Het meten van de effecten van farmacologische verbindingen op mitochondriale morfologie in muisverouderingsmodellen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft methoden om de effecten te meten van medicijnen toegediend via implanteerbare osmotische minipompen op mitochondriale morfologie in verouderende muismodellen. Driedimensionale (3D) superresolutie confocale beeldvorming van muizenlevers wordt uitgevoerd, en er wordt een pijplijn ontwikkeld voor onbevooroordeelde segmentatie, classificatie en kwantitatieve analyse van mitochondriale structuren.

Samenvatting

Door veroudering gerelateerde moleculaire schade kan bijdragen aan veranderingen in mitochondriale morfologie en metabole disfunctie, vooral in weefsels met hoge energieverbruik. Farmacologische verbindingen die metabole disfunctie verlichten en gezonde, 'jonge' mitochondriale morfologieën herstellen, kunnen daardoor effectieve modaliteiten zijn om de gezondheidsspanne (dat wil zeggen, het deel van iemands levensduur dat vrij is van de last van verouderingsgerelateerde chronische ziekten) bij zoogdieren te verlengen. Hierin worden methoden beschreven voor het uitvoeren van subcutane osmotische pompimplantaties bij oude muizen voor de stabiele afgifte van hydrofobe farmacologische verbindingen. Vervolgens worden weefsels gefixeerd, gecryosectioneerd, gekleurd en afgebeeld met superresolutie confocale lichtmicroscopie. Ten slotte wordt een geautomatiseerde pijplijn gepresenteerd voor de driedimensionale segmentatie, classificatie en kwantitatieve meting van mitochondriale structuren. Deze methoden kunnen dus nuttig zijn om kwantitatieve veranderingen in de mitochondriale driedimensionale structuur in verschillende weefsels gedurende de levensduur van de muis te beoordelen. Bovendien kunnen deze technieken helpen bij de reproduceerbare identificatie van klein-molecuulgeneesmiddelen die verouderingsgerelateerde stofwisselingsstoornissen verminderen.

Inleiding

Mitochondriën zijn dubbelmembraan-gebonden organellen die ruimtelijk en tijdelijk georganiseerd zijn om te voldoen aan de huidige metabole behoeften van hun gastheercel en weefsel¹. Invaginaties in het binnenmembraan, cristae genoemd, worden gevormd en georganiseerd via een dynamische coördinatie tussen niet-dubbellaagse binnenmembraanfosfolipiden zoals cardiolipine en fosfatidylethanolamine, rijen ATP-syntase-dimeren aan de cristae-uiteinden, cardiolipine-bindende oligomere van de dynamine-achtige GTPase Optic Atrophy 1 (OPA1) aan de top van de cristae, en Mitochondrial Contact Site and Cristae Organizing System (MICOS)-complexen bij de cristae-verbindingen¹. Deze binnenmembraanstructuren subcompartimentaliseren mitochondriën in individuele functionele eenheden² en bieden een groter oppervlak waarop de mitochondriale transmembraanpotentiaalproducerende ademhalingscomplexen zich kunnen samenvoegen¹. Als dynamische organellen met secundaire cellulaire functies gerelateerd aan apoptotische signaal³, Ca²⁺ en reactieve zuurstofsoortenhomeostase³, en lipidebiosynthese⁴, zijn mitochondriale morfologische structuren zeer gevoelig voor omgevingsveranderingen zoals verminderde zuurstofbeschikbaarheid⁵ en verhoogde Ca²⁺ afgifte uit het endoplasmatisch reticulum ^6,7.

Moleculaire schadeopbouw draagt bij aan veranderingen in mitochondriale structuur en functie tijdens^{de leeftijd van 8} jaar. Baanbrekende cryo-elektrontomografie (cryo-ET) studies uitgevoerd door de Kühlbrandt-groep bij verschillende modelorganismen hebben een duidelijke correlatie aangetoond tussen cristaedichtheid en ademhalingscapaciteit, evenals een leeftijdsafhankelijke afname van cristaedichtheid en het bijbehorende verlies van ATP-synthasedimers ^9,10. Bovendien kunnen veranderingen in het mitochondriale volume het gevolg zijn van verminderde mitochondriale splijting en fusiedynamiek¹¹, verhoogde lipidenaccumulatie¹² en verhoogde zwelling¹³. In skeletspieren kan VO₂ max, dat een sterke voorspeller is van de levensverwachting^14,15, nauwkeurig worden voorspeld op basis van de mate van intermyofibrillaire mitochondriale fragmentatie en cristaedichtheid¹⁶.

Het is dan ook niet verrassend dat verouderingsgerelateerde structurele en functionele veranderingen in mitochondriën kunnen bijdragen aan de pathogenese van verschillende chronische ziekten 17,18,19,20. Verhoogde mitochondriale fragmentatie en veranderingen in mitochondriale biogenese en morfologie zijn geassocieerd met zowel de ziekte van Alzheimer als de ziekte van Parkinson²⁰. Deze veranderingen leiden tot verstoringen van de oxidatieve fosforyleringscomplexen, waardoor de aanmaak van de protonmotor wordt aangetast en een overmatige productie van reactieve zuurstofsoorten 20,21,22 ontstaat. Bij verouderingsgerelateerde hartstoornissen en hartfalen dragen verhoogde mitochondriale fragmentatie, zwelling, vacuolisatie en verlies van cristaedichtheid bij aan een verminderde ATP-productie ^23,24. Deze structurele veranderingen kunnen deels verband houden met veranderde mitochondriale Ca²⁺ behandeling en verhoogde activiteit van de mitochondriale permeabiliteitsovergangspore 6,7,13,25. Als veronderstelde regulator van mitofagie kan overmatige opening van de permeabiliteitsovergangsporie tijdens veroudering juist destructief zijn en leiden tot ongecontroleerde celdood¹³. Ten slotte is bekend dat verouderingsgerelateerde tekorten in de mitochondriale lipidmetabolisme en mitofagie ook kunnen bijdragen aan de ontwikkeling van niet-alcoholische levervetting²⁶. In het bijzonder is aangetoond dat hepatische steatose gepaard gaat met verhoogde oxidatieve stress en verhoogde vorming van donutachtige mitochondriale structuren ^3,27.

Daarom is er aanzienlijke interesse in het ontwikkelen van therapieën die zich richten op verouderingsgerelateerde achteruitgang van mitochondriale functies om de kwaliteit van leven te verbeteren van mensen die lijden aan bepaalde chronische ziekten. Forzinity (elamipretide), een lipiden-interactief peptide dat het binnenmembraanoppervlak^{potentiaal 28} verzwakt en de mitochondriale ATP-generatie ^29,30 verhoogt, werd onlangs het eerste door de FDA goedgekeurde mitochondriën-gerichte geneesmiddel voor de behandeling van het Barth-syndroom. Het Barth-syndroom is een X-gebonden aandoening waarbij defecten in de remodellering van cardiolipine bijdragen aan cardiomyopathie, zwakte van de skeletspieren en vroegtijdige sterfte³¹. Hoewel kortdurende behandeling geen detecteerbare veranderingen in spierbiologische leeftijd bij oudere muizen^{heeft laten} zien, heeft de behandeling met elamipretide herhaalde verbeteringen laten zien in functionele parameters van veroudering, zoals cardiale ejectiefractie en globale longitudinale spanning^32,33, spiervermoeidheid en krachtgeneratie 33,34,35, en kwetsbaarheid³². Urolithin A, een uit de darm afgeleide ellagitannine die mitofagie^{induceert 36}, heeft ook klinische verbeteringen laten zien in aerobe spieruithoudingsvermogen en kracht^37,38, naast positieve effecten op hartstoornissen bij oudere muizen en rattenmodellen van geïnduceerd hartfalen³⁹. Metformine, een antidiabetisch medicijn dat is aangetoond te interageren met Complex I⁴⁰, is ook voorgesteld als een gedeeltelijke mimetica van calorische restrictie^41,42. Hoewel metforminebehandeling in eerdere epidemiologische gegevens^43,44 in verband is gebracht met een lager kankerrisico en vertraagde cognitieve achteruitgang, is de effecten op gezondheid en levensduur bij niet-diabetische patiënten nog steeds een open vraag⁴⁵. Tot slot kan behandeling met nicotinamide riboside, een NAD+ voorloper, mitochondriale biogenese en de mitochondriale unfolded eiwitrespons verhogen om de energieproductie^{te verbeteren, maar} de langdurige behandeling bij UM-HET3 muizen had geen significant effect op de mediane muis of de levensduur van het 90e percentiel⁵⁰.

