Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Onderzoeksartikel
Deze retrospectieve case-controle studie evalueerde serum miR-146a, miR-642a, miR-2861 en metabolische markers bij vrouwen met het polycystisch ovariumsyndroom. Er werden gecoördineerde veranderingen waargenomen in miRNA's, adipokinen, insulineresistentie, ontsteking en testosteron, terwijl een gecombineerd biomarkermodel een sterkere onderscheidende prestatie vertoonde dan individuele markers.
Polycysteus ovariumsyndroom (PCOS) is een veelvoorkomende endocriene en metabole stoornis bij vrouwen in de reproductieve leeftijd, maar de relaties tussen circulerende microRNA's (miRNA's) en voedingsgerelateerde eiwitten zijn nog onvolledig begrepen. Deze studie onderzocht de associaties van serum miR-146a, miR-642a en miR-2861 met metabole en inflammatoire markers bij PCOS. De studie omvatte 62 vrouwen met PCOS en 71 gezonde controles. Serum miR-146a, miR-642a en miR-2861 werden gemeten via kwantitatieve real-time PCR, terwijl adiponectine (ADPN), leptine (LEP), retinol-bindend eiwit 4 (RBP4), de homeostasis model assessment of insulin resistance (HOMA-IR), interleukine-6 (IL-6) en testosteron (T) ook werden beoordeeld. Methodologische validatie evalueerde de omstandigheden van monsterverwerking, de precisie van de assay en de overeenstemming tussen analytische methoden. In vergelijking met de controles vertoonden vrouwen met PCOS een verhoogde expressie van miR-146a en een verlaagde expressie van miR-642a en miR-2861. ADPN-niveaus waren verlaagd, terwijl LEP-, RBP4-, HOMA-IR-, IL-6- en T-niveaus verhoogd waren. miR-146a was negatief gecorreleerd met ADPN en positief gecorreleerd met LEP, RBP4, HOMA-IR, IL-6 en T. miR-642a was negatief gecorreleerd met RBP4, HOMA-IR en IL-6, terwijl miR-2861 positief gecorreleerd was met ADPN. De methodologische validatie toonde een acceptabele assay-stabiliteit, precisie en overeenstemming tussen de methoden aan. Het model dat de drie miRNA's combineerde met ADPN, LEP, RBP4, HOMA-IR, IL-6 en T behaalde een area under the curve van 0,929, met een sensitiviteit van 82,26% en een specificiteit van 94,37%. Deze bevindingen tonen gecoördineerde veranderingen aan in circulerende miRNA's en metabole markers bij PCOS en ondersteunen verdere evaluatie van hun gecombineerde diagnostische potentieel.
PCOS is de meest voorkomende endocriene en metabole stoornis bij vrouwen in de reproductieve leeftijd. De wereldwijde prevalentie wordt geschat op 6% tot 20%. Ongeveer 70% van de aangedane vrouwen heeft insulineresistentie en meer dan de helft heeft overgewicht of obesitas1. PCOS kan leiden tot ovulatiestoornissen, onvruchtbaarheid, diabetes type 2, hart- en vaatziekten en andere langetermijncomplicaties, waardoor de reproductieve gezondheid en de kwaliteit van leven ernstig worden beïnvloed2. Hoewel de pathogenese nog niet volledig is opgehelderd, wordt algemeen aangenomen dat PCOS meerdere factoren omvat, waaronder genetische vatbaarheid, chronische laaggradige ontsteking, abnormaliteiten in de insulinesturingspaden en verstoring van de lokale ovariële micro-omgeving. Tegen deze achtergrond is het identificeren van specifieke moleculaire markers die de progressie van de ziekte weerspiegelen van duidelijke waarde voor vroege diagnose en precieze interventie bij PCOS3,4.
