Verrijking van muizenhypofyse-schildkirtelen van hypothyreoïde muizen met behulp van CD90-gebaseerde fluorescentie-geactiveerde celsortering

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de verrijking van thyrotropen uit hypothyroïde volwassen muishypofyseklieren met behulp van enzymatische dissociatie en CD90-gebaseerde fluorescentie-geactiveerde celsortering, waardoor downstream moleculaire analyses en kortetermijn-primaire kweek van een thyrotrope-verrijkte celpopulatie mogelijk zijn.

Samenvatting

Schildkliercellen zijn gespecialiseerde endocriene cellen in de voorste hypofyse die schildklierstimulerend hormoon (TSH) afscheiden en de schildklieractiviteit reguleren. TSH-secretie wordt positief gereguleerd door het hypothalamische thyrotropine-releasing hormoon en negatief gereguleerd door circulerende schildklierhormonen. Thyrotropen vormen slechts een klein deel van de hypofysecellen (~5%), wat de inspanningen om hun fysiologie te isoleren en te bestuderen bemoeilijkt. Hier beschrijven we een verbeterde aanpak om schildklierpatronen te isoleren van hypothyreoïde volwassen muizen. Hypothyreoïdie werd geïnduceerd om de thyrotropepopulatie uit te breiden voorafgaand aan enzymatische dissociatie van de voorste hypofyse en fluorescentie-geactiveerde celsortering met behulp van het CD90.2 oppervlakteantigeen. Het verwerken van voorste hypofyseklieren van twaalf muizen leverde ongeveer 1,5 × 10⁶ CD90.2-positieve cellen op die verrijkt waren voor Tshb boodschapper RNA-expressie. CD90.2-positieve cellen vertegenwoordigden ongeveer 25% van de voorste hypofysecellen en vertoonden ongeveer vijf keer een hogere Tshb-expressie vergeleken met CD90.2-negatieve cellen, wat wijst op een aanzienlijke thyrotropeverrijking. Geïsoleerde cellen bleven levensvatbaar in kortdurende kweek en behielden de respons op triiodothyroninebehandeling. Dit protocol maakt verrijking en kweek van muisthyrotropen mogelijk voor downstream moleculaire, transcriptomische, epigenomische en fysiologische analyses.

Inleiding

De hypofyse is een endocrien orgaan aan de basis van de hersenen dat hiërarchische controle uitoefent over de hormonale homeostase. De activiteit wordt gereguleerd door hypothalamische signalen die de productie van hypofysehormonen stimuleren of remmen, die op hun beurt de functie van perifere endocriene organen reguleren. De klier bevat een heterogene en dynamische populatie cellen, waaronder stam-/voorlopercellen en gedifferentieerde hormoonproducerende cellen¹. Als reactie op fysiologische stress of letsel kunnen hypofysestam-/voorlopercellen activeren, zichzelf vernieuwen en differentiëren tot meerdere hormoonafscheidende lijnen ^2,3. Structureel is de hypofyse georganiseerd in twee hoofdlobben: de achterkwab (PL), bestaande uit hypofycyten en neurosecretoire uiteinden die oxytocine en vasopressine afgeven, en de voorkwab (AL), die gespecialiseerde endocriene celtypen bevat die groeihormoon, prolactine, schildklierstimulerend hormoon (TSH), adrenocorticotrope hormoon en het gonadotropine follikelstimulerend hormoon (FSH) en het luteïniserende hormoon (LH) van gonadotropinen afscheiden. De voorste hypofyse herbergt ook niet-hormonale celtypen, zoals S100B-positieve folliculostellaatcellen, endotheelcellen en pericyten, die de endocriene functie^{ondersteunen 4,5,6}. Knaagdieren bevatten ook melanotrofen in de intermediaire kwab van de hypofyse ^7,8.

Interesse in de functie, differentiatie en ontwikkeling van de hypofyse heeft geleid tot de ontwikkeling van meerdere protocollen gericht op het isoleren van volwassen hypofysestam- en voorlopercellen in knaagdiermodellen. Ratten worden vaak gebruikt in onderzoek naar de hypofysefysiologie omdat hun grotere hypofyseklieren een groter aantal cellen opleveren en het herstel tijdens weefselverwerking^verbeteren. Daarentegen blijft het isoleren van hypofysecellen van muizen technisch uitdagend, en gestandaardiseerde protocollen zijn beperkt. Recente protocollen die gebruikmaken van volwassen hypofysestam/voorlopercelaggregaten bieden nuttige hulpmiddelen voor het modelleren van de ontwikkeling en functie van de hypofyse¹⁰; Deze systemen staan echter nog geen directe isolatie van specifieke endocriene celpopulaties toe. Onder de hormoonproducerende celtypen van de voorste hypofyse zijn thyrotropen de belangrijkste regelaars van de hypothalamus-hypofyse-schildklier (HPT) as, die de synthese en secretie van schildklierhormoon (TH) bij zoogdieren regelen. De TSH die door thyrotropen wordt geproduceerd, is een heterodimeer glycoproteïne die bestaat uit een gemeenschappelijke α-subunit (gecodeerd door Cga en gedeeld met FSH en LH) en een β-subunit (gecodeerd door Tshb), die receptorspecificiteit verleent. Deze cellen zijn zeer gevoelig voor circulerende triiodothyronine (T3) en thyroxine (T4) niveaus. De thyrotropepopulatie groeit wanneer de T3- en T4-niveaus laag zijn tijdens hypothyreoïdie en krimpt tijdens hyperthyreoïdie via een klassiek negatief-feedbackmechanisme 11,12,13.

Ondanks hun essentiële fysiologische rol blijven thyrotropen moeilijk te bestuderen omdat ze slechts een klein deel van de voorste hypofysecellen vormen (ongeveer 5%) en fenotypische kenmerken delen met andere endocriene populaties. Deze schaarste, samen met het ontbreken van robuuste in vitro modellen, heeft mechanistische onderzoeken naar thyrotroperegulatie en HPT-ascontrole beperkt. De TαT1 tumorcellijn vertegenwoordigt een veelgebruikt thyrotrope-achtig model¹⁴, maar weerspiegelt niet volledig fysiologische reacties; in het bijzonder is T3-afhankelijke repressie van Tshb vaak moeilijk te beoordelen vanwege het zeer lage basale transcriptieniveau¹⁵. Daarom hebben veel studies vertrouwd op niet-thyrotrope cellijnen zoals HEK293, COS, CV1, GH3 of JEG3 cellen die verschillende Tshb-constructen ¹⁵ tot expressie brengen. Dit zijn echter heterologe systemen die niet-fysiologische regulatorische artefacten kunnen introduceren, waaronder effecten die worden aangedreven door plasmidruggengraat in plaats van endogene transcriptiemechanismen.

