Deze studie beschrijft een in vitro-model om de beschermende effecten van Sanqi Baiji San te evalueren tegen ethanol-geïnduceerde gastric epitheliale celbeschadiging en de betrokkenheid ervan bij PI3K/AKT-gerelateerde signalering.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Onderzoeksartikel
Deze studie beschrijft een in vitro-model om de beschermende effecten van Sanqi Baiji San te evalueren tegen ethanol-geïnduceerde gastric epitheliale celbeschadiging en de betrokkenheid ervan bij PI3K/AKT-gerelateerde signalering.
Dit werk was bedoeld om het beschermende mechanisme van Sanqi Baiji San (SQBJ) tegen ethanol-geïnduceerde gastric epitheliale celbeschadiging te verduidelijken en de mogelijke relevantie ervan voor maagzweer (GU) te onderzoeken. Netwerkfarmacologie werd gebruikt om de actieve componenten van SQBJ te screenen (Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform [TCMSP], Oral Bioavailability [OB] ≥ 20%, Drug-Likeness [DL] ≥ 0,1), hun doelen in kaart te brengen (Universal Protein Resource [UniProt]), GU-gerelateerde doelen te verzamelen (GeneCards/OMIM/DrugBank) en overlappende doelen te analyseren via Gene Ontology (GO)/Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) verrijking en moleculaire koppeling. Ethanolbeschadigde gastrische epitheliale cellijn-1 (GES-1) cellen werden behandeld met SQBJ of de PI3K-remmer LY294002. CCK-8 werd gebruikt om de optimale SQBJ-concentratie te bepalen. Netwerkfarmacologieanalyses identificeerden 126 gemeenschappelijke doelwitten die verrijkt zijn binnen PI3K/AKT/MAPK-gerelateerde cascades en suggereerden mogelijke interacties tussen de belangrijkste SQBJ-bestanddelen en PI3K/AKT-gerelateerde eiwitten. In ethanol-uitgedaagde cellen verlichtte SQBJ celbeschadiging door de afgifte van ontstekingsmediatoren en oxidatieve stress te verminderen, zoals blijkt uit lagere intracellulaire reactieve zuurstofsoorten en malondialdehydeniveaus. SQBJ herstelde het mitochondriale membraanpotentiaal en het ATP-gehalte en verminderde apoptose-geassocieerde veranderingen in B-cel lymfoom-2, gespleten caspase-3 en Bcl-2-geassocieerde X-eiwitniveaus. SQBJ moduleerde ook PI3K/AKT- en MAPK-geassocieerde signaleringsmarkers. Deze beschermende effecten werden grotendeels verzwakt door LY294002, wat suggereert dat PI3K/AKT-gerelateerde signalering betrokken is bij SQBJ-gemedieerde cytoprotectie. Deze bevindingen bieden een in vitro mechanistische basis voor de mogelijke toepassing van SQBJ in GU, hoewel verdere validatie in diermodellen van ethanol-geïnduceerde maagzweer vereist is.
Gastrische ulcus (GU) is wereldwijd een zeer voorkomende gastro-intestinale aandoening, gekenmerkt door lokale ontsteking, erosie en ulceratie van het maagslijmvlies. Volgens schattingen uit de Global Burden of Disease (GBD 2021)-analyse van 2021 blijft maagzweer (PUD) wereldwijd een aanzienlijke klinische en economische last leggen voor miljoenen patiënten. Hoewel de algemene prevalentie van PUD is afgenomen door de wijdverspreide en uitgebreide klinische afhankelijkheid van anti-infectieve regimes en zuuronderdrukkende protonpompremmers (PPI's), is deze neerwaartse trend gestabiliseerd, met zelfs een herstel waargenomen in sommige regio's1. Opmerkelijk is dat alcoholgebruik (ethanol) een cruciale pathogene factor is, onafhankelijk van Helicobacter pylori (H. pylori.) infectie en het gebruik van niet-steroïde ontstekingsremmende middelen (NSAID). Langdurig overmatig alcoholgebruik beschadigt de maagslijmvliesbarrière, versnelt de ontwikkeling van zweren en verhoogt zelfs de vatbaarheid voor maagkankers—waardoor deze aandoening een kritieke internationale gezondheidscrisiswordt. In ontwikkelingslanden neemt het incidentie van alcoholgerelateerde maagslijmvliesbeschadigingen toe door meerdere factoren, waaronder een toename van alcoholgebruik en veranderingen in levensstijl, wat een dringende behoefte creëert aan effectieve en veilige preventie- en behandelingsstrategieën.
Het pathologische mechanisme achter ethanol-geïnduceerde maagslijmvliesbeschadiging is multifactorieel en gelaagd. Bij direct contact met het maagslijmvlies verstoort ethanol snel de slijm-bicarbonaatbarrière en veroorzaakt een ongecontroleerde piek van intracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS). Deze oxidatieve uitbarsting veroorzaakt vervolgens lipideperoxidatie (gekenmerkt door verhoogde malondialdehyde, MDA), put endogene antioxidanten in het maagslijmvlies uit, waaronder superoxidedismutase (SOD), samen met glutathion (GSH), en induceert uiteindelijk mitochondriale disfunctie3. Steeds meer bewijs wijst erop dat intracellulaire ROS geïnduceerd door ethanol voornamelijk afkomstig is van mitochondriën en nauw samenhangt met het instorten van het binnenste mitochondriale membraanpotentiaal (Δψm) en de remming van adenosinetrifosfaat (ATP) synthese4. Ondertussen activeert oxidatieve stress verder de pro-inflammatoire cascades onder leiding van nucleaire factor-kappa B (NF-κB). Deze activatie bevordert vervolgens de massale afgifte van ontstekingsmediatoren, voornamelijk tumornecrosefactor-α (TNF-α), interleukine-6 (IL-6) en C-reactief eiwit (CRP), waardoor een vicieuze cirkel van "oxidatieve stress-inflammatoire respons" ontstaat. Op deze basis wordt de intrinsieke apoptotische cascade veroorzaakt door mitochondriën getriggerd, zoals blijkt uit een verstoorde verhouding van Bcl-2 tot Bax naast de sequentiële enzymatische proteolytische splitsing van cysteinylaspartaat-specifieke protease 3 (Caspase-3), wat uiteindelijk leidt tot massale dood van maagslijmvlieze en ulcusvorming6. Daarom vormt gelijktijdige targeting van de drie kernpathologische verbindingen oxidatieve stress, ontstekingsrespons en apoptose een belangrijke strategie voor de effectieve interventie van alcoholische maagslijmvliesbeschadiging.
De phosphoinositide 3-kinase/eiwitkinase B (PI3K/AKT) signaalroute vormt een centrale regulerende as die de cellange levensduur, proliferatie en geprogrammeerde dood reguleert, en een essentiële rol vervult in het behoud van de gastric mucosale homeostase. Na activatie fosforyleert PI3K/AKT-signaal meerdere downstream-substraten, remt de activiteit van de pro-apoptotische factor Bad, waardoor het mitochondriale ontsnappen van celdestructief cytochroom C wordt belemmerd, de ΔΨm-homeostase wordt gehandhaafd en celoverleving7 wordt bevorderd. Bovendien is er een complexe antagonistische crosstalk tussen de PI3K/AKT cascade en mitogeen-geactiveerde eiwitkinase (MAPK) netwerken: de upregulatie van PI3K/AKT kan ontstekingssignaaltransductie en apoptotische cascade-reacties verzwakken door de activatie van stresskinasen te remmen, waaronder p38, c-Jun N-terminale kinase (JNK) en extracellulaire gereguleerde proteïnekinasen (ERK)8. Meerdere studies hebben aangetoond dat verminderde activiteit van de PI3K/AKT-route nauw samenhangt met verergerde ontsteking en verhoogde apoptose in maagslijmvliesbeschadigingsmodellen, terwijl herstel van de activiteit van deze route mucosale schade9 aanzienlijk kan verzachten. Er is echter momenteel een gebrek aan systematische causale experimentele verificatie met betrekking tot het precieze regulatiemechanisme van PI3K/AKT bij ethanol-geïnduceerde maagslijmvliesbeschadiging, met name de synergetische relatie met de MAPK-route.
Wat betreft moderne farmacotherapie zijn PPI's de eerste optie voor het klinische beheer van GU, maar hun langdurige toediening heeft steeds meer zorgen over de veiligheid veroorzaakt. Verzamelende studies hebben chronisch PPI-gebruik in verband gebracht met diverse bijdelige uitkomsten, waaronder nierziekten, hart- en vaatziekten, osteoporotische fracturen, voedingstekorten (ijzer, magnesium en vitamine B12), Clostridioides difficile-infectie en zelfs een verhoogd risico op maagkanker10. Bovendien is het fenomeen van terugkerende maagzuurhypersecretie na het stoppen met PPI bevestigd door grootschalige farmacovigilantiegegevens11. Deze veiligheidsrisico's hebben zowel klinische als fundamentele onderzoeksgemeenschappen ertoe aangezet actief alternatieve therapieën te onderzoeken met multi-target beschermingsmechanismen, minimale bijwerkingen en geschiktheid voor langdurig gebruik. In het bijzonder hebben natuurlijke preparaten uit de traditionele Chinese geneeskunde (TCM) veel aandacht gekregen vanwege hun holistische therapeutische concept van "multi-component, multi-target en multi-pathway" actie12.
Sanqi Baiji-poeder (SQBJ) is een klassieke TCM-samengestelde formule die bestaat uit Panax notoginseng en Bletilla striata met een massaverhouding van 1:1. Panax notoginseng staat bekend om zijn effecten van het bevorderen van de bloedcirculatie en het stoppen van bloedingen, evenals het verlichten van pijnlijke zwelling. De belangrijkste bioactieve bestanddelen, waaronder notoginsenoside R1 samen met ginsenosiden (Rg1, Rb1), hebben aanzienlijke ontstekingsremmende, antioxidanten en mucosa-herstellende effecten. Bletilla striata wordt gekenmerkt door zijn samentrekkende effecten die het bloeden stoppen, zwelling verminderen en de regeneratie van beschadigd weefsel bevorderen. Tegelijkertijd heeft Bletilla striata polysaccharide (BSP), dat dient als het primaire actieve extract, effectiviteit aangetoond bij het onderdrukken van de JNK/p38 MAPK-cascade, waardoor de expressie van interleukine-1β (IL-1β), TNF-α en IL-6 afneemt en de antioxidante verdedigingscapaciteit van het maagslijmvlies13 wordt versterkt. Verzameld literatuurbewijs heeft bevestigd dat co-toediening van Panax notoginseng. saponines (PNS) en BSP een synergetisch effect heeft in alcoholische maagzweermodellen14, en SQBJ-gerelateerde preparaten hebben significante mucosale beschermende effecten laten zien in preklinische studies van reflux-oesofagitis en maagzweer15. Er is echter momenteel geen systematische in vitro experimentele verificatie van het signaalwegmechanisme dat ten grondslag ligt aan het maagslijmvliesbeschermingseffect van SQBJ, met name de kernrol van de PI3K/AKT-route en de regulatorische relatie met MAPK. Ondertussen is de oorzakelijke relatie tussen de cruciale bestanddelen en functionele receptoren van SQBJ nog niet volledig opgehelderd.
Om deze hiaten aan te pakken, hanteerde de huidige studie een geïntegreerde onderzoeksstrategie die netwerkfarmacologie combineert en in vitro experimentele verificatie, waarbij de ethanol-uitgedaagde GES-1 cellijn wordt gebruikt als experimenteel platform om het potentiële moleculaire mechanisme ten grondslag te onderzoeken van de maagepitheliale beschermingseffecten van SQBJ, met nadruk op oxidatieve stress, ontstekingsreacties, apoptotische processen, PI3K/AKT-gerelateerde signalering. en MAPK-gerelateerde wijzigingen. Eerst gebruikten we de PI3K-inhibitor LY294002 om voorlopig de betrokkenheid van PI3K/AKT-signalering te evalueren en ontdekten we dat het remmen van deze route het beschermende effect van SQBJ verminderde, wat suggereert dat PI3K/AKT-gerelateerde signalering bijdraagt aan SQBJ-gemedieerde cytoprotectie. Ten tweede onderzochten we de associatie tussen PI3K/AKT-gerelateerde veranderingen en regulatie van de MAPK-route, waarbij we voorlopig bewijs leverden dat veranderingen in de MAPK-signalering mogelijk verband houden met SQBJ-modulatie van de functionele respons van de PI3K/AKT-as. Gezamenlijk stelt dit werk een invitro moleculair kader vast om te evalueren hoe SQBJ ethanol-geïnduceerde maagepitelbeschadiging vermindert en levert het voorlopig bewijs voor verder onderzoek naar TCM-verbindingen bij alcoholische maagslijmvliesbeschadiging. Dierproeven zijn echter nog steeds nodig om te bevestigen of deze cellulaire beschermende effecten kunnen worden vertaald naar in vivo. therapeutische effectiviteit binnen experimentele modellen van door alcohol veroorzaakte maagzweer (Aanvullende Figuur S1).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Deze studie betrof geen menselijke deelnemers, menselijke weefselmonsters, klinische monsters of dierproeven. Publiek beschikbare en geanonimiseerde databasebronnen werden gebruikt voor netwerkfarmacologische analyses, en commercieel verkrijgbare GES-1-cellen werden gebruikt voor in vitro experimenten. Daarom waren formele ethische goedkeuring en geïnformeerde toestemming niet vereist. Gedetailleerde informatie over de belangrijkste reagentia, antilichamen, assaykits, instrumenten, fabrikanten, catalogusnummers en Research Resource Identifiers (RRIDs), waar van toepassing, wordt samengevat in de Materiaaltabel.
Bereiding en kwaliteitscontrole van SQBJ waterig extract
Kruidenmaterialen
De grondstoffen van Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen (wortel en wortel) en Bletilla striata.(Thunb. ex A. Murray) Rchb. f. (knol) werden verkregen van een commerciële leverancier van traditionele Chinese geneeskunde en vervolgens geauthenticeerd door een senior TCM-apotheker na de Chinese Farmacopee (editie 2025). Voucherspecimens (Nr. SQBJ-20240301, nr. PN-20240301, nr. BS-20240301) zijn gedeponeerd in het herbarium van onze instelling. De twee kruiden werden geplet en gemengd in een massaverhouding van 1:1 om SQBJ-poeder te maken.
Bereiding van SQBJ waterig extract
SQBJ-poeder onderging twee opeenvolgende refluxextracties met gedeïoniseerd water in een vaste vloeistofverhouding van 1:10 (g/mL) gedurende 1 uur per sessie. Daarna werden de verzamelde extracten gecombineerd en door vier lagen medisch gaas gehaald om restmateriaal te verwijderen. Het resulterende filtraat werd onder verminderde druk bij 60 °C geconcentreerd tot een relatieve dichtheid van 1,05–1,10, gevolgd door vacuüm vriesdrogen om SQBJ waterextractpoeder te verkrijgen, met een uiteindelijke extractopbrengst van 18,2% ± 0,6%. Het extractpoeder werd verzegeld en opgeslagen bij −20 °C, opgelost in serumvrij DMEM-medium, en vervolgens door een membraanfilter van 0,22 μm geleid voor sterilisatie voorafgaand aan celexperimenten.
Kwaliteitscontrole van SQBJ waterig extract
Om de consistentie van batch tot batch en standaardisatie van het SQBJ-waterextract te evalueren, voerden we kwantitatieve bepaling uit naast high-performance liquid chromatography (HPLC) vingerafdrukprofilering. De Materiaaltabel vermeldt de uitgebreide technische parameters met betrekking tot het HPLC-systeem. Op basis van de chemische profielen van beide bestanddelen van de kruiden richtten we ons op vier representatieve markers: notoginsenoside R1, ginsenoside Rg1, ginsenoside Rb1 en militarine. Deze op HPLC gebaseerde kwaliteitscontrolestrategie weerspiegelde echter voornamelijk verschillende representatieve componenten en bood geen volledig chemisch profiel van alle actieve stoffen in SQBJ.
Chromatografische scheiding werd bereikt via een omgekeerde fase C18-kolom (4,6 mm × 250 mm, 5 μm). De werking werd gehandhaafd op een kolomtemperatuur van 30 °C, met een debiet van 1,0 mL/min, een injectievolume van 10 μL en een detectiegolflengte van 203 nm. De samenstelling van de mobiele fase bestond uit acetonitril (A) en 0,1% fosforzuur waterige oplossing (B), waarbij de volgende gradiënt-elusie werd gebruikt: 0–15 min, 19% A; 15–35 min, 19%–35% A; 35–55 min, 35%–55% A; en 55–60 min, 55%–19% A. Gedetailleerde instrument- en kolominformatie is te vinden in de Materiaaltabel.
Referentiestofbereiding
Om kwantitatieve analyses uit te voeren, hebben we commerciële standaarden aangeschaft voor notoginsenoside R1, ginsenoside Rg1, ginsenoside Rb1 en militarine, allemaal met zuiverheid ≥ 98%. De afzonderlijke referentiechemicaliën werden nauwkeurig gemeten en opgelost in één enkele methanolvoorraad om een uniforme gemengde referentieoplossing te bereiken met een eindconcentratie van 50 μg/mL per component.
Monstervoorbereiding:
SQBJ waterig extract droog poeder (50 mg) werd nauwkeurig gemeten, gevolgd door oplossing met 25 mL analytisch methanol. Dit mengsel onderging een ultrasone badbehandeling gedurende 30 minuten onder gecontroleerde instrumentatieparameters (vermogen: 250 W; frequentie: 40 kHz). Na het terugbrengen van evenwicht naar de kamertemperatuur werd de vloeistof door een organisch filtermembraan van 0,22 μm geleid om de uiteindelijke analytische testoplossing te verkrijgen.