Hierin worden methoden beschreven voor het voorbereiden van weefsels van oude muizen die behandeld zijn met farmacologische verbindingen voor superresolutie confocale beeldvorming van mitochondriale morfologie. Succesvolle implantatie van osmotische minipompen voor langdurige medicijnafgifte bij muizen wordt aangetoond en levers worden geanalyseerd op de effecten van de behandeling op de structuur van het buitenmembraan. Tot slot wordt een analysepijplijn gepresenteerd voor onbevooroordeelde, reproduceerbare kwantitatieve metingen van mitochondriaal volume, oppervlakte en sfericiteit, evenals de classificatie van mitochondriën in verschillende structuren. Deze methoden zijn dus toepasbaar zowel voor het bestuderen van veranderingen in mitochondriale morfologie gedurende de levensduur van zoogdieren als voor het identificeren van farmacologische verbindingen die verouderingsgerelateerde achteruitgang in de metabole gezondheid kunnen verminderen.

Protocol

Alle procedures met proefdieren werden uitgevoerd volgens de institutionele richtlijnen voor het gebruik van proefdieren en goedgekeurd door de Brigham and Women's Hospital en Harvard Medical School Institutional Animal Care and Use Committees onder Protocol nr. 2016N000368. Onderzoekers die dit protocol in andere landen willen toepassen, dienen hun lokale institutionele en regelgevende instanties te raadplegen om te waarborgen dat ze voldoen aan de toepasselijke dierenwelzijnsregels.

1. Subcutane osmotische pompimplantatie

OPMERKING: Dieroperaties mogen alleen worden uitgevoerd door ervaren, getraind personeel, en er moet grote zorg worden betracht om dierenstress en/of lijden te minimaliseren. Voer procedures uit met proefdieren uitsluitend zoals precies beschreven in goedgekeurde dierprotocollen. Al het onderzoek met het gebruik van dieren moet strikt voldoen aan de 3R's – Vervanging, Reductie en Verfijning. Dit protocol beschrijft de implantatie van de subcutane osmotische pomp, wat wordt geclassificeerd als een kleine chirurgische ingreep. Intraperitoneale osmotische pompimplantaties kunnen ook worden uitgevoerd, maar dit is een ingewikkeldere procedure die wordt geclassificeerd als een grote chirurgische ingreep. Daarom wordt aanbevolen dat de subcutane procedure wordt uitgevoerd, tenzij er sterke wetenschappelijke onderbouwing is voor intraperitoneale implantatie.

1. Vulling van osmotische pompen
   OPMERKING: Het bereiden van medicijnoplossingen en het vullen van osmotische pompen moeten plaatsvinden in een bioveiligheidskast met behulp van een steriele techniek. Pompmodellen moeten worden gekozen op basis van het gewenste reservoirvolume en de duur van de behandeling. Voor deze studie werd model 2004 gebruikt (~200 μL reservoirvolume, behandelingsafgifte gedurende 4 weken).
   1. Bereid de geneesmiddeloplossing voor in een oplosmiddel dat compatibel is met de osmotische pompen. Raadpleeg https://alzet.com/formulating-the-solution/. Gebruik de debiet (μL/h) die op de batch van de georden osmotische pompen staat vermeld om de benodigde medicijnconcentratie te bepalen om de beoogde dagelijkse dosering te bereiken.
      OPMERKING: Een oplossing van 50% v/v DMSO en 50% v/v PEG₃₀₀ oplost hydrofobe verbindingen stabiel en is compatibel met de osmotische pompen. Alle verbindingen en oplosmiddelen moesten, indien mogelijk, van farmaceutische kwaliteit zijn.
   2. Filter de medicijnoplossing met een 0,22 μm spuitfilter en houd het op kamertemperatuur.
   3. Plaats een flow-moderator in een pomp en duw hem naar beneden totdat hij in een microfuge-buis past. Duw de flow-moderator niet helemaal naar beneden.
   4. Toets een analytische balans op een lege microfugebuis en registreer vervolgens het gewicht van de osmotische pomp.
   5. Sluit de vulbuis aan op een 1 mL spuit en trek minstens 1,5 keer het reservoirvolume van de pomp op. Verwijder luchtbellen door de zuiger naar beneden te trekken, de spuit te tikken en omhoog te duwen totdat er vloeistof ontstaat bovenop de vulbuis.
   6. Verwijder de flowmoderator terwijl je de pomp rechtop houdt.
   7. Steek de vulbuis door de opening bovenaan de pomp totdat hij niet verder kan.
   8. Duw de zuiger langzaam naar beneden terwijl je de pomp rechtop houdt. Blijf vullen totdat de oplossing bij de uitlaat verschijnt. Verwijder vervolgens de vulbuis en veeg overtollige oplossing weg met een voorzichtig doekje.
   9. Plaats de debietmoderator totdat de dop gelijk ligt met de bovenkant van de pomp.
   10. Plaats de gevulde pomp terug in een microfugebuis en weeg het af. Bepaal het gewicht van de oplossing en controleer dat het vulvolume minstens 90% van het reservoirvolume is (gewichtsverschil in milligram ≈ volume in microliter).
   11. Vul een 15 mL conische buis met 5 mL steriele 1× fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en voeg de vooraf gevulde pomp toe. Sluit af met paraffinefilm en prim de pomp(en) door te incuberen bij 37 °C gedurende de benodigde tijd van het model osmotische pompen. Voor model 2004 is dit 40 h.
2. Bereiding van meloxicam
   OPMERKING: Dit moet worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast met behulp van een steriele techniek. Meloxicam, een niet-steroïde ontstekingsremmer (NSAID), is geen gereguleerde stof maar vereist mogelijk een vergunning voor gecontroleerde stoffen.
   1. Met een 27-G naald en een 3 mL Luer-lok spuit verdun je de 5 mg/mL meloxicam-bouillon tot 1 mg/mL met steriele PBS in een 5 mL steriel glazen flesje. Bereid het op de dag zelf voor en bewaar het op kamertemperatuur.
3. Voorbereiding van de operatielocatie
   OPMERKING: Het is niet nodig om een osmotische pomp in een bioveiligheidskast uit te voeren, noch is het mogelijk om de steriliteit tijdens chirurgische ingrepen te behouden. De praktijklocatie moet echter nog steeds voldoen aan strikte hygiënenormen en aseptische praktijken. De praktijklocatie moet schoon zijn, vrij van rommel en weinig bezoekers hebben. Idealiter is er zowel een voorbereidingsplek (dus voor scheren en scrubben) als een operatieplek (dus voor het uitvoeren van de pompimplantatie).
   1. Desinfecteer het operatiegebied volledig met 70% ethanol en veeg het af met keukenpapier.
   2. Zet de glazen kralensterilisator aan en zet hem op 250 °C. Laat het 15–30 minuten opwarmen.
   3. Zet de vaporizer aan en zet het verwarmingskussen op 65%. Stel het lichaamsgewicht van het dier in en stel het isofluranpercentage in op 3,2%.
   4. Plak een van de temperatuurprobes op het oppervlak van het verwarmingskussen. Laat het verwarmingskussen opwarmen tot 35–37 °C.