Hier presenteren we een stapsgewijs protocol voor het isoleren van thyrotropen uit de volwassen muishypofyse, aangepast van een eerder gevestigde methode bij ratten⁹, en geoptimaliseerd voor de kleinere grootte en lagere thyrotrope-inhoud van de muishypofyse. Verschillende belangrijke aanpassingen werden geïntroduceerd om de opbrengst van Tshb-expressieve cellen te verbeteren en betrouwbare downstream analyse te waarborgen. Het protocol maakt gebruik van de expressie van het oppervlakteantigeen CD90, een oppervlaktemarker verrijkt in thyrotropen. CD90 (ook bekend als THY1) is een glycosylfosfatidylinositol-verankerd membraaneiwit^16,17 dat juxtacrine signalering mediaert via heterotypische interacties met de integrine β2-ligand (ITGB2). Hoewel CD90 vaak wordt geassocieerd met immuun- en neurale celpopulaties, identificeerden eerdere transcriptomische studies Thy1-verrijking in thyrotropes. THY1-afhankelijke contactsignalering vindt plaats in diverse celtypen, waaronder hematopoëtische cellen, T-cellen, fibroblasten, endotheelcellen en neuronen, waar het adhesie, migratie, apoptose, tumorsuppressie en fibrose^reguleert 18,19,20.

Belangrijk is dat single-cell transcriptomische profilering van de voorste hypofyse van de rat Thy1 identificeerde als een van de meest uitgedrukte adhesiegerelateerde genen in thyrotropen⁵, wat suggereert dat THY1 een oppervlaktemarker is die verrijkt is in thyrotropes. Bovendien geven openbaar beschikbare muizenhypofyse-single-cell ribonucleïnezuur (RNA)-sequencingdatasets aan dat Thy1/CD90-expressie verrijkt is in thyrotropen^22,23. De expressie ervan is echter niet volledig beperkt tot deze lijn, met detecteerbare expressie in subsets van PIT1-lijncellen, waaronder somatotropen en lactotropen, evenals voorloperachtige populaties. Enkelcel-transcriptomische studies hebben aanzienlijke transcriptionele overlap aangetoond tussen PIT1-lijnige hypofysecellen, waaronder de identificatie van een gemeenschappelijke PIT1-voorloperpopulatie die in staat is somatotropen, lactotropen en thyrotropen^{te genereren 24}. Evenzo identificeert Thy1/CD90 niet uitsluitend de thyrotropepopulatie, maar kan het worden gebruikt om muizenthyrotropes te verrijken. Voortbouwend op deze bevindingen biedt het gebruik van THY1-gerichte antilichamen in onze isolatiestrategie een effectieve methode om schildkliertropen te verrijken na door hypothyreoïdie veroorzaakte uitbreiding en maakt het functionele studies mogelijk, waaronder het beoordelen van hormonale reacties op T3.

Het protocol begint met het voeren van wildtype C57BL/6 muizen een jodiumarm dieet en het remmen van de schildklierfunctie met methimazol (MMI) en kaliumperchloraat (KClO₄) in het drinkwater²⁵. Deze behandeling veroorzaakt binnen een week significante hypothyreoïdie en vergroot de populatie van Tshb-expressieve thyrotropen in de voorste hypofyse. TSH-producerende cellen onder hypothyreoïdale omstandigheden ondergaan aanzienlijke fysiologische en morfologische aanpassingen, waaronder hyperplasie, hypertrofie, overvloedig vacuoleerd cytoplasma, prominente cytoplasmatische processen en vergrote lysosomen, wat aanpassing aan de afwezigheid van TH-feedback^weerspiegelt 26,27,28. Daarom kan inductie van hypothyreoïdie worden gebruikt als strategie om de thyrotropepopulatie uit te breiden.

Na de inductie van hypothyreoïdie worden muizen verdoofd met isoflurane en onderworpen aan hartperfusie met Ca^2+/Mg²⁺⁺-vrije HEPES-gebufferde zoutoplossing om de levensvatbaarheid van de cellen tijdens weefseldissociatie te maximaliseren. Na de oogst ondergaat de voorste hypofyse een zachte enzymatische vertering om een single-cell suspension te produceren die wordt geïncubeerd met een phycoerythrin-cyanine 7-geconjugeerd anti-CD90.2-antilichaam om de thyrotropen te verrijken door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Gelabelde cellen worden vervolgens verzameld in groeimedium voor kortdurende kweek of in TRIzol voor RNA-extractie. Om de verrijkingsstrategie te valideren, werd de expressie van Tshb-boodschapper RNA gemeten in gesorteerde populaties en werd deze sterk verrijkt gevonden in CD90-positieve cellen. Deze methode ondersteunt een breed scala aan downstream toepassingen bij muizen, waaronder genexpressieprofilering, transcriptomische en epigenomische analyses, high-throughput assays en primaire celkweek, en biedt een waardevol platform voor het onderzoeken van de cellulaire en moleculaire mechanismen achter de thyrotropefunctie en regulatie van de HPT-as.

Protocol

Dit protocol beschrijft de isolatie van thyrotropen uit de AL van vers gedissecte hypofyseklieren die zijn verkregen van volwassen muizen na minstens 1 week inleiding door hypothyreoïdie. Alle dierprocedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de instelling en de National Institutes of Health voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. De Commissie voor Institutionele Dierenverzorging en -gebruik van de University of Texas Medical Branch keurde alle dierprocedures goed.

Mannelijke en vrouwelijke muizen werden tijdens de experimenten samengevoegd omdat er geen geslachtsafhankelijke verschillen in thyrotropeopbrengst of downstream-analyses werden waargenomen. Er werden ongeveer 12 muizen per experiment gebruikt, hoewel grotere cohorten van maximaal 20 dieren kunnen worden verwerkt door alle reagentiavolumes proportioneel te schalen.

Succesvolle isolatie is afhankelijk van snelle en consistente perfusie, minimale dissectietijd, volledige verwijdering van de PL en hoogdichte plating van primaire cellen. De aanbevolen maximale verwerkingstijd tussen euthanasie, perfusie, hypofyse-dissectie en start van enzymatische spijsvertering was 6 uur. Cellen werden geplateerd met een dichtheid van 2,0–2,5 × 10^5-cellen per 0,7 cm² put (het oppervlak van één put van een glaskamerglaasje met 8 putjes). Een minimale levensvatbaarheid van 95% was vereist om kortdurende thyrotropekweek te ondersteunen.

