$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Deze database-gebaseerde computationele studie omvat geen menselijke deelnemers, dierproeven of klinische monsters. Volgens artikel 32 van China's Maatregelen voor Ethische Beoordeling van Levenswetenschappen en Medisch Onderzoek met Menselijke Proefpersonen komen studies die gebruikmaken van rechtmatig verkregen openbaar beschikbare gegevens, geen schade toebrengen aan menselijke proefpersonen, bevatten geen gevoelige persoonlijke informatie en geen commerciële belangen hebben, in aanmerking voor vrijstelling van ethische toetsing. Daarom is ethische goedkeuring niet vereist voor deze studie.
Het experimentele ontwerp en de analytische pijplijn van deze studie worden geïllustreerd in het stroomdiagram (Figuur 1).
Figuur 1: Algemene workflow van de studie. Het stroomdiagram illustreert de sequentiële workflow van de netwerkfarmacologie en moleculaire docking-analyses, inclusief het verwerven van actieve componenten en doelwitten van Sishen Decoction (SSD), verzameling van jicht-gerelateerde doelwitten, identificatie van overlappende doelwitten, opbouw van het geneesmiddel-component–doelwit–ziekte-netwerk en eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerk, Gene Ontology (GO) en Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) verrijkingsanalyses, en moleculaire koppelingssimulaties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Verwerving van actieve componenten en doeleiwitten van SSD
Op 2 januari 2026 werden de actieve chemische componenten van de vijf kruiden waaruit SSD bestaat, namelijk Huangqi, Yuanzhi, Huainiuxi, Shihu en Jinyinhua, gehaald uit de Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology (TCMSP) database21. Screeningscriteria op basis van farmacokinetische eigenschappen werden toegepast: orale biobeschikbaarheid (OB) van ≥30% en geneesmiddelgelijkheid (DL) van ≥0,1822. Componenten die aan deze criteria voldeden, werden beschouwd als potentiële werkzame ingrediënten. Vervolgens werden overeenkomstige doelen voor elk onderdeel verzameld. Omdat TCMSP geen volledige gegevens had voor Yuanzhi en Shihu, werden de chemische componenten van deze twee kruiden op dezelfde dag bovendien uit de Herb 2.0-database gehaald. Na het verkrijgen van de componentnamen werd in TCMSP een omgekeerde zoekopdracht uitgevoerd waarbij de componentnamen en bijbehorende CAS-nummers als trefwoorden werden gebruikt om doelinformatie op te halen. Voor verbindingen verkregen uit de Herb-database werden alleen stoffen behouden die succesvol waren gekoppeld aan vermeldingen in TCMSP via componentnaam of CAS-nummer. De gematchte verbindingen werden vervolgens onderworpen aan dezelfde farmacokinetische screeningscriteria (OB ≥ 30% en DL ≥ 0,18) met TCMSP-gegevens, en verbindingen zonder volledige OB- of DL-informatie werden uitgesloten. Alle gematchte en gefilterde verbindingen werden handmatig verifiërd aan de hand van de originele Herb 2.0-records om verkeerde identificatie te voorkomen. Vervolgens werd de doelinformatie uit de Herb-database samengevoegd met die van de overige kruiden om de volledige set actieve ingrediëntendoelen voor SSD te genereren.
Alle teruggevonden doeleiwitten werden gestandaardiseerd naar officiële gensymbolen met behulp van de UniProt-database. Er werd één-op-één correspondentie tot stand gebracht door alleen door mensen beoordeelde (Swiss-Prot) vermeldingen te behouden en niet-beoordeelde (TrEMBL) vermeldingen uit te sluiten. Wanneer meerdere isoformen overeenkwamen met hetzelfde gensymbool, werd de canonieke isoform gekozen. De gestandaardiseerde doeldataset werd behouden voor latere analyse van kruisende genen.
Verzameling van jichtgerelateerde doelwitten
Op 2 januari 2026 werden systematische zoekopdrachten uitgevoerd in de GeneCards-database en de OMIM-database, waarbij "jicht" als ziektetrefwoord werd gebruikt om jichtgerelateerde ziektedoelen te verkrijgen. De doelen die uit de twee databases werden verkregen, werden geëxporteerd naar WPS Spreadsheets (versie 12.1.0). De kolom Gensymbool van OMIM werd naast de kolom Gensymbool van GeneCards geplaatst, en dubbele doelen werden verwijderd met de functie "Verwijder Duplikaaten" op basis van exacte overeenkomsten met officiële gensymbolen op een naam-insensitive manier. De doelen uit de twee databases werden vervolgens samengevoegd tot een uitgebreide set jichtgerelateerde ziektedoelstellingen.
