kralenoppervlak glad. Schaalbalk = 50 μm. (H) Kralenaggregatie. Schaalbalk = 50 μm. (I,J) Geen duidelijke ontkieming of slechts beperkte kiemvorming. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Schematische illustratie van de experimentele workflow. (A) Bereiding van HUVECs, HOMF's en microcarrier-kralen met chemisch gekoppeld zuur-gedenatureerd porcine type I collageen onder geschikte omstandigheden vóór assay-opstelling. (B) Menging van HUVECs met de voorbereide microcarrierkralen om de hechting van endotheelcellen aan het kraaloppervlak te bevorderen. (C) Kralencoating-incubatie met zachte inversie elke 20 minuten gedurende 12 uur om een uniforme hechting van endotheelcellen te bevorderen. (D) Overbrengen van gecoate kralen naar een kweekkolf voor verdere incubatie om een stevige hechting van endotheelcellen aan het oppervlak van de microdragerkraal mogelijk te maken. (E) Inbedding van HUVEC-gecoate microdragerkralen in een basale membraanmatrix, gevolgd door het zaaien van HOMF's bovenop de gel om stromale paracriene ondersteuning te bieden voor endotheelontkieming en vasculaire remodellering. (F) Microscopische observatie en kwantitatieve analyse van endotheelkiem, lumenachtige structuurvorming, verbindingen tussen kiemen, kiemaantallen en vasculariseerd gebied op dag 7, 9 en 11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Het huidige protocol beschrijft een aangepast driedimensionaal endotheliaal ontkiemingsmodel gebaseerd op microcarrierkralen. Figuur 3 geeft een schematisch overzicht van de experimentele workflow. Het protocol is aangepast van de klassieke angiogenese-assay gerapporteerd door Nakatsu en Hughes en geoptimaliseerd om te voldoen aan de doelstellingen van de huidige studie ^8,9. In het klassieke systeem worden endotheelcellen bedekt met collageen-gecoate microdragerkralen, ingebed in een driedimensionale matrix, en geco-cultureerd met fibroblasten om kiem, verlenging, lumenvorming en vasculair-achtige anastomose ^7,10 te ondersteunen. In het huidige protocol werd een basale membraanmatrix gebruikt in plaats van fibrinegel, en werden menselijke orale mucosale fibroblasten als ondersteunende cellen gebruikt, waarmee een handig driedimensionaal kweeksysteem werd gecreëerd voor in vitro observatie van endotheliale angiogene gedrag. De ontkiemende structuren die op de representatieve afbeeldingen worden getoond, zijn afgeleid van HUVEC-gecoate microdragerkralen, terwijl menselijke orale mucosale fibroblasten worden gezaaid als overlay-ondersteunende cellen en niet specifiek in deze beelden zijn gelabeld.

Een belangrijk kenmerk van dit protocol is het gebruik van een basale membraanmatrix in plaats van het klassieke fibrinegelsysteem. Experimenteel vereenvoudigt de basalmembraanmatrix de assay-opstelling omdat deze klaar is voor gebruik, snelle temperatuurafhankelijke gelatie ondergaat en het gemakkelijk inbedden van endotheelcel-gecoate microdragerkorrels mogelijk maakt zonder aparte voorbereiding van fibrinogen, trombine of aprotinine. Deze eigenschap maakt het protocol relatief eenvoudig en geschikt voor routinematige microscopische observatie. Deze modificatie verandert echter ook de biologische micro-omgeving van de assay. In tegenstelling tot fibrinegel bevat de basale membraanmatrix extracellulaire matrixcomponenten en bioactieve aanwijzingen die de endotheeladhesie, migratie, uitspruiting, lumenachtige morfologie en netwerkremodellering kunnen beïnvloeden. Daarnaast kunnen verschillen in matrixstijfheid, degradatie en ligandensamenstelling invloed hebben op de kiemkinetiek en netwerkmorfologie. Daarom moeten de resultaten die met deze aangepaste assay zijn verkregen, worden geïnterpreteerd als uitkomsten van een basalmembraanmatrix-gebaseerd microcarrier bead spruitmodel en niet als een direct equivalent van de oorspronkelijke fibrine-gebaseerde assay.