   5. Verwijder de verdamperspuit. Duw het groene lipje helemaal in en vul met isofluraan door het aan te sluiten op een fles isoflurane en trek de zuiger naar achteren.
   6. Bevestig de spuit weer aan de vaporizer en start de spuit.
   7. Plaats een tweede warmtekussen onder een schone dierenkooi voor herstel. Plaats de kooi half op en half af op het warmtekussen.
4. Pompimplantatie
   OPMERKING: Alle chirurgische instrumenten moeten van tevoren worden schoongemaakt en geautoclaveerd. Voor het steriliseren van chirurgische instrumenten tussen dieren kan een glazen kralensterilisator worden gebruikt. Dit kan alleen worden gebruikt voor groepen van maximaal 5 dieren. Zorg ervoor dat je een autoclave-indicatorstrip toevoegt om te controleren of de sterilisatieparameters zijn gehaald. De juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) omvatten een schone labjas, een chirurgisch masker, steriele chirurgische handschoenen en een haarbedekking. Dieren die een operatie ondergaan, mogen niet in het zicht van andere dieren zijn.
   1. Pak de muis bij de basis van de staart en plaats hem in de anesthesiekamer. Klem de buizen los en zet de isoflurane stroom (3,2%) naar de kamer. Leg twee gesteriliseerde gordijnen bovenop het verwarmingskussen.
   2. Wacht tot de muis op zijn zij draait en monitor de ademhaling. Wanneer de ademhaling vertraagt en ontspannen wordt, stop dan de isofluranenstroom naar de kamer. Klem de buizen aan de kamer en maak de buizen los van de neuskegel die gebruikt zal worden. Start de stroom van isofluraan (2%) naar de neusconus.
   3. Haal de muis uit de kamer en steek zijn neus in de neuskegel op het verwarmingskussen. Voeg oogzalf toe aan beide ogen.
   4. Weeg de muis op een weegschaal en ga dan terug naar de neusconus. Bepaal het volume van 1 mg/mL meloxicam dat toegediend moet worden. Voor een dosering van 5 mg/kg vermenigvuldig je het gewicht van de muis in gram met 5 om de microliter meloxicam te krijgen.
   5. Spuit het dopje van het flesje van 1 mg/mL meloxicam in met 70% ethanol en droog het met een voorzichtige taalige doek. Trek vervolgens met een 0,3 mL insulinespuit het juiste volume meloxicam op. Verwijder alle luchtbellen uit de spuit.
   6. Stoppelbaar/bind de muis vast met één hand, met het hoofd naar beneden gekanteld. Steek de naald onder een hoek van 30°–45° in het rechterbenedenkwadrant van de buik met de afschuining naar boven. Aspireer om de juiste plaatsing van de naald te bevestigen.
   7. Als er geen aspiratie wordt waargenomen, druk dan soepel de zuiger in en injecteer meloxicam intraperitoneaal.
   8. Zet de muis terug in de neusconus en het verwarmingskussen. Scheer 150% van het gebied rond de implantatieplaats (midden tot bovenrug) volledig af met een chirurgische knipper. Als het klaar is, stofzuig/borstel je voorzichtig het haar van het dier af en gooi je het eerste doek weg.
      OPMERKING: Een schone schering is noodzakelijk om aseptische chirurgie uit te voeren. Minimaal moet elke incisie volledig vrij zijn van dierenharen.
   9. Plaats de muis zo dat het hoofd naar de chirurg wijst. Voer afwisselend een scrubbeurt uit met povidonjodium en 70% ethanol, met watten-tip applicators, voor in totaal 3 toepassingen. Zorg ervoor dat je midden in de geplande incisie begint en spiraal naar buiten met de watten applicators naar buiten spiraal.
   10. Bedek het dier met steriele, fenestreerde chirurgische gordijnen en gebruik de juiste aseptische techniek om chirurgische handschoenen aan te trekken.
   11. Controleer de pedalreflexen grondig door beide voeten stevig vast te knijpen met een tissue pincet voordat je incisies maakt. Ga niet verder tot na meerdere aanslagen, er is geen beweging. Dit bevestigt een chirurgisch vlak van anesthesie.
   12. Zet de middenhuid van het schouderblad omhoog met een weefselpincet en maak een incisie van 1 cm loodrecht op de wervelkolom met een kleine iris-chirurgische schaar. Om een rechte snede te maken, knip je met de Iris-chirurgische schaar onder een hoek van 90° ten opzichte van de muis.
   13. Gebruik kleine hemostatische pincetten binnen de incisie om het subcutane weefsel te spreiden en een zakje voor de pomp te creëren. Zorg ervoor dat het vakje voor de pomp van de voorkant van het dier af zit en iets aan één kant van het dier wordt geplaatst. Gebruik de hemostatische tang om de huid aan alle zijden van de incisie los te maken.
   14. Open de incisie met de weefselpincet en breng de pomp in met de hemostatische tang. Plaats eerst de pomp met de flowmoderator erin.
       VOORZICHTIG: De pomp moet zo worden geplaatst dat deze voldoende van de incisie verwijderd is, dat wil zeggen zodat de huid rondom de incisie niet onder spanning staat. Als het niet goed is geplaatst, kan dit leiden tot wonddehiscentie. De pomp kan ook van positie veranderen tijdens het herstel van het dier.
   15. Gebruik de weefselpincet om de huid voorzichtig te spannen en beide zijden van de incisie gelijk te trekken. Vanaf één uiteinde van de incisie gebruik je de clip-applier om 7 mm gewonden clips over de hele incisie te plaatsen (2–4 clips kunnen nodig zijn).
   16. Voor eventuele openingen in de incisie die te klein zijn om met een andere wondclip te worden gevuld, breng een kleine hoeveelheid weefsellijm aan met de steriele applicator. Knijp dicht met de weefselpincet.
   17. Trek voorzichtig aan de huid rond de incisie om te controleren of de wond gesloten is. Sluit vervolgens de isofluranenstroom naar de neuskegel af en knip de relevante buizen vast. Plaats de muizen in de herstelkooi op het verwarmingskussen.
   18. Houd de muis volledig in de gaten totdat hij wakker wordt en loopbaar is. Houd de dieren regelmatig in de gaten op tekenen van stress of pijn, en houd ze geïsoleerd van andere muizen totdat ze hersteld zijn.
   19. Na 24 uur opnieuw 5 mg/kg meloxicam toegediend via intraperitoneale injectie. (Optioneel) Om het herstel van het dier te bevorderen, geef je Electro-Gel-supplementen en/of plaats je het voer op de vloer van de kooi.
   20. Na 10–14 dagen verdoof je de dieren opnieuw met isoflurane, breng je oogzalf aan en verwijder je de clips met de clipverwijderaar.
       OPMERKING: Clips moeten binnen deze tijd verwijderd worden om haargroei over de wondclips te voorkomen. Ook hebben alle osmotische pompen een vaste duurperiode. Zorg ervoor dat je de pompen verwijdert of de dieren aan het einde van hun werkperiode laat inslapen. Voor langere behandelingsperiodes kunnen meerdere pompimplantaties direct achter elkaar bij hetzelfde dier worden uitgevoerd.

