Isoflurane-geassisteerde elektroacupunctuur in een rattenmodel van oligoasthenozoospermie

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de oprichting van een adenine-geïnduceerd oligoasthenozoospermiemodel bij ratten en de daaropvolgende toediening van elektroacupunctuur bij CV3, CV4, ST36 en SP6 onder isoflurane anesthesie. De uitkomsten werden geverifieerd met behulp van computerondersteunde spermaanalyse voor aantal en motiliteit, samen met testiculaire histologie met hematoxyline- en eosinekleuring.

Samenvatting

Oligoasthenozoospermie is een van de meest voorkomende vormen van mannelijke voortplantingsstoornissen. In knaagdierstudies vormt het consequent toedienen van elektroacupunctuur (EA) over herhaalde sessies een technische uitdaging, vooral bij het combineren van abdominale middenlijn- en achterpootacupunten, waarbij stabiel elektrodecontact cruciaal is. Zhongji (CV3), Guanyuan (CV4), Zusanli (ST36) en Sanyinjiao (SP6) werden geselecteerd omdat deze punten vaak worden gebruikt in acupunctuurprotocollen voor onvruchtbaarheid en spermaafwijkingen, en de abdominale middenlijn plus achterpootconfiguratie geschikt is voor gestandaardiseerde elektrodeparen. Dit rapport beschrijft een praktisch protocol voor het opzetten van een adenine-geïnduceerd rattenmodel van oligoasthenozoospermie en voor het toedienen van isoflurane-geassisteerde EA met gepaarde stimulatie van CV3–CV4 en ST36–SP6. Mannelijke Sprague-Dawley-ratten kregen 28 dagen lang adenine via dagelijkse gavage om voortplantingsstoornissen op te leiden. Vervolgens werd EA dagelijks toegediend gedurende 28 dagen onder inhalatie-anesthesie, waarbij 3% isofluraan werd gebruikt voor inductie en 1,5% voor maskeronderhoud, om stabiele naaldplaatsing en elektrodekoppeling (CV3–CV4 en ST36–SP6) mogelijk te maken met gedefinieerde stimulatieparameters (2 Hz, 1,5 mA, 30 min). De behandelingseffecten werden geëvalueerd met computerondersteunde spermaanalyse op zaadtelling en motiliteit, aangevuld met testiculaire hematoxyline en eosin (HE) histologie. Representatieve resultaten geven aan dat adenineblootstelling het aantal zaadcellen en de beweeglijkheid verminderde en de samenvattubulusarchitectuur verstoorde, terwijl EA geassocieerd was met gedeeltelijk herstel in zowel spermaparameters als testiculaire morfologie. Dit protocol biedt een gemakkelijke referentie voor studies die consistente EA-afgifte en sperma-/histologische verificatie vereisen in een rattenmodel van oligoasthenozoospermie.

Inleiding

Mannelijke factoren dragen aanzienlijk bij aan onvruchtbaarheid, goed voor ongeveer de helft van alle onvruchtbare koppels, waarbij afwijkingen in zaadtelling en motiliteit tot de meest voorkomende klinische bevindingen behoren ^1,2. Oligoasthenozoospermie, gekenmerkt door verminderde zaadconcentratie en verminderde motiliteit, is een van de meest voorkomende vormen van mannelijke voortplantingsstoornissen ^3,4. Ondanks de beschikbaarheid van geassisteerde voortplantingstechnieken en empirische medische therapieën, blijven effectieve strategieën om de kwaliteit van het sperma te verbeteren beperkt, wat de noodzaak van verder preklinisch onderzoek benadrukt ^5,6,7. Deze klinische en translationele behoeften motiveren de ontwikkeling van reproduceerbare experimentele workflows om mannelijke voortplantingsstoornissen onder gecontroleerde omstandigheden te bestuderen.

Acupunctuurinterventies zijn onderzocht op spermaafwijkingen en mannelijke onvruchtbaarheid, zowel in klinische als experimentele contexten⁸. Hoewel klinische studies potentiële voordelen suggereren voor bepaalde spermaparameters, verschillen hun ontwerpen, interventieprotocollen en uitkomstmaten sterk⁹. Elektroacupunctuur (EA) is bijzonder geschikt voor laboratoriumonderzoek omdat het gecontroleerde stimulatieparameters en een meer uniforme regulatie biedt dan handmatige acupunctuur, wat het beoordelen van behandelingsgerelateerde veranderingen in meetbare voortplantingsuitkomsten vergemakkelijkt 10,11,12. Dit procedurele voordeel maakt EA zeer geschikt voor gestructureerde preklinische workflows in mannelijk voortplantingsonderzoek.

