Deze studie integreert openbare datasets, validatie met gepaarde weefsels, celmigratie-assays, voorspelling van target-netwerken en analyse van immuunsignaturen om miR-192-5p in colorectale kanker te evalueren. De bevindingen benadrukken de discrepantie tussen de expressiegegevens van TCGA/GDC en lokale qRT-PCR-resultaten en waarschuwen tegen overinterpretatie van de diagnostische, prognostische, functionele en immuun-gerelateerde significantie ervan.
Onderzoeksartikel
Klinische significantie, immuuninfiltratielandschap en functionele netwerkanalyse van miR-192-5p bij colorectale kanker
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Colorectaal carcinoom (CRC) is een heterogene maligniteit waarbij microRNA's kunnen bijdragen aan tumorprogressie en de ontdekking van biomarkers. Deze studie evalueerde de klinische significantie, immuunassociaties en het functionele netwerk van miR-192-5p bij CRC door de integratie van bioinformatische analyses van TCGA/GDC en GEO, qRT-PCR-validatie van gepaarde weefsels, targetvoorspelling, analyse van immuunsignaturen en wound-healing-experimenten met HT29-cellen. Heranalyse van TCGA/GDC miRNA-seq-data omvatte 616 tumor- en 11 normale COADREAD-monsters en toonde een hoger hsa-mir-192-signaal op databaseniveau in tumor-monsters dan in normale monsters (Mann-Whitney p = 9.96 x 10-8). Dezelfde trend werd waargenomen in 11 gepaarde TCGA-gevallen (mediaan verschil tumor-normaal = 3.13 log2[RPM + 1], Wilcoxon p = 0.0029), terwijl lokale qRT-PCR in gepaarde klinische weefsels een lagere expressie van volwassen miR-192-5p in CRC-weefsels ondersteunde. Op TCGA gebaseerde ROC-analyse toonde een sterke scheiding tussen tumor en normaal weefsel, maar gebalanceerde resampling- en leave-one-normal-out-analyses bevestigden dat dit resultaat voorzichtig geïnterpreteerd moet worden vanwege het beperkte aantal normale monsters. Clinicopathologische analyse suggereerde associaties met N-stadium en leeftijd in de TCGA-cohort, terwijl T-stadium en M-stadium niet significant waren in de samenvattende tabel, en de analyse van de algehele overleving geen significante prognostische associatie liet zien. Analyses van kandidaat-hubgenen met behulp van TCGA RNA-seq leverden exploratief bewijs voor expressie, correlatie en overleving, maar stelden geen directe targeting door miR-192-5p vast. Analyse van immuunsignaturen toonde heterogene, grotendeels zwakke correlaties. Functioneel gezien reduceerde transfectie met een miR-192-5p-mimic de wondsluiting van HT29. Deze bevindingen geven aan dat miR-192-5p biologisch relevant is voor CRC, maar dat de expressierichting en klinische interpretatie platformafhankelijk zijn en verdere experimentele validatie vereisen.
Inleiding
Colorectaal carcinoom (CRC) is een van de meest voorkomende maligniteiten wereldwijd en blijft een belangrijke oorzaak van kankergerelateerde mortaliteit1,2. Hoewel colonoscopie, immunochemische ontlastingstests, SEPT9-methyleringstests, circulerende tumormarkers en moleculaire profilering de detectie en het klinische beheer van CRC hebben verbeterd3,4, blijft er aanzienlijke heterogeniteit bestaan in de tumorbiologie, de behandelrespons en de uitkomsten voor de patiënt5,6,7. Biomarkers die helpen bij het karakteriseren van de CRC-biologie kunnen daarom bijdragen aan risicostratificatie en aan de ontwikkeling van meer geïndividualiseerde therapeutische strategieën8.
Micro-RNA's (miRNA's) zijn kleine niet-coderende RNA's, ongeveer 19–24 nucleotiden lang, die genexpressie reguleren voornamelijk via post-transcriptionele mechanismen9. Ontregelde miRNA-expressie kan de proliferatie, migratie, invasie, apoptose, immuuninteracties en behandelingsrespons van kankercellen beïnvloeden10. Er is gerapporteerd dat miR-192-5p op een contextafhankelijke manier werkt bij verschillende ziekten en kankers, met zowel oncogene als tumor-suppressieve associaties, afhankelijk van het weefseltype, de moleculaire achtergrond en het experimentele systeem11,12,13,14,15,16. Bij CRC hebben eerdere studies veranderde miRNA-profielen in klinische monsters en functionele regulatie van maligne fenotypes in colonkankercellen gerapporteerd12,14,15. Analyses van publieke databases laten echter niet altijd dezelfde expressierichting zien, en de klinische significantie, het target-netwerk en de immuunassociaties van miR-192-5p bij CRC vereisen een zorgvuldige evaluatie.
De huidige studie evalueerde miR-192-5p in CRC door de integratie van bio-informatische analyses van TCGA/GDC en GEO, qRT-PCR validatie in gepaarde klinische weefsels, in vitro migratie-assays, voorspelling van kandidaat-doelgenen, pathway-verrijking en correlatieanalyse van immuunsignaturen. De studie was gebaseerd op de hypothese dat rijp miR-192-5p mogelijk downgereguleerd is in CRC-weefsels en een tumorsuppressief effect kan uitoefenen. Omdat het geanalyseerde TCGA/GDC miRNA-seq signaal de tegenovergestelde expressierichting vertoonde, worden de resultaten geïnterpreteerd als exploratief en platformafhankelijk, in plaats van als een enkel definitief expressiepatroon.
Protocol
Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki. Goedkeuring werd verleend door de Ethiekcommissie van de Inner Mongolia Medical University op 21 oktober 2021. Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle deelnemers die aan de studie deelnamen.
Afname van klinische monsters
Gepaarde CRC- en aangrenzende niet-kankerous weefsels werden verzameld van 45 patiënten die tussen december 2017 en februari 2020 een radicale resectie ondergingen. Geen van de patiënten ontving preoperatieve radiotherapie of chemotherapie, en patiënten met andere maligniteiten werden uitgesloten. Aangrenzend niet-kankerous weefsel werd verzameld op ten minste 5 cm van de tumormarge. Monsters werden direct na chirurgische verwijdering ingevroren en bewaard in vloeibare stikstof tot aan de RNA-extractie. De cohort bestond uit 27 mannelijke en 18 vrouwelijke patiënten; 13 patiënten waren jonger dan 60 jaar en 32 waren 60 jaar of ouder. Clinicopathologische variabelen omvatten tumerdiameter, TNM-stadium, differentiatie, vasculaire tumortrombus, lymfekliermetastasen en het preoperatieve CEA-niveau.
