Handheld apparaat voor speekselvoorbehandeling ter verbetering van cortisoldetectie

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een snelle speekselvoorbehandelingsmethode om de detectie van cortisol te verbeteren. Een handfiltratieapparaat wordt gebruikt om mucines en andere storende stoffen te verwijderen terwijl het doelanalyt behouden blijft. Het voorbehandelde speeksel vertoont een verbeterde capillairstroom, waardoor een consistentere en reproduceerbare assay-prestatie mogelijk wordt.

Samenvatting

Speekselcortisoldetectie biedt een niet-invasief alternatief voor bloedgebaseerde analyse. De praktische toepassing ervan blijft echter beperkt door de intrinsieke viscositeit van het speeksel en de aanwezigheid van interfererende componenten. In het bijzonder belemmeren mucinen en speekseleiwitten de capillair-gedreven stroming en belemmeren ze de betrouwbaarheid van latere laterale stroomtests (LFA's), waardoor effectieve en toegankelijke voorbehandelingsstrategieën noodzakelijk zijn. Hier presenteren we een handzaam speekselvoorbehandelingsapparaat, SaliFilter genoemd, voor point-of-care cortisoldetectie. Het apparaat maakt gebruik van een filtratiemechanisme dat selectief storende componenten met hoog moleculair gewicht verwijdert, terwijl kleine moleculen, waaronder cortisol, doorgelaten kan worden. Bediend met eenvoudige handmatige druk, maakt het snelle monsterverwerking (~2 min) mogelijk zonder externe apparatuur, waardoor het geschikt is voor gedecentraliseerde omgevingen. De prestaties van het apparaat werden geëvalueerd met behulp van troebelheidsmetingen, eiwitkwantificatie en SDS-PAGE, die efficiënte verwijdering van mucine- en speekseleiwitten bevestigden. Behandelde monsters vertoonden een verbeterde capillaire stroom, wat resulteerde in stabiele en betrouwbare werking van de LFA. Kwantitatieve analyse toonde verbeterde signaalreproduceerbaarheid aan, en cortisoldetectie bereikte een detectielimiet van 1,47 ng mL⁻¹ over klinisch relevante concentratiebereiken. Dit protocol stelt een effectieve speekselvoorbehandelingsstrategie vast die de analytische gevoeligheid en betrouwbaarheid verbetert zonder de integriteit van de analyten in gevaar te brengen. De voorgestelde aanpak biedt een praktische, draagbare oplossing voor speekselgebaseerde diagnostiek, met potentiële toepasbaarheid voor point-of-care testen en zelfmonitoring.

Inleiding

Cortisol, een glucocorticoïdehormoon dat door de bijnierschors wordt uitgescheiden, is een belangrijke biomarker voor het beoordelen van fysiologische stress ^1,2. Het kan worden gemeten in meerdere biologische vloeistoffen, waaronder serum, plasma, urine, interstitiële vloeistof en speeksel, waarbij bloed en speeksel het meest worden gebruikt in de klinische praktijk³. Hoewel bloedmetingen betrouwbare kwantitatieve informatie bieden, vereisen ze invasieve venipunctie en getraind personeel, wat hun geschiktheid voor frequente of longitudinale monitoring beperkt ^4,5,6. Daarentegen biedt het meten van speekselcortisol een niet-invasieve en handige alternatief, waardoor point-of-care en zelfmonitoringstoepassingen^{mogelijk zijn.} Opvallend is dat speekselcortisolniveaus sterk correleren met bloedconcentraties, wat speeksel als een betrouwbaar surrogaatmonster^ondersteunt. De intrinsieke viscositeit van het speeksel en de aanwezigheid van interfererende componenten belemmeren echter de analytische prestaties aanzienlijk, waardoor effectieve voorbehandeling vóór analyse 10,11,12 noodzakelijk is.

Verschillende voorbehandelingsstrategieën zijn onderzocht om deze uitdagingen aan te pakken. Centrifugatie wordt veel gebruikt om grote componenten zoals mucinen, eiwitten en cellulair afval te verwijderen. Het vereist echter omvangrijke laboratoriumapparatuur en meerdere verwerkingsstappen, wat de toepasbaarheid in gedecentraliseerde omgevingen beperkt^13,14. Verdunning met bufferoplossingen kan de viscositeit verminderen en de^{monsterstroom verbeteren}. Desalniettemin verlaagt het tegelijkertijd de analytenconcentratie, waardoor de analytische gevoeligheid wordt aangetast. Als gevolg hiervan blijven bestaande benaderingen onvoldoende voor point-of-care-toepassingen, waar snelle, apparatuurvrije verwerking en behoud van doelanalyten essentieel zijn.

Om deze beperkingen te overwinnen, ontwikkelden we SaliFilter, een handzaam apparaat voor speekselvoorbehandeling, afgestemd op het detecteren van cortisol op het punt van zorg. Het apparaat maakt gebruik van een filtratiemechanisme dat selectief interfererende stoffen met hoog moleculair gewicht verwijdert, terwijl het de doorgang van kleine moleculen, waaronder cortisol¹⁶, toestaat. Handmatig bediend maakt het apparaat snelle, gebruiksvriendelijke verwerking mogelijk zonder externe instrumentatie. Door storende componenten te elimineren, verbetert deze benadering de capillaire stroming in laterale stroomassays, waardoor de analytische betrouwbaarheid wordt vergroot. Dit protocol beschrijft de fabricage van het apparaat en de toepassing ervan voor snelle speekselbehandeling voorafgaand aan cortisoldetectie met behulp van laterale stroomassays.

Protocol

Commercieel verkregen, gedeïdentificeerd gepoold menselijk speeksel werd in deze studie gebruikt. Er werden geen menselijke deelnemers gerekruteerd en institutionele ethische goedkeuring was niet vereist.

1. Voorbereiding van speekselmonsters

1. Instrueer deelnemers om minstens 30 minuten voor het monsterafnemen niet te eten of drinken.
2. Bereid het speekselmonster voor volgens de instructies van de leverancier.
   OPMERKING: Deze studie gebruikte commercieel verkrijgbaar gepoold menselijk speeksel voor protocolvalidatie.
3. Meng het speekselmonster voorzichtig voor gebruik om homogeniteit te waarborgen.
4. Bewaar de speekselmonsters bij 4 °C en gebruik ze binnen de door de leverancier aanbevolen opslagperiode.

2. Voorbereiding van het met RBCM gecoate membraan (Figuur 1A)

1. Isoleer RBCM uit volbloed volgens een eerder gerapporteerd protocol¹⁶.
   1. Gebruik commercieel verkregen menselijk volbloed anticoaguleerd met K2EDTA als RBCM-bron.
   2. Centrifugeer het hele bloed op 800 × g gedurende 5 minuten en verzamel de rode bloedcellen na het verwijderen van het plasma en de buffy coat.
   3. Was de geïsoleerde rode bloedcelpellet drie keer met ijskoude 1× fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met voorzichtige handmatige menging.
   4. Suspendeer de gewassen rode bloedcelpellet opnieuw in ijskoude 0,25× PBS gedurende 30 minuten om hemolyse op te wekken.
   5. Scheid vrij hemoglobine door de gelyseerde suspensie 30 minuten te centrifugeren op 20.000 × g en de RBCM-pellet te verzamelen.
   6. Was de verzamelde RBCM-pellet nog drie keer met 0,25× PBS en bewaar de lichtroze RBCM-pellet op −80 °C tot verder gebruik.
2. Bereid een polyethersulfon (PES) membraan voor met een poriegrootte van 30 nm en een diameter van 13 mm.
3. Deponeer 100 μL van 2% (w/v) RBCM-oplossing aan één kant van het PES-membraan. Verspreid of doseer de oplossing voorzichtig druppelwijs totdat het hele membraanoppervlak volledig nat is.
4. Incubeer het membraan op 50 °C gedurende 30 minuten om een uniforme coating en droging te garanderen.
5. Bewaar het gecoate membraan op kamertemperatuur en gebruik het binnen 15 dagen na voorbereiding¹⁷.
   OPMERKING: Gedetailleerde karakterisering van het RBCM-gecoate PES-membraan is beschreven in onze vorige studie¹⁶.

3. Fabricage van het SaliFilter-apparaat (Figuur 1B)

1. Plaats het met RBCM gecoate membraan in de aangewezen filterhouder.
2. Assembleer het apparaat door de inlaat- en uitlaatcomponenten stevig aan te sluiten.
3. Bevestig een 1 ml spuit aan de inlaat van het apparaat.
   VOORZICHTIG: Zorg ervoor dat alle componenten stevig zijn afgesloten om lekkage tijdens gebruik te voorkomen.

4. Voorbehandeling van speeksel

1. Laad 500 μL speeksel in de spuit die is aangesloten op het SaliFilter-apparaat.
2. Oefen zachte handmatige druk uit om het speekselmonster door het membraan te laten passeren (~ 2 min).
3. Verzamel het voorbehandelde speeksel uit de uitlaat.
4. Gebruik het voorbehandelde monster direct of bewaar het bij 4 °C tot verdere analyse.

5. SDS-PAGE-analyse van speekseleiwitten

1. Meng 15 μL van het monster met 5 μL Laemmli-samplebuffer.
2. Laad het mengsel in aparte putten van een 8% SDS-PAGE gel.
3. Voer elektroforese uit op 150 V gedurende 40 minuten.
4. Beits de gel 2 uur met Coomassie blue.
5. Ontkleur de gel een nacht in gedestilleerd water.
6. Maak beelden van de gel met een smartphone of beeldvormingssysteem.

6. Cortisoldetectie met behulp van Lateral Flow Assay (LFA)

1. Breng 150 μL voorbehandeld speeksel aan op het monsterpad van de LFA-strip.
2. Laat het monster 10 minuten langs de strook migreren.
3. Maak beelden van de testresultaten met een smartphone of beeldvormingssysteem.
4. Open de LFA-afbeelding in ImageJ en gebruik Image > Color > Split Channels om de RGB-kanalen te scheiden.
5. Gebruik de groene kanaalafbeelding voor testlijnintensiteitsanalyse.
6. Selecteer een rechthoekige Regio van Belang (ROI) van 100 × 10 pixels die de testlijn bedekt en pas dezelfde ROI-grootte toe op alle stripafbeeldingen.
7. Meet de gemiddelde intensiteitswaarde van de ROI van de testlijn. Selecteer een aangrenzend leeg membraangebied met dezelfde ROI-grootte en meet de achtergrondintensiteit.
8. Bereken de genormaliseerde testlijnintensiteit als volgt: genormaliseerde intensiteit = testlijnintensiteit − achtergrondintensiteit.

7. Statistische analyse

1. Presenteer kwantitatieve gegevens als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD), tenzij anders vermeld. Definieer foutbalken als SD.
   OPMERKING: In deze studie vertegenwoordigen alle gerapporteerde N-waarden technische replicaties die zijn uitgevoerd met aliquots van commercieel verkregen gepoold menselijk speeksel.
2. Voer lineaire regressieanalyse uit met behulp van de genormaliseerde testlijnintensiteitswaarden verkregen uit cortisolconcentraties van 0–8 ng mL⁻¹ en bereken de determinatiecoëfficiënt (R²) uit de aangepaste curve.
3. Bereken de detectielimiet (LOD) met de volgende vergelijking: LOD = 3,3 × SE / |helling|, waarbij SE de standaardfout is van de y-intercept en |helling| is de absolute waarde van de helling verkregen uit de lineaire regressievergelijking. Gebruik de absolute waarde van de helling omdat de concurrerende LFA een negatieve helling oplevert.
   OPMERKING: In deze studie werden geen inferentiele statistische tests uitgevoerd en werden er geen significantiecriteria toegepast.

Resultaten

Effectieve voorbehandeling van speeksel vereist het verwijderen van storende componenten, waaronder mucinen en eiwitten, die de downstream analytische prestaties aantasten. De filtratiecapaciteit van SaliFilter werd eerst geëvalueerd door veranderingen in troebelheid te vergelijken met die verkregen met commerciële speekselverzamelkits (Figuur 2A). Onbehandeld speeksel vertoonde een hoge troebelheid, terwijl SaliFilter-behandelde monsters zichtbaar helder le...

Discussie

Speekselgebaseerde diagnostiek biedt een niet-invasief alternatief voor bloedanalyse. Hun bredere adoptie is echter beperkt door de intrinsieke viscositeit van speeksel en de aanwezigheid van interfererende componenten zoals mucinen en eiwitten. Deze factoren verstoren de capillair-gedreven stroming en belemmeren de prestaties van eenvoudige analyseplatforms, waaronder LFA's, waardoor effectieve voorbehandeling van monsters noodzakelijk is.

In deze studie tone...

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Artificial saliva	Solarbio, China	A7990
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent	Bio-Rad, USA	5000006	Voor Bradford-assay
Coomassie blue	Abcam, UK	ab119211	Voor visualisatie van eiwitbanden
Cortisol ELISA Kit	Abcam, UK	ab154996
Cortisol LFA	In-house
Hot plate	Daihan Scientific, Republiek Korea)
Hydrocortison (Cortisol)	Sigma-Aldrich, USA	PHR1014
Laemmli sample buffer	GenDEPOT, USA	L1200-001	Voor eiwitdenaturatie vóór SDS-PAGE
Membraanhouder	GVS Filter Technology	1220950	13 mm diameter houder
Mini-PROTEAN® Tetra Cell voor 0,75 mm gels	Bio-Rad, USA	1658000	Voor gelelektroforese
Mucine	Sigma-Aldrich, USA	M2378
NanoDrop 2000 spectrofotometer	Thermo Fisher Scientific, USA		Voor eiwitassay
PES-membranen	STERLITECH, USA	PES00313100	0,03 Micron, 13 mm PES-membraan
Fosfaat-gebufferd zout (PBS)	DUKSAN, Republiek Korea	LB004
Gelegde menselijke speeksel	Innovative Research Inc., USA	IRHUSL5ML
RBCM	In-house
Resolutie Gel Buffer voor PAGE	Bio-Rad, USA	1610798	Voor de bereiding van resolutie gel
Salivette Cortisol	SARSTEDT, Duitsland	51.1534.500	Speekselopvangkit
Stacking Gel Buffer voor PAGE	Bio-Rad, USA	1610799	Voor de bereiding van stacking gel
Super•SAL™	Oasis Diagnostics, USA	SSAL-601	Speekselopvangkit
Spuit	koreavaccine, Republiek Korea)		1 ml volume
TEMED	Bio-Rad, USA	1610800	Voor acrylamidpolymerisatie

```