Resultaten van inhoudsbepaling:
De gemiddelde inhoud van kernkarakteristieke componenten in drie opeenvolgende batches van SQBJ waterextract was als volgt: notoginsenoside R1 3,12 ± 0,11 mg/g, ginsenoside Rg1 8,45 ± 0,23 mg/g, ginsenoside Rb1 5,26 ± 0,18 mg/g, en militarine 2,78 ± 0,09 mg/g, waarbij de RSD van elk component 5% tussen batches <, wat de consistentie van het extract per batch bevestigt.
Ethiek- en nalevingsverklaring
Noch dierproeven, noch de opname van menselijke klinische monsters, weefselbiopten en levende proefpersonen waren gedurende deze studie betrokken. De netwerkfarmacologische analyse werd uitgevoerd met behulp van publiek beschikbare databases, waaronder TCMSP, UniProt, GeneCards, OMIM, DrugBank, STRING, Metascape, PubChem en RCSB PDB. Alle gegevens die uit deze databases werden gehaald, waren openbaar toegankelijk en geanonimiseerd; daarom was de bio-informaticaprofilering volledig vrijgesteld van het verplicht stellen van formele geïnformeerde toestemming of aanvullende ethische controle.
De huidige in vitro-experimenten werden uitgevoerd met de commercieel verkrijgbare menselijke maagslijmvlies-epitheelcellijn GES-1. Er werden geen primaire menselijke cellen of door patiënten afgeleide biologische materialen gebruikt. De cellijn werd verkregen uit een geauthenticeerd celarchief en behandeld volgens institutionele richtlijnen voor bioveiligheid en celkweek. Omdat deze studie alleen bestaande cellijnen en openbaar beschikbare databases betrof, was deze vrijgesteld van formele goedkeuring door de institutionele ethische commissie. Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante institutionele laboratoriumveiligheids- en onderzoeksnalevingseisen.
Netwerkfarmacologiestudies
Identificatie en screening van doelwitten van actieve bestanddelen
De actieve bestanddelen van Panax notoginseng en Bletilla striata., de twee bestanddelen van SQBJ, zijn opgehaald uit openbaar beschikbare databases. Alle database-afgeleide informatie die in deze studie werd gebruikt, was openbaar toegankelijk en bevatte geen identificeerbare persoonlijke informatie. Met botanische namen als zoekopdrachten identificeerden we kandidaat-fytochemicaliën uit de Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP). Om geschikte bioactieve moleculen te identificeren, paste het screeningsprotocol drempels van orale biobeschikbaarheid (OB) ≥ 20% en geneesmiddelgelijkheid (DL) ≥ 0,1 toe. Vervolgens identificeerden we de potentiële downstream gendoelen die geassocieerd zijn met deze kandidaatcomponenten, waarbij we alle bestanddelen zonder gematchte valide gendoelen uitsloten. Alle doelgenen werden geannoteerd en gestandaardiseerd via de Universal Protein Resource (UniProt), waarbij de zoekopdracht in de referentiedatabase uitsluitend werd beperkt tot Homo sapiens, waardoor de definitieve doelgenenlijst voor de functionele SQBJ-actieve componenten werd gegenereerd.
Terugvinden van pathologie-gerelateerde doelen
Om genen die aan de aandoening zijn gekoppeld te verzamelen, hebben we drie openbare databases doorzocht: GeneCards, Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) en DrugBank, met "maagzweer" als zoekterm. De cross-platform dataset werd vervolgens samengevoegd, gevolgd door het elimineren van redundante vermeldingen om een gestandaardiseerde lijst van gastric ulcus-geassocieerde doelgenen op te stellen.
Netwerkconstructie voor ingrediënten, doelwitten en ziekten
We bepaalden de overlappende doelgenen tussen de actieve componenten van SQBJ en de maagzweer. Vervolgens werd een multi-layer interactienetwerk opgebouwd met behulp van netwerkvisualisatiesoftware. Om het belang van knooppunten te evalueren, berekende het geïntegreerde topologische evaluatie-algoritme de topologische parameters van elke knoop, inclusief graad- en tussenheidscentraliteit. Op basis van deze berekende waarden identificeerden we de actieve componenten en belangrijke functionele doelen van SQBJ bij de behandeling van maagzweer.
Mapping van eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerken
De geïdentificeerde consensusdoelen die gedeeld werden tussen SQBJ en maagzweer zijn vergeleken met de STRING-database. Onze zoekopdracht specificeerde het multi-eiwit analysesjabloon terwijl de analytische achtergrond werd beperkt tot Homo sapiens. PPI's werden gefilterd met een minimale interactiebetrouwbaarheidsdrempel van gemiddelde betrouwbaarheid (> 0,4).
De resulterende functionele connectiviteitsrecords werden geëxporteerd als een TSV-bestand, dat vervolgens werd geïntegreerd in speciale netwerkvisualisatiesoftware voor PPI-analyse. Op basis van de berekende verbindingstopografie evalueerden we de kernfunctionele knooppunten in het netwerk door de specifieke graadwaarde van elke knoop te rangschikken.
Downstream functionele annotatie en padmapping
Om de biologische rollen van de gedeelde snijknopen te verduidelijken, voerden we Gene Ontology (GO) functionele verrijkingsanalyse en Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) padverrijkingsanalyse uit met behulp van een webtoegankelijke bio-informatische annotatietool. De functionele classificatie categoriseert genen in drie klassieke categorieën: biologisch proces (BP), cellulaire component (CC) en moleculaire functie (MF). Bubbeldiagrammen en staafdiagrammen voor verrijkingsresultaten werden gegenereerd met behulp van een online bio-informatica-plotplatform om de primaire biologische processen en signaalroutes in kaart te brengen die geassocieerd zijn met het therapeutische effect van SQBJ op maagzweer.
Computationele moleculaire dockingsimulatie
De ruimtelijke geometriebestanden van de kerncomponenten van SQBJ werden gedownload uit openbare compounddatabases en vervolgens opgeslagen als MOL2-bestanden met behulp van bestandsverwerkingssoftware. We verkregen ook de driedimensionale kristalstructuren van de kern-doeleiwitten door de Protein Data Bank te raadplegen. Deze macromoleculaire structuren werden voorbewerkt door het verwijderen van oorspronkelijke liganden en watermoleculen, en de resulterende schone modellen werden opgeslagen in PDB-formaat. Om receptor-ligandbindende energetica te simuleren, werd de dockingverificatie met kerncomponenten en doeleiwitten uitgevoerd via standaard computationele moleculaire dockingsoftware. De dockingresultaten werden geoptimaliseerd en weergegeven met moleculaire visualisatiesoftware.
Celkweek
GES-1 mensafgeleide maagepitelcellen werden gekweekt met behulp van RPMI-1640 medium, geïntegreerd met 10% foetaal rundserum en 1% penicilline–streptomycine bij 37 °C onder een bevochtigde atmosfeer met 5% CO₂. We identificeerden de broncultuur als een gevestigde cellijn, waarbij we de initiële voorraad verkregen uit een geauthenticeerde celopslag. Bij een waargenomen confluentie van 80–90% werden de monolagen 2x afgespoeld met PBS, gevolgd door detachering met 0,25% trypsine-EDTA gedurende 2 minuten bij 37 °C. Om de enzymatische splijtingsreactie te beëindigen, brachten we een gelijk volume van volledig medium in. De resulterende cellulaire suspensie werd 5 minuten gecentrifugeerd op 1.000 × g, waarna de pellet werd opnieuw opgehangen in een vers, volledig medium en opnieuw werd ingezaaid met de juiste dichtheid. De kweek werd teruggebracht naar identieke broedomstandigheden. Gedurende de voortplantingsperiode werd een omgekeerde fasecontrastmicroscoop gebruikt om de levensvatbaarheid, morfologie en groeistatus van cellen te beoordelen, en cellen in hun logaritmische groeifase werden routinematig verzameld voor downstream-analyses.
Vestiging en behandeling van het ethanol-geïnduceerde GES-1 celbeschadigingsmodel
Logaritmisch-fase GES-1-cellen werden gezaaid bij 5 × 10 5-cellen per put in 6-wellplaten of 1 × 10 4-cellen/put in 96-well platen en 's nachts geïncubeerd om te hechten. Door ethanol veroorzaakte schade werd vastgesteld door cellen 4 uur lang bloot te stellen aan 500 mmol/L ethanol in niet-aangevuld RPMI-1640. Deze aandoening werd geselecteerd op basis van voorlopige concentratie- en tijdsrespons-experimenten. In de voorlopige assay veroorzaakte 250 mmol/L ethanol gedurende 4 uur slechts milde schade, waarbij de cellevensvatbaarheid bleef op ongeveer 78,6 ± 5,4%, terwijl 750 mmol/L ethanol de levensvatbaarheid verlaagde tot 32,8 ± 4,7%, wat wijst op overmatige cytotoxiciteit. Blootstelling aan 500 mmol/L ethanol gedurende 4 uur verlaagde de cellevensvatbaarheid tot 54,7 ± 4,9%, wat reproduceerbare matige tot ernstige schade veroorzaakte, terwijl voldoende levensvatbare cellen werden behouden voor latere interventies en mechanistische tests. Daarom werd 500 mmol/L ethanol voor 4 uur geselecteerd voor modelopbouw. Deze aandoening werd gebruikt om acuut door ethanol geïnduceerd epitheelletsel in vitro te simuleren en reproduceert niet volledig het fysiologische blootstellingspatroon van het maagslijmvlies in vivo.
Voor farmacologische interventie werden drie concentraties SQBJ-waterextract (5, 10 en 50 μg/mL) geselecteerd en direct na de ethanol-uitdaging toegediend. In de PI3K-inhibitiearm werden cellen pre-geïncubeerd met 20 μmol/L LY294002 gedurende 30 minuten voorafgaand aan co-behandeling met ethanol en de optimale SQBJ-concentratie. Een positieve controlecohort kreeg direct na ethanolblootstelling 20 μmol/L omeprazol. Omeprazol werd gebruikt als referentie-gastroprotectief middel in plaats van als dosis-equivalente vergelijker. De concentratie werd geselecteerd op basis van een voorlopige cytotoxiciteitsevaluatie en op veelgebruikte in vitro interventiebereiken, en was bedoeld als farmacologische referentie voor celbescherming. Controlecellen werden in een volledig medium gehouden zonder ethanol of extra middelen. Alle incubaties vonden plaats in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO₂ bij 37 °C. Elke experimentele groep bestond uit ten minste drie replicateputten, en het hele protocol werd onafhankelijk 3 keer uitgevoerd.
Bepaling van optimale SQBJ-concentratie via de CCK-8 methode
Log-fase HGE/GES-1 elementen werden verplat in 96-put vectoren met een dichtheid van 1 × 104 cellen per put en 's nachts geïncubeerd in een volledig RPMI-1640 medium onder standaardomstandigheden (37 °C, 5% CO₂) om naleving te waarborgen. De culturen werden gerandomiseerd in vier groepen: voertuigcontrole (volledig medium alleen), laag-dosis SQBJ-interventie (5 μg/mL), middelmatige dosis SQBJ-interventie (10 μg/mL) en hoog-dosis SQBJ-interventie (50 μg/mL); deze drie concentraties werden gebruikt voor therapeutische screening en bereid door SQBJ op te lossen in PBS. Alle omstandigheden werden getest in ten minste drie parallelle putten, en het totale protocol werd herhaald in drie verschillende experimentele batches. Na de aangewezen behandelingsperiode ontving elke put 10 μL CCK-8 reagens, gevolgd door een incubatieperiode van 2 uur bij 37 °C. De optische dichtheid (OD) bij 450 nm werd gemeten met een microplaatlezer. Het percentage cellevensvatbaarheid werd berekend als (absorbance_treatment / absorbance_control) × 100%, waardoor de meest effectieve SQBJ-concentratie voor latere experimenten kon worden geïdentificeerd.
qPCR
Logfase GES-1-elementen werden gekweekt in 6-well platen (5 × 105 cellen per put) en 's nachts gehouden op 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO₂ om hechting te garanderen. Daarna werden cellen blootgesteld aan de vooraf bepaalde optimale concentratie SQBJ en geoogst bij de basislijn (0 uur) en 6, 12, 24 en 48 uur na behandeling om de dynamische respons van signaalmoleculen te bepalen. Op basis van de tijdsresultaten werd het 24-uursinterval gekozen voor latere mechanistische assays omdat het de sterkste signaalrespons toonde terwijl de cellen stabiel bleven. Elk tijdstip werd weergegeven door drie driedubbele putten, en het hele experiment werd onafhankelijk 3x herhaald.
We isoleerden totaal RNA met een gespecialiseerd extractiereagens, waarbij we de concentratie en kwaliteit van het resultaat beoordeelden met een spectrofotometer. Alle monsters vertoonden een A₂₆₀/A₂₈₀ absorptieverhouding binnen het bereik van 1,8 tot 2,0. Een reverse transcriptiekit met gDNA-wiper werd gebruikt om cDNA van 1 μg totaal RNA te reverse-transcriberen. Realtime PCR-analyse werd uitgevoerd via een kwantitatieve PCR-methode met primers voor PI3K, AKT, p38, JNK, ERK en het referentiegen GAPDH. Details van het PCR-systeem, reagentia en primer-synthesedienst zijn te vinden in de Materiaaltabel. Primers waren ontworpen voor specifieke regio's van de bijbehorende menselijke genen. qPCR-protocol: warmstartactivatie bij 95 °C gedurende 30 seconden, gevolgd door 40 denaturatiecycli bij 95 °C gedurende 5 seconden en gloeien/verlengen bij 60 °C gedurende 30 seconden. De berekening van de mRNA-expressie van doelgenen was gebaseerd op de relatieve kwantitatieve PCR-methode met de 2-ΔΔCt-methode .
ELISA
Supernatanten werden geoogst en verwijderd via centrifugatie bij 1.200 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C voor het verwijderen van cellulair afval. De niveaus van ontstekingsmediatoren (CRP, IL-6, TNF-α) en oxidatieve stressindices (SOD, MDA, GSH) werden geëvalueerd met commerciële ELISA-kits volgens de specifieke instructies van de fabrikant. De concentratieprofielen van deze doelen werden geverifieerd met commerciële assayformuleringen volgens de instructies van de leveranciers. Elke experimentele groep bestond uit drie replicatiewellen, en de procedure werd uitgevoerd in drie afzonderlijke celkweekbatches om de reproduceerbaarheid van de experimentele data te bevestigen. Kort gezegd werd 100 μL van standaard- of geklaarde supernatanten in voorgecoate reactieplaten gedoseerd en 90 minuten geïncubeerd bij 37 °C. Na drie opeenvolgende wascycli ontving elke holte 100 μL van het specifieke detectie-antilichaam voor een incubatie van 60 minuten bij 37 °C, gevolgd door nog eens drie wascycli. Vervolgens werd een substraatoplossing (100 μL) toegevoegd, en de monsters werden 15 minuten tegen licht beschermd voordat de enzymatische reactie werd geblokkeerd met 50 μL stopoplossing. Optische dichtheid bij 450 nm werd gedetecteerd via een microplaatlezer. Concentraties werden geïnterpoleerd uit de overeenkomstige standaardcurves. Om bias veroorzaakt door verschillen in celaantal of door behandeling veroorzaakte veranderingen in cellevensvatbaarheid te minimaliseren, werden MDA-, SOD-, GSH-, CRP-, TNF-α- en IL-6-profielen gekalibreerd op de eiwitinhoud van elk analysemonster, zoals bepaald door de BCA-assay, en uitgedrukt als relatieve waarden vergeleken met de controlegroep.
Detectie van intracellulaire ROS in GES-1-cellen met behulp van DCFH-DA fluorescerende sonde
Om intracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS) te kwantificeren, gebruikten we de membraandoorlatende fluorogene indicator DCFH-DA. Geoogste cellen werden opnieuw opgehangen in niet-aangevuld RPMI-1640 met 10 μmol/L DCFH-DA en 20 minuten onder standaard kweekomstandigheden (37 °C, 5% CO₂) in het donker gehouden. Na drie opeenvolgende washes met serumvrij medium om de ongebonden probe te clearen, werd de fluorescentieintensiteit gemonitord met flowcytometrie met 488 nm excitatie en 525 nm emissie. Relatieve ROS-niveaus werden gerapporteerd als de gemiddelde fluorescentieintensiteit voor elke behandelgroep, genormaliseerd naar het levensvatbare celaantal bepaald in parallelle putten met behulp van de CCK-8 assay, en uitgedrukt ten opzichte van de overeenkomstige controlegroep.
Bepaling van het mitochondriale membraanpotentiaal (ΔΨm)
We evalueerden veranderingen in het mitochondriale membraanpotentiaal (ΔΨm) met behulp van een commerciële JC-1 assaykit. Kort gezegd werden de geoogste cellen opnieuw opgehangen in een vers bereide JC-1 werkoplossing—een mengsel van JC-1 kleurstof en kleuringsdemper geleverd door de kit—tot een eindconcentratie van 1 × 106 cellen/mL. Na 20 minuten incubatie bij 37 °C in een bevochtigde omgeving met 5% CO₂, beschermd tegen licht om bleken te voorkomen, werd het monster geoogst door centrifugatie (800 × g., 5 min) en eenmaal afgespoeld met 1 mL ijsgekoelde JC-1 kleuringsbuffer. Fluorescentie werd vervolgens verkregen door flowcytometrie.
JC-1-aggregaten (wat duidt op intact ΔΨm) werden gemonitord via het FL2-kanaal met 488 nm excitatie en 590 nm emissiegolflengten, terwijl JC-1 monomeren (indicatief voor ΔΨm-dissipatie) werden gevolgd via het FL1-kanaal met 488 nm excitatie en 525 nm emissie-instellingen. De ΔΨm werd uitgedrukt als de verhouding tussen rood en groen fluorescentiesignaal; dalende waarden duiden op mitochondriale depolarisatie.