Alle reagentia die werden gebruikt voor de productie van single-cell suspension werden onder steriele omstandigheden bereid. Werkoppervlakken werden gesteriliseerd met 70% ethanol, dissectie-instrumenten werden vóór gebruik geautoclaveerd en alle celkweekvoorbereidingsstappen werden uitgevoerd in een bioveiligheidskast met behulp van aseptische techniek. Dit protocol werd gestandaardiseerd voor 12 dieren. Schaal alle reagensvolumes proportioneel op bij gebruik van een verschillend aantal muizen. Raadpleeg de Materiaaltabel voor alle reagentia, verbruiksartikelen en apparatuur.

Tijdens de inductie van hypothyreoïdie werden muizen gehuisvest onder specifieke ziekteverwekkervrije omstandigheden bij 20°C–24°C en 40%–60% relatieve luchtvochtigheid, met een 12 uur licht/12 uur donkere cyclus en ad libitum toegang tot voedsel en water. De dieren werden gegroepeerd (tot drie muizen per kooi) in individueel geventileerde kooien met standaard bodembedekking en milieuverrijking, waaronder nestmateriaal en onderdak. Succesvolle hypothyreoïdie-inductie werd bevestigd door het meten van de expressie van leverjodothyronine dejodinase (Dio1). Een vermindering van minstens 50% in Dio1-boodschapper-RNA (mRNA)-expressie ten opzichte van euthyroïde controlemuizen werd als een indicatie van succesvolle hypothyreoïdie-inductie beschouwd.

1. Hypothyreoïdie-inductie bij C57BL/6 muizen

OPMERKING: Voer deze procedure uit over 7–10 dagen om hypothyreoïdie in vivo te induceren via een jodiumtekort dieet en chemische remming van de schildklierfunctie. Zie Figuur 1A voor het experimentele ontwerp en Figuur 1B voor validatie van de inductie van hypothyreoïdie.

Figuur 1. Inductie van hypothyreoïdie bij C57BL/6 muizen. (A) Schematische weergave van de experimentele workflow die wordt gebruikt om hypothyreoïdie op te wekken bij volwassen C57BL/6 muizen. Muizen kregen 0,05% methimazol (MMI) en 0,1% kaliumperchloraat (KClO₄) in drinkwater, samen met een jodiumdeficiënt dieet gedurende 7 dagen voordat de voorste hypofyse-isolatie plaatsvond. (B) Omgekeerde transcriptie kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR) analyse van lever-Dio1-boodschapper ribonucleïnezuur (mRNA) expressie in euthyroïde en hypothyreoïde muizen. Cyclofiline A (CyA) werd als referentiegen gebruikt. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD) (n = 6 per groep). De statistische significantie werd bepaald met behulp van de Student's t-test. **P < 0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Bereid MMI/KClO₄ drinkwater voor
   1. Los 1 g MMI en 2 g KClO₄ op in 2 L gefilterd water.
   2. Roer de oplossing op kamertemperatuur (20°C–25°C) gedurende 1 uur tot volledige oplossing.
      VOORZICHTIG: MMI en KClO₄ zijn gevaarlijke chemicaliën. Draag handschoenen, een labjas en oogbescherming tijdens de voorbereiding en het hanteren.
      OPMERKING: MMI remt de organisatie van jodied, terwijl KClO₄ de opname van jodiede blokkeert via de natrium–jodide symporter²⁵. Vervang de drinkoplossing elke 2 dagen om de juiste dosering te behouden en besmetting door bodembelag, voedselresten en microbiële groei te minimaliseren. Als het niet direct wordt gebruikt, bewaar de oplossing dan tot 14 dagen in een goed afgesloten lichtbestendige container bij 4°C.
2. Induceer hypothyreoïdie
   1. Huisvest 8 weken oude mannelijke of vrouwelijke C57BL/6 muizen in groepen van maximaal drie dieren per kooi onder jodiumvrije huisvesting.
      OPMERKING: Huismuizen onder specifieke ziekteverwekkervrije omstandigheden bij 20°C–24°C en 40%–60% relatieve luchtvochtigheid met een 12 uur licht/12 uur donkercyclus en ad libitum toegang tot voedsel en water. Houd dieren in individueel geventileerde kooien met standaard bodembedekking en milieuverrijking, inclusief nestmateriaal en onderdak. Acklimatiseer de dieren gedurende 3 dagen voordat de behandeling begint. Huismuizen zijn apart huismuizen. Voor de hier beschreven experimenten bestond de euthyroïdegroep uit zes mannetjes en zes vrouwtjes die in aparte kooien werden gehouden, en de hypothyreoïdegroep uit zes mannetjes en zes vrouwtjes in aparte kooien. Verzamel AL's van mannelijke en vrouwelijke muizen binnen dezelfde behandelgroep tijdens celvoorbereiding omdat er geen geslachtsafhankelijke verschillen in thyrotrope-opbrengst of downstream analyses werden waargenomen.
   2. Geef de muizen een jodiumtekort dieet ad libitum gedurende 7–10 dagen.
      OPMERKING: Begin gelijktijdig met het jodiumtekort dieet en de behandeling met MMI/KClO₄.
   3. Verskaf gedurende de behandelingsperiode drinkwater met 0,05% MMI en 0,1% KClO₄ ad libitum.
      OPMERKING: Blijf behandelen tot aan euthanasie. Houd dagelijks het lichaamsgewicht, voedselinname, waterinname en klinische symptomen in de gaten tijdens de inductie van hypothyreoïdie. Succesvolle inductie van hypothyreoïdie gaat meestal gepaard met verminderde gewichtstoename en klinische symptomen zoals verminderde activiteit of doffe vacht in vergelijking met euthyroïdale controles. Inductieperiodes van zeven en tien dagen leveren vergelijkbare thyrotrope-verrijkingsefficiëntie op.

2. Cardiale perfusie en AL-dissectie

OPMERKING: Voer deze procedure uit in ongeveer 15 minuten per muis om de levensvatbaarheid van het weefsel te maximaliseren en de celintegriteit tijdens de isolatie van de hypofyse te behouden.