Het succesvol opzetten van dit model hangt af van verschillende cruciale stappen. Uniforme endotheelcelcoating op het oppervlak van de microcarrier-parel is essentieel voor een consistente kieminitiatie en -extensie. Onvoldoende of ongelijke coating kan leiden tot een lager aantal kiemen, slechte richtingsgroei en verminderde reproduceerbaarheid. Stabiele gelvorming is een andere belangrijke factor voor assayprestaties. Tijdens matrixvoorbereiding en inbedding kan onjuiste temperatuurregeling leiden tot voortijdige gelatie, ongelijke parelverdeling of bubbelvorming, die allemaal de endotheelkiemvorming kunnen belemmeren. Daarnaast zijn ondersteunende fibroblasten nodig om aanhoudende paracriene signalen te leveren die de groei en stabilisatie van de kiemen bevorderen. Zorgvuldige controle van deze stappen is daarom essentieel voor stabiele en reproduceerbare resultaten.

Verschillende maatregelen kunnen de consistentie van de assay verbeteren. De representatieve suboptimale uitkomsten die in Figuur 2 worden getoond, kunnen worden gebruikt als praktische indicatoren voor probleemoplossing. Uitgebreide celdood kan het gevolg zijn van slechte cellevensvatbaarheid, oververtering tijdens celloslating, een onjuist aantal passages of vertraagde mediumvervanging; Daarom worden gezonde logaritmische-fase endotheelcellen en een zachte enzymatische vertering aanbevolen. Ruptuur van microcarrier-korrels of korrelaggregatie kan worden veroorzaakt door krachtig pipetteren, overmatige mechanische beweging of onvoldoende parel-resuspension, en kan worden verminderd door voorzichtig mengen en zorgvuldig hanteren tijdens de voorbereiding en coating. Ongelijke endotheelcelcoating of grote celclusters op het kraaloppervlak duiden meestal op onvoldoende menging, een hoge celdichtheid of onvoldoende contact tussen kralen en celen tijdens de coatingperiode; In dit geval moet de celkorrel-suspensie voorzichtig op regelmatige afstanden worden omgekeerd en onderzocht worden voordat ze worden ingebed. Bel vorming en lokale matrixinstorting worden vaak in verband gebracht met onjuiste matriksbehandeling, voortijdige gelatie of verstoring van de gel tijdens toevoeging of vervanging van het medium; Het bevriezen van de matrix vóór gebruik, het vermijden van luchtbellen tijdens het doseren, het toestaan van volledige gelatie en het langzaam toevoegen van medium langs de putwand kan deze problemen verminderen. Culturen die geen duidelijke kiemvorming of slechts beperkte kiemvorming vertonen, kunnen wijzen op een slechte endotheelcelbinding, lage levensvatbaarheid van cellen, onvoldoende ondersteuning van fibroblasten of onstabiele matrixvorming, en moeten worden uitgesloten van de kwantitatieve analyse.

In vergelijking met conventionele tweedimensionale buisvormingsassays reproduceert dit driedimensionale microcarrier-kraalmodel effectiever het ruimtelijke gedrag van endotheelcellen binnen een extracellulaire matrix en maakt het visualisatie mogelijk van endotheliale spruiting, verlenging, lumenachtige structuurvorming en netwerkassemblage. Daarnaast biedt de driedimensionale kweekomgeving omstandigheden die meer lijken op in vivo nutriënten- en signaalverdeling^11,12. In vergelijking met microfluidische vaatchipsystemen, die vaak technisch veeleisend en kostbaar zijn, is deze methode relatief eenvoudig, reproduceerbaar en kosteneffectief, waardoor het goed geschikt is voor routinematige in vitro studies van angiogenese.

Een belangrijke beperking van dit protocol is dat een basale membraanmatrix werd gebruikt als vervanging voor het klassieke fibrinegelsysteem. Om deze reden moet de huidige assay worden beschouwd als een aangepaste versie van het eerder gerapporteerde endotheliale microcarrier kraalkiemmodel, in plaats van een directe replica van de oorspronkelijke fibrine-gebaseerde methode. Omdat verschillende matrices verschillen in samenstelling, mechanische eigenschappen en afbraakgedrag, kunnen ze invloed hebben op de kiemkinetiek, lumenstabiliteit en de morfologie van het vaatstelsel 13,14,15. Daarom is voorzichtigheid geboden bij het vergelijken van resultaten die met dit model zijn verkregen met die gegenereerd met conventionele fibrine-gebaseerde systemen.

Dit model heeft potentiële toepassingen buiten de observatie van basale endotheliale ontkieming. Het kan ook worden aangepast voor farmacologische interventiestudies, gen-overexpressie- of knockdown-experimenten, analyse van signaalroutes en onderzoeken naar ziekte-geassocieerde endotheelfenotypes^16,17. Met verdere optimalisatie kan deze driedimensionale kiemtest dienen als een betrouwbaar in vitro platform voor het bestuderen van mechanismen van vasculaire ontwikkeling en therapeutische strategieën gericht op angiogenese.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1.5 mL microcentrifuge tube	Beyotime	FTUB306	Duidelijk, nuclease-vrij
15 mL centrifuge tube	Haier	311005	Conische bodem, steriele, zakverpakking
24-well cell culture plate	Haier	612003	Vlakbodem, weefselkweekbehandeld, afzonderlijk verpakt, voor adhesieve celkweek
Automated cell counting slide	Countstar	12-0005-50	Wegwerpslide voor geautomatiseerde celteller, 50 slides/doos
CO2 cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific	3110	Gebruikt voor celkweek bij 37 °C met 5% CO2
Cytodex 3 microcarriers	Cytiva	17048503	Droge poeder; collageen-gecoate dextran microcarrier korrels
Dotted Line plugin	N/A	N/A	Plugin voor visualisatie van geïnteresseerde regio's die wordt gebruikt voor het weergeven van omlijnde gevasculariseerde gebieden
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose	EvaCell (EVA Life Sciences)	E2102	DMEM basic (1×), bevat 4,5 g/L D-glucose, L-glutamine en 110 mg/L natriumpyruvaat, 500 mL
Endothelial Cell Medium (ECM)	ScienCell Research Laboratories	1001	Weefselkweekmedium voor endotheelcellen, aangevuld met extra FBS tot een uiteindelijke concentratie van 10% voor gebruik
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10099141C	Gekwalificeerd, single-use formaat, Australische oorsprong, 500 mL
Human oral mucosal fibroblasts (HOMFs)	Jiemei Zhai onderzoeksgroep, The Affiliated Stomatological Hospital of Kunming Medical University	N/A	Primaire fibroblasten geïsoleerd uit menselijke orale mucosa; vriendelijk ter beschikking gesteld door een ander laboratorium
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)	In-house	N/A	Primaire endotheelcellen geïsoleerd uit menselijke navelstrengsaders; geen catalogusnummer
ImageJ software	National Institutes of Health (NIH), USA	N/A	Open-source software; versie 1.54p
Inverted microscope	Olympus, Japan	N/A	Voor helderveld, fasecontrast en fluorescentie beeldvorming
Laser scanning confocal microscope	Nikon, Japan	N/A	Voor confocale beeldvorming; model niet gespecificeerd
Matrigel basement membrane matrix	Corning	354262	Hoge concentratie (HC), fenol rood-vrij, LDEV-vrij, 10 mL
Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep)	Gibco	15140-122	Penicilline-streptomycine oplossing voor celkweek, 100×, 100 mL
Phosphate-buffered saline (PBS)	LiJi Bio	AC08L011	1×, steriele, 500 mL
T25 cell culture flask	ABCBIO	ABC707008	T25, geventileerde dop, weefselkweekbehandeld, voor adhesieve celkweek
Trypsin-EDTA (0,25%)	Gibco	25200-056	0,25% trypsine-EDTA oplossing, 100 mL