Identificatie van overlappende doelwitten tussen geneesmiddelen en ziekte
De geneesmiddeldoelset verkregen via actieve componentscreening en de jichtgerelateerde ziektedoelset werden in dezelfde projectmap geplaatst (D:\Venn). R-software (versie 4.4.0) werd gestart en het readxl-pakket werd gebruikt om Excel-bestanden (.xlsx) met de doel-lijsten te importeren. Het dplyr-pakket werd gebruikt voor datamanipulatie, inclusief filteren en het hernoemen van kolommen voorafgaand aan de intersectieanalyse. De twee doelsets werden vervolgens omgezet in tekenvectoren, en overlappende doelen werden geïdentificeerd met behulp van de calculate.overlap()-functie uit het VennDiagram-pakket. Het VennDiagram-pakket werd geïnstalleerd vanuit CRAN met het commando install.packages("VennDiagram") en opgeslagen in het standaard pad van de R-bibliotheek. Als er een bericht verscheen dat aangaf dat het pakket al was geïnstalleerd, werd de installatie als succesvol beschouwd. De werkmap werd ingesteld met het commando setwd("D:\\Venn"), dat de map met de invoerbestanden aanwees en als uitvoermap diende. Het R-script werd vervolgens uitgevoerd om de snijpunt te berekenen tussen de geneesmiddeldoelset en de jichtgerelateerde ziektedoelstelling. De resulterende overlappende doelwitten werden gedefinieerd als potentiële therapeutische doelen van SSD voor de behandeling van jicht.
Constructie van het netwerk "Geneesmiddelcomponent-Doelziekte"
De elkaar overlappende genen die werden geïdentificeerd uit de overlap tussen SSD-doelen en jichtgerelateerde doelen werden opgeslagen als het overlapping_targets.txt-bestand , en de actieve componentinformatie van SSD werd opgeslagen als het drug_components.txt-bestand . Beide bestanden werden geplaatst in de projectmap (D:\Network), die diende als werkmap voor de analyse. Om reproduceerbaarheid te waarborgen, werd deze analyse uitgevoerd met R. Gegevenslees-, filter- en samenvoegoperaties werden uitgevoerd met een combinatie van basis R-functies, waaronder read.table(), write.table() en merge(), samen met het dplyr-pakket voor dataframe-manipulatie. Het commando setwd("D:\Network") werd uitgevoerd om expliciet de werkmap te definiëren.
De graph_from_data_frame()- functie werd gebruikt als de kernintegratiefunctie. Elke rij drug_components.txt koppelde een actief component aan het bijbehorende doelgen met behulp van officiële gensymbolen. Alleen doelen die in overlapping_targets.txt aanwezig waren, werden behouden en er werd geen extra filtering toegepast buiten de snijpuntvereiste. De resulterende netwerkdataset werd geëxporteerd als network.txt in edge-listformaat. Elke rij bevatte twee kolommen (knooppunt1 en knooppunt2), waarbij knooppunt1 ofwel de SSD-formule of een actieve component vertegenwoordigde, en knooppunt2 een actieve component of een doelgen. De ziekteknoop ("jicht") was verbonden met de SSD-formule als een aparte rand. Randgewichten werden niet toegewezen en alle randen werden gelijk behandeld (randbreedte = 0,8).
Het network.txt-bestand werd geïmporteerd in de Cytoscape (versie 3.7.2) netwerkvisualisatiesoftware. De ingebouwde NetworkAnalyzer-tool werd benaderd via Tools → Network Analysis → Analyze Network om de basisstructuur van het netwerk te verkrijgen, en "Degree Distribution" werd gekozen als analytisch kader. Knoopvormen en kleuren werden toegekend op basis van knooppunttypes: blauwe ruiten vertegenwoordigden de SSD-formule, blauwe rechthoeken actieve componenten, oranje ellipsen ziektedoelgenen en rode achthoeken de jicht-entiteit. De knoopgrootte werd evenredig ingesteld met knooppuntgraad (knoopgrootte = 30+ graad × 5, maximale grootte = 100).
Constructie van het Eiwit–Eiwitinteractie (PPI) Netwerk
De gefilterde set van snijdende doelgenen werd op 2 januari 2026 geïmporteerd in de STRING-database (versie 12.0). De soort was beperkt tot Homo sapiens, de minimale interactiebetrouwbaarheidsdrempel werd ingesteld op hoge betrouwbaarheid (0,700), losgekoppelde eiwitten werden verborgen, interactiebronnen omvatten alle beschikbare bewijskanalen, en alle andere parameters werden op hun standaardinstellingen gehandhaafd om bekende en voorspelde eiwit-eiwitinteracties te verkrijgen. De resulterende netwerkgegevens werden geëxporteerd in tab-separated values (TSV)-formaat met behulp van de standaard exportopties.
Het geëxporteerde netwerk werd geïmporteerd in de netwerkvisualisatiesoftware voