Hier presenteren we een dissectieprotocol dat de pijnappelklier behoudt, die vaak verloren gaat wanneer de hersenen uit de schedelholte worden verwijderd. Dit protocol waarborgt het behoud van de pijnappelklier in embryonale en vroege postnatale muizenhersenenpreparaten voor downstream-toepassingen, waaronder immunohistochemie, in situ hybridisatie en ruimtelijke transcriptomica.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het behouden van de pijnappelklier in perinatale preparaten van de muizenhersenen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De pijnappelklier, een neuroendocriene structuur die melatonine uitscheidt, ontstaat uit een aanleg op de dorsale middellijn in de embryonale voorhersenen. Op embryonale dag (E) 14.5 bij de muis is een pineale divertikel zichtbaar die uitstulpt uit het dak van het diencephalon tussen de gepaarde telencefale blaasjes. Deze divertikel is in nauw contact met het overliggende kraakbeen-, meningeale en vasculaire weefsel. De structuur gaat gemakkelijk verloren wanneer de schedelkap wordt geopend om de hersenen te extraheren in late embryonale of vroege postnatale stadia. Ondanks de belangrijke neuroendocriene rol blijft de vroege ontwikkeling van de pijnappelklier en de signaleringsmechanismen die dit proces reguleren onvoldoende begrepen, mede door de moeilijkheid om deze structuur intact te behouden tijdens de embryonale stadia van de ontwikkeling van de muizenhersenen.
Dit artikel presenteert een innovatieve dissectieprocedure die de pijnappelklier behoudt, terwijl de structurele integriteit en de aanhechting aan het dak van het diencefalon bewaard blijven tijdens de isolatie van de hersenen van embryonale stadia tot postnatale dag (P) 7. De procedure wordt gedemonstreerd met een E18.5 muizenbrein en is daarom geschikt voor downstream-toepassingen die behoud van de weefselarchitectuur vereisen, waaronder in situ hybridisatie, immunohistochemie en ruimtelijke transcriptomics. Het protocol kan ook worden gebruikt om de in ontwikkeling zijnde pijnappelklier te isoleren, waardoor de specifieke representatie van de pijnappelklier in transcriptomische en proteomische analyses wordt verbeterd, wat anders uitdagend is vanwege de geringe omvang.
Inleiding
De pijnappelklier is een kleine neuroendocriene structuur gelegen in de dorsale middellijn van de hersenen van gewervelden en speelt een centrale rol bij het reguleren van de circadiane fysiologie via de ritmische secretie van melatonine1,2. Tijdens de embryogenese van zoogdieren ontstaat de pijnappelklier uit de dorsale middellijn van de zich ontwikkelende voorhersenen. Bij muizen begint de ontwikkeling van de pijnappelklier wanneer een gespecialiseerd gebied van het dorsale diencefalische neuroepithelium de pineale aanleg/recessus pinealis vormt, die vervolgens uitstulpt om het diverticulum pineale te vormen op embryonale dag (E) 14,53,4,5. Dit diverticulum is bevestigd aan het dak van het diencefalon en is zichtbaar tussen de gepaarde telencefalische blaasjes. Naarmate de ontwikkeling vordert, raakt dit diverticulum nauw verbonden met bovenliggende structuren in de dorsale middellijn van de hersenen, in het bijzonder de sinus sagittalis superior (SSS) en de sinus transversus (TS), veneuze kanalen die langs het dorsale oppervlak van de voorhersenen lopen6. De zich ontwikkelende pijnappelklier ligt direct onder het kruispunt van de SSS en de TS, en de fragiele verbinding met het dorsale diencefalon is bijzonder kwetsbaar wanneer de bovenliggende vasculo-meningeale structuren worden verwijderd om de hersenen uit de schedelholte te halen7. Dit maakt de pijnappelklier bijzonder vatbaar voor beschadiging, aangezien deze kan worden afgescheurd wanneer de schedelholte wordt geopend voor de extractie van de hersenen. Als gevolg hiervan gaat de pijnappelklier vaak verloren tijdens routinematige dissecties, wat de analyse van de structuur en moleculaire samenstelling in intacte preparaten beperkt.