Publieke data-acquisitie en preprocessing
Open-access miRNA-seq-, RNA-seq- en klinische gegevens voor TCGA-COAD en TCGA-READ werden verkregen via het Genomic Data Commons-portaal. Primaire tumoren en normale vaste weefselmonsters werden geïdentificeerd op basis van het GDC-monstertype. Metastatische en recidiverende tumorstalen werden uitgesloten van de differentiële expressieanalyse tussen tumor en normaal weefsel. Voor de TCGA miRNA-seq-bestanden was hsa-mir-192 de database-entry die voor deze analyse werd gedetecteerd; expressiewaarden werden geanalyseerd als log2(RPM + 1), waarbij RPM staat voor reads per million gemapte miRNA-reads. Zowel ongepaarde als gepaarde tumor-normaal analyses werden uitgevoerd wanneer overeenkomstige monsters beschikbaar waren. De GEO-datasets GSE89076 en GSE156355 werden gebruikt voor de screening van kandidaat-doelgenen. Differentieel tot expressie gebrachte genen uit GEO werden gescreend met een aangepaste p < 0,05 en een absolute log2 fold-change ≥ 2. De namen van de datasets werden in het gehele manuscript op consistentie gecontroleerd.
Diagnostische, clinicopathologische en overlevingsanalyses
Receiver operating characteristic (ROC)-analyse werd gebruikt om de exploratieve scheiding tussen tumor- en normaalweefsel te beoordelen in TCGA-COAD, TCGA-READ en de gecombineerde COADREAD-cohort. Vanwege het geringe aantal normale monsters werden aanvullende sensitiviteitsanalyses uitgevoerd, waaronder gebalanceerde tumor-normaal resamplings met 5.000 iteraties en leave-one-normal-out-analyse. Voor clinicopathologische associatieanalyses werden primaire tumorstalen verdeeld in groepen met een hoge en lage expressie op basis van het mediane TCGA miR-192-expressieniveau. Analyses werden herhaald voor de gecombineerde COADREAD-cohort en voor COAD en READ afzonderlijk wanneer de steekproefomvang dit toeliet. De algehele overleving werd geëvalueerd met Kaplan-Meier-analyse met de log-ranktoets en univariabele Cox-regressie. Diagnostische, clinicopathologische en overlevingsanalyses werden afzonderlijk gerapporteerd om overschatting van prognostische conclusies te voorkomen.
Analyses van kandidaat-doelgenen en hub-genen
Kandidaat-doelgenen werden geïdentificeerd door miRWalk-voorspellingen te integreren met differentieel tot expressie gebrachte genen uit GSE89076 en GSE156355. De overlap tussen deze drie bronnen werd behouden voor verdere exploratieve analyse. Er werd een eiwit-eiwit-interactienetwerk geconstrueerd met STRING, en hub-genen werden geselecteerd op basis van node-graad en module-connectiviteit met behulp van Cytoscape-gebaseerde cytoHubba- en MCODE-analyses. De behouden hub-genen (KIF20A, TPX2, CDCA5, CCNB1, CDK1, PLP1, NRXN1, GRIK3 en KIF5C) werden verder geëvalueerd met behulp van TCGA RNA-seq data. Verschillen in expressie tussen tumor- en normaalweefsel, Spearman-correlaties met TCGA miR-192 expressie en associaties met de algehele overleving werden samengevat als aanvullende exploratieve analyses. Deze genen werden uitsluitend als kandidaat-doelen beschouwd; er werd op basis van de bio-informatische gegevens geen directe binding, rescue-effect of regulatie op eiwitniveau stroomafwaarts afgeleid.
GO- en KEGG-verrijkingsanalyse
Gene Ontology (GO)- en Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)-verrijkingsanalyses werden uitgevoerd voor de set kandidaatgenen en significante netwerkmodules. GO-termen werden gegroepeerd in categorieën voor biologische processen, cellulaire componenten en moleculaire functies. Verrijkingsresultaten met p < 0,05 werden als statistisch opmerkelijk beschouwd en werden geïnterpreteerd als hypothese-genererende signalen voor pathways in plaats van experimenteel gevalideerde mechanismen.
RNA-extractie en qRT-PCR-analyse
Totaal RNA werd geëxtraheerd uit 45 gepaarde CRC- en aangrenzende niet-kankerous weefselmonsters met TRIzol-reagens volgens het protocol van de fabrikant. De RNA-zuiverheid en -concentratie werden spectrofotometrisch bepaald, en monsters met A260/A280-waarden tussen 1,8 en 2,1 werden gebruikt voor reverse transcriptie. qRT-PCR werd uitgevoerd met een miRNA reverse transcriptie-systeem en SYBR Green-gebaseerde miRNA qPCR-reagentia van TransGen Biotech. Reverse transcriptie en qPCR-amplificatie werden uitgevoerd volgens de instructies van de reagensfabrikant. Elke qRT-PCR-reactie werd in technisch triplikaat uitgevoerd. RNU6B werd gebruikt als interne referentie. De miR-192-5p-primers waren 5'-GGGGCTGACCTATGAATTGA-3' (forward) en 5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3' (reverse). De RNU6B-primers waren 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3' (forward) en 5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3' (reverse). Smeltcurve-analyse werd gebruikt om de amplificatiespecificiteit te beoordelen wanneer dit werd ondersteund door het qPCR-platform. De relatieve expressie werd berekend met de 2-ΔΔCt-methode. Resultaten van gepaarde tumor- en aangrenzende weefsels werden geanalyseerd als gepaarde klinische metingen.
Celkweek en transfectie
De menselijke CRC-cellijn HT29 werd verkregen uit de laboratoriumvoorraad van de auteurs en was geauthenticeerd en bevestigd als vrij van mycoplasma-contaminatie. HT29-cellen werden gekweekt in McCoy's 5A-medium aangevuld met 10% foetaal runderserum, 100 U/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine bij 37 oC in een 5% CO2-atmosfeer. Cellen werden gepasseerd wanneer ze een confluentie van ongeveer 80% bereikten. miR-192-5p mimics en het negatieve-controle-oligonucleotide con238 werden gekocht bij Sangon Biotech (Shanghai, China) en gebruikt voor transiënte transfectie. HT29-cellen werden uitgeplaat in 6-wells platen en getransfecteerd wanneer de celdichtheid ongeveer 20–30% bereikte, met een uiteindelijke oligonucleotideconcentratie van 50 nM en een lipid-gebaseerd transfectieprotocol dat werd uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant van het reagens. De exacte reagens-oligonucleotide-verhouding en reagenshoeveelheid volgden het door de fabrikant aanbevolen protocol zoals vastgelegd in de laboratoriumverslagen van de auteurs. Cellen werden geïncubeerd met transfectiecomplexen onder standaard kweekcondities, waarna downstream transfectie-imaging en wound-healing assays werden uitgevoerd volgens het experimentele schema. Alleen gegevens van HT29-cellen werden in de huidige studie opgenomen.
Wondgenezingsassay
Getransfecteerde HT29-cellen werden uitgezaaid in 6-wells platen en gekweekt tot er een confluente monolaag was gevormd. Met een steriele 200 µL pipetpunt werd een lineaire kras aangebracht, waarna losgekomen cellen werden verwijderd door te wassen met PBS. Het medium werd vervolgens vervangen door serumvrij medium om proliferatie-gerelateerde effecten tijdens de beoordeling van de migratie te verminderen. Beelden van de wond werden vastgelegd op 0 h, 24 h en 48 h. De wound-healing assay werd uitgevoerd in drie onafhankelijke biologische replica's, waarbij voor elke groep en elk tijdstip meerdere microscopische velden werden gemeten. De wondbreedte werd gekwantificeerd op basis van microscopiebeelden met behulp van beeldanalyse-software; de exacte softwareversie die werd gebruikt voor de oorspronkelijke metingen was niet beschikbaar in de brondocumentatie. De wondgenezingssnelheid werd berekend als [(wondbreedte op 0 h - wondbreedte op het aangegeven tijdstip) / wondbreedte op 0 h] x 100%. Omdat de beschikbare manuscriptgegevens geen apart proliferatie-controle-experiment bevatten, werden de wound-healing resultaten geïnterpreteerd als migratie-gerelateerd, maar zonder proliferatie-effecten volledig uit te sluiten.
Correlatieanalyse van immuunhandtekeningen
De associatie tussen TCGA miR-192 expressie en immuun-gerelateerde signatures werd opnieuw beoordeeld met behulp van RNA-seq data van primaire tumoren. In totaal werden 425 tumorstalen met bijbehorende miRNA- en RNA-seq data opgenomen in de correlatieanalyse van de signature-scores. De expressie van miR-192 vertoonde na correctie voor de false-discovery rate statistisch significante, maar zwakke negatieve correlaties met verschillende immuun-signatures, waaronder Tfh-cellen (rho = -0.205, FDR = 0.00049), geactiveerde dendritische cellen (rho = -0.186, FDR = 0.00098), Treg-cellen (rho = -0.185, FDR = 0.00098), plasmacytoïde dendritische cellen (rho = -0.169, FDR = 0.0027) en macrofagen (rho = -0.149, FDR = 0.0092). Positieve correlaties werden hoofdzakelijk waargenomen voor eosinofiele (rho = 0.139, FDR = 0.0155) en Th17-cel signatures (rho = 0.121, FDR = 0.0296). Deze bevindingen wijzen op heterogene en over het algemeen zwakke immuunassociaties in plaats van een uniform positief patroon van immuuninfiltratie.
Statistische analyse
Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van GraphPad Prism 9.0, SPSS 25.0 en R-software 3.6.3. Continue variabelen werden samengevat als gemiddelde ± standaarddeviatie of mediaan met interkwartielafstand, afhankelijk van de geschiktheid. Gepaarde weefselvergelijkingen werden geanalyseerd met gepaarde tests wanneer tumor- en aangrenzende weefselmonsters waren gekoppeld. Non-parametrische tests werden gebruikt wanneer de aannames voor normaliteit niet werden behaald. ROC-curves, gebalanceerde resampling en leave-one-normal-out analyse werden gebruikt voor exploratieve diagnostische discriminatie; Chi-kwadraat-tests werden gebruikt voor categorische clinicopathologische associaties; log-rank en Cox-modellen werden gebruikt voor overlevinganalyses; en Spearman-correlatie werd gebruikt voor analyses van immuun- en hub-genen. Tweezijdige p < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant, waarbij correctie voor de false-discovery rate werd gerapporteerd voor correlaties van immuunhandtekeningen.
Resultaten
Expressieanalyse in publieke datasets en gepaarde klinische weefsels
Het expressiepatroon van miR-192 werd opnieuw beoordeeld met behulp van GDC-afgeleide TCGA-COAD en TCGA-READ miRNA-seq data (Figuur 1). In deze bestanden was de vermelding op databaseniveau geannoteerd als hsa-mir-192 in plaats van direct als de mature hsa-miR-192-5p soort; daarom werd dit resultaat uit de openbare database geïnterpreteerd als een TCGA miR-192 signaal. In de gecombineerde COADREAD cohort werden 616 primaire tumoren en 11 normale monsters van solide weefsel geanalyseerd. Tumorstalen vertoonden een hogere miR-192 expressie dan normale stalen (mediaan 16,05 vs 13,46 log2[RPM + 1], Mann-Whitney p = 9,96 x 10-8). Dezelfde trend van hogere expressie in tumoren werd waargenomen in COAD alleen (455 tumoren en 8 normale stalen, p = 9,89 x 10-8) en READ alleen (161 tumoren en 3 normale stalen, p = 1,94 x 10-5). Gepaarde TCGA-analyse toonde eveneens een hogere tumor-expressie aan in 11 gematchte gevallen (mediaan verschil tumor-normaal = 3,13 log2[RPM + 1], Wilcoxon p = 0,0029). Deze resultaten bleven inconsistent met het lokale gepaarde qRT-PCR resultaat, dat wees op een verminderde mature miR-192-5p expressie in CRC-weefsels (Figuur 2).
Diagnostische prestaties en clinicopathologische associaties
De op TCGA gebaseerde ROC-analyse werd herhaald met behulp van de hierboven beschreven definitie van discriminatie tussen tumor- en normaalmonsters (Figuur 3). De AUC was 0,968 voor de gecombineerde COADREAD-cohort, 0,947 voor COAD alleen en 0,994 voor READ alleen. Aanvullende gebalanceerde resampling leverde mediane AUC's op van 0,983 voor COADREAD, 0,984 voor COAD en 1,000 voor READ; echter waren de 95% betrouwbaarheidsintervallen breed voor COADREAD (0,868–1,000) en COAD (0,781–1,000), en READ bevatte slechts drie normaalmonsters. Een leave-one-out analyse van de normaalmonsters toonde even tevoren aan dat de ROC-schatting gevoelig was voor de kleine groep normaalmonsters. Daarom werd het ROC-resultaat slechts behouden als verkennend bewijs voor de scheiding tussen tumor en normaal, en niet als voldoende bewijs voor een klinische diagnostische biomarker. De clinicopathologische associatieanalyse op basis van de mediane TCGA miR-192 expressie toonde significante associaties met het N-stadium (p = 0,019) en leeftijd (p = 0,004), terwijl het T-stadium (p = 0,110) en M-stadium (p = 0,932) niet significant waren (Tabel 1).
Overlevingsanalyse
De analyse van de algehele overleving ondersteunde geen significante prognostische associatie voor de TCGA miR-192-expressie in CRC (Figuur 3). In de gecombineerde COADREAD-cohort was de Kaplan-Meier-vergelijking op basis van de mediaan-cut niet significant (log-rank p = 0,857), en univariabele Cox-regressie liet eveneens geen significante associatie zien (HR = 0,934 per log2-expressie-eenheid, p = 0,374). Dezelfde conclusie werd getrokken voor COAD (log-rank p = 0,889; Cox p = 0,493) en READ (log-rank p = 0,807; Cox p = 0,716). De gegevens ondersteunen dus geen sterke claim voor miR-192 als prognostische biomarker in CRC.
Kandidaat-doelgenen en functionele verrijking
De analyse van kandidaat-doelgenen werd uitgevoerd door miRWalk-voorspellingen te integreren met differentieel tot expressie gebrachte genen uit de GEO-datasets GSE89076 en GSE156355. Deze screening identificeerde 93 kandidaatgenen voor verdere netwerk- en verrijkingsanalyses (Figuur 4). Proteïne-interactieanalyse behield KIF20A, TPX2, CDCA5, CCNB1, CDK1, PLP1, NRXN1, GRIK3 en KIF5C als explorerende hub-genen (Figuur 5). TCGA RNA-seq sensitiviteitsanalyse toonde aan dat KIF20A, TPX2, CDCA5, CCNB1 en CDK1 hoger waren in tumorweefsel dan in normaal weefsel, terwijl PLP1, NRXN1, GRIK3 en KIF5C lager waren in tumorweefsel. De correlatieanalyse met TCGA miR-192 expressie was gemengd: CDCA5, CCNB1 en CDK1 vertoonden positieve correlaties, terwijl PLP1, NRXN1 en KIF5C negatieve correlaties vertoonden. Verrijkingsanalyse benadrukte representatieve termen gerelateerd aan geneesmiddelenmetabolisme door cytochroom P450, metabolisme van xenobiotica door cytochroom P450, retinolmetabolisme, termen gerelateerd aan de glutamaterge synaps en presynaptische organisatie (Figuur 6). Deze bevindingen ondersteunen de biologische relevantie van het hub-gennetwerk, maar bewijzen geen directe targeting door miR-192-5p.
Celmigratie-assay
HT29-cellen werden getransfecteerd met miR-192-mimics om de functionele effecten van de opregulatie van miR-192 te beoordelen. Fluorescentiemicroscopie bevestigde de succesvolle transfectie in de miR-192-5p-mimic- en de negatieve-controlegroep (Figuur 7). In de wound-healing assay was de migratiesnelheid van miR-192-getransfecteerde HT29-cellen lager dan die van niet-getransfecteerde HT29-cellen en negatieve-controle-getransfecteerde cellen, zowel na 24 h als na 48 h (Figuur 8). Na 24 h was de migratiesnelheid 9,75 +/- 2,43% in de miR-192-getransfecteerde groep, vergeleken met 15,69 +/- 3,47% in de niet-getransfecteerde groep en 15,45 +/- 3,92% in de negatieve-controlegroep (P = 0,010). Na 48 h was de migratiesnelheid 20,04 +/- 2,54% in de miR-192-getransfecteerde groep, vergeleken met respectievelijk 26,84 +/- 7,65% en 27,98 +/- 6,78% in de twee controlegroepen (P = 0,021). Deze resultaten suggereren dat opregulatie van miR-192 de migratie van HT29-cellen in vitro onderdrukt.
Correlatieanalyse van de immuunsignatuur
De associatie tussen TCGA miR-192-expressie en immuungerelateerde signaturen werd opnieuw beoordeeld met behulp van RNA-seq-gegevens van primaire tumoren (Figuur 9). In totaal werden 425 tumorstalen met bijbehorende miRNA- en RNA-seq-gegevens opgenomen in de correlatieanalyse van de signaturescore. De expressie van miR-192 vertoonde zwakke negatieve correlaties met meerdere immuuncelsignaturen, waaronder Tfh-cellen (rho = -0,205, p = 2,15e-05), geactiveerde dendritische cellen (rho = -0,186, p = 0,00011), Treg-cellen (rho = -0,185, p = 0,00013), plasmacytoïde dendritische cellen (rho = -0,169, p = 0,00046), macrofagen (rho = -0,149, p = 0,0020), Tcm-cellen (rho = -0,136, p = 0,0050), NK CD56bright-cellen (rho = -0,132, p = 0,0065) en Tem-cellen (rho = -0,129, p = 0,0078). Zwakke positieve correlaties werden waargenomen voor eosinofiele (rho = 0,139, p = 0,0040) en Th17-cel-signaturen (rho = 0,121, p = 0,0129). Bijgevolg lijkt de immuunassociatie van miR-192 in CRC heterogeen te zijn en mag deze niet worden beschreven als uniform positief over alle immuuninfiltraten heen.
Beschikbaarheid van gegevens
De publieke datasets die in deze studie zijn geanalyseerd, zijn beschikbaar via het GDC/TCGA-portaal en de Gene Expression Omnibus (GEO)-database onder de accessienummers GSE89076 en GSE156355. De dry-lab-analyses en re-analyses die tijdens deze studie zijn uitgevoerd, zijn opgenomen in Aanvullende Tabel 1. De onderliggende experimentele gegevens ter ondersteuning van de qRT-PCR- en wondgenezingsanalyses, inclusief ruwe qRT-PCR Ct-waarden, wondbreedtemetingen, originele microscopiebeelden en gerelateerde experimentele gegevens, zijn beschikbaar in Aanvullende Map 1.
Figuur 1: Pan-cancer expressieoverzicht van miR-192 in TCGA. De x-as toont afkortingen van tumoren en de y-as toont de relatieve miR-192 expressie. Blauw geeft normaal weefsel aan en rood geeft tumorweefsel aan. Statistische significantie wordt als volgt aangegeven: * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001; NS = niet significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: miR-192/miR-192-5p-expressie in CRC-datasets en gepaarde weefsels. (A) TCGA/GDC miRNA-seq-analyse die een hoger hsa-mir-192-signaal op databaseniveau laat zien in CRC-tumorstalen dan in normale stalen. (B) qRT-PCR-analyse van gepaarde lokale weefselstalen die een lagere expressie van rijp miR-192-5p laat zien in CRC-weefsels dan in aangrenzende niet-kankerous weefsels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Exploratieve diagnostische en overlevingsanalyses gebaseerd op TCGA hsa-mir-192 expressie. (A–C) Kaplan-Meier overlevingscurves. Overlevingsanalyse ondersteunde geen significante prognostische associatie. (D) ROC-curve voor tumor-normaal discriminatie in de TCGA-cohort. De AUC moet voorzichtig worden geïnterpreteerd vanwege het geringe aantal normale monsters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Screening van kandidaat-doelgenen en analyse van eiwitinteracties. (A) Venn-diagram dat de overlap laat zien tussen miRNA-doelvoorspellingen en differentieel tot expressie gebrachte genen uit GSE89076 en GSE156355. (B) Eiwit-eiwitinteractienetwerk van de 93 kandidaatgenen. Knopen vertegenwoordigen genen en randen vertegenwoordigen voorspelde of gecureerde genassociaties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Screening van hub-genen uit het netwerk van kandidaat-doelwitten. (A,B) Netwerkmodules geïdentificeerd door modulescreening. (C) Hub-gene ranking op basis van netwerkconnectiviteit. (D) Kandidaat hub-doelwitten die behouden blijven na integratie van de module- en graadgebaseerde screening. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Geselecteerde GO- en KEGG-verrijkingstermen voor kandidaatgenen en significante netwerkmodules. De bubble plot vat representatieve verrijkte biologische functies en pathways samen. Verrijkingsresultaten zijn exploratief en vereisen experimentele validatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Beelden van transfectie van HT29-cellen. (A) Representatieve HT29-cellen. (B) Fluorescentiebeeld van HT29-cellen getransfecteerd met miR-192-5p mimic. (C) Fluorescentiebeeld van HT29-cellen getransfecteerd met negatieve controle con238. Schaalbalk = 100 µm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Wound-healing assay in HT29-cellen. (A) Representatieve scratch-afbeeldingen op 0 u, 24 u en 48 u in niet-getransfecteerde HT29-cellen, miR-192-5p mimic-getransfecteerde HT29-cellen en con238-getransfecteerde HT29-cellen. (B) Kwantificering van de wound-healing rates op 24 u en 48 u, weergegeven als percentages. Schaalbalk = 100 µm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Correlatie tussen TCGA miR-192 expressie en immuungerelateerde handtekeningscores in CRC-tumorstalen. De analyse toonde heterogene immuunassociaties, met verschillende zwakke negatieve correlaties en, voornamelijk voor eosinofiel- en Th17-celhandtekeningen, positieve correlaties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Kenmerken | Lage expressie van TCGA miR-192 | Hoge expressie van TCGA miR-192 | p-waarde | Methode |
| n | 308 | 308 | ||
| T-stadium, n (%) | 0.11 | Chikwadraattoets | ||
| T1 | 9 (1.5%) | 11 (1.8%) | ||
| T2 | 44 (7.2%) | 59 (9.6%) | ||
| T3 | 209 (34.1%) | 211 (34.4%) | ||
| T4 | 43 (7%) | 27 (4.4%) | ||
| N-stadium, n (%) | 0.019 | Chiquadraat-toets | ||
| N0 | 156 (25.5%) | 190 (31%) | ||
| N1 | 88 (14.4%) | 63 (10.3%) | ||
| N2 | 61 (10%) | 54 (8.8%) | ||
| M-stadium, n (%) | 0.932 | Chiquadraat-toets | ||
| M0 | 214 (39.9%) | 234 (43.7%) | ||
| M1 | 41 (7.6%) | 47 (8.8%) | ||
| Leeftijd, mediaan (IQR) | 66 (56, 75) | 69 (60, 77) | 0.004 | Wilcoxon |
Tabel 1: Associatie tussen TCGA miR-192 expressiegroepen en clinicopathologische kenmerken bij CRC. Hoge en lage expressiegroepen werden gedefinieerd op basis van het mediane TCGA miR-192 expressieniveau. In de samenvattende tabel waren het N-stadium en de leeftijd significant, terwijl het T-stadium en het M-stadium dat niet waren.
Aanvullende tabel 1: Dry-lab reanalyse-resultaten gegenereerd voor deze studie. Het werkboek bevat TCGA/GDC-expressievergelijkingen, gebalanceerde ROC-sensitiviteitsanalyses, leave-one-normal-out-analyses, clinicopathologische associatieanalyses, overlevingsanalyses, samenvattingen van hub-genexpressie en correlaties, en resultaten van immuunhandtekening-correlaties.Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende map 1: Ruwe experimentele gegevens ter ondersteuning van de qRT-PCR, celtransfectie en wondgenezingsexperimenten. Deze bestanden bevatten de oorspronkelijke qRT-PCR Ct-waarden, flowcytometrie-/transfectiegegevens, wondbreedtemetingen en representatieve microscopiebeelden die zijn gebruikt voor de analyses in het manuscript.Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussie
Deze studie evalueerde de klinische en biologische relevantie van miR-192-5p bij CRC door publieke datasetanalyse, lokale weefselvalidatie, targetnetwerkvoorspelling, immuunsignatuuranalyse en in vitro migratie-experimenten te combineren. De analyses maakten gebruik van geverifieerde TCGA-monsterdefinities, scheidden COAD en READ waar mogelijk, gebruikten log2(RPM + 1) miRNA-waarden, maakten onderscheid tussen gepaarde en ongepaarde vergelijkingen, testten de robuustheid van de ROC en voegden RNA-seq-gevoeligheidsanalyses van hub-genen toe. De belangrijkste bevinding is dat het publieke TCGA/GDC miR-192-signaal en het lokale mature miR-192-5p qRT-PCR-resultaat in tegenovergestelde expressierichtingen wijzen, wat de noodzaak benadrukt om onderscheid te maken tussen precursor-annotaties op databaseniveau en metingen van mature miRNA9,11.
Deze discrepantie zou niet uitsluitend verklaard moeten worden door ongelijke steekproefgroottes. De normale groep van TCGA was klein, maar niet-gepaarde, gepaarde, COAD-specifieke en READ-specifieke analyses toonden allemaal dezelfde hogere tumorrichting in TCGA/GDC. Verschillende factoren kunnen hieraan bijdragen, waaronder verschillen in monsterbron, sequencing- versus qRT-PCR-platforms, hsa-mir-192-annotatie op databaseniveau versus meting van rijp hsa-miR-192-5p, RNA-verwerking, tumorzuiverheid, de definitie van aangrenzend weefsel en populatiekenmerken. Vergelijkbare zorgen over de interpretatie van biomarkers en tumorheterogeniteit zijn benadrukt in CRC-studies5,6,7,8. Daarom ondersteunen de bevindingen een context- en platformafhankelijke interpretatie van miR-192-5p in CRC, in plaats van één universele expressierichting.
De diagnostische analyse moet ook met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd. Hoewel de op TCGA gebaseerde ROC-analyse een hoge AUC opleverde, bevatte de vergelijking veel meer tumorstalen dan normale stalen, met slechts 11 normale stalen in de gecombineerde COADREAD-cohort. Gebalanceerde resamplings toonden nog steeds hoge mediane AUC-waarden, maar de intervallen waren breed omdat elke gebalanceerde vergelijking werd beperkt door de kleine normale groep. De ROC-resultaten ondersteunen dus de verkennende scheiding tussen tumor en normaal binnen TCGA/GDC, maar zijn onvoldoende om miR-192-5p vast te stellen als een klinische diagnostische biomarker. Deze interpretatie is consistent met het algemene onderscheid tussen verkennende biomarker-signalen en klinisch gevalideerde diagnostische of prognostische biomarkers4,8.
Overlevingsanalyse toonde geen significante associatie aan tussen de expressie van miR-192 en de algehele overleving in COADREAD, COAD of READ. In de huidige analyse kan miR-192 geassocieerd zijn met geselecteerde clinicopathologische variabelen, maar de beschikbare gegevens ondersteunen geen sterke conclusie met betrekking tot een prognostische biomarker. Dit onderscheid is belangrijk omdat prognostische biomarkers bewijs vereisen dat de status van de marker onafhankelijk en reproduceerbaar geassocieerd is met de uitkomst in klinisch relevante contexten8.
De in vitro wondgenezingsassay levert functioneel bewijs dat de opregulatie van miR-192 de migratie van HT29-cellen kan verminderen. Dit resultaat is consistent met een potentiële tumorsuppressieve functie in CRC-cellen en met de richting van de lokale qRT-PCR. Eerder werk heeft ook gewezen op de rol van miRNA's, waaronder miR-192-gerelateerde pathways, bij het reguleren van de epitheliaal-mesenchymale transitie, het cellot en migratie-gerelateerde fenotypes15,16,17. De functionele gegevens blijven echter onvolledig. Aanvullende nat-labvalidatie is nodig om een mechanistisch tumorsuppressor-model te ondersteunen, waaronder herhaalde transfecties in ten minste één aanvullende CRC-cellijn, proliferatiecontroles voor wondgenezingsassays, Transwell-migratie/invasieassays, dual-luciferase-validatie van geselecteerde targets, metingen van target-mRNA en -eiwitten, en rescue-experimenten.
De hub-genanalyse moet worden beschouwd als hypothese-genererend. Aanvullende TCGA RNA-seq gegevens toonden sterke verschillen in expressie tussen tumor- en normaalweefsel voor de behouden hub-genen, maar hun correlaties met miR-192 waren gemengd. Verschillende celcyclusgenen, waaronder CDCA5, CCNB1 en CDK1, waren positief in plaats van negatief gecorreleerd met miR-192, wat niet past bij een eenvoudig direct miRNA-doelwit-repressiemodel. In tegenstelling hiermee vertoonden PLP1, NRXN1 en KIF5C negatieve correlaties. Deze resultaten ondersteunen de biologische relevantie van het netwerk, maar geven aan dat directe targeting niet kan worden geconcludeerd zonder validatie via luciferase, eiwitniveau en rescue-experimenten. Deze voorzichtige interpretatie is consistent met het verkennende karakter van in silico doelwit-netwerkanalyses10,11.
De immuunanalyse ondersteunt een voorzichtige interpretatie verder. De immuunsignatuurscores uit RNA-seq van de tumor lieten zien dat de expressie van miR-192 negatief correleerde met verschillende immuunsignaturen en voornamelijk positief correleerde met eosinofiele en Th17-celsignaturen. De meeste correlaties waren zwak, zelfs na correctie voor de false-discovery rate. Omdat methoden voor immuunsignaturen pathway- of celtoestand-verrijking afleiden uit bulk-expressiegegevens, moeten deze bevindingen als exploratief worden beschouwd en vereisen ze validatie met behulp van orthogonale methoden voor immuunprofilering13.
Deze studie kent enkele beperkingen. Ten eerste was de lokale validatiecohort relatief klein en afkomstig van één centrum. Ten tweede maakten de analyse van publieke datasets en de lokale qRT-PCR-validatie gebruik van verschillende platforms en meetniveaus. Ten derde waren er weinig normale miRNA-seq-monsters uit de TCGA, wat de diagnostische gevolgtrekking beperkt. Ten vierde waren de hub-gen- en immuunanalyses computationeel van aard en vereisen zij experimentele validatie. Ten vijfde waren de beschikbare functionele experimenten beperkt tot HT29 wound-healing-gegevens. Deze beperkingen rechtvaardigen dat de studie wordt gepresenteerd als een geïntegreerde exploratieve analyse in plaats van als definitief bewijs dat miR-192-5p een gevalideerde diagnostische, prognostische of mechanistische biomarker is bij CRC6,8.
Samenvattend lijkt miR-192-5p biologisch relevant te zijn voor CRC, maar zijn expressiepatroon en klinische interpretatie zijn complex. TCGA/GDC-analyse toonde een hoger miR-192-signaal in CRC-tumorstalen, terwijl qRT-PCR in een lokale cohort van gepaarde weefsels een lagere expressie van matuur miR-192-5p liet zien. ROC-analyse wees op een verkennende scheiding tussen tumor en normaal weefsel, maar werd beperkt door de kleine TCGA-normaalgroep. Er werd geen significant verband met de algehele overleving waargenomen. Hub-gen- en immuunanalyses leveren bewijs dat kan dienen voor het genereren van hypothesen, en HT29 wound-healing-data suggereren dat upregulatie van miR-192-5p de celmigratie kan verminderen. Verdere onafhankelijke cohorten en gerichte wet-lab-experimenten zijn vereist voordat miR-192-5p kan worden beschouwd als een gevalideerde diagnostische, prognostische of mechanistische biomarker bij CRC.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenverstrengeling te verklaren.
Dankbetuigingen
De auteurs danken het Molecular Diagnostic Laboratory of Tumor van de Inner Mongolia Medical University voor de technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door het Scientific Research Project van de Yancheng Municipal Health Commission (Grant No. YK2023101), die ook de kosten voor de publicatie van het artikel heeft gefinancierd.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0,25%+2:60 trypsine-EDTA | Biological Industries | 03-054-1 | Celldigestie/passaging |
| 10% ammoniumpersulfaat | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | A8090 | SDS-PAGE reagens |
| 10% natriumdodecylsulfaat | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | SIS1070 | SDS-PAGE reagens |
| 4x protein-laadbuffer | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | P1016 | Voorbereiding van proteinemonsters |
| Ultra-lage temperatuurvriezer (-80 °C) | Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd. | https://www.haiermedical.com/ | Monsteropslag |
| Anti-Myc mycoplasma-verwijderingsreagens | Wuhan Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | P-CMR-001 | Mycoplasma-decontaminatie |
| ARL2, BATF2, MEN1 en beta-actine primer-sets | Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China | Custom synthesized | mRNA qPCR-primers |
| Automatische microplatereader | PerkinElmer, USA | VICTOR Nivo | Absorbantiemeting |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | Proteinkwantificering |
| Biosafety cabinet / clean bench | Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd. | https://www.haiermedical.com/ | Aseptische celkweek |
| Celtelekamer / hemocytometer | Shanghai Qiujing Biochemical Reagent Instrument Co., Ltd. | http://www.shqiujing.net/ | Celtelling |
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | Biosharp | BS350B | Celproliferatie/cytotoxiciteitsassay |
| Celkweekflessen, kweekplaten, centrifugebuizen en pipetpunten | Corning | https://www.corning.com/in/en.html | Algemene verbruiksartikelen voor celkweek |
| Cell Cycle and Apoptosis Detection Kit | Meilun Biotechnology Co., Ltd., Dalian, China | https://www.chemicalbook.com/ShowSupplierProductsList13366/0_EN.htm | Flowcytometrische celcyclus-/apoptoseanalyse |
| CO2-celincubator | Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd. | https://www.haiermedical.com/ | Celkweek |
| con238 negatieve-controle oligonucleotide | Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China | Custom synthesized | Transfectiecontrole |
| Cytoscape software | Cytoscape Consortium | https://cytoscape.org/ | Visualisatie van netwerkmodules en hub-genen |
| Digitale thermostatische magnetroerder | Changzhou Saipu Experimental Instrument Factory | https://czxtyq.en.alibaba.com/ | Bereiding van oplossingen |
| Elektrische thermostatische blast-droogoven | Nanjing Wohuan Technology Industry Co., Ltd. | https://www.wtsensor.com/about-wt/aboutwt/ | Ondersteuning bij drogen/sterilisatie |
| Elektroforesesysteem | Bio-Rad Laboratories | Mini-PROTEAN 3 Cell | Gelelektroforese |
| Elektrotransfer-systeem | Hoefer | TE77XP | Proteïnetransfer |
| Foetaal bovien serum | Biological Industries | 04-001-1ACS | Supplement voor celkweek |
| Flowcytometer | ACEA Biosciences | NovoCyte | Flowcytometrie |
| Fluorescentie-inverted-microscoop | Ningbo Sunny Instruments Co., Ltd. | https://www.sunny-instrument.com/en | Beeldvorming van cellen en wonden |
| GDC/TCGA portaal | National Cancer Institute | Open-access database | Publieke miRNA-seq, RNA-seq en klinische gegevens |
| GEO-database | National Center for Biotechnology Information | GSE89076 en GSE156355 | Publieke genexpressie-datasets |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 9 | Statistische analyse en grafieken |
| Hogesnelheids gekoelde centrifuge | Shanghai Huxiangyi Centrifuge Instrument Co., Ltd. | https://www.bioridgecentrifuge.com/ | Monsterbereiding |
| HT29-cellen | Celvoorraad laboratorium auteurs | Not applicable | Humane colorectale kankercellijn |
| Beeldanalyse-software | ImageJ | Not applicable | Kwantificering van wondbreedte |
| Beeldvormingssysteem | Tanon Science & Technology Co., Ltd. | Tanon-5200 | Gel/blot-beeldvorming |
| IncuCyte S3 systeem voor dynamische celobservatie en functionele analyse | Beijing Sensi Wantong Technology Co., Ltd. | IncuCyte S3 | Live-cell imaging/functieanalyse |
| Intelligent thermostatisch waterbad | Leica | HI1210 | Temperatuurgecontroleerde incubatie |
| Lentivirus en infectiereagens | Shanghai GeneChem Co., Ltd. | https://synapse.patsnap.com/organization/04ffbf33ff2a6311226a8fa05498cec4 | Stabiele celtransductie |
| Handmatige pipetten | Gilson | PIPETMAN P | Vloeistofbehandeling |
| McCoy's 5A basaal medium | Wuhan Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | PM150710 | HT29 celkweekmedium |
| Medische centrifuge | Fabrikant uit Zhuhai niet gespecificeerd | 3200 | Monsterbereiding |
| Medische koelkast-vriezer | Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd. | https://www.haiermedical.com/ | Opslag van reagentia/monsters |
| Meilunbio Fixer Supersensitive ECL Chemiluminescent Substraat | Meilun Biotechnology Co., Ltd., Dalian, China | MA0186 | Immunoblot-detectie |
| Minicentrifuge | Beijing DLAB Scientific Co., Ltd. | https://www.dlabsci.com/ | Monsterbereiding |
| miR-192-5p en U6 primer-sets | TIANGEN Biotech Co., Ltd., Beijing, China | Custom synthesized | miRNA qPCR-primers |
| miR-192-5p mimic | Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China | Custom synthesized | Oligonucleotide voor transiënte transfectie |
| miRcute Enhanced miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit | TIANGEN Biotech Co., Ltd., Beijing, China | KR211 | miRNA reverse transcriptie |
| miRcute Enhanced miRNA Fluorescence Quantitation Kit (SYBR Green FP) | TIANGEN Biotech Co., Ltd., Beijing, China | FP411 | miRNA qPCR |
| miRWalk | Publieke database | Webdatabase | miRNA-target voorspellingsdatabase |
| Nitrocellulosemembraan | Millipore | HATF00010 | Membraan voor proteïnetransfer |
| Vetvrije melkpoeder | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | D8340 | Immunoblot blokkeringsreagens |
| Gepaarde colorectale kanker- en aangrenzende niet-kankeuwevloeden | Instituut van de auteurs | Not applicable | Klinische specimens |
| PCR-buisjes | Corning | PCR-02-C | PCR/qRT-PCR opstelling |
| Penicilline-streptomycine oplossing | Biological Industries | 03-031-1B | Antibioticum voor celkweek |
| PerfectStart Uni RT&qPCR Kit | TransGen Biotech Co., Ltd., Beijing, China | AUQ-01 | mRNA reverse transcriptie en qPCR |
| Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | Celwasbuffer |
| Prestained protein marker | Fermentas | 26619 | Moleculaire gewichtsmarker voor proteïnen |
| Systeem voor de bereiding van zuiver water | China Moer | Not available | Bereiding van zuiver water |
| Puromycine | Phygene | PH1143 | Selectie van getransduceerde cellen |
| R software | R Foundation for Statistical Computing | Version 3.6.3 | Statistische analyse en bioinformatica |
| Rapid transfer buffer | Crisbio | Not applicable | Proteïne-elektrotransfer |
| Real-time fluorescentie kwantitatief PCR-systeem | Applied Biosystems (ABI), USA | Not available | qRT-PCR detectie |
| RIPA lysisbuffer | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | R0020 | Proteïne-extractie |
| RNase-vrije microcentrifugebuisjes | Corning | 3208 | RNA-behandeling |
| Serumvrij celcryopreservatiemedium | New Cell & Molecular Biotech Co., Ltd. | C40100 | Celcryopreservatie |
| SPSS Statistics | IBM | Version 25 | Statistische analyse |
| Gestabiliseerde antilichaamverdunner | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | Not applicable | Verdunning van primaire/secundaire antilichamen |
| Steriele pipetpunten | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | TP-10-C | Tool voor wondgenezing-scratch |
| STRING-database | STRING Consortium | Webdatabase | Analyse van proteïne-interactienetwerken |
| TEMED | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T8090 | SDS-PAGE reagens |
| TransZol Up | TransGen Biotech Co., Ltd., Beijing, China | ET111-01 | RNA-extractie |
| Tris-HCl buffer, pH 6,8 | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1020 | SDS-PAGE stacking-gel buffer |
| Tris-HCl buffer, pH 8,8 | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1010 | SDS-PAGE resolving-gel buffer |
| Tween-20 | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T8220 | Immunoblot wasreagens |
| Verticale overdrukstoomsterilisator | Shanghai Boxun Medical Biological Instrument Corp. | BXM-30R | Sterilisatie |
Referenties
- Sung, H. et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA Cancer J Clin. 69 (1), 7-34 (2019).
- Issa, I. A., Noureddine, M. Colorectal cancer screening: an updated review of the available options. World J Gastroenterol. 23 (28), 5086-5096 (2017).
- Song, L., Jia, J., Peng, X., Xiao, W., Li, Y. The performance of the SEPT9 gene methylation assay and a comparison with other CRC screening tests: a meta-analysis. Sci Rep. 7 (1), 3032 (2017).
- Linnekamp, J. F., Wang, X., Medema, J. P., Vermeulen, L. Colorectal cancer heterogeneity and targeted therapy: a case for molecular disease subtypes. Cancer Res. 75 (2), 245-249 (2015).
- Sveen, A., Kopetz, S., Lothe, R. A. Biomarker-guided therapy for colorectal cancer: strength in complexity. Nat Rev Clin Oncol. 17 (1), 11-32 (2020).
- Whiffin, N. et al. Identification of susceptibility loci for colorectal cancer in a genome-wide meta-analysis. Hum Mol Genet. 23 (17), 4729-4737 (2014).
- Ballman, K. V. Biomarker: predictive or prognostic? J Clin Oncol. 33 (33), 3968-3971 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Forterre, A., Komuro, H., Aminova, S., Harada, M. A comprehensive review of cancer microRNA therapeutic delivery strategies. Cancers (Basel). 12 (7), 1852 (2020).
- Ren, F. J., Yao, Y., Cai, X. Y., Fang, G. Y. Emerging role of miR-192-5p in human diseases. Front Pharmacol. 12, 614068 (2021).
- Nagy, Z. B. et al. Colorectal adenoma and carcinoma specific miRNA profiles in biopsy and their expression in plasma specimens. Clin Epigenetics. 9, 22 (2017).
- Hanzelmann, S., Castelo, R., Guinney, J. GSVA: gene set variation analysis for microarray and RNA-seq data. BMC Bioinformatics. 14 (1), 7 (2013).
- Staiteieh, S. A. et al. Study of microRNA expression profiling as biomarkers for colorectal cancer patients in Lebanon. Mol Clin Oncol. 16 (2), 39 (2022).
- Przygodzka, P. et al. Regulation of miRNAs by Snail during epithelial-to-mesenchymal transition in HT29 colon cancer cells. Sci Rep. 9 (1), 2165 (2019).
- Sun, C. Y., Zhang, X. P., Wang, W. Coordination of miR-192 and miR-22 in p53-mediated cell fate decision. Int J Mol Sci. 20 (19), 4768 (2019).
- Zhao, L., Wang, B., Sun, L., Sun, B., Li, Y. Association of miR-192-5p with atherosclerosis and its effect on proliferation and migration of vascular smooth muscle cells. Mol Biotechnol. 63 (12), 1244-1251 (2021).