Diermodellen staan centraal in deze evaluatie, maar modelselectie blijft een belangrijk methodologisch probleem in oligoasthenozoospermieonderzoek. Een recente systematische review merkte op dat busulfan-geïnduceerde modelleringsmethoden controversieel zijn en aanzienlijke heterogeniteit in evaluatie-indices vertonen, wat de noodzaak benadrukte van duidelijkere procedures en consistentere uitlezingen¹³. Adenine-gebaseerde modellen bieden een praktische experimentele benadering omdat adenine gavage voortplantingsstoornissen bij ratten kan veroorzaken, waaronder verminderde spermagerelateerde eindpunten en histologische schade in testikelweefsel^14,15. In ons eerdere werk werd een adenine-geïnduceerd oligoasthenozoospermie-rattenmodel behandeld met EA bij een Shu-Mu hersen-nier acupointset (Epangsanxian, BL23, GB25 en KI3), naast niet-acupoint- en positieve geneesmiddelcontroleomstandigheden, met uitgebreide uitkomstmaten waaronder orgaancoëfficiënten en serumhormoonniveaus gekwantificeerd door ELISA¹⁶. Voortbouwend op deze experimentele basis en met erkenning van de heterogeniteit in acupuntselectie, controleontwerp, stimulatieparameters en uitkomstmaten binnen bestaande EA-studies, is het huidige protocol ontworpen om de methodologische workflow voor stabiele EA-levering te verfijnen en uit te breiden.

Daarom richt het huidige protocol zich op de levering, waarbij twee praktische variabelen worden behandeld die cruciaal zijn voor herhaalde EA-sessies bij knaagdieren. Ten eerste, om naaldverplaatsing en intermitterend elektrodecontact veroorzaakt door dierbeweging en looddraadtractie te voorkomen, beschrijven we een door isofluraan onderhouden procedure die de positionering tijdens stimulatie stabiliseert en zorgt voor betrouwbaar elektrodecontact tijdens sessies; Dit is vooral belangrijk bij het combineren van buikmiddellijnpunten met achterpoten. Ten tweede, op basis van eerdere reviews en akupoint-voorschriftanalyses ^9,17, waarbij CV4, SP6, ST36 en CV3 werden geïdentificeerd als veelvoorkomende reproductieve acupunkturen in onvruchtbaarheids- en sperma-afwijkingsprotocollen, selecteerden we CV3, CV4, ST36 en SP6 en pasten we gepaarde stimulatie toe op CV3-CV4 en ST36-SP6. Deze configuratie, die de middellijn van de buik en de achterste ledematen combineert, standaardiseert elektrodeverbindingen, minimaliseert variabiliteit veroorzaakt door onstabiele loodhechting en ondersteunt reproduceerbare EA-toediening over herhaalde behandelingssessies. Om een protocolgerichte scope te behouden en te voorkomen dat eerder gerapporteerde endocriene, mechanistische of positieve controlemodules worden gedupliceerd, is uitkomstverificatie beperkt tot een primaire zaad- en testisuitlesset. Deze set bestaat uit computerondersteunde spermaanalyse en testiculaire HE-kleuring, die voldoende zijn om succesvolle fenotype-inductie en behandelingsgerelateerde veranderingen binnen deze workflow te bevestigen.

Protocol

Alle dierprocedures voldeden aan de institutionele richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en werden goedgekeurd door de Ethische Commissie van de Ningxia Medische Universiteit (goedkeuring nr. IACUC-NYLAC-2021-130). Mannelijke Sprague-Dawley-ratten, 8 weken oud en met een gewicht van 180–220 g, werden verkregen van het Experimenteel Dierencentrum van de Ningxia Medische Universiteit (vergunning nr. SYXK (Ning) 2020-0001). De dieren werden gehuisvest onder standaard laboratoriumomstandigheden bij 22–24 °C en 52%–56% relatieve luchtvochtigheid met een 12 uur licht/12 uur donkere cyclus, en hadden vrije toegang tot voedsel en water.