Hier beschrijven we een stapsgewijs protocol voor het dissekeren van de muizenhersenen, waarbij de pijnappelklier en de aanhechting ervan aan het dak van het diencefalon behouden blijven. De methode is toepasbaar op embryonale stadia van E16.5 tot vroege postnatale stadia (P7), en is geschikt voor studies naar de ontwikkeling van de pijnappelklier met behulp van in situ hybridisatie, immunohistochemie en ruimtelijke transcriptomica. Ter demonstratie van downstream-toepassingen worden in situ hybridisatie en immunohistochemie voor de pijnappelklier-verrijkte marker CRX gepresenteerd.
De belangrijkste innovatie van deze methode is dat de spanning op de middenlijnstructuren wordt geminimaliseerd door zorgvuldig de fysieke aanhechtingen te verwijderen die anders de pijnappelklier zouden afscheuren wanneer de hersenen uit het schedelgewelf worden verwijderd. Dit is een verbetering ten opzichte van de standaardprocedure.
Deze dissectiemethode is beperkt tot stadia tot P7, omdat de progressieve ossificatie van het schedeldak tijdens de vroege postnatale ontwikkeling de stijfheid van de schedel vergroot en de verbinding met meningeale en vasculaire structuren versterkt. Hoewel verschillende studies dissectieprocedures voor de pijnappelklier bij volwassen knaagdieren hebben beschreven8, hebben zeer weinig zich gericht op het behoud van de pijnappelklier tijdens embryonale en vroege postnatale stadia, wanneer de klier bijzonder fragiel is en vatbaar voor beschadiging tijdens de isolatie van de hersenen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures zijn goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de Institutional Animal Ethics Committee van het Tata Institute of Fundamental Research.
1. Materiaalpreparatie
- Zorg ervoor dat alle benodigde instrumenten voor microdissectie (zie de Tabel met Materialen) zijn voorbereid voordat de procedure begint. Steriliseer alle instrumenten met 70% ethanol. Voor het verzamelen van preparaten voor downstream toepassingen zoals ruimtelijke transcriptomica/in situ hybridisatie, veeg de instrumenten af met een RNase-decontaminatieoplossing.
- Maak de tafel van de dissectiemicroscoop schoon met RNase-decontaminatieoplossing en houd een fles ijskoud 1× PBS bij de hand nabij de dissectiebank.
- Houd de volgende instrumenten en plasticware gereed voordat u aan deze procedure begint:
- Voor de dierpreparatie, houd het volgende gereed: 2 paren stompe pincetten, 1 paar chirurgische scharen, 2 petrischalen (10 cm), meerdere petrischalen (6 cm; naar behoefte, één per kop).
- Voor het isoleren van de hersenen, houd het volgende gereed: 1 paar #5 pincetten, 1 paar #55 pincetten, 1 paar microdissectiescharen en verzamelbuisjes/schalen die geschikt zijn voor de downstream toepassing.
- OPMERKING: Als de downstream toepassing in situ hybridisatie of ruimtelijke transcriptomica omvat, maak de dissectie-instrumenten dan vóór gebruik schoon met RNase-decontaminatieoplossing.
2. Voorbereiding van de dieren
- Volg stappen (2.1.1– 2.1.6) voor dieren E14.5–P0
- Euthanaseer de drachtige moederdier in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutionele Commissie voor Dierethiek. In het getoonde voorbeeld werd het moederdier geëuthanaseerd door middel van cervicale dislocatie.
- Maak een midline incisie in de buikholte van het drachtige moederdier om de baarmoeder bloot te leggen. Trek de uterine hoorns voorzichtig uit met stompe pincetten en plaats deze in een steriele schaal van 10 cm met ijskoud 1× PBS.
- Isoleer de individuele foetussen zorgvuldig door ze te scheiden van de omringende vruchtzak en placenta.
- Verplaats de foetussen naar een schone petrischaal van 10 cm met ijskoud 1× PBS en houd ze op ijs tot ze een voor een worden genomen voor de isolatie van de hersenen. Verplaats één foetus naar een petrischaal van 6 cm met ijskoud PBS.
- Voor postnatale stadia tot P7: euthanaseer de pup in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutionele Commissie voor Dierethiek. Ga vervolgens verder vanaf stap 2.1.6.
- Scheid de kop van het lichaam met een chirurgische schaar, zodanig dat de rhombencephalon in de kop is opgenomen om de telencephalon te beschermen tegen onbedoelde beschadiging.
- Was de kop met koud PBS om het bloed te verwijderen. Verplaats deze naar een schone petrischaal van 6 cm met ijskoud 1× PBS. Houd de kop ondergedompeld in het PBS zodat bloed en debris tijdens de daaropvolgende dissectiestappen worden weggespoeld.
3. Dissectieprocedure om de hersenen met een intacte pijnappelklier te isoleren
OPMERKING: Alle onderstaande stappen moeten worden uitgevoerd met een dissectiemicroscoop. Stel de vergroting in op ten minste 2× (of naar behoefte) om de hersenen en de omliggende structuren gedurende de gehele dissectie duidelijk te kunnen visualiseren. Het volledige dissectieproces moet worden uitgevoerd in ijskoud PBS om degradatie van RNA en eiwitten te minimaliseren. Gebruik bij stappen 3.1–3.10 de niet-dominante hand om de kop stevig vast te houden en te stabiliseren gedurende de procedure, conform de instructies in stap 3.1. Stappen 3.2–3.9 worden uitgevoerd terwijl de niet-dominante hand de kop stabiliseert en de dominante hand wordt gebruikt voor de fijne motoriek, beginnend met een #5 pincet en vervolgens overschakelend naar een #55 pincet of microdissectieschaar zoals gespecificeerd per stap.
- Gebruik een #5 pincet in de niet-dominante hand. Voeg de twee pootjes in de oogkassen door middel van een krachtige neerwaartse beweging. Handhaaf de neerwaartse druk om de hersenen tegen de bodem van de petrischaal te fixeren totdat stap 3.9 is voltooid.
OPMERKING: De hersenen bevinden zich boven de oogkassen en worden niet beïnvloed door het inbrengen van de pincetten in de oogkassen. Het handhaven van een constante neerwaartse druk stabiliseert de hersenen gedurende de gehele dissectie. - Knijp met de dominante hand de huid die de kop bedekt af en verwijder deze met een #5 pincet.
OPMERKING: In dit stadium is te zien dat het gladde chondrocranium de hersenen bedekt. - Verwijder het deel van het chondrocranium dat boven het midden- en achterbrein ligt als volgt:
- Gebruik de pincet #5 om twee penetrerende incisies in het chondrocranium te maken aan weerszijden van het middenhersenen, precies op de plek waar deze aansluiten op het telencephalon.
- Schuif één tak van de #5 pincet tangentieel onder het chondrocranium langs de denkbeeldige tangentiale lijn die het telencephalon van het middenbrein scheidt. Grijp stevig vast en scheur het chondrocranium open.
- Verwijder het chondrocranium verder totdat de middenhersenen en de achterhersenen zijn blootgelegd.
- Schakel over naar #55 pincetten. Steek één punt net onder de rand van de caudale marge van het chondrocranium dat over het telencephalon ligt. Scheid het chondrocranium voorzichtig door alle verbindingen met vasculaire en meningeale weefsels los te maken.
- Snij met een microdissectieschaar langs de dorsale telencefalische middenlijn in de richting van de bulbus olfactorius. Verwijder met een gesloten #55 pincet voorzichtig alle aanhechtingen van het chondrocranium aan de hersenen. Scheid de twee helften van het chondrocranium die de telencefalische hemisferen bedekken met behulp van de #5 pincet.
OPMERKING: In dit stadium is de SSS zichtbaar als een donkerrode ader langs de superieure rand van het chondrocranium in de hersenen, en is de TS loodrecht op de SSS zichtbaar. - De pijnappelklier bevindt zich direct onder de SSS. Maak met een microdissectieschaar een inkeping aan het rostrale uiteinde van de SSS.