2. Fixatie, inbedding en doorsnijden van weefsels

1. Fixatie van weefsels
   OPMERKING: Alle dierprocedures moeten worden uitgevoerd door ervaren personeel om stress en lijden van dieren te minimaliseren. De euthanasiekamer moet worden schoongemaakt en fysiek tussen elk dier worden gedumpt om eventuele resterende kooldioxide te verwijderen. Om stress te minimaliseren, moeten dieren indien mogelijk in hun eigen kooien worden geëuthanaseerd. Tot slot mogen dieren niet worden geëuthanaseerd in ruimtelijke nabijheid of in het zicht van andere muizen. Schone chirurgische instrumenten zijn vereist voor niet-overlevingsprocedures, maar ze hoeven niet steriel te zijn (d.w.z. geautoclaved).
   1. Plaats de muis in de inductiekamer en open de regelaar totdat de doorstroommeter de beoogde debiet bereikt (~40%–70% van het kamervolume per minuut).
   2. Observeer de muis gedurende de hele procedure en zorg ervoor dat er geen tekenen van stress zijn, zoals springen. Houd de ademhalingsactiviteit in de gaten gehouden en handhaaf de_CO-2-stroom gedurende minstens 2 minuten na het stoppen van de ademhalingsactiviteit. Zorg ervoor dat de totale blootstelling aan_CO-2 minstens 5 minuten is.
   3. Haal de muis terug en voer een secundaire euthanasiemethode uit, zoals een cervicale dislocatie.
   4. Zet de ledematen van het dier vast op een stuk polystyreenschuim bedekt met aluminiumfolie met 23-G naalden. Maak de vacht nat door 70% ethanol te bespuiten.
   5. Maak een kleine incisie bij de basis van de buik en snijd de huid door tot aan de hals. Volg diezelfde incisie om de lichaamsholte te openen en snijd voorzichtig door de ribbenkast.
   6. Maak U-vormige incisies beginnend bij de basis van de buik en pin de huid met 23-G naalden.
   7. Ontleed het relevante orgaan/de orgaan(en) en plaats het in een 15 mL conische buis die vooraf gevuld is met 5 mL 4% paraformaldehyde (PFA). Fix voor 24 uur op 4 °C op een rotisserie.
      VOORZICHTIG: PFA-oplossing is gevaarlijk. Vermijd contact met de huid. Goede PBM bij het hanteren omvat een labjas, nitril handschoenen en veiligheidsbril.
      OPMERKING: Als bloed uit de weefsels moet worden geperfuseerd, en/of als perfusiefixatie gewenst is, voer dan een cardiale perfusie uit zoals eerder beschreven⁵¹. Bij immersiefixatie, zoals hier wordt uitgevoerd, kan het tijd duren voordat het fixatief door het weefsel is gediffuseerd, vooral bij grotere stukken weefsel. Dit kan de mitochondriale morfologie veranderen; Bovendien kan fixatie op PFA er ook voor zorgen dat weefsels^{tot 52 krimpen}.
   8. Na 24 uur verwijder je de paraformaldehydeoplossing en spoel je de weefsels af met 10 mL 1× PBS. Voer in totaal 3 keer gedurende 10 minuten elk op kamertemperatuur op een rotisserie.
   9. Verwijder de PBS en dompel de weefsels onder in 10 ml 30% sucrose gedurende 48 uur bij 4 °C op een rotisserie. De infiltratie van sucrose is voltooid wanneer het weefsel(s) zinkt.
      OPMERKING: Om te verifiëren dat het oplosmiddel aan het dier is toegediend, meet je de hoeveelheid die nog in de pomp zit.
2. Inbedding van weefsels
   OPMERKING: Zorg ervoor dat je de locatie en oriëntatie van het weefsel in de mallen bijhoudt.
   1. Vul een container met polystyreenschuim met droogijs en leg er een metalen plaat plat bovenop.
   2. Plaats de mallen bovenop het metalen plaatje en vul 2/3–3/4 tot bovenaan met optimale snijtemperatuur (OCT) compound (weefsel-inbeddingsmedium). Breng eventuele luchtbellen naar het oppervlak of naar de hoeken met een fijne tang. Om de vriestijd te versnellen, plaats je droge ijspellets direct tegen de mallen.
   3. Plaats wat weefsel-embeddingmedium in een weegboot en meng de weefsels erin. Probeer te voorkomen dat je de sucroseoplossing overneemt.
   4. Zodra het weefselinbeddingmedium volledig bevroren is aan de onderkant van de mal (het moet volledig ondoorzichtig zijn), dompel het weefsel in de mal onder zodat het geen enkele kant van de mal of het oppervlak raakt. Plaats op de gewenste locatie en oriëntatie.
   5. Wacht tot het weefsel-inbeddingmedium volledig is ingevroren voordat je de mallen in een vriezer van -80 °C plaatst.
      OPMERKING: (Pauzepunt) De ingebedde weefsels kunnen minimaal 3 maanden worden opgeslagen.
3. Doorsnijden van weefsels
   OPMERKING: Om de variatie in sectiedikte per batch te verminderen, moeten alle te analyseren weefsels in één sessie worden gesneden.
   1. Haal ingesloten weefsels uit de -80 °C vriezer en plaats ze in een polystyreenschuimcontainer gevuld met droogijs.
   2. Koel de temperatuur van de cryostatkamer en de monsterhouder vooraf af tot respectievelijk -24 °C en -25 °C.
   3. Plaats een nieuw microtome-mes in de meshouder en plaats de anti-roll plaat. Voor het makkelijker schoonmaken bekleed de cryostatkamer met keukenpapier.
   4. Haal de monster-chuck uit de cryostaatkamer en warm hem tot kamertemperatuur.
   5. Gebruik een scheermesje om voorzichtig elke hoek van het weefsel door te snijden. Wrik het voorzichtig los om het weefsel-inbeddingsblok te verwijderen.
   6. Druk het weefselblok stevig in de monsterchuck terwijl je heen en weer draait. Zodra het stevig vastzit, plaats je de monster-chuck een paar minuten in de cryostatkamer om te bevriezen.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat het weefselblok in de juiste oriëntatie op de chuck wordt geplaatst, zodat het weefsel in de gewenste oriëntatie wordt gesneden.
   7. Zodra het weefselblok volledig aan de boorkop is vastgelegd, plaats je de schach in de chuckhouder en draai je hem strak vast. Beweeg het cryostatblad zodat het net voor het weefselblok ligt zonder het aan te raken.
   8. Stel de triminstelling in op 50 μm en begin met het trimmen van het blok totdat een volledige doorsnede van het weefsel is blootgelegd.
   9. Schakel de triminstelling uit en stel de doorsnededikte in op 20 μm. Snijd een paar plakjes op deze dikte voordat je de anti-roll plaat laat zakken. Snijd langzaam en soepel door ~80%–90% van het gedeelte voordat je stopt.
   10. Til de antirollplaat op. Haal een geladen glazen glaasje uit en druk de geladen kant op de weefselsectie op de gewenste plaats.
       OPMERKING: Als de weefselsectie oprolt nadat de anti-roll plaat is opgetild, gebruik dan de fijne borstels om deze uit te rollen.
   11. Haal de boorkop uit de houder. Haal de chuck uit de cryostaat en warm hem tot kamertemperatuur. Haal het tissue blok uit de boorkop en plaats het terug in de mal.
   12. Wikkel in aluminiumfolie om te voorkomen dat het weefselblok uit de mal valt, en breng het terug naar de -80 °C vriezer.
   13. Plaats de gemonteerde weefselsecties op -20 °C.
       OPMERKING: (Pauzepunt) Weefselsecties kunnen veilig worden bewaard bij -20 °C voor onbepaalde tijd.

3. Immunofluorescentiekleuring

1. Haal de cryosecties eruit en laat ze 10 minuten drogen bij 37 °C in een broedmachine.
2. Was de preparaten om overtollig weefsel te verwijderen.
   1. Bereid 1 L van 1× PBS voor met 0,1% v/v Triton X-100 (PBS-T)
   2. Vul 3 kleurpotjes met PBS-T.
   3. Plaats de slides in het slide-rek. Dompel de glaasjes 10 minuten onder in een kleurpotje. Herhaal dit in totaal drie keer.
3. Blokkeer het weefsel voor verkleuring.
   1. Tik voorzichtig op elke diparat met een delicaat taai doekje om te drogen. Leg de preparaten neer, hangend in een glaasdoos met het weefsel naar boven gericht.
   2. Bereid een blokkeringsoplossing van 20 mL voor van 1× PBS, 0,3% v/v Triton X-100 en 5% met rund serumalbumine (BSA).
   3. Pipette 1 ml blokkadevloeistof op elke glaasje, waarbij je ervoor zorgt dat de weefsels volledig bedekt zijn.
   4. Broed 1 uur op kamertemperatuur.
4. Incubeer de weefsels met het primaire antilichaam.
   1. Tik voorzichtig op elke diparat met een delicaat taai doekje om te drogen. Gebruik een andere voorzichtige doek om voorzichtig het resterende vocht tussen de weefselsecties weg te zuigen.
   2. Bereid een verdunning van 1:200 voor van Tom20 konijnen-α-muis antilichaam in blokkerende oplossing (200 μL per preparat)
   3. Leg papieren handdoeken onderin de slidebox en bevochtig ze volledig met water.
   4. Leg de glaasjes neer, hangend in de glaasdoos met het weefsel naar boven gericht. Pipette 200 μL verdund primaire antistof op elke glaas, zodat de weefsels volledig bedekt zijn.
   5. Snijd stukken paraffinefilm ongeveer zo groot als de te gebruiken dekstukken. Snijd 1 stuk paraffinefilm voor elke dia.
   6. Plaats elk stukje paraffinefilm op elke dia, zodat de antistofverdunning over de weefselsecties wordt verspreid. Sluit de slidebox en laat het 's nachts broeden bij 4 °C.
5. Was de glaasjes na de incubatie met het primaire antilichaam.
   1. Vul 3 kleurpotjes met PBS-T. Haal de dia's eruit en verwijder stukjes paraffinefolie.
   2. Plaats de slides in het slide-rek. Dompel de glaasjes 10 minuten onder in een kleurpotje. Herhaal dit in totaal drie keer.
6. Incubeer de glaasjes in het secundaire antilichaam.
   OPMERKING: Om de specifieke etikettering van mitochondriën te bevestigen, bereid u van elke groep ten minste één preparaat voor die alleen met het secundaire antilichaam is gekleurd.
   1. Tik voorzichtig op elke diparat met een delicaat taai doekje om te drogen. Gebruik een andere voorzichtige doek om voorzichtig het resterende vocht tussen de weefselsecties weg te zuigen.
   2. Bereid een 1:200 verdunning voor van geiten-α-konijn Alexa Fluor 568 antilichaam en 5 μg/mL 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) in blokkerende oplossing (200 μL per glaasje).
   3. Leg de glaasjes neer, hangend in de glaasdoos met het weefsel naar boven gericht. Pipette 200 μL verdund secundair antilichaam op elke glaas, zodat de weefsels volledig bedekt zijn.
   4. Snijd stukken paraffinefilm ongeveer zo groot als de te gebruiken dekstukken. Snijd 1 stuk paraffinefilm voor elke dia.
   5. Plaats een stuk parafilm op elke dia, zodat de antistofverdunning over de weefselsecties wordt verspreid. Sluit de diabak en breng 4 uur op kamertemperatuur, of 's nachts op 4 °C.
7. Was de dekbriefjes.
   OPMERKING: Gebruik plastic pincetten om coverslips op te pakken en vast te houden
   1. Plaats dekfolies één voor één in een beker gevuld met heet kraanwater en een wasmiddel voor glas, zoals Contrad 70. Bedek met een stuk paraffinefolie.
   2. Sonicate 30 minuten in een badsonicator.
   3. Spoel meerdere keren af met heet kraanwater. Spoel daarna nog een paar keer af in dubbel gedestilleerd water. Sonicate 15 minuten tijdens de laatste dubbel gedestilleerde waterspoeling.
   4. Plaats dekfolies in 70% ethanol en bewaar ze. Wanneer je klaar bent om coverslips te monteren, haal ze dan uit de 70% ethanol en laat ze aan de lucht drogen in een dampkap.
8. Was de glaasjes na de incubatie met het secundaire antilichaam.
   1. Vul 3 kleurpotjes met PBS-T. Haal de dia's eruit en verwijder stukjes paraffinefolie.
   2. Plaats de slides in het slide-rek. Dompel de glaasjes 10 minuten onder in een kleurpotje. Herhaal dit in totaal drie keer.
   3. Tik voorzichtig op elke diparat met een delicaat taai doekje om te drogen. Gebruik een andere voorzichtige doek om voorzichtig het resterende vocht tussen de weefselsecties weg te zuigen.
9. Bevestig de dekmantels.
   1. Voeg 2–3 gelijkmatig verspreide druppels antifade-montage toe aan een slide.
   2. Om luchtbellen te voorkomen, neem je een schoongemaakte #1.5 coverslip en houd je deze onder een hoek van 45° ten opzichte van de slide langs de lange as. Kantel het dekmantel voorzichtig en langzaam op de glijbaan. Herhaal dit voor alle dia's.
   3. Laat de glaasjes 18–60 uur uitharden op kamertemperatuur, terwijl ze beschermd zijn tegen licht.
   4. Bewaar de dia's op 4 °C die beschermd zijn tegen licht.
      OPMERKING: (Pauzepunt) Dia's kunnen direct na de uithardingsperiode worden afgebeeld, of tot 1 maand wanneer ze bij 4 °C worden bewaard. Er is geen noodzaak om de randen af te dichten. Zorg ervoor dat je #1,5 of #1,5H coverslips gebruikt, want andere diktes veroorzaken bolvormige aberratie en kunnen de beeldkwaliteit verminderen. Gebruik geen montagemedia met DAPI, omdat DAPI brede excitatie- en emissiespectra heeft. De uithardingstijd hangt af van de dikte van het monster; Hier, 48 uur.

4. Superresolutiebeeldvorming

OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van een ZEISS Airyscan2 punt-scannende LSM 980 confocale camera rond een ZEISS Axio Observer Z1 en uitgerust met twee multi-alkali fotomultiplierbuizen (PMT's) en een GaASP 32-kanaals spectrale detector, een omgevingsbehuizing en een Plan Apo 63×/1.4 olie-differentieel interferentiecontrast (DIC) III-objectief.

1. Regel de overname.
   1. Voeg één Airyscan SR-spoor toe en selecteer de juiste fluorofoor.
   2. Selecteer de 10" plaat en de bijbehorende emissiebanddoorlaatfilters.
      OPMERKING: De 10" plaat is specifiek voor deze microscoop, aangezien deze ook is uitgerust met infrarood (IR) detectoren.
   3. Selecteer de juiste laser(s). Stel de Nyquist-bemonsteringscriteria in op 2 door op SR te klikken (pixelgrootte moet worden aangepast naar 0,05 μm).
   4. Klik live en lijn de Airyscan-detector uit (selecteer de live-uitlijningsfunctie). Klik op stoppen zodra de intensiteit in het midden van het detectoricoon is gelokaliseerd en zodra de detector groen is.
      OPMERKING: Als alles correct is ingesteld, zou er aan de linkerkant van de software een melding moeten verschijnen dat "Airyscan-instellingen succesvol geoptimaliseerd zijn".
   5. Ga weer live en pas de laserintensiteit aan zodat er een goed signaal is maar geen verzadigde pixels (klik op de afstandsindicator). Klik op stop zodra je geoptimaliseerd bent.
      1. (Optioneel) Om het signaal te verhogen zonder het laservermogen aan te passen, verhoog je de versterking.
2. Voer gegevensverzameling uit.
   1. Klik op z-stack en controleer of de stapgrootte is ingesteld op 0,1 μm (pas aan als dat niet zo is).
   2. Klik live en stel de onder- en bovengrens van de z-stack in.
   3. Klik op start experiment.
   4. Zodra de z-stack is verzameld, ga je naar het Airyscan-tabblad onder de afbeelding en klik je op 3D bewerken. Houd de parameters van het denoising Weinerfilter die hier worden gebruikt consistent over verschillende replicaties en behandelgroepen.
   5. Bewaar de verwerkte Airyscan z-stack.
      OPMERKING: Als er twee Airyscan SR-sporen worden gebruikt, zorg er dan voor dat de microscoop elk frame van sporen wisselt.

5. Creatie van een geautomatiseerde pijplijn voor het kwantificeren van mitochondriale morfologie

OPMERKING: Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van een geautomatiseerde beeldanalysepijplijn voor 3D-kwantificering van mitochondriale morfologie met behulp van ZEISS arivis Pro Software 4.1.2.

1. Converteer door Airyscan verwerkte .czi-bestanden naar .sis-formaat met behulp van de arivis-conversietool.
   OPMERKING: Als de volledige afbeelding groot is en de verwerkingstijd te lang is tijdens parameteroptimalisatie, snijd dan een klein, representatief subgebied van de afbeelding bij om als werkreferentie te gebruiken voor het optimaliseren van instellingen. Deze bijgesneden afbeelding moet zowel goed geïsoleerde mitochondriën als gebieden met een hogere dichtheid bevatten, zodat het het volledige beeldveld nauwkeurig weergeeft. Zodra bevredigende segmentatie op de bijgesneden afbeelding is bereikt, kan de geoptimaliseerde pijplijn worden toegepast op de volledige beeldset. Deze aanpak bespaart aanzienlijk tijd en maakt het makkelijker om alle parameters aan te passen zonder de kwaliteit van de pijpleiding in te spelen.
2. Zet de pijplijn op en optimaliseer ze.
   1. Open een representatief beeld (bijvoorbeeld van de controlegroep) in de software.
   2. Selecteer het Tom20-immunofluorescentiekanaal als invoer voor analyse.
   3. Pas een dedoiseringsstap toe vóór segmentatie. Hier werd het deeltjesversterkingsalgoritme gebruikt, met een diameter van 5,42 en een sterkte van 0,5.
      OPMERKING: Het deeltjesversterkingsfilter is een structuurbehoudend denoising-algoritme dat is ontworpen om compacte, ruwweg bolvormige of langwerpige objecten te versterken terwijl achtergrondruis wordt onderdrukt. Het werkt door de lokale intensiteit op een bepaalde ruimtelijke schaal (diameter) te vergroten, waardoor het bijzonder geschikt is voor mitochondriën, die verschijnen als heldere, geïsoleerde deeltjes of buisjes tegen een donkere achtergrond. Als de diameterparameter te klein is ingesteld, versterkt dit ruis, terwijl een te grote waarde aangrenzende objecten vervaagt. De sterkteparameter bepaalt de mate van versterking, waarbij hoge waarden de signaalversterking verhogen maar artefacten kunnen introduceren als ze te hoog worden ingesteld. Begin met de standaardwaarden en pas aan terwijl je visueel de output inspecteert op een representatief interessegebied. Er zijn verschillende denoisingmethoden beschikbaar in arivis Pro. Gaussische gladmaking is een eenvoudige, snelle optie die hoogfrequente ruis uniform vermindert, maar fijne structurele details kan vervagen. Mediaan filteren is beter in het behouden van scherpe randen en verwijdert zout-en-peper ruis. Deeltjesversterking (hier gebruikt) heeft de voorkeur wanneer het doel is om discrete fluorescerende objecten te detecteren, omdat het selectief het signaal van structuren versterkt die overeenkomen met het opgegeven groottebereik. Voor beelden met een lage signaal-ruisverhouding of significante achtergrondheterogeniteit kan een sterkere denois-pass gerechtvaardigd zijn. Het wordt aanbevolen om twee of drie methoden te testen op hetzelfde representatieve beeld en de segmentatiekwaliteit van downstream te vergelijken.
   4. Segmenteer individuele mitochondriën met behulp van het Blob Finder-algoritme, dat objecten in 3D-ruimte detecteert.
   5. Pas segmentatieparameters aan, waaronder objectgrootte en gevoeligheidsdrempel, en inspecteer visueel de overlap tussen gedetecteerde objecten en het gedenoisede beeld om nauwkeurige segmentatie te garanderen. Hier werden de volgende parameters gebruikt: een diameter van 0,244 μm, een waarschijnlijkheidsdrempel van 25% en een splitsensitiviteit van 22,22%, met normalisatie ingesteld op het eerste startpunt.
      OPMERKING: Segmentatieparameters zijn afhankelijk van beeldresolutie en voxelgrootte. In deze studie waren de beeldafmetingen 1354 × 1354 pixels met een XY-pixelgrootte van 0,049 μm en een voxelgrootte van 0,049 × 0,049 × 0,100 μm³.
3. Voer feature-extractie en kwaliteitscontrole uit.
   1. Extraheren van morfologische parameters voor elk gedetecteerd object, inclusief volume (μm³), oppervlakte (μm²) en sfericiteit (oppervlakte van een bol met hetzelfde volume/oppervlakte van de mitochondriën).
   2. Exporteer gesegmenteerde objecten als TIFF-bestanden voor visuele validatie.
   3. Open geëxporteerde bestanden in FIJI of arivis en leg ze over de originele afbeelding voor visuele inspectie van de segmentatienauwkeurigheid.
   4. Exporteer kwantitatieve metingen als afzonderlijke spreadsheetbestanden voor elk monster.
4. Pas de pijplijn toe.
   1. Bewaar de geoptimaliseerde pijplijn. Een voorbeeldpipeline is te vinden in Aanvullend Bestand 1.
   2. Pas de pijplijn toe op aanvullende beelden van alle experimentele groepen uit de studie.
   3. Verfijn segmentatieparameters iteratief indien nodig om consistente prestaties te garanderen over alle experimentele groepen.
   4. Na afronding pas je de pijplijn in batchmodus toe op alle afbeeldingen in de studie.
5. Voer data-analyse uit
   1. Importeer de geëxporteerde gegevens in RStudio (versie 4.3.2) voor statistische analyse.
   2. Als het niet geïnstalleerd is, installeer dan de pakketten: readxl, dplyr, tidyr, purrr, ggplot2, ggpubr, patchwork, scales, randomForest, caret, umap, factoextra, RColorBrewer, mclust, outliers en tidyverse.
   3. Upload het script (Aanvullend Bestand 2) om alle datasets samen te voegen, de data te filteren (zie hieronder), het volume, het oppervlak en de sfericiteit te plotten, en de gesegmenteerde mitochondriën te analyseren voor proporties per monster subtype.
   4. (Optioneel) Filter mitochondriën op basis van volume om segmentatie-artefacten en ruis uit te sluiten.
      1. Om geschikte filters te bepalen, inspecteer je de volumeverdelingen visueel.
         OPMERKING: Alle monsters toonden een uitgesproken piek bij zeer kleine volumes (onder 0,0003 μm³), wat overeenkomt met segmentatieruis in plaats van echte mitochondriën.
      2. Om de ondergrens te identificeren, evalueer je deeltjesretentie over kandidaatdrempels (0,0009, 0,003, 0,005, 0,007 en 0,01 μm³). De steilste daling in het deeltjesaantal vond plaats onder 0,003 μm³, wat aangeeft dat de meeste ruisdeeltjes in dat bereik vallen. Visuele inspectie bevestigde dat 0,003 μm³ overeenkwam met de rechterrand van de ruispiek.
      3. Voor de bovengrens taperden de verdelingen natuurlijk ver onder 10 μm³; stel deze limiet in om grote artefactische objecten zoals overgesegmenteerde mitochondriale netwerken uit te sluiten. Eindfiltering van vastgehouden deeltjes met volumes tussen 0,003 en 10 μm³.
         OPMERKING: Dit script berekent de mediane waarden per steekproef over alle gedetecteerde mitochondriën en gebruikt deze als analyse-eenheid. Deze benadering verklaart de niet-onafhankelijkheid van individuele mitochondriën binnen hetzelfde biologische monster.

Resultaten

Het hierboven beschreven protocol is uitgevoerd (Figuur 1) bij 20 maanden oude mannelijke UM-HET3-muizen. De muizen kregen ofwel een voertuig (Control) of een chemische herprogrammeringscocktail (behandeld) met behulp van model 2004 osmotische minipompen⁵³. Levers werden vervolgens gesneden en gefotografeerd met een Airyscan2 confocale microscoop voordat de z-stacks met de analysepijplijn werden verwerkt.

De 3D-fluorescentiebeelden werden verwerkt en geanalyseerd met ZEISS arivis Pro Software 4.1.2. Voor de segmentatie van mitochondriën werd het deeltjesversterkingsalgoritme toegepast om de beelden te denoise en achtergrond, onscherp licht, autofluorescentie en/of fluorescentie afkomstig van niet-specifieke binding te verwijderen. De deeltjesversterking versterkt selectief het signaal vanuit een gegeven diameter. Na het denoiseren werden individuele mitochondriën in 3D gesegmenteerd met behulp van het Blob Finder-algoritme, dat objecten detecteert op basis van lokale intensiteitsmaxima binnen een gedefinieerd groottebereik. Tot slot reduceert objectsegmentatie elke 2D-snede tot een binaire afbeelding.

Om de segmentatieworkflow te illustreren, toont Figuur 2 representatieve optische sneden in elke fase van de verwerkingspijplijn voor controle- en behandelde monsters. Het ruwe fluorescentiebeeld toont het onbewerkte Tom20-signaal, dat een mengsel bevat van specifieke mitochondriale fluorescentie en ongewenste achtergrond, onscherp licht en autofluorescentie. Na het toepassen van deeltjesversterkingsdenoising werd het achtergrondsignaal aanzienlijk verminderd en blijft de resterende fluorescentie beperkt tot discrete, goed gedefinieerde structuren (Figuur 2). Dit resulteert in een schonere weergave van mitochondriale grenzen die nauwkeurige segmentatie mogelijk maakt.

De output van de Blob Finder-segmentatie wordt weergegeven in groen. Om te bevestigen dat de z-stacks nauwkeurig zijn gesegmenteerd, werden de ontruisde 2D-sneden met de bijbehorende gesegmenteerde binaire beelden over elkaar gelegd (Figuur 2). Als het segmentatieproces voldoende geoptimaliseerd is, moet sterke en consistente colocalisatie van mitochondriale fluorescentie met de binaire objecten worden waargenomen. Als het segmentatieproces oversegmenteert (d.w.z. individuele mitochondriën splitst in meerdere objecten) of ondersegmenteert (d.w.z. meerdere mitochondriën tot één samenvoegt), pas dan de segmentatieparameters aan. Visuele inspectie van de insets bevestigt segmentatie van hoge kwaliteit: gedetecteerde objecten colokaliseren precies met het ontruisde Tom20-fluorescentiesignaal, zonder bewijs van oversegmentatie, overdimensionering van objecten, ongepaste samenvoeging van ruimtelijk aangrenzende mitochondriën tot enkele objecten, of het genereren van valse objecten in gebieden zonder Tom20-signaal. Dit niveau van segmentatienauwkeurigheid werd consequent bereikt over zowel controle- als behandelde monsters, wat aantoont dat de pijplijnparameters die in ZEISS arivis-software zijn geoptimaliseerd, robuust en generaliseerbaar zijn over de experimentele groepen. Samen valideren deze resultaten de segmentatiebenadering en ondersteunen ze de betrouwbaarheid van de morfologische metingen die hieruit zijn afgeleid.

De gesegmenteerde objecten kunnen worden gemeten op mitochondriale parameters zoals volume, bolkracht en oppervlakte (Figuur 3). Om rekening te houden met het grote aantal mitochondriën per biologische steekproef en de niet-onafhankelijkheid van individuele organellen binnen een cel, werden de mediane waarden per steekproef berekend en gebruikt als eenheid voor statistische vergelijking. Groepsverschillen werden beoordeeld met behulp van de Wilcoxon-test. Behandelde monsters vertoonden significant een hoger mitochondriaal volume en oppervlakkig oppervlak dan controles, wat erop wijst dat chemische herprogrammering substantiële hermodellering van mitochondriale morfologie induceert.

Ten slotte kunnen de gesegmenteerde mitochondriën worden ingedeeld in verschillende subtypes^54,55 (Figuur 4). De elbow-methode⁵⁶ werd gebruikt om het optimale aantal clusters voor k-means clustering^57,58 te bepalen (Figuur 4A). Vervolgens werden, met behulp van k = 4 clusters, willekeurige submonsters van mitochondriën voor controle- en behandelde groepen uitgezet via uniforme manifold-benadering en projectie (UMAP) dimensionaliteitsreductie (Figuur 4B), gekleurd op zowel mitochondriale subtype (links) als behandelgroep (rechts). Ten slotte werden de verhoudingen van elk mitochondriale subtype (Figuur 4C) voor de controle- en behandelde groepen uitgezet. In de Behandelingsgroep waren er minder gefragmenteerde mitochondriën, maar geen significante verandering in het aandeel netwerk- of verlengde mitochondriën.