MiRNA's zijn een klasse niet-coderende RNA's met een lengte van ongeveer 22 nucleotiden. Deze moleculen reguleren de genexpressie na transcriptie door ofwel de afbraak van mRNA te bevorderen of de translatie te remmen. Daarom zijn deze moleculen cruciaal voor veel cellulaire processen, waaronder celgroei, differentiatie, reacties op ontsteking en metabole regulatie5,6. Eerdere studies hebben een kenmerkende dysregulatie van miR-146a, miR-642a en miR-2861 aangetoond in het serum van patiënten met PCOS. Upregulatie van miR-146a kan chronische ontstekingsreacties mediëren via gerichte regulatie van het TLR4/NF-κB-pad7, terwijl een verminderde expressie van miR-642a en miR-2861 nauw is geassocieerd met insulineresistentie en een verminderde functie van de granulosacellen in de eierstokken8,9. ADPN, LEP en RBP4, proteïnen die gerelateerd zijn aan voeding, spelen een cruciale rol bij het reguleren van de metabole balans. Veranderingen in hun spiegels kunnen direct invloed hebben op de manier waarop lipiden worden verwerkt, de insulinegevoeligheid van het lichaam en de ontstekingsstatus. Dit wordt beschouwd als een essentieel onderdeel van de moleculaire basis van de metabole problemen die bij PCOS worden gezien10,11. De meeste gepubliceerde studies hebben echter miRNA's of voedinggerelateerde proteïnen afzonderlijk onderzocht in relatie tot PCOS12,13, en de moleculaire relatie tussen beide is nog niet op systematische wijze opgehelderd.
In deze studie hebben we de expressieniveaus van drie miRNA's en zes kernbiomarkers gemeten bij patiënten met PCOS, de correlaties tussen deze markers en hun associaties met klinische biochemische indices geanalyseerd, en verder onderzocht of miRNA's kunnen deelnemen aan het pathologische proces van PCOS via associaties met eiwitten die gerelateerd zijn aan voeding. De bevindingen van deze studie kunnen het huidige begrip van de moleculaire basis van PCOS verrijken, potentiële doelwitten bieden voor therapieën gericht op nutritionele en metabole regulatie, en laboratoriumbewijs leveren voor vroege screening, effectmonitoring en geïndividualiseerd beheer van PCOS.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Ethische verklaring
De studie is uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki en is goedgekeurd door de Medisch Ethische Commissie van het Ganzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine (goedkeuringsnr. GZSZYYKYLL20240092, datum: 2024-12-20).
Alle materialen, reagentia, assaykits en apparatuur die in dit protocol worden gebruikt, staan vermeld in de Tabel met materialen.
Studieopzet
Deze retrospectieve case-controlstudie omvatte 62 patiënten met PCOS, gediagnosticeerd bij de polikliniek gynaecologie van het Ganzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine tussen juni 2024 en augustus 2025, en 71 gezonde vrouwen in de reproductieve leeftijd die in dezelfde periode werden onderzocht bij het gezondheidsmanagementcentrum van het ziekenhuis. Controles werden geselecteerd om vergelijkbaarheid op groepsniveau wat betreft leeftijd te bereiken; BMI werd niet gebruikt als matchingvariabele en werd geëvalueerd als een baseline-kenmerk.
Studieonderwerpen
Inclusiecriteria: De inclusiecriteria voor de PCOS-groep waren als volgt: (1) leeftijd >18 jaar; (2) diagnose van PCOS volgens de gewijzigde Rotterdam-criteria zoals ondersteund door de 2023 International Evidence-based Guideline, waarbij ten minste twee van de volgende drie kenmerken vereist zijn na uitsluiting van verwante aandoeningen: oligo-ovulatie of anovulatie, gedefinieerd als menstruatiecycli langer dan 35 dagen of minder dan acht cycli per jaar; klinisch hyperandrogenisme en/of biochemisch hyperandrogenisme, waarbij biochemisch hyperandrogenisme wordt gedefinieerd als een serumtotaal T-concentratie boven de assay-specifieke bovenste referentiewaarde; en polycystische ovariale morfologie, gedefinieerd als ten minste 20 follikels in één eierstok of een ovariaal volume van ten minste 10 mL wanneer een volledige follikel telling niet haalbaar was14; (3) volledige elektronische medische dossiers; (4) geen hormoonsubstitutietherapie, hypoglycemische middelen of immunosuppressiva gedurende de voorafgaande 3 maanden; en (5) beschikbaarheid van een nuchter serummonster dat bij inschrijving is afgenomen en bewaard is in de institutionele biobank.
De inclusiecriteria voor de controlegroep waren als volgt: (1) deelname aan een gezondheidsonderzoek gedurende dezelfde periode; (2) regelmatige menstruatiecycli; (3) normale ovariummorfologie bij transvaginale echografie; (4) geen voorgeschiedenis van endocriene stoornissen, gynaecologische aandoeningen, infertiliteit of klinisch significante lever- of nierfunctiestoornissen; en (5) beschikbaarheid van een nuchter serummonster dat op de dag van het onderzoek is afgenomen en is bewaard in de institutionele biobank.
De exclusiecriteria waren als volgt: (1) endometriose, uterine myomen, eierstoktumoren, bekkenontsteking of andere gynaecologische aandoeningen; (2) schildklierdysfunctie, syndroom van Cushing, hyperprolactinemie, congenitale bijnierschorshyperplasie of een andere endocriene stoornis die de ovulatiestoornis of het hyperandrogenisme zou kunnen verklaren; (3) ernstige hart-, lever-, nier- of longdysfunctie, maligne tumoren, auto-immuunziekten of hematologische aandoeningen; (4) zwangerschap, bevalling of abortus in de voorafgaande 6 maanden; (5) gebruik van glucocorticoiden, orale anticonceptiva of andere medicatie die het glucose- of lipidemetabolisme beïnvloedt gedurende de voorafgaande 3 maanden; (6) psychiatrische stoornissen of cognitieve beperkingen; (7) ontbrekende essentiële klinische informatie; en (8) ernstige serumhemolyse, gedefinieerd als een hemoglobinconcentratie >2,0 g/L, lipemie, icterus, meer dan één vries-dooi-cyclus of onderbroken monsterbewaring. Schildklierdysfunctie, hyperprolactinemie en niet-klassieke congenitale bijnierschorshyperplasie werden respectievelijk uitgesloten op basis van metingen van het thyreostimulerend hormoon, serumprolactine en 17-hydroxyprogesteron; het follikelstimulerend hormoon werd waar nodig gecontroleerd, terwijl bij klinische indicatie werd onderzoek gedaan naar het syndroom van Cushing of een bijniertumor. Dezelfde pre-analytische procedure werd toegepast op alle klinische monsters, en geen enkel monster in de primaire analyse werd onderworpen aan meer dan één vries-dooi-cyclus.
Afname en bewaring van serummonsters
Nuchter veneus bloed (10 mL) werd in de ochtend afgenomen in buizen zonder antistollingsmiddel, gedurende 30 min bij kamertemperatuur gelaten om te stollen en gecentrifugeerd bij 1,505 x g gedurende 15 min bij 4 °C. Het serum werd verdeeld in aliquoten van 200 µL en bewaard bij −80 °C tot aan de analyse. Dezelfde pre-analytische procedure werd toegepast op alle klinische monsters, en geen enkel monster dat in de primaire analyse was opgenomen, werd blootgesteld aan meer dan één vries-dooi-cyclus.
Voorbereiding van monsters voor methodologische validatie
Tien gepoolde serummonsters van gezonde vrijwilligers werden gebruikt om de effecten te evalueren van centrifugatiesnelheid (1.505, 3.000 en 4.000 x g gedurende 15 min), vries-dooi frequentie (0, 1, 3 en 5 cycli), bewaartemperatuur (4 °C, −20 °C en −80 °C gedurende 7 dagen), bewaarduur (1, 3, 6 en 12 maanden bij −80 °C) en hemolyse (<0,1, 0,1–0,5 en 0,5–2,0 g/L hemoglobine).
Laboratoriumtesten
Alle laboratoriumanalyses werden uitgevoerd door dezelfde getrainde technicus onder gestandaardiseerde omgevingsomstandigheden en volgens vooraf vastgestelde werkprocedures. Serum miRNAs werden gekwantificeerd via qRT-PCR; ADPN, LEP en RBP4 werden gemeten via sandwich ELISA; T en IL-6 werden gemeten via chemiluminescentie-gebaseerde immunoassays; en glucose-metabole variabelen werden verkregen met behulp van routinematige geautomatiseerde laboratoriummethoden.
Kwantificering van serum miRNA via qRT-PCR
Totaal RNA werd geëxtraheerd uit 200 µL serum met behulp van TRIzol-reagens. Spectrofotometrische RNA-concentraties en A260/A280 zuiverheidsgegevens waren niet beschikbaar voor de gearchiveerde serum-RNA-preparaten. De acceptabiliteit van de qRT-PCR-assay werd daarom beoordeeld op basis van de aanwezigheid van een enkele specifieke smeltcurvepiek en concordantie tussen drie technische replica's. Na chloroform-fase-scheiding, isopropanolprecipitatie en twee wasbeurten met 75% ethanol, werd het RNA-pellet opgelost in enzymvrij water. Het reactiesysteem van 20 µL bevatte 4 µL 5x buffer, 1 µL reverse transcriptase, 1 µL 10 µM stem-loop primer en 5 µL RNA-template. De reactiecondities waren 16 °C gedurende 30 min, 42 °C gedurende 30 min en 85 °C gedurende 5 s. De reverse-getranscribeerde producten werden bewaard bij −20 °C. Kwantitatieve PCR werd uitgevoerd met de TaKaRa SYBR Premix Ex Taq II kit. Elke reactie van 20 µL bevatte 10 µL 2× SYBR-mengsel, telkens 0,8 µL forward- en reverse-primers (10 µM) en 2 µL cDNA-template. Amplificatie werd uitgevoerd op een Applied Biosystems 7500 real-time PCR-systeem onder de volgende condities: pre-denaturatie bij 95 °C gedurende 30 s; 40 cycli van 95 °C gedurende 5 s en 60 °C gedurende 30 s; vervolgens werd een smeltcurve-analyse uitgevoerd om de amplificatiespecificiteit te bevestigen. U6 snRNA diende als intern referentiegen, en de relatieve expressieniveaus van miR-146a, miR-642a en miR-2861 werden berekend met de 2-ΔΔCt methode. Elk monster werd in drievoud getest. De sequenties van alle in deze studie gebruikte primers staan vermeld in Tabel 1.
Detectie van serumeiwitmarkers
Serumconcentraties van ADPN, LEP en RBP4 werden gemeten via een double-antibody sandwich ELISA met gebruik van respectievelijk de Human Total ADPN/Acrp30 Quantikine ELISA Kit (analytische sensitiviteit, 0.891 ng/mL; meetbereik, 3.9–250 ng/mL), de Human Leptin Quantikine ELISA Kit (analytische sensitiviteit, 7.8 pg/mL; meetbereik, 15.6–1,000 pg/mL) en de Human RBP4 Quantikine ELISA Kit (analytische sensitiviteit, 0.628 ng/mL; meetbereik, 1.56–100 ng/mL). Elke assay was specifiek voor de overeenkomstige humane analyt en serummonsters werden verdund volgens de instructies van de fabrikant. De absorbentie werd gemeten bij 450 nm en concentraties werden berekend met behulp van vierparameter logistieke standaardcurven. De intra-assay of inter-assay CV's waren 2.5% of 3.2% voor ADPN, 2.7% of 3.4% voor LEP en 2.6% of 3.3% voor RBP4.
T-meting
Serum T werd gemeten via een elektrochemiluminescentie-immunoassay met gebruik van een Roche Cobas e601 automatische immunoassay-analyzer.
Glucosemetabole en inflammatoire metingen
Nuchtere plasmaglucose, nuchtere insuline en HbA1c-waarden werden verkregen uit klinische laboratoriumgegevens van dezelfde dag, in plaats van uit de gearchiveerde serumaliquots die werden gebruikt voor de miRNA- en metabole proteïne-assays. Nuchtere plasmaglucose werd gemeten met de glucose-oxidase-methode, nuchtere insuline via immunoturbidimetrie en HbA1c via high-performance liquid chromatography. HOMA-IR werd berekend als [nuchtere plasmaglucose (mmol/L) × nuchtere insuline (mIU/L)]/22.5. Serum IL-6 werd gemeten via chemiluminescentie-immunoassay.
Methodologische validatie
De vergelijkingen tussen alternatieve methoden werden uitgevoerd om vast te stellen of de primaire metingen robuust waren voor het assayplatform en werden niet gebruikt om de belangrijkste resultaten tussen de groepen te genereren. De expressieniveaus van de drie miRNA's en vijf biochemische markers werden gemeten onder de verschillende verwerkingscondities die hierboven zijn beschreven, en de variatiecoëfficiënt voor elke indicator werd berekend als CV = (standaarddeviatie/gemiddelde) x 100%. Een CV <15% werd als acceptabel beschouwd voor het evalueren van de stabiliteit van de assayresultaten onder verschillende monstersverwerkings- en opslagcondities. De precisie binnen één dag werd beoordeeld door hetzelfde gepoolde serummonster 10 keer op één dag herhaaldelijk te meten, terwijl de precisie tussen verschillende dagen werd bepaald op basis van metingen die één keer per dag gedurende vijf opeenvolgende dagen werden uitgevoerd. Voor elke indicator werden het gemiddelde, de standaarddeviatie en de overeenkomstige CV berekend. Voor de toetsing van de analytische overeenkomst werden vijf biochemische analyten — ADPN, LEP, RBP4, IL-6 en T — in de validatiemonsters gemeten met behulp van de primaire assay en een op chemiluminescentie gebaseerd immunoassayplatform van Roche. Bland–Altman-analyse werd gebruikt om de 95% overeenstemmingslimieten te berekenen. De primaire qRT-PCR-assay werd gebruikt voor alle klinische miRNA-metingen, terwijl de miScript SYBR Green PCR Kit alleen als orthogonale methode werd gebruikt in het experiment voor analytische overeenkomst; Pearson-correlatiecoëfficiënten werden berekend tussen de twee qRT-PCR-systemen.
Statistische analyse
De data-analyse werd uitgevoerd met behulp van statistische software. Alle continue variabelen werden eerst op normaliteit getest met de Shapiro-Wilk-test. Data met een normale verdeling worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie. Vergelijkingen tussen twee groepen werden gemaakt met de t-test voor onafhankelijke steekproeven, terwijl vergelijkingen tussen meerdere groepen werden uitgevoerd met een eenweg-variantieanalyse, gevolgd door de LSD-t-test voor paarsgewijze vergelijkingen. Data die niet aan een normale verdeling voldeden, worden gepresenteerd als mediaan (interkwartielafstand) [M (P25, P75)]. Vergelijkingen tussen twee groepen werden vervolgens uitgevoerd met de Mann-Whitney U-test, en vergelijkingen tussen meerdere groepen met de Kruskal-Wallis H-test. Categorische gegevens werden gepresenteerd als frequenties en percentages. We gebruikten de χ2-test of de exacte test van Fisher om de groepen te vergelijken. Correlaties tussen variabelen werden beoordeeld met Pearson-correlatieanalyse of Spearman-rangcorrelatieanalyse, afhankelijk van de dataverdeling. Als explorerende analyse werden Pearson-correlaties tussen elk miRNA en de zes metabole markers herhaald binnen niet-obese (BMI <28 kg/m2) en obese (BMI ≥28 kg/m2) PCOS-subgroepen. Correlatiecoëfficiënten werden vergeleken met de r-naar-z-transformatie van Fisher, en de resulterende p-waarden tussen de subgroepen werden gecorrigeerd met de Benjamini–Hochberg-procedure voor de false-discovery-rate. We evalueerden de diagnostische prestaties met behulp van receiver operating characteristic (ROC)-curves en de area under the curve (AUC). Daarnaast analyseerden we gecombineerde detectie met behulp van een logistisch regressiemodel. Alle testen waren tweezijdig, en p < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Baselinekenmerken van de studiepopulatie
In totaal werden 62 patiënten met PCOS en 71 gezonde controles opgenomen in deze studie. De twee groepen waren vergelijkbaar wat betreft leeftijd, etnische samenstelling en andere baselinekenmerken (p > 0,05). Daarentegen waren de menstruatiecycli in de PCOS-groep significant langer dan in de controlegroep (p < 0,001), wat consistent is met het typische klinische beeld van PCOS (Tabel 2).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Met behulp van gestandaardiseerde serum biochemische assays en qRT-PCR werden in deze studie serummonsters van 62 patiënten met PCOS en 71 gezonde controles geanalyseerd. We stelden een karakteristiek patroon vast van gedereguleerde miRNA- en nutritioneel gerelateerde eiwitexpressie bij PCOS, samen met significante post-transcriptionele associaties tussen beide. Alle experimenten werden onderworpen aan een strikte methodologische validatie. De precisie, stabiliteit en inter-methode overeenstemming van het detectiesysteem...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs verklaren dat er geen belangenverstrengeling is.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Ultra-low temperatuurvriezer van -80 °C | Thermo Fisher (USA) | Forma 900 | Langdurige bewaring van serummonsters bij lage temperatuur |
| Adiponectin (ADPN) ELISA-kit | R&D Systems (USA) | DY1065 | Kwantitatieve detectie van de serum-ADPN-concentratie |
| Automatische biochemische analyzer | Beckman Coulter (USA) | AU5800 | Detectie van nuchtere bloedglucose, insuline en geglyceerd hemoglobine |
| Automatische microplaatlezer | Tecan (Switzerland) | Infinite M200 Pro | Absorbantiemeting bij 450 nm voor ELISA-experimenten |
| Bloedglucose-detectiekit | Beckman Coulter (USA) | A11A01 | Detectie van nuchtere serumglucose via de glucose-oxidase-methode |
| Cobas e601 chemiluminescentie-immunoassay-analyzer | Roche (Germany) | Cobas e601 | Electrochemiluminescentie-detectie van serumtestosteron en IL-6 |
| Enzymvrije cryopreservatiebuis | Axygen (USA) | MCT-150-C | Aliquoteren van serummonsters, bewaring bij ultra-lage temperatuur van -80 °C |
| Eppendorf Research plus Pipet | Eppendorf (Germany) | Research plus 0.5-1,000 μL | Aspiratie van serum, pipetteren van RNA/reagentia, aliquoteren van monsters |
| Geglyceerd hemoglobine (HbA1c) kit | Beckman Coulter (USA) | A11A03 | Detectie van serum-HbA1c via vloeistofchromatografie met hoge druk |
| IL-6 detectiekit | Roche (Germany) | 5200057190 | Kwantificering van serum-interleukine-6 |
| Insuline-detectiekit | Beckman Coulter (USA) | A11A02 | Detectie van nuchtere seruminsuline via immunoturbidimetrie |
| Leptine (LEP) ELISA-kit | R&D Systems (USA) | DY398 | Kwantitatieve detectie van de serum-LEP-concentratie |
| Sneldraaiende centrifuge voor lage temperaturen | Xiangyi Instrument (China) | TDZ5-WS | Centrifugatie van monsters bij de gespecificeerde centrifugale krachten |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen (Germany) | 218073 | Verificatie van methodologische consistentie voor miRNA-detectie |
| PrimeScript RT Reverse Transcription Kit | TaKaRa (Japan) | RR036A | miRNA-reversetranscriptie voor de synthese van cDNA |
| Real-time fluorescentie kwantitatief PCR-instrument | Applied Biosystems (USA) | 7500 | miRNA qRT-PCR amplificatie en fluorescentiedetectie |
| Retinol-bindend proteïne 4 (RBP4) ELISA-kit | R&D Systems (USA) | DY6005 | Kwantitatieve detectie van de serum-RBP4-concentratie |
| SPSS statistische software | IBM (USA) | 25 | Normaliteitstoets van gegevens, intergroepvergelijking, correlatie en ROC-analyse |
| SYBR Premix Ex Taq II Kit | TaKaRa (Japan) | RR420A | miRNA fluorescentie kwantitatieve PCR-amplificatie |
| Testosteron (T) detectiekit | Roche (Germany) | 5200067190 | Kwantificering van serumtestosteronspiegels |
| TRIzol totaal RNA-extractiereagens | Invitrogen (USA) | 15596026 | Extractie van totaal RNA uit serummonsters |
| Vacuüm bloedafnamebuis zonder antistollingsmiddel | BD Biosciences (USA) | 367812 | Afname van nuchter bloed uit de vena cubitalis voor serumscheiding |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.