1. Diervoorbereiding, groepstoewijzing en het opzetten van adenine-geïnduceerde modellen

1. Pas de ratten 7 dagen aan voor het experiment en houd dagelijks hun algemene toestand in de gaten.
2. Na acclimatisatie wijs je negen ratten unieke identificatienummers toe en verdeel je ze willekeurig in een verhouding van 1:1:1 in drie groepen met behulp van een computergegenereerde randomisatiesequentie: een controlegroep (n = 3), een modelgroep (n = 3) en een EA-groep (n = 3). Gebruik elke rat als experimentele eenheid en neem alle dieren en monsters mee in de eindanalyse, tenzij aan vooraf bepaalde uitsluitingscriteria wordt voldaan.
3. Houd de onderzoekers bezig met computerondersteunde spermaanalyse en histologische beoordeling, blind voor groepstoewijzing.
   OPMERKING: De onderzoekers die EA toedienen mogen niet blind worden omdat de interventie zichtbare, groepsspecifieke procedures omvat.
4. Bereid een 20 mg/mL suspensie van adenine voor in normale zoutoplossing met 0,5% (w/v) arabische gom als suspensiemiddel, en meng grondig zowel voor als tijdens de overgang om sedimentatie te voorkomen.
5. Geef normaal zoutoplossing aan de controlegroep en adenine suspension aan de model- en EA-groepen via gavage van 10 mL/kg, gelijk aan 1 mL/100 g lichaamsgewicht, eenmaal dagelijks gedurende 28 opeenvolgende dagen. Gebruik een adenine-dosis van 200 mg/kg/dag.
6. Noteer het lichaamsgewicht en de algemene conditie gedurende de modelleerperiode.
   OPMERKING: Adenine wordt toegediend als suspensie en neigt tijdens het hanteren tot sedimentatie. Houd continue beweging tijdens de gavage aan om neerslag te minimaliseren, wat anders kan leiden tot doseringsinconsistentie en blokkade van de gavagenaald. Als er verstopt is, suspendeer de oplossing dan grondig opnieuw en vervang de gavagenaald voordat je verder gaat.

2. Isoflurane anesthesie voor elektroacupunctuurtoediening (Figuur 1)

1. Bereid een isoflurane anesthesiesysteem voor met een inductiekamer, een neusmasker en een warmtekussen.
2. Induceer anesthesie met 3% isofluraan in de inductiekamer totdat de spontane activiteit aanzienlijk afneemt.
3. Breng de rat in rugligging over op het verwarmingskussen en houd de verdoving met 1,5% isofluraan via een neusmasker gedurende de hele EA.
4. Bevestig voldoende verdoving door minder spontane beweging en verlies van de knipperreflex, terwijl je regelmatig ademhaling handhaaft.

3. Nauwkeurigheid en kwaliteitscontrole van stimulatieafgifte

1. Gebruik een warmtekussen om de lichaamstemperatuur gedurende de sessie te behouden en de fysiologische variatie door onderkoeling te verminderen.
2. Pas consistente anesthesie-instellingen toe op alle dieren en sessies, waarbij 3% isofluraan voor inleiding en 1,5% isoflurane voor onderhoud wordt gebruikt. Houd de verdovingsdiepte op het minimale niveau dat nodig is om problemen te voorkomen, terwijl je regelmatig ademhalen blijft.
3. Steek steriele wegwerp-acupunctuurnaalden (0,25 mm × 13 mm) verticaal in bij de geselecteerde acupunktuurpunten. Steek de naalden in op dieptes van ongeveer 2 mm bij CV3 en CV4, 7 mm bij ST36 en 5 mm bij SP6.
4. Na het inbrengen van de naald en het aansluiten van de elektrode bevestig je visueel dat elke naald stabiel blijft staan, zonder merkbare losser worden door ademhaling of beweging van ledematen. Als er een verplaatsing optreedt, plaats je de naald verticaal terug naar de oorspronkelijke diepte en controleer je een stabiel elektrodecontact voordat je de stimulatie hervat.
5. Klem de elektrodekabels dicht bij het proximale uiteinde van de naaldhandvat, en richt en bevestig ze om grip te minimaliseren, aangezien loodgewicht en trekken veelvoorkomende oorzaken van loslaten zijn.
6. Bevestig effectieve stimulatie door een milde lokale spiertremor bij het acupoint te observeren zonder grove lichaamsbeweging. Als er geen tremor is, controleer dan opnieuw en bevestig opnieuw het contact met de elektrode en de plaatsing van de naald.
7. Voer halverwege de sessie een enkele gestandaardiseerde controle uit na 15 minuten. Indien nodig, stel de naalden opnieuw in en bevestig de milde lokale tremor, voordat je doorgaat met het verminderen van variabiliteit in stimulatietoediening tussen dieren.
   OPMERKING: Bij het aansluiten van het EA-apparaat klem je de kabels aan het proximale uiteinde van de naaldhendel om de grip van het kabelgewicht te verminderen. Indien nodig, bevestig de lijn en/of naald met tape om losraken tijdens de sessie te voorkomen.

4. Elektroacupunctuurbehandeling (Figuur 2)

1. Start EA op de dag na de 28 dagen durende adenine gavage-periode en dien het dagelijks toe gedurende 28 opeenvolgende dagen.
2. Onder isoflurane anesthesie wordt de onderbuik en achterpoten blootgelegd, en Zhongji (CV3), Guanyuan (CV4), Zusanli (ST36) en Sanyinjiao (SP6) lokaliseerd met behulp van anatomische herkenningspunten aan het oppervlak.
3. Plaats steriele wegwerp-acupunctuurnaalden (0,25 mm × 13 mm) verticaal tot dieptes van 2 mm bij CV3 en CV4, 7 mm bij ST36 en 5 mm bij SP6.
4. Verbind één paar elektroden met CV3 en CV4, en het andere paar met ST36 en SP6.
5. Geef elektrische stimulatie bij 2 Hz en 1,5 mA gedurende 30 minuten. Gebruik deze parameters om te matchen met die eerder toegepast bij adenine-geïnduceerde oligoasthenozoospermie¹⁶.
6. Pas de kwaliteitscontroles uit zoals beschreven in Sectie 3, inclusief één enkele controle halverwege de sessie van 15 minuten.
   OPMERKING: Lokaliseer rat-acupunkturen met verwijzing naar Yong Tang's Experimental Acupuncture and Moxibustion Science¹⁸, Appendix II ("Acupunctuurpunten die vaak bij proefdieren worden gebruikt"), samen met vergelijkende anatomische herkenningspunten. Omdat rat-acupunkturen afzonderlijke anatomische gebieden vertegenwoordigen in plaats van vaste geometrische punten, wordt een consistente lichaamshouding, vaste anatomische referentiepunten en millimeter-gebaseerde oppervlaktemetingen gebruikt tussen dieren en sessies. Lokaliseer Zhongji (CV3) op de ventrale middenlijn, ongeveer 33 mm caudaal ten opzichte van het midden van de navel. Lokaliseer Guanyuan (CV4) op de ventrale middenlijn, ongeveer 25 mm caudaal ten opzichte van het midden van de navel, nabij de subcutane oppervlakkige slagaders van de buikwand. Lokaliseer Zusanli (ST36) aan de posterolaterale zijde van de knie, ongeveer 3 mm distaal van het fibulaire hoofd. Lokaliseer Sanyinjiao (SP6) aan de mediale zijde van de achterpoot, ongeveer 10 mm proximaal van de punt van de mediale malleolus. Pas dezelfde lokalisatiereferenties, lichaamshouding, inzethoek en inzetdiepte consequent toe op alle dieren en behandelsessies.

5. Monsterverzameling

1. Vastmaak de ratten 24 uur na de laatste EA-sessie.
2. Induceer diepe anesthesie via intraperitoneale injectie van 2% pentobarbital natrium bij 2 mL/kg vóór weefselverzameling. Bevestig diepe anesthesie door het ontbreken van de terugtrekkingsreflex van het pedaal en spontane beweging.
3. Euthanaser de rat door onthoofding onder diepe anesthesie, volgens institutioneel goedgekeurde protocollen.
4. Stel de voortplantingsorganen onmiddellijk aseptisch bloot. Isoleer één cauda epididymis voor spermaanalyse en verwijder één testis voor histologisch onderzoek.
5. Fixeer de testis in 4% paraformaldehyde gedurende minstens 24 uur voordat de histologische verwerking plaatsvindt.

6. Spermaanalyse

1. Verwijder het omliggende vet uit de cauda epididymis en plaats het weefsel onmiddellijk in 2 mL normale zoutoplossing die voorverwarmd is tot 37 °C.
2. Incubeer het weefsel 5 minuten in een waterbad van 37 °C, maal het met een oogschaar, filter de suspensie door een 200-mesh scherm en meng het filtraat voorzichtig.
3. Laad een 10 μL aliquot van de sperma-suspensie in een voorverwarmde telkamer en analyseer het aantal zaadcellen en de motiliteit met behulp van een computerondersteund spermaanalysesysteem (CASA).
4. Gebruik hetzelfde kamertype, verwarmingsomstandigheden en verzamelinstellingen voor alle monsters binnen een gegeven experiment.

7. Histologisch onderzoek van testikelweefsel

1. Fixeer het testiculair weefsel in 4% paraformaldehyde gedurende minimaal 24 uur. Knip het doelgebied af en plaats het in gelabelde cassettes.
2. Dehydrateer de monsters via een gegradueerde ethanolreeks, zuiver ze met xyleen, infiltreer ze met paraffine, inbed ze en snijd ze in op 4 μm.
3. Laat de secties drijven in een waterbad van 40 °C, monteer ze op slides en droog ze in een oven van 60 °C.
4. Voor hematoxyline- en eosinekleuring, ontwas je de secties in xyleen, hydrateer ze met gegradueerde ethanol, kleur ze 5–10 minuten met hematoxyline en eosine 1–5 minuten, dehydrateer ze dan, maak ze schoon en monteer je ze.
5. Onderzoek de organisatie van de spermatogene buis en de samenstelling van spermatogene cellen onder consistente vergrotingsinstellingen over alle groepen.

8. Evaluatie van modelopbouw en behandelingsgerelateerde veranderingen

1. Bevestig modelopbouw door een vermindering van het aantal zaadcellen en de motiliteit, samen met de ongeorganiseerde samengestelde samengevoegde buisstructuur ten opzichte van de controlegroep.
2. Bevestig behandelingsgerelateerde veranderingen door een toename van het aantal zaadcellen en de motiliteit, samen met gedeeltelijke restauratie van de morfologie van de seminifere tubuli, in de EA-groep ten opzichte van de modelgroep.
3. Bepaal technisch gecompromitteerde monsters, zoals die met vertraagde spermaverwerking, uitval in de laadkamer of laagwaardige secties die niets met modellering te maken hebben, als exclusiecriteria. Documenteer eventuele uitsluitingen tijdens de analyse.

Resultaten

Spermaanalyse (Figuur 3)
Epididymale sperma-suspensies werden geanalyseerd met behulp van een computerondersteund spermaanalysesysteem om het aantal zaadcellen en de motiliteit te kwantificeren. In deze representatieve dataset verminderde de toediening van adenine beide parameters aanzienlijk ten opzichte van de controlegroep, wat het succesvolle modelopzetten bevestigde. EA-interventie verhoogde vervolgens het aantal zaadcellen en de motiliteit vergeleken met de modelgroep (Figuu...

Discussie

Gezien de multifactoriele etiologie van oligoasthenozoospermie en de beperkte effectiviteit van beschikbare farmacologische behandelingen, hebben acupunctuur en EA aandacht gekregen als herhaalbare, niet-farmacologische interventies¹⁹. De bestaande klinische en preklinische literatuur suggereert verschillende plausibele mechanismen waarmee acupunctuur of EA de mannelijke voortplantingsfunctie kan beïnvloeden, waaronder het moduleren van neuro-endocriene regulatie,...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Adenine	Beijing Solarbio Science & Technology Co.Ltd.	A8330
CASA computer-assisted semen analysis system	Nanning Songjing Tianlun Biotechnology Co.,Ltd.	VICOS-SPERM
Centrifuge	Sartorius	A-14C
Differentiation fluid	Shanghai Biyuntian Biotechnology Co.,Ltd	C0163M
Disposable sterile acupuncture needles	Hanyi brand		0.25 mm ´ 13 mm
Drying machine	Leica	HI1220
Electrical stimulator	Changzhou Yingdi Electronic Medical Device Co., Ltd	KWD-808I
Electronic balance	Hangzhou Youheng Weighing Equipment Co.,Ltd	HLD-6002
Eosin Y Stain Solution	Lanke Biotech	BS248
Hematoxylin staining solution	Zhuhai Beso Biotechnology Co. LTD	BA-4041
Isoflurane	RWD Life Science Co., Ltd.	R510-22-10
Microtome	Leica	RM2255
Neutral balsam	Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co.,Ltd	Zli-9555
Paraffin embedding machine	Leica	HistoCore Arcadia H
SD rats	Animal Center of Ningxia Medical University		8-week-old,Male,180-220 g
Slide scanner	Leica	Aperio LV1
Small Animal Anesthesia Machine	RWD Life Science Co., Ltd.	R500
Vortex oscillator	Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co.,Ltd	QL-902
Warming pad	Dongguan Hongda Electronics Co., Ltd.	45W-80X28CM