Figuur 1: Overzicht van het protocol. Muizen worden tot 6 weken behandeld met medicijnen of een voertuig met subcutane osmotische minipompimplantatie (1). Na behandeling worden de muizenweefsels gefixeerd, geïnfiltreerd met sucrose, ingebed in OCT-verbinding en cryo-doorgesneden (2). De weefselsecties worden vervolgens gekleurd met antilichamen tegen Tom20 en secundaire antilichamen gelabeld met Alexa Fluor 568 (3). Superresolutie z-stacks worden verzameld op een Airyscan2 puntscanning confocale microscoop (4), en de gedenoisedeerde bewerkte z-stacks worden in arivis gesegmenteerd om mitochondriale morfologie te kwantificeren (5). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Geautomatiseerde pijplijn voor mitochondriale segmentatie en morfologieanalyse.
Representatieve enkele optische sneden uit controlemonsters (bovenste panelen) en behandelde (onderste panelen). Het Tom20-immunofluorescentiesignaal wordt weergegeven in grijs (links). Hetzelfde beeld na het dedoiseren wordt grijs weergegeven, gevolgd door de segmentatie-output die gedetecteerde mitochondriale objecten groen benadrukt. De samengevoegde afbeelding toont de overlap tussen het gedenoisede signaal en gesegmenteerde objecten. Insets tonen hogere vergrotingsweergaven van de aangegeven gebieden, wat de effecten van denoising en de nauwkeurigheid van segmentatie illustreert. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Mitochondriale morfologie in de controle- en behandelde groepen. Boxplots tonen het mediane ± interkwartielbereik van per-steekproef mediaanwaarden (n = 10 per groep). Elke stip vertegenwoordigt één biologisch monster, samengevat als de mediaan over alle mitochondriën die in dat monster zijn gedetecteerd. Volume en oppervlakte worden weergegeven op een logaritme_{schaal van 10} . Groepen werden vergeleken met behulp van Wilcoxon rangsomtests. Significantieniveaus: ns p ≥ 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Ongecontroleerde morfometrische classificatie van mitochondriale subtypes. (A) Elbow-grafiek die de totale som van kwadraten binnen het cluster (WSS) toont als functie van het aantal clusters (k), berekend op een willekeurige substeekproef van 10.000 mitochondriën. Het kantelpunt bij k = 4 werd geselecteerd als het optimale aantal clusters voor downstream analyse. (B) (Links) UMAP-dimensionaliteitsreductie van mitochondriale morfometrische kenmerken (n = 20.000 willekeurig bemonsterde mitochondriën), gekleurd op toegewezen subtype. Er werden vier morfologisch verschillende subtypen geïdentificeerd: gefragmenteerd (klein, hoge bol), langwerpig (lang, lage bol), netwerkgebonden (groot, onregelmatig) en intermediair. (Rechts) UMAP-projectie gekleurd op experimentele groep (Control vs. Treated) die de verdeling van elke groep over de morfologische ruimte toont. (C) Proporties per steekproef van elk mitochondriaal subtype in elke experimentele groep. Elk datapunt vertegenwoordigt één biologisch monster (n = 10 per groep). Boxplots tonen het interkwartielbereik en mediaan, met snorharen die zich uitstrekken tot 1,5 keer het interkwartielbereik. Subtypeverhoudingen werden vergeleken tussen groepen met behulp van de Wilcoxon-rangsomtest, en p-waarden werden gecorrigeerd voor meervoudige vergelijkingen met de Benjamini-Hochberg-methode. NS P ≥ 0,05, ****p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand 1: Voorbeeld van arivis-pijplijn. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: R-script voor het kwantificeren van mitochondriale morfologie en subtypepopulaties.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

De twee belangrijkste stappen voor het succesvol uitvoeren van dit protocol zijn (i) het sluiten van de incisie tijdens de implantatie van de osmotische pomp, en (ii) nauwkeurige segmentatie. Voor het eerste moet je extra goed letten op het creëren van een subcutane pocket die groot genoeg is voor de pomp, maar niet te groot zodat de pomp langs de flank van het dier kan glijden. Wanneer de incisie gesloten is, moet de pomp voldoende ver weg worden geplaatst om geen spanning op de omliggende huid te veroorzaken, wat tot dehiscence kan leiden. Zorg ervoor dat je in alle richtingen aan de huid rondom de gesloten incisie trekt om te controleren of de wond voldoende gesloten is voordat je begint met het herstel van het dier. Wondclips zijn voordelig omdat ze snel aan te brengen en te verwijderen zijn. Als er echter problemen ontstaan doordat de incisies niet goed kunnen sluiten, kunnen onderbroken hechtingen worden gebruikt. Voor het laatste vereist nauwkeurige segmentatie dat je voortdurend de segmentatieresultaten vergelijkt met de ongeruisde beelden totdat er voldoende beeldgelijkenis is. Z-stacks van controle- en behandelde dieren moeten worden verzameld met dezelfde verzamelparameters en bij voorkeur tijdens dezelfde beeldvormingssessie. Evenzo moeten alle verwerkingsstappen op alle afbeeldingen worden toegepast met exact dezelfde parameters. De diametersegmentatieparameter definieert de verwachte grootte van de te detecteren objecten. Een goed uitgangspunt is de gemeten gemiddelde mitochondriale breedte van enkele handmatig geïnspecteerde objecten met één optische snee. De waarschijnlijkheidsdrempel bepaalt het minimale detectievertrouwen dat vereist is om een object te accepteren. Lagere waarden verhogen de gevoeligheid en detecteren meer objecten, maar sommige van deze objecten kunnen onwaar zijn. Omgekeerd verbeteren hogere waarden de specificiteit, maar kunnen ze ervoor zorgen dat objecten met een lager signaal verloren gaan. Een aanbevolen startbereik is 25%–30%. Ten slotte bepaalt splitsengevoeligheid hoe agressief aanrakende of overlappende objecten worden gescheiden in individuele objecten. Een lage split-gevoeligheid zorgt ervoor dat geclusterde mitochondriën als enkele samengevoegde objecten worden achtergelaten. Aan de andere kant kan een hoge splitsengevoeligheid resulteren in oversplijting van langwerpige of vertakte mitochondriën in fragmenten. Waarden tussen 15%–30% zijn redelijk voor typische mitochondriale morfologische studies. Als nauwkeurige segmentatie nog steeds uitdagend is, kan segmentatie worden uitgevoerd met Mitochondria^{Analyzer 59} in FIJI⁶⁰. Een semi-geautomatiseerde pijplijn voor de kwantificering van mitochondriale morfologieën in zowel cellen als weefsels met behulp van Huygens Professional-software en een aangepast Python-script is onlangs ook beschreven⁶¹.

Een beperking is de resolutielimiet van de Airyscan2 confocale microscoop, die ~150 nm in XY en ~350 nm in het Z-vlak is. Dit voorkomt beeldvorming met hoge resolutie van mitochondriale cristae, aangezien de afstanden tussen individuele cristae ~40–120 nm 62,63,64 zijn. Daarentegen kan gestimuleerde emissiedepletie (STED) lateraal resolutielimieten van ~20–50 nm bereiken en kan het duidelijk individuele mitochondriale cristae 62,63,64 onderscheiden. Er zijn recentelijk verschillende STED-kleurstoffen ontwikkeld die effectieve kleuring en beeldvorming van het mitochondriale binnenmembraan mogelijk maken in zowel levende als gefixeerde cellen 63,64,65. Aangezien analyse van cristae-morfologieën inzicht kan geven in de bio-energetische gezondheid van mitochondriale¹⁰, is dergelijke data daarom gewenst. De mitochondriale morfologie verschilt echter sterk tussen zoogdierweefsels en celkweek (hieronder uitgebreid besproken), en er is momenteel geen methode om het binnenmembraan van weefsels te kleuren voor STED-beeldvorming en analyse van cristae-structuren.