1. Bereid perfusie- en verzameloplossingen voor
   1. Maak HEPES-gebufferde zoutoplossing (HBSS) zonder Ca²⁺ en Mg²⁺
      1. Combineer 667 mL 0,9% NaCl, 20 mL 1 M HEPEES en 313 mL dubbel gedestilleerd water (ddH₂O) om 1 L speciaal bereid HBSS te bereiden zonder Ca²⁺ en Mg²⁺.
      2. Autoclave de oplossing en bewaar deze bij 4°C tot gebruik.
   2. Bereid heparinized HBSS voor zonder Ca²⁺ en Mg²⁺
      1. Voeg 27 μL enoxaparinenatrium (100 mg/mL voorraadoplossing) toe aan 50 mL speciaal bereide HBSS zonder Ca²⁺ en Mg²⁺.
   3. Bereid verzamelmedium voor (CM)
      1. Combineer 440 mL Dulbecco's gemodificeerde Eagle-medium, 50 mL hitte-geïnactiveerd fotaal bovin serum (FBS), 4 mM L-glutamine en 10 mL 1 M HEPES tot een eindvolume van 500 mL.
      2. Filter de oplossing met een filter van 0,22 μm en bewaar deze tot 1 maand op 4°C.
         OPMERKING: Bereid 50 mL aliquots voor onder een bioveiligheidskast vóór opslag om besmetting te minimaliseren.
      3. Verwarm de CM tot 20°C–25°C vóór gebruik.
   4. Steriliseer dissectie-instrumenten
      1. Steriliseer schaar, pincet, pincet, naaldhouders, irispincetten, chirurgische lepels en stomp probes met 75% ethanol vóór gebruik.
         OPMERKING: Laat instrumenten volledig aan de lucht drogen na ethanolsterilisatie vóór weefselcontact.
2. Voer hartperfusie uit
   1. Doof de muis diep met isoflurane toegediend in 100% zuurstof. Induceer anesthesie in een kamer met 5% isofluraan en houd de anesthesie via een neuskegel van 3% isoflurane met continue monitoring en afvalgassen.
      VOORZICHTIG: Voer isoflurane anesthesieprocedures uit volgens de institutionele veiligheidsrichtlijnen en gebruik geschikte opvangsystemen om de blootstelling aan inademing te minimaliseren.
   2. Bevestig volledige verdoving door te controleren of de terugtrekkingsreflex van het pedaal ontbreekt met een teenknijp.
   3. Spuit het dier met 75% ethanol en plaats het op de perfusiefase in de verzamelpan.
   4. Klem de ledematen om het peritoneale gebied bloot te leggen.
   5. Open de thoracale holte voorzichtig om schade aan belangrijke organen en bloedvaten te voorkomen.
   6. Snijd langs de ribben om een borstflap te maken, vouw de flap over de kop en zet hem vast met een hemostaat.
   7. Stabiliseer het hart met een klem en steek een naald van 23 gauge in de top van de linker hartkamer.
   8. Verbind de naald met een peristaltische pomp met siliconen slangen.
   9. Begin met perfusie met hepariniseerde HBSS zonder Ca²⁺ en Mg²⁺ op kamertemperatuur.
   10. Inceer direct na de perfusie het rechteratrium om drainage toe te laten.
   11. Perfusie het dier 5 minuten met een debiet van 3 mL/min.
       OPMERKING: Bevestig succesvolle perfusie door zichtbare verpaling van de lever te observeren.
3. Isoleer de AL
   1. Onthoofd de muis direct na de perfusie.
   2. Verwijder de hoofdhuid en schedelbotten met fijne snijscharen en pincetten om de hersenen bloot te leggen.
   3. Steek een chirurgische lepel tussen de hersenen en de schedel.
   4. Til de hersenen voorzichtig op en snijd het optische chiasma door.
   5. Verwijder het dunne meningeale membraan (dura mater) dat de hypofyse bedekt onder een stereomicroscoop met een fijne pincet.
   6. Ontleed en gooi de PL zorgvuldig weg zoals weergegeven in Figuur 2A.
      OPMERKING: Identificeer de AL als het grotere roze weefsel dat rostral aanwezig is. Identificeer de PL als het kleinere wit-doorschijnende weefsel dat dorsaal ligt.
   7. Knip het omliggende bindweefsel en resterende meningeale membranen af met een stompe sonde om de toegang tot de AL te verbeteren.
   8. Pak de AL vast met een stompe pincet en breng het over in een 15 mL polypropyleen buis met 1,8 mL CM.
      OPMERKING: Combineer AL's van 12 dieren in dezelfde verzamelbuis.
   9. Houd het monster op kamertemperatuur totdat alle dissecties zijn voltooid.
      OPMERKING: Niet langer dan 3 uur tussen weefselverzameling en het starten van enzymatische vertering om verlies van cellevensvatbaarheid te minimaliseren.
4. Bevestig inductie van hypothyreoïdie
   1. Verzamel een klein levermonster (ongeveer 50 mg) van elke muis.
   2. Kwantificeer de expressie van lever-Dio1 mRNA door real-time reverse transcription polymerasekettingreactie en vergelijk deze met onbehandelde euthyroïde controles (Figuur 1B).
      OPMERKING: Definieer succesvolle hypothyreoïdie-inductie als een vermindering van minstens 50% in lever-Dio1-expressie ten opzichte van euthyroïde controles. Dio1-expressie correleert positief met circulerende TH-niveaus²⁹; daarom bevestigt verminderde Dio1-expressie succesvolle inductie van hypothyreoïdie.
5. Herhaalde weefselverzameling
   1. Herhaal stappen 2.2–2.4. totdat AL's van 12 muizen zijn verzameld.
   2. Ga direct door naar Stap 3.

Figuur 2. Bereiding van een eencellige suspensie uit de voorste hypofyse van de muis. (A) Werkwijze die de dissectie van de voorste lob (AL), enzymatische dissociatie en de bereiding van een single-cel suspensie voor fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) illustreert. De workflow omvat verwijdering van de achterkwab, de vertering van collagenase, de vertering van trypsine–ethyleendiamintetraazijnzuur (EDTA) en filtratie vóór FACS-analyse. (B) Representatieve beelden van levensvatbaarheidskleurstof en geautomatiseerde celtelling van gedissocieerde voorste hypofysecellen van euthyroïdale en hypothyreoïde muizen. Totale celopbrengst en concentratie van levensvatbare cellen zijn aangegeven. Schaalbalk = 200 μm. (C) Verdeling van de diameter van de voorste hypofysecellen na weefseldissociatie en voorbereiding voor downstream FACS-analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 

3. Bereiding van een single-cel suspensie uit muis-AL

OPMERKING: Voer deze procedure uit in ongeveer 60 minuten om een single-cell suspension te genereren uit het voorste hypofyseweefsel.