Bepaling van het intracellulaire ATP-niveau
De mitochondriale functionaliteit werd beoordeeld via intracellulaire ATP-kwantificatie met behulp van een ATP-assaykit. Een luciferine–luciferase bioluminescente reactie werd gebruikt om het ATP-gehalte te bepalen, dat recht evenredig is met mitochondriale activiteit. Kort werden de geoogste cellen opnieuw opgehangen in een ijskoude ATP-lysebuffer en gedurende een tijdje van 5 minuten op ijs gelaten. Centrifugatie werd vervolgens uitgevoerd bij 12.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C, waarna 20 μL van het verkregen gezuiverde supernatant werd overgebracht naar 96-put witte ondoorzichtige microplaten. Vervolgens werd 100 μL vers bereide ATP-detectiewerkoplossing—een mengsel van luciferase-reagens en luciferinesubstraat, bereid volgens het aangegeven protocol—in elke holte gebracht. Het resulterende luminescentiesignaal werd direct vastgelegd met een luminescentie-microplaatlezer. Om relatieve ATP-niveaus te verkrijgen, werden ruwe luminescentiewaarden genormaliseerd naar de individuele supernatante totale eiwitconcentraties, gekwantificeerd met een commerciële BCA-eiwitassaykit, waarmee variaties in celaantal werden gecorrigeerd.
Detectie van celapoptose door Annexin V/PI dubbele kleuring
Apoptotische celdetectie werd uitgevoerd met een commerciële Annexin V-FITC/PI celsterfte-assayconfiguratie zoals beschreven door de fabrikant. Na het wassen werden de pellets opnieuw opgehangen in een Annexin V-FITC bindingsbuffer tot een celdichtheid van 1 × 106 cellen/mL (195 μL per monster). Vervolgens kreeg elke onafhankelijke buis 5 μL Annexin V-FITC, gevolgd door 10 μL PI-kleuringsoplossing. Het monster werd voorzichtig gevortexed en 15 minuten in het donker bij kamertemperatuur geïncubeerd. Na dit proces werden apoptotische cellen gemonitord met een flowcytometer. De respectievelijke fluorescentiekanalen maakten het onderscheid mogelijk tussen levensvatbare cellen (Annexine V⁻/PI⁻), vroege apoptotische cellen (Annexine V⁺/PI⁻) en late apoptotische/necrotische cellen (Annexine V⁺/PI⁺). Het percentage apoptotische cellen in elke groep werd gekwantificeerd volgens deze gatingparameters.
Westelijk vlek
Membranen werden 's nachts geïncubeerd bij 4 °C met primaire antilichamen tegen Bcl-2, Bax, gespleten Caspase-3, AKT, p38 MAPK, JNK, ERK1/2 en GAPDH. Antilichamen werden geselecteerd op basis van validatie-informatie voor menselijke monsters en western blot-toepassingen. RRID's werden toegevoegd voor alle antilichamen met beschikbare gegevens in het Antibody Registry of RRID Portal. De doeleiwitniveaus werden genormaliseerd naar GAPDH. Na standaard wasprotocollen werden de vlekken 1 uur bij kamertemperatuur blootgesteld aan HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen. Banden werden gedetecteerd met een ECL-substraatoplossing. De grijswaarden van de Western blot band werden geëvalueerd met behulp van digitale beeldanalysesoftware.
Immunofluorescentiekleuring
GES-1 monolagen werden aangebracht op glazen dekplaten binnen 24-wellplaten voorafgaand aan de aangegeven behandelingen. Na de behandeling werd de fixatie uitgevoerd met 4% paraformaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door membraanpermeabilisatie met 0,3% Triton X-100 in PBS gedurende 10 minuten, en blokkering met 5% rundserumalbumine gedurende 30 minuten bij 37 °C. Coverslips werden vervolgens overgebracht voor nachtelijke incubatie bij 4 °C met primaire antilichamen gericht op AKT, p38, JNK en ERK. Na drie opeenvolgende PBS-wasbeurten werden exemplaren 1 uur op kamertemperatuur geïncubeerd met een fluorescentie-geconjugeerd anti-konijn secundair antilichaam, beschermd tegen licht. DAPI-tegenkleuring werd 5 minuten toegepast om de kernen zichtbaar te maken. Dekkingen werden vervolgens gemonteerd met antifade-reagens, en de gegevensverzameling maakte gebruik van een confocale laserscanningmicroscoop om de subcellulaire distributie van de doeleiwitten te bepalen. Alle immunofluorescentiebeelden werden gemaakt onder dezelfde beeldparameters met een 20× objectieflens. Schaalbalken die overeenkomen met 50 μm werden toegevoegd aan alle representatieve immunofluorescentiebeelden.
Statistische analyse
Kwantitatieve waarden worden geïllustreerd als het gemiddelde ± standaarddeviatie (SD), afkomstig van ten minste drie onafhankelijke experimentele runs waarbij elk monster in drievoud wordt geverifieerd. Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van gespecialiseerde numerieke analysetools. Om verschillende variaties tussen meerdere cohorten te bepalen, gebruikten we eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) naast Tukey's post hoc-test voor intergroepsvergelijkingen. Een tweezijdige drempel van P < 0,05 gaf statistische significantie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Bio-informatische dissectie van SQBJ-gemedieerde mechanismen in maagzweer
Om te onderzoeken hoe SQBJ zijn farmacologische werking op GU kan uitoefenen, voorspelden we aanvankelijk de doelwitten die overeenkwamen met de primaire bioactieve bestanddelen. Met R-programmering hebben we redundante vermeldingen tussen deze bioactieve componenten verwijderd en verwijderd, wat uiteindelijk 411 kandidaatdoelen opleverde. Vervolgens werden GU-gekoppelde pathologische doelen ver...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Het primaire doel van dit onderzoek was te evalueren of SQBJ, een klassieke TCM-verbindingsformule bestaande uit Panax notoginseng en Bletilla striata., cytoprotectieve werking heeft tegen door ethanol getriggerde maagslijmvliesepitheliale schade binnen een GES-1 celmodel, met betrokkenheid van PI3K/AKT-gerelateerde signalering en bijbehorende verminderingen van ontstekingsmediatoren, oxidatieve stressindicatoren, mitochondriale disfunctie en apoptotische gebeurtenissen...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs hoeven geen belangenconflicten aan te geven.
Deze studie werd gefinancierd door het Jiangsu Provincial Traditional Chinese Medicine Science and Technology Development Plan Project-General Project (2023), Projectnummer: MS2023118.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Apoptosis assay | Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit | Beyotime | C1062L |
| ATP assay | Enhanced ATP Assay Kit | Beyotime | S0027 |
| Buffer | PBS | Solarbio | — |
| Cell digestion reagent | 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200072 |
| Cell line | GES-1 human gastric mucosal epithelial cells | Cell Bank, Chinese Academy of Sciences | SCSP-533 |
| Cell viability assay | CCK-8 reagent | — | — |
| Confocal microscope | LSM 880 confocal microscope | Zeiss | LSM 880 |
| Culture medium | RPMI-1640 | Gibco | — |
| ELISA kit | Human CRP ELISA Kit | R&D Systems | DCPR00 |
| ELISA kit | Human IL-6 ELISA Kit | R&D Systems | DTAM00D |
| ELISA kit | Human TNF-α ELISA Kit | R&D Systems | — |
| Flow cytometer | FACSCalibur / FACSCanto II | BD Biosciences | — |
| Herbal material | Bletilla striata (Thunb. ex A. Murray) Rchb. f. (tuber) | Anguo Traditional Chinese Medicine Market | Voucher No. BS-20240301 |
| Herbal material | Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen (root and rhizome) | Anguo Traditional Chinese Medicine Market | Voucher No. PN-20240301 |
| Herbal material | Sanqi Baiji San powder | In-house preparation | Voucher No. SQBJ-20240301 |
| HPLC column | ZORBAX SB-C18 column | Agilent Technologies | 4.6 mm × 250 mm, 5 μm |
| HPLC system | 1260 Infinity II HPLC system | Agilent Technologies | 1260 Infinity II |
| IF secondary antibody | Alexa Fluor 594–conjugated anti-rabbit IgG | Invitrogen | A11012 |
| Inverted microscope | CKX41 inverted phase-contrast microscope | Olympus | CKX41 |
| Luminescence reader | Infinite 200 PRO microplate reader | Tecan | Infinite 200 PRO |
| Membrane | PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 |
| Microplate reader | iMark microplate reader | Bio-Rad | iMark |
| Mitochondrial membrane potential kit | JC-1 Assay Kit | Beyotime | C2006 |
| Nuclear stain | DAPI | Beyotime | C1002 |
| Online platform | Online bioinformatics plotting platform | Bioinformatics online analysis platform | Online platform |
| Online platform | Web-based enrichment analysis platform | Metascape | Online platform |
| Oxidative stress assay | GSH Assay Kit | Beyotime | S0052 |
| Oxidative stress assay | MDA Assay Kit | Beyotime | S0131 |
| Oxidative stress assay | SOD Assay Kit | Beyotime | S0109 |
| PI3K inhibitor | LY294002 | MCE | S1105 |
| Positive control drug | Omeprazole | MCE | HY-B0053 |
| Primary antibody | AKT | Cell Signaling Technology | 4691 |
| Primary antibody | Bax | Cell Signaling Technology | 5023 |
| Primary antibody | Bcl-2 | Cell Signaling Technology | 15071 |
| Primary antibody | Cleaved Caspase-3 Asp175 | Cell Signaling Technology | 9664 |
| Primary antibody | ERK1/2 | Cell Signaling Technology | 4695 |
| Primary antibody | GAPDH | Abcam | ab8245 |
| Primary antibody | JNK / SAPK-JNK | Cell Signaling Technology | 9252 |
| Primary antibody | p-AKT Ser473 | Cell Signaling Technology | 4060 |
| Primary antibody | p-ERK1/2 Thr202/Tyr204 | Cell Signaling Technology | 4370 |
| Primary antibody | p-JNK Thr183/Tyr185 | Cell Signaling Technology | 4668 |
| Primary antibody | p-p38 MAPK Thr180/Tyr182 | Cell Signaling Technology | 4511 |
| Primary antibody | p-PI3K p85 Tyr458 / p55 Tyr199 | Cell Signaling Technology | 4228 |
| Primary antibody | p38 MAPK | Cell Signaling Technology | 8690 |
| Primary antibody | PI3K p85 | Cell Signaling Technology | 4257 |
| Primer | AKT forward | — | — |
| Primer | AKT reverse | — | — |
| Primer | ERK forward | — | — |
| Primer | ERK reverse | — | — |
| Primer | GAPDH forward | — | — |
| Primer | GAPDH reverse | — | — |
| Primer | JNK forward | — | — |
| Primer | JNK reverse | — | — |
| Primer | p38 forward | — | — |
| Primer | p38 reverse | — | — |
| Primer | PI3K forward: | — | — |
| Primer | PI3K reverse | — | — |
| Protease inhibitor | PMSF | Beyotime | ST506 |
| Protein assay | BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0010 |
| Protein lysis buffer | RIPA buffer | Beyotime | P0013B |
| Public database | DrugBank | DrugBank Online | Online database |
| Public database | GeneCards | Weizmann Institute of Science | Online database |
| Public database | Online Mendelian Inheritance in Man | Johns Hopkins University | Online database |
| Public database | PubChem compound database | National Center for Biotechnology Information | Online database |
| Public database | RCSB Protein Data Bank | RCSB PDB | Online database |
| Public database | STRING protein interaction database | STRING Consortium | Online database |
| Public database | Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform | TCMSP | Online database |
| Public database | Universal Protein Resource | UniProt Consortium | Online database |
| Real-time PCR system | CFX96 Real-Time PCR System | Bio-Rad | CFX96 |
| Reverse transcription kit | PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser | Takara Bio | RR047A |
| RNA extraction reagent | TRIzol reagent | — | — |
| ROS probe | DCFH-DA | Beyotime | S0033 |
| Secondary antibody | HRP-conjugated anti-rabbit IgG | Cell Signaling Technology | 7074 |
| Software | Cytoscape | Cytoscape Consortium | 3.9.1 |
| Software | GraphPad Prism | GraphPad Software |