- Verwijder met een #55 pincet het dorsale deel van het chondrocranium aan beide zijden volledig om de pijnappelklier, de SSS en de TS beter bloot te leggen.
- Maak met een microdissectieschaar twee sneden in de TS aan weerszijden van de pijnappelklier. Ontkoppel met een #55 pincet de laterale aanhechtingen van de TS.
- Verplaats voorzichtig het rostrale gedeelte van de hersenen uit het ventrale schedeldak met een gesloten #5 pincet. Schuif het gesloten pincet onder de ventrale zijde van de hersenen om deze volledig los te maken.
- Bewaar de hersenen met de epifyse intact, zoals geschikt voor verdere downstream-toepassingen.
4. Kritische stappen in het protocol
OPMERKING: Het succes van dit dissectieprotocol hangt af van een zorgvuldige behandeling van de vasculaire aanhechtingen rondom de pijnappelklier. De volgende punten zijn cruciaal om de pijnappelklier tijdens de gehele dissectieprocedure intact te houden:
- Stabiliseer de kop door de tanden van een #5 pincet in beide oogkassen te plaatsen en houd gedurende stappen 3.1–3.9 een stevige neerwaartse druk vast. Dit biedt een stabiele ondersteuning terwijl directe druk op de hersenen wordt vermeden.
- Vermijd bij het verwijderen van het chondrocranium (stap 3.3) overmatig trekken of pellen, aangezien dit kan leiden tot het losraken van de pijnappelklier van het dorsale diencephalon.
- Gebruik bij het vrijmaken van de meningeale en vasculaire aanhechtingen (stap 3.4) en bij het openen van het dorsale telencefalische chondrocranium (stap 3.5) uitsluitend de punten van het #55 pincet. Diepe penetratie van het pincet kan de pijnappelklier beschadigen, die zich direct onder het caudale telencefalische dak bevindt.
- Voltooi de doorsnijding van de sinus sagittalis superior (stap 3.6) en de bilaterale doorsnijding van de sinus transversus (stap 3.8) voordat de hersenen worden verwijderd. Deze incisies verminderen de spanning in het dorsale veneuze netwerk en voorkomen afscheuring van de pijnappelklier tijdens het verwijderen van de hersenen.
- Verplaats in stap 3.9 de hersenen voorzichtig met een gesloten pincet, zonder de dorsale middellijn te verstoren. De hersenen moeten vrij loskomen van het schedeldak zodra alle meningeale en vasculaire aanhechtingen zijn losgelaten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit dissectieprotocol maakt een consistente isolatie mogelijk van embryonale en vroege postnatale muizenhersenen van E16.5–P7, waarbij de pijnappelklier behouden blijft in zijn oorspronkelijke anatomische positie (Figuur 1).
Stapsgewijze verwijdering van het chondrocranium, gecombineerd met zorgvuldige vrijmaking van de meningeale en vasculaire aanhechtingen, voorkomt onbedoelde afschuifspanning op de pijnappelklier. Bovendien zorgt het gecontroleerd doorsnijden v...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Gestandaardiseerde methoden voor de dissectie van de pijnappelklier zijn ontwikkeld voor het menselijke foetale/infante brein, wat forensisch pathologen helpt bij het begrijpen van de oorzaak van het plotselinge infantedoodsyndroom11. Eerdere protocollen toonden de verwijdering van de pijnappelklier samen met oppervlakkige vasculatuur, hersenvliezen en de plexus choroidea aan12; er zijn echter geen methoden beschreven om betrouwbaar een intacte pijnappelklier te behouden di...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Alle auteurs verklaren dat er geen concurrerende belangen zijn.
Dankbetuigingen
Wij danken Dr. Shital Suryavanshi en het personeel van de dierhouderij van het Tata Institute of Fundamental Research voor hun uitstekende ondersteuning. Wij danken Dr. Sundar Naganathan voor het genereus toestaan van het gebruik van de Olympus MVX10 stereo macro zoom microscoop in zijn laboratorium voor het opnemen van de video van de procedure. Dit werk werd gefinancierd door een beurs van het Department of Atomic Energy (DAE), Government of India, Project Identification No. RTI4003 en RTI4015 (ST); ICMR-DHR SUG-beurs, GAP00303, ANRF PMECRG-beurs GAP00313 (AP).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Brightfield microscoop | Olympus | IX73 | Elke brightfield microscoop met een kleurencamera is geschikt. |
| Confocale microscoop | Olympus | FV3000 | Afhankelijk van de vereiste resolutie is elke confocale microscoop of epifluorescentiemicroscoop geschikt |
| CRX antilichaam | Invitrogen | PA5-32182 | Immunokleuringsprotocol beschreven in Parichha et al.9. |
| CRX probe | Custom made | Custom made | In situ hybridisatieprotocol Parichha et al.10. |
| Fijne pincet # 5 | F.S.T | 11251-23 | Kan worden vervangen door vergelijkbare instrumenten van elke fabrikant. |
| Fijne pincet # 55 | F.S.T | 11255-20 | Kan worden vervangen door vergelijkbare instrumenten van elke fabrikant. |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | Kan worden vervangen door vergelijkbare producten van elke fabrikant. |
| Petrischaal | Corning | CLS351029 | Kan worden vervangen door vergelijkbare producten van elke fabrikant. |
| RNaseZap | Invitrogen | AM9782 | RNaseZap RNase Decontaminatie Oplossing is een oppervlakte-decontaminatie-oplossing die RNases bij contact vernietigt |
| Veerschaar (microdissectieschaar) | F.S.T | 15020-15 | Kan worden vervangen door vergelijkbare instrumenten van elke fabrikant. |
| Stereozoommicroscoop | Nikon | SMZ745 | Elke dissectiemicroscoop is geschikt |
Referenties
- Nakahara D, Nakamura M, Iigo M, Okamura H. Bimodal circadian secretion of melatonin from the pineal gland in a living CBA mouse. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003;100(16):9584-9.
- Christ E, Pfeffer M, Korf HW, von Gall C. Pineal melatonin synthesis is altered in Period1-deficient mice. Neuroscience. 2010;171(2):398-406.
- Rath MF. Homeobox gene-encoded transcription factors in development and mature circadian function of the rodent pineal gland. J Pineal Res. 2024;76(3):e12950.
- Rath MF, Rohde K, Klein DC, Møller M. Homeobox genes in the rodent pineal gland: roles in development and phenotype maintenance. Neurochem Res. 2013;38(6):1100-12.
- Estivill-Torrús G, Vitalis T, Fernández-Llebrez P, Price DJ. The transcription factor Pax6 is required for development of the diencephalic dorsal midline secretory radial glia that form the subcommissural organ. Eur J Neurosci. 2001;14(6):1011-22.
- Dias M, et al. Transection of the superior sagittal sinus enables bilateral access to the rodent midline brain structures. eNeuro. 2021;8(4):ENEURO.0146-21.2021.
- Matsunaga MM, et al. Morphologic analysis of mice's pineal gland. J Morphol Sci. 2011;28(3):157-60.
- Boeckmann D. Morphological investigation of the deep pineal of the rat. Cell Tissue Res. 1980;210(2):283-94.
- Parichha A, et al. Constitutive activation of canonical Wnt signaling disrupts choroid plexus epithelial fate. Nat Commun. 2022;13:633.
- Parichha A, et al. Dentate gyrus morphogenesis is regulated by β-catenin function in hem-derived fimbrial glia. Development. 2022;149(21):dev200953.
- Sparks DL, Coyne CM, Sparks LM, Hunsaker JC 3rd. Recommended technique for brain removal to retain anatomic integrity of the pineal gland in order to determine its size in sudden infant death syndrome. J Forensic Sci. 1997;42(1):100-2.
- Bowyer JF, et al. A visual description of the dissection of the cerebral surface vasculature and associated meninges and the choroid plexus from rat brain. J Vis Exp. 2012;69:e4285.
- Calvo J, Boya J. Embryonic development of the rat pineal gland. Anat Rec. 1981;200(4):491-500.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