1. Bereid enzymatische verteringsoplossingen voor
   1. Bereid een 2% collagenase-oplossing voor
      1. Los 100 mg collagenase op uit Clostridium histolyticum (>125 collagenase-verteringseenheden/mg vaste stof) in 4,9 mL ddH₂O.
      2. Voeg 100 μL van 1 M HEPES toe om een eindvolume van 5 mL te verkrijgen.
      3. Steriliseer de oplossing met een 0,22 μm filter.
      4. Aliquot de oplossing in volumes van 200 μL en bewaar tot 2 maanden bij −30°C.
         OPMERKING: Vermijd herhaalde vries-dooicycli. Gebruik geen ontdooide collagenase-aliquoten.
   2. Bereid 0,25% trypsine–ethyleendiamintetraazijnzuur (EDTA) voor
      1. Meng 1 ml 0,5% trypsine–EDTA met 1 mL HBSS zonder Ca²⁺ en Mg²⁺.
      2. Bewaar de oplossing op 4°C tot gebruik.
         OPMERKING: Gebruik op de dag van bereiding de verdunde trypsine–EDTA-oplossing. Bewaar of hergebruik niet verdund trypsine–EDTA.
2. Voer collagenase-vertering uit
   1. Voeg 200 μL 2% collagenaseoplossing toe aan de verzamelde AL-weefsels.
   2. Meng het weefsel voorzichtig door te pipetten met een P1000 micropipet met tips met lage retentie.
   3. Incubeer de suspensie 15 minuten in een waterbad van 37°C.
      OPMERKING: Houd de buisdop gesloten tijdens de incubatie om besmetting te minimaliseren.
   4. Tik elke 5 minuten zachtjes op de buis tijdens de incubatie.
3. Voer deoxyribonuclease I (DNase I) vertering uit
   1. Voeg 5 μL DNase I (1 U/μL) direct toe aan de ophanging zonder het supernatant te verwijderen.
   2. Tik de buis voorzichtig 10 keer om de oplossing te mengen.
   3. Breng de suspensatie 5 minuten uit bij 37°C.
4. Pellet het weefsel
   1. Centrifugeer de suspensie op 100 × g gedurende 5 minuten op kamertemperatuur.
   2. Verwijder het supernatant voorzichtig met een pipet van 1 mL.
      OPMERKING: Laat ongeveer 50 μL restvloeistof boven de pellet tijdens het verwijderen van supernatant om celverlies te minimaliseren.
5. Voer trypsine vertering uit
   1. Voeg 2 ml 0,25% trypsine–EDTA toe aan de pellet.
   2. Incubeer de suspensie bij 37°C gedurende 10–15 minuten totdat er geen zichtbare intacte weefselfragmenten meer overblijven.
      OPMERKING: Blijf niet langer dan 15 minuten om overmatige weefselvertering en verminderde cellevensvatbaarheid te voorkomen.
6. Stop enzymatische vertering en dissocieer het weefsel
   1. Voeg 2 ml CM toe om trypsinisatie te stoppen.
   2. Pipetteer de suspensie voorzichtig 10–20 keer op en neer met een micropipet ingesteld op 1 mL totdat er geen zichtbare weefselfragmenten meer overblijven.
      OPMERKING: Gebruik pipettips met lage retentie tijdens mechanische dissociatie. Een acceptabele single-cell suspension is een uniforme, laag-viscositeit suspensie die voornamelijk uit enkele cellen bestaat met minimale zichtbare aggregaten of afvalresten (≤5%–10% klonten bij microscopisch onderzoek met Trypan Blue-uitsluiting).
7. Verzamel de single-cell suspension
   1. Centrifugeer de suspensie op 100 × g gedurende 5 minuten op kamertemperatuur.
   2. Verwijder het supernatant voorzichtig.
   3. Ga direct door naar Stap 4.
      OPMERKING: Begin met kleuren binnen 15 minuten na de voorbereiding van single-cel suspensie en voltooi de celsortering binnen 1 uur wanneer mogelijk. Houd cellen tijdens dit interval op ijs om levensvatbaarheidsverlies te minimaliseren.

4. Kleuring voor fluorescentie-geactiveerde celsortering

OPMERKING: Voer deze procedure uit in ongeveer 60 minuten om gedissocieerde voorste hypofysecellen te kleuren op FACS van CD90-positieve cellen.

1. Bereid de celsuspensie voor
   1. Voeg 350 μL kleuringsbuffer bestaande uit fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, 1×) met 2% FBS en 0,09% natriumazide toe aan de celpellet.
   2. Suspendeer de pellet voorzichtig opnieuw door 10 keer op en neer te pipetteren met een P1000 micropipet met tips met lage retentie om een single-cell suspension te verkrijgen.
   3. Breng de suspensie over in een 1,5 mL laagbindende microcentrifugebuis.
2. Bepaal de celconcentratie en levensvatbaarheid
   1. Verwijder een aliquot van 5 μL uit de suspensie voor celtelling.
   2. Meng de aliquot met 5 μL levensvatbaarheidskleurstof.
   3. Laad 10 μL van het mengsel in een geautomatiseerde celteller.
      OPMERKING: Ga over tot FACS wanneer de levensvatbaarheid van cellen ≥85% is, bepaald door het uitsluiten van levensvatbare kleurstoffen en wanneer minimale rest- en celaggregaten worden waargenomen.
   4. Bevestig dat de totale celconcentratie ongeveer 1 × 10^{7 cellen} /mL is voor euthyroïde monsters en 2 × 10^{7 cellen} /mL voor hypothyreoïde monsters (Figuur 2B). De celgrootteverdeling na dissociatie wordt weergegeven in Figuur 2C.
3. Bereid compensatiecontroles voor
   1. Breng 50 μL van de celsuspensie over in een 300 μL kleuringsbuffer.
   2. Verdeel de suspensie in drie 100 μL aliquots in aparte 1,5 mL microcentrifugebuizen.
   3. Bereid de volgende controles voor: (i) ongekleurde controle, (ii) propidiumjodide (alleen PI)-controle, en (iii) fycoerythrin-cyanine 7 (PE-Cy7) CD90.2-only controle.
4. Kleur de cellen
   1. Voeg 3 μL PE-Cy7-geconjugeerde anti-CD90.2 antilichamen toe aan 300 μL celsuspensie.
      OPMERKING: De antistofconcentratie is bepaald door eerdere titratie-experimenten. Een uiteindelijke verdunning van 1:100 zorgde voor een optimale scheiding tussen positieve en negatieve populaties, terwijl achtergrondkleuring werd geminimaliseerd.
   2. Voeg 1 μL antilichaam toe aan de CD90.2-compensatiecontrole om een uiteindelijke verdunning van 1:100 te verkrijgen.
   3. Breng alle monsters 30 minuten in het donker op ijs.
      OPMERKING: Meng de monsters voorzichtig elke 10 minuten tijdens de incubatie om de homogene kleuring te behouden.
5. Was de gekleurde cellen
   1. Voeg 1 ml koud kleurbuffer toe aan elke buis.
   2. Centrifugeer de monsters op 210 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: indien beschikbaar, schakel de centrifugerem uit om verstoring van de celpellet tijdens het vertragen te minimaliseren.
   3. Verwijder en gooi het supernatant voorzichtig weg.
6. Stil de gekleurde cellen opnieuw op
   1. Suspendeer de hoofdcel-suspensie opnieuw in een 300 μL kleurbuffer.
      OPMERKING: Voeg direct voor sortering PI toe tot een uiteindelijke concentratie van 1 μg/mL.
   2. Onderbreek elke compensatieregeling opnieuw in een 100 μL kleuringsbuffer.
7. Filter de celsuspensie
   1. Filter de celsuspensie direct voor sortering door een flowcytometriebuis voorzien van een 35 μm celzeef.
8. Ga over naar fluorescentie-geactiveerde celsortering
   1. Ga direct door naar stap 5 en sorteer de gekleurde cellen met een fluorescentie-geactiveerde celsorter.

5. FACS-gating- en sorteerstrategie

OPMERKING: Voer deze procedure uit in ongeveer 60 minuten om levensvatbare CD90.2-positieve thyrotropen te isoleren met FACS.

1. Configureer de celsorter
   1. Installeer een 100 μm nozzle op de celsorter.
   2. Stel de manteldruk in op 20 psi.
      OPMERKING: Gebruik steriele PBS-gebaseerde mantelvloeistof op kamertemperatuur.
2. Voer instrumentkwaliteitscontrole uit
   1. Voer kwaliteitscontroleprocedures uit volgens de instructies van de fabrikant vóór het nemen van het monster.
      OPMERKING: Vergelijkbare door de fabrikant aanbevolen kwaliteitscontroleworkflows kunnen worden gebruikt op alternatieve celsorterings.
   2. Controleer de druppelvertraging en stroomstabiliteit met kalibratiekralen.
3. Voer fluorescentiecompensatie uit
   1. Verwerf eenkleurige compensatiecontroles.
   2. Voer fluorescentiecompensatie uit vóór gating en sortering.
      OPMERKING: Bereken de compensatie met behulp van ongekleurde en enkelkleurige controles. Controleer en pas compensatiematrices handmatig aan voordat je sorteert wanneer nodig.
4. Definieer de gatingstrategie
   1. Sluit puin uit met behulp van voor-verstrooide en zij-verstrooide parameters (Figuur 3A,B).
   2. Gate enkele cellen met voorste verstrooiingshoogte versus voorwaartse verstrooiingsoppervlakte en zijverstrooiingshoogte versus zijverstrooiingsgebied (Figuur 3A,B).
   3. Dode cellen uitsluiten door PI-negatieve cellen te gaten.
   4. Gate CD90.2-positieve cellen voor thyrotrope-verrijking.
      OPMERKING: Definieer CD90.2-positieve cellen als gebeurtenissen met fluorescentieintensiteit groter dan 10³ in het CD90-detectiekanaal (Figuur 3C–F).
5. Maak verzamelbuizen klaar
   1. Bereid verzamelbuizen voor volgens de beoogde downstream toepassing.
      OPMERKING: Vul laagretentie-verzamelbuizen vooraf met ofwel 1 mL QIAzol lyse-reagens voor RNA-isolatie of Medium 199 aangevuld met 10% houtskoolgestript foetaal rundvleesserum voor celkweektoepassingen.
6. Sorteer CD90.2-positieve thyrotropen
   1. Sorteer CD90.2-positieve losse cellen in verzamelbuisjes.
   2. Verzamel cellen voor RNA-analyse
      1. Verzamel cellen direct in 1 mL lysereagens.
      2. Laat de buizen 1 minuut vortexen om de cellen te lyseren.
      3. Vries de monsters direct in op droogijs.
      4. Bewaar de monsters bij −80°C tot RNA-extractie.
   3. Verzamel cellen voor primaire kweek
      1. Verzamel cellen in kweekmedium aangevuld met 10% houtskoolgestript foetaal rundvleesserum en 1% penicilline-streptomycine.
      2. Zaad de cellen in 8-well glaskamerglaasjes met een dichtheid van minstens 2 × 10 5-cellen per put in een eindvolume van 200 μL.
      3. Kweek de cellen tot 72 uur bij 37°C in een bevochtigde broedmachine met 5% CO₂.
         OPMERKING: Acceptabele kweekprestaties worden aangegeven door zichtbare celhechting binnen 24 uur, ongeveer 60%–80% hechtingsefficiëntie en ≥70%–80% levensvatbaarheid na 72 uur.
      4. Voeg indien nodig 100 nM T3 toe aan het kweekmedium.
         OPMERKING: Start de T3-behandeling na celhechting, meestal 24 uur na het plateren, en houd de behandeling vol tot monsterafname op 72 uur. Bereid T3-voorraadoplossing voor in 40 mM NaOH en neem de met het voertuig behandelde controles op dezelfde uiteindelijke oplosmiddelconcentratie.
         OPMERKING: Koolstofgestript serum handhaaft een TH-depleated cultuuromgeving en verbetert de detectie van experimenteel geïnduceerde T3-afhankelijke onderdrukking van Tshb-expressie .

Figuur 3. FACS-gatingstrategie en validatie van thyrotrope-verrijking. (A,B) Sequentiële gatingstrategie gebruikt om levensvatbare enkele voorste hypofysecellen te isoleren. Poorten omvatten uitsluiting van afval met behulp van voorver-verstrooide gebied (FSC-A) en zijverstrooiingsgebied (SSC-A), singlet-discriminatie met voorwaartse verstrooiingshoogte (FSC-H) versus FSC-A en zijverstrooiingshoogte (SSC-H) versus SSC-A, en uitsluiting van propidiumjodide (PI)-positieve dode cellen. (C–F) Representatieve FACS-grafieken tonen identificatie en verrijking van CD90.2-positieve en CD90.2-negatieve celpopulaties met behulp van een phycoerythrin-cyanine 7 (PE-Cy7)-geconjugeerd anti-CD90.2-antilichaam. (G–I) Reverse-transcriptie kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR) validatie van thyrotrope-verrijking in gesorteerde celpopulaties. Afkortingen: FSC-A, voorwaartse verstrooiingsgebied; SSC-A, zij-verstrooiingsgebied; FSC-H, voor-voor-verstrooide hoogte; SSC-H, zijdelingse verstrooiingshoogte; PI, propidiumjodide; PE-Cy7, fycoerythrine–cyanine 7; NT, onbehandeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Genexpressie-analyse van Tshb mRNA in CD90-positieve versus CD90-negatieve cellen door middel van real-time polymerasekettingreactie

OPMERKING: Voer deze procedure uit in ongeveer 5 uur om de expressie van Tshb mRNA in gesorteerde celpopulaties te kwantificeren.

1. Verzamel gesorteerde cellen voor RNA-extractie
   1. Verzamel gelijke aantallen CD90-positieve en CD90-negatieve cellen (2,5 × 10⁵ cellen) in aparte 1,5 mL buizen met 1 mL lysisreagens.
2. Lyseer de cellen
   1. Draai de monsters krachtig 1 minuut lang om de cellen volledig te laten lyseren en plaats ze dan op ijs.
      OPMERKING: Bewaar gelyseerde monsters bij −80°C vóór RNA-extractie indien nodig.
3. Extractie van totaal RNA
   1. Extraheer het totale RNA volgens de instructies van de fabrikant die bij de RNA-extractiekit zijn geleverd.
      OPMERKING: Voer de vertering van DNase uit tijdens zuivering met RNase-vrije DNase I volgens de instructies van de fabrikant om het resterende genomische deoxyribonucleïnezuur (DNA) te verwijderen vóór eluatie.
   2. Meet de RNA-concentratie met een spectrofotometer.
      OPMERKING: Gebruik monsters met een A260/A280-verhouding van ongeveer 1,8–2,1 en een A260/A230-verhouding groter dan 1,8 voor complementaire DNA-synthese.
4. CDNA synthetiseren
   1. Synthetiseer cDNA uit 100 ng totaal RNA volgens de instructies van de fabrikant die bij de eerste streng cDNA-synthese kit zijn geleverd.
      OPMERKING: Gebruik oligo(dT)-primers tijdens cDNA-synthese.
   2. Bereid het sjabloon-primermengsel voor volgens Tabel 1.
   3. Meng de reagentia voorzichtig en centrifugeer kort om het monster op de bodem van de buis te verzamelen.
   4. Denatureer het sjabloon-primermengsel bij 65°C gedurende 10 minuten.
   5. Laat de monsters direct koelen op ijs.
   6. Bereid het omgekeerde transcriptie-reactiemengsel voor volgens Tabel 2 om een eindvolume van 20 μL te verkrijgen.
      OPMERKING: Bereid een mastermix voor door de in Tabel 2 vermelde reagensvolumes te vermenigvuldigen met het totale aantal monsters en voeg een extra 10% overtollig volume toe om rekening te houden met de pipetvariabiliteit.
   7. Meng de reactie voorzichtig zonder vortex en centrifugeer kort.
   8. Incubeer de reactie bij 50°C gedurende 60 minuten.
   9. Inactiveer de reactie bij 85°C gedurende 5 minuten.
   10. Koel de monsters op ijs.
   11. Ga direct door met reverse-transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) of sla het cDNA op bij −30°C tot gebruik.
       OPMERKING: cDNA kan tot 6 maanden worden opgeslagen bij −30°C onder nucleasevrije omstandigheden. Vermijd herhaalde vries-dooicycli.
       OPMERKING: Voer cDNA-synthesestappen uit in een thermocycler met een verwarmd deksel om verdamping te minimaliseren.
5. Bereid het RT-qPCR reactiemengsel voor
   1. Bereid het RT-qPCR reactiemengsel voor volgens Tabel 3.
6. Laad de RT-qPCR-plaat
   1. Voeg 9 μL RT-qPCR reactiemengsel toe aan elke put van een 96-put plaat.
   2. Voeg 1 μL cDNA-sjabloon toe dat overeenkomt met het omgekeerd getranscribeerde product, gegenereerd uit 5 ng input totaal RNA.
   3. Meng de monsters voorzichtig en centrifugeer kort.
7. Voer RT-qPCR uit
   1. Voer RT-qPCR uit volgens de instructies van de fabrikant die bij de SYBR Green mastermix zijn geleverd.
      OPMERKING: Gebruik een initiële denaturatiestap van 95°C gedurende 2 minuten, gevolgd door 40 cycli van 95°C voor 5 seconden en 60°C voor 30 seconden. Verkrijg fluorescentie aan het einde van elke extensiestap. Voer smeltcurveanalyse uit van 65°C tot 95°C in stappen van 0,5°C om de amplificatie van enkelvoudig product te verifiëren.
8. Normaliseer de Tshb-expressie
   1. Normaliseer Tshb-expressie naar Cyclophiline A (CyA)-expressie met behulp van de ΔCt-methode.
      OPMERKING: Valideer de stabiliteit van CyA vóór analyse door minimale CT-variatie tussen experimentele groepen te bevestigen.
9. Bereken relatieve genexpressie
   1. Bereken relatieve Tshb-expressie in CD90-positieve cellen ten opzichte van CD90-negatieve cellen met behulp van de 2^{−ΔΔCt-methode} .
      OPMERKING: Voer RT-qPCR-analyse uit met acht biologische monsters, elk geanalyseerd in technische dubbele reacties (Figuur 3G–I).

Reagens	Volume	Eindniveau/concentratie
Totaal RNA	Variabele	100 ng
Verankerde oligo(dT)18 primer (50 pmol/μL)	1 μL	2,5 μM
PCR-kwaliteit water	Variabele	Stel het volume van 13 μL aan
Totaal	13 μL	—

Tabel 1: Template–primer-mengsel voorbereiding voor complementaire deoxyribonucleïnezuursynthese. Reagentia, volumes en uiteindelijke hoeveelheden die worden gebruikt om het template–primer-mengsel te bereiden voor complementaire deoxyribonucleïnezuur (cDNA) synthese. Elke reactie bevatte 100 ng totaal ribonucleïnezuur (RNA), een verankerde oligo(dT)18-primer en polymerasekettingreactie (PCR)-kwaliteit water, aangepast tot een eindvolume van 13 μL. De gerapporteerde concentratie van 2,5 μM verwijst naar de primerconcentratie in het 13 μL template–primer-mengsel vóór toevoeging van de reverse-transcriptie-reactiecomponenten.

Reagens	Volume	Eindniveau/concentratie
Transcriptor omgekeerde transcriptase reactiebuffer (5×)	4 μL	1×
Protector RNase-remmer (40 U/μL)	0,5 μL	20 U
Deoxynucleotidemengsel (10 mM elk)	2 μL	1 mM per stuk
Transcriptor omgekeerde transcriptase (20 U/μL)	0,5 μL	10 U
Sjabloon–primermengsel (Tabel 1)	13 μL	—
Totaal	20 μL	—

Tabel 2: Omgekeerd-transcriptie reactiemengsel voor complementaire deoxyribonucleïnezuursynthese. Reagentia, volumes en eindconcentraties gebruikt voor eerstestrengs complementaire deoxyribonucleïnezuur (cDNA) synthese. Het uiteindelijke reactievolume was 20 μL. De gerapporteerde deoxynucleotidetrifosfaatconcentraties (1 mM elk) verwijzen naar de uiteindelijke concentraties in het volledige reactiemengsel.

Reagens	Volume	Eindniveau/concentratie
PowerTrack SYBR Groene Master Mix (2×)	5 μL	1×
Tshb voor- en omgekeerde oligonucleotide primers (zie Tabel van Materiaal)	0,5 μL	400 nM
PCR-kwaliteit water	3,5 μL	Stel het reactievolume van 9 μL aan
Subtotaalreactievolume	9 μL	—
cDNA-sjabloon	1 μL	5 ng
Eindreactievolume	10 μL	—

Tabel 3: Omgekeerd-transcriptie kwantitatieve polymerasekettingreactie-mengselvoorbereiding. Reagentia, volumes en eindconcentraties gebruikt voor reverse-transcriptie quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) amplificatie van Tshb boodschapper ribonucleïnezuur (mRNA). Het reactiemengselvolume vóór de toevoeging van het sjabloon was 9 μL. Voeg direct voor amplificatie 1 μL complementair deoxyribonucleïnezuur (cDNA) sjabloon toe om een uiteindelijk reactievolume van 10 μL te verkrijgen.

Resultaten

Twaalf C57BL/6 muizen van 8 weken oud (6 mannetjes en 6 vrouwtjes) werden 1 week lang behandeld met MMI en KClO₄ in drinkwater samen met een jodiumdeficiënt dieet om hypothyreoïdie te induceren (Figuur 1A). De expressie van levertype 1 Dio1 mRNA werd gekwantificeerd bij muizen bij euthyroïde en hypothyreoïde om succesvolle hypothyreoïdie-inductie te bevestigen²⁹. Hypothyreoïde muizen vertoonden een vermindering van ongeveer 6...

Discussie

Het hier beschreven CD90-gebaseerde FACS-protocol biedt een reproduceerbare methode om primaire thyrotropen uit volwassen muis hypofyseweefsel te verrijken, terwijl de hormonale respons behouden blijft. Deze methode pakt een langdurige technische beperking aan in de studie van thyrotropebiologie en HPT-asregulatie. Historisch gezien hebben onderzoeken naar thyrotroperegulatie sterk vertrouwd op de TαT1-cellijn; echter, TαT1-cellen vertonen een zeer lage basale Tshb-expressie en ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.22 µm filter	Corning	430769	Voor sterilisatie van het verzamelingsmedium
0.22 µm spuitfilter	Pall Life Sciences	PN4602	Voor sterilisatie van collagenase
0,5% Trypsin–EDTA	Gibco	15400-054	Voor celafsplitsing
1,5 mL lage binding microcentrifugebuisjes	Invitrogen	AM12450	Voor FACS-kleuring
15 mL polypropyleenbuisjes	Falcon	352097	Voor verzameling van de voorkwab en celafsplitsing
23-gauge naald	BD Vacutainer Safety-Lok	367283	Voor hartperfusie
8-well glazen kamerslide	Millipore	PEZGS0816	Voor post-FACS-cultuur
Accudrop-kralen	BD Biosciences	345249	Voor druppelvertragingskalibratie tijdens FACS
Anti-muis PE-Cy7 anti-CD90.2-antilichaam	Invitrogen	25-0902-82	Voor FACS-kleuring
Geautomatiseerde celteller	DeNovix	s-10700	Voor celtelling
Charcoal-gestript foetaal bovien serum	Gibco	12676029	Voor post-FACS thyrotrope cultuur
Collagenase uit Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C9263	Voor celafsplitsing
Verzamelbak	Standaard laboratorium dissectielade	N/A	Voor hartperfusie
Op maat gemaakte HEPES-gebufferde zoutoplossing (HBSS) zonder Ca2+ en Mg2+	N/A	N/A	Voor perfusie en celafsplitsing
Cyclophilin A (CyA) oligonucleotide primer voorwaarts	Integrated DNA Technologies	5′-GCC GAT GAC GAG CCC TTG-3′	Voor RT-qPCR
Cyclophilin A (CyA) oligonucleotide primer achterwaarts	Integrated DNA Technologies	5′-TGC CGC CAG TCG CAT TAT-3′	Voor RT-qPCR
DMEM, 1×	Gibco	11965-092	Voor verzamelingsmedium
DNase I-oplossing	Promega	M6101	Voor celafsplitsing
Enoxaparin-natriuminjectie	Sandoz	0781-3119-64	Voor perfusie
Foetaal bovien serum (FBS)	Cytiva HyClone	SH30088.02HI	Voor verzamelingsmedium
Flow cytometry kleuringsbuffer	Invitrogen	00-4222-26	Voor FACS-kleuring
Hemostat	Fine Science Tools	13008-12	Voor stabilisatie van de borstholte
HEPES, 1 M	Gibco	15630-080	Voor verzamelingsmedium
HEPES, 1 M	Teknova	H1035	Voor HBSS-voorbereiding
Jodiumarm dieet	Envigo	TD.95007	Voor in vivo hypothyreoïdie-inductie
Iristang	Fine Science Tools	11065-07	Voor hypofysdissectie
Isofluraan	Piramal Critical Care	66794-017-25	Voor anesthesie
L-glutamine	Gibco	35050-061	Voor verzamelingsmedium
Medium 199	Gibco	11150-059	Voor post-FACS-cultuur
Methimazool (MMI)	Sigma-Aldrich	M8506-100G	Voor in vivo hypothyreoïdie-inductie
MicroAmp Fast 96-well reactieplaat	Applied Biosystems	4346907	Voor RT-qPCR
Penicilline–Streptomycine	Gibco	15140122	Voor post-FACS-cultuur
Peristaltiekpomp	Fisher Scientific	GP1000	Voor hartperfusie
Kaliumperchloraat (KClO4)	Sigma-Aldrich	241830-500G	Voor in vivo hypothyreoïdie-inductie
PowerTrack SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	A46109	Voor RT-qPCR
Propidiumjodide	eBioscience	00-6990-50	Voor levensvatbaarheidskleuring tijdens FACS
QIAzol-lysisreagens	Qiagen	79306	Voor RNA-extractie
Siliconen slang	Cole-Parmer	EW-96410-13	Voor hartperfusie
Stereomicroscoop	Nikon	SMZ-745T	Voor hypofysdissectie
StepOnePlus Real-Time PCR-systeem	Applied Biosystems	4376600	Voor RT-qPCR
Chirurgische lepel	Fine Science Tools	10090-13	Voor hersenopheffing tijdens hypofysexpositie
Transcriptor First Strand cDNA Synthese Kit	Roche	4379012001	Voor cDNA-voorbereiding
Trypan Blauw	Thermo Fisher Scientific	T10282	Voor celtelling
Tshb oligonucleotide primer voorwaarts	Integrated DNA Technologies	5′-TCT GTG CTG GGT ATT GTA TGA C-3′	Voor RT-qPCR
Tshb oligonucleotide primer achterwaarts	Integrated DNA Technologies	5′-GCG GCT TGG TCG AGT AGT TG-3′	Voor RT-qPCR
Waterbad	Fisher Scientific Isotemp Water Bath	15-462-5Q	Voor enzymatische vertering