Het kwantificeren van mitochondriale morfologie in intact weefsel brengt unieke uitdagingen met zich mee vergeleken met celkweeksystemen. In gekweekte cellen zijn mitochondriën doorgaans verspreid over het cytoplasma in goed gescheiden netwerken met minimale overlap tussen cellen. Bij weefseldoorsneden of hele mount-preparaten zijn cellen echter dicht opeengepakt en zijn hun grenzen niet goed gedefinieerd. Indien celniveauanalyse nodig is, moet een extra fluorescerend label dat gericht is op het plasmamembraan of een celtype-specifieke marker worden toegevoegd, samen met een bijbehorende segmentatiestap in de beeldanalysepijplijn om individuele celgrenzen te definiëren voordat de mitochondriale morfologie wordt gekwantificeerd. Een tweede belangrijk verschil is dat mitochondriën in gekweekte cellen vaak continu, onderling verbonden reticulaire netwerken vormen die gemakkelijk te visualiseren en te interpreteren zijn. In weefsels wordt dit patroon zelden waargenomen. Mitochondriën van leversecties vertonen bijvoorbeeld een punctate, staaf- en bundelpatroon dat het gehele cytosol⁶⁶ bezet. Hepatocyten in cultuur vertonen echter buisvormige morfologieën met duidelijke netwerkformaties⁶⁶. Evenzo worden bij het vergelijken van mitochondriën van glad weefsel met die van gladde spiercellen in cultuur duidelijke verschillen waargenomen in hun morfologieën en netwerkpatronen⁶⁷. De driedimensionale architectuur, gecombineerd met celtype-specifieke verschillen in mitochondriale verdeling, zorgt ervoor dat mitochondriën in deze weefsels verschijnen als discrete, dicht gepakte puncta of korte fragmenten in plaats van langgerekte netwerken. Daarom is een voorzichtige interpretatie van gegevens gerechtvaardigd bij het vergelijken van morfologische kenmerken tussen weefsels en celkweek, aangezien verschillen tussen beide deels kunnen worden toegeschreven aan beeldvormingscontext in plaats van aan echte biologische variatie.

Een hoogtepunt van dit protocol is het vermogen om mitochondriale structuren in weefsels kwantitatief te meten met behulp van lichtmicroscopie. Hoewel er andere methoden bestaan om mitochondriale morfologie te kwantificeren op basis van superresolutie lichtmicroscopiebeelden, zijn veel daarvan alleen geschikt voor cellen in cultuur. Bovendien is de hier gepresenteerde pijplijn, in tegenstelling tot andere analysemethoden, volledig geautomatiseerd, kwantificeert zowel mitochondriale afmetingen als subtypeverhoudingen, en vereist weinig codeerervaring om succesvol uit te voeren. Scanning/transmissie-elektronenmicroscopie (SEM/TEM) en cryo-ET zijn eerder gebruikt om mitochondriale structuren in weefsels in 2D en 3D 10,68,69 in beeld te brengen. Voor de eerste zijn er echter zorgen over het behoud van inheemse structuren na monsterfixatie, uitdroging en inbedding^70,71. Bovendien is handmatige meting van mitochondriale parameters in FIJI⁶⁰ soms de voorkeursmethode voor TEM-beelden⁷², wat veel werk vereist en kan leiden tot steekproefbias. Diepe learningmethoden voor geautomatiseerde kwantificering van mitochondriale morfologieën uit TEM-beelden zijn echter recent beschreven^73,74. Een voordeel van de gepresenteerde aanpak is dat zodra de analysepijplijn is opgezet, deze afbeeldingen kan batchverwerken met weinig tot geen gebruikersinvoer. Voor laatstgenoemde kan hogedrukbevriezing weefselstructuren behouden onder nabij-inheemse omstandigheden⁷⁵. Cryo-ET monster bevriezen, doorsnijden, freezen, dataverzameling en gegevensverwerking vereisen echter allemaal uitgebreide training en zeer geavanceerde apparatuur. Daarentegen is superresolutie confocale microscopie relatief toegankelijker en vereist het minder training en middelen om succesvol uit te voeren.

Osmotische pompimplantaties kunnen veilig worden uitgevoerd bij oudere muizen om de effecten van verschillende farmacologische verbindingen op verouderingsgerelateerde afnames in fysiologische functies te evalueren. Daarnaast zijn de hier beschreven methoden generaliseerbaar naar veel verschillende organen. Het is goed gekarakteriseerd dat verouderingsgerelateerde afnames in metabole functie bijdragen aan ziekte en voortkomen uit mitochondriale disfunctie, een van de informele kenmerken van het ouder worden van⁷⁶ jaar. Bovendien wordt begrepen dat mitochondriale structuren mitochondriale bio-energetische capaciteit en metabole status^{beïnvloeden 77,78}. Het kwantitatief beoordelen van verbindingen op hun effecten op de mitochondriale structuur tijdens het ouderen van de muizen, met behulp van de hier beschreven methoden, kan dus helpen bij het identificeren van therapieën die de menselijke gezondheidsduur kunnen verlengen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Airyscan2 point scanning confocal microscope	ZEISS	LSM 980 with Airyscan2	ZEISS point scanning LSM 980 confocal gebouwd rond een ZEISS Axio Observer Z1 en uitgerust met twee multi-alkali PMT's en een GaASP 32-kanaals spectraal detector, een omgevingsbehuizing en een Plan Apo 63×/1.4 Oil DIC III objectief. De microscoop die in dit onderzoek werd gebruikt, is ook uitgerust met twee externe NIR-detectoren, evenals de volgende laserlijnen: 405, 458, 488, 514, 561, 594, 639 en 730 nm.
Aluminiumfolie	Essendant	BWK7112
Analytische balans	Mettler Toledo	MR204
Anti-rol glazen plaat	Gel Company	LGI70
Arivis Pro Software	ZEISS	Versie 4.1.2
Bath sonicator	Branson Ultrasonics	71020-MT
Bovine serum albumin	Research Products International	A30075
Centrifugebuizen, 15 mL	CELLTREAT	229411
Gelaaide microscoopglazen	Globe Scientific	1358W
Klep verwijderaar	Alzet	0009976
CO2	Airgas	CD 50
Contrad 70	Decon Labs	1003
Wattenstaafjes met katoen	Puritan Medical	25-8061WC
Cryostat	Leica Biosystems	CM3050 S
Cryostat bladen	Sakura Finetek USA Inc	4689
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	Bereid tot 5 mg/mL in ddH2O, verdeel in portieën en bewaar bij -20 °C beschermd tegen licht
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650
EasyDip slide staining system	Electron Microscopy Services	71388-01
Electro-Gel	Bio-Serv	EGS-1
Inbeddingsvormen, 22 mm ´ 22 mm ´ 20 mm	Polysciences	18646A-1
Ethanol, 200 proof	Decon Labs	V1001
Geperforeerde steriele draaglakens	Dukal	20001
Fijne tang	Fine Science Tools	11445-12
Glazen kralen sterieliseerder	VWR	75999-324
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11036
Verwarmingspad	CVS	215313
Hemostatische pincetten	World Precision Instruments	501705
Immersieolie Immersol 518 F	ZEISS	433802-9010-000
Inductiekamer	World Precision Instruments	EZ178
Insuline-spuiten, 0,3 mL	BD	328431
Iris chirurgische schaar	Sklar Surgical Instruments	47-1135
Isofluran	Patterson Veterinary	07-890-8115
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120
Luer-Lok 1 mL spuiten	BD	309628
Luer-Lok 3 mL spuiten	BD	309657
Luer-Lok 50 mL spuiten	BD	309653
Meloxivet (meloxicam)	Patterson Veterinary	07-894-8524
Microcentrifugebuizen, 1,5 mL	CELLTREAT	229443
Microscoopglasdoos	Heathrow Scientific	15994E
Microscoopglasdekglas, #1.5, 22 mm ´ 50 mm	Electron Microscopy Services	72204-04
Non-CO2 incubator	Benchmark Scientific	H2200-H
Niet-geperforeerde steriele draaglakens	Dukal	20-002
OCT Compound	Sakura Finetek USA Inc	4583
Oogzalf	Patterson Veterinary	07-888-2572
Osmotische minipompen	Alzet	2004
Parafilm	Bemis	PM999
Paraformaldehyde, 4% w/v	Santa-Cruz Biotechnology	sc-281692
PBS, 1½	Thermo Scientific	10010023
PEG300	Sigma-Aldrich	90878
PES-spuitenfilters, 0,22 µm	CELLTREAT	229747
Povidon jodium 10% USP staafjes	Medline	MDS093901ZZ
ProLong Glass Antifade	Invitrogen	P36980
Rabbit anti-Tom20 antilichaam	Novus Biologicals	NBP2-67501
Veiligheidsmesjes, 0,22 mm	VWR	55411-050
Rotator/rotisserie	Labnet	H5500
RStudio	The R Project for Statistical Computing	versie 4.3.2
Schaal	Fisher Scientific	S72422
SomnoSuite lage-stroom anesthesie systeem	Kent Scientific	SS-01
Stoomsterilisatie indicator strips	Crosstex	SIS-250
Steriele glazen flesjes, 5 mL	Thermo Scientific	ST5
Steriele naalden, 0,5", 23 G	BD	305145
Steriele naalden, 0,5", 27 G	BD	305109
Sterilisatie zakjes	Cardinal Health	92510
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378	Bereid een oplossing van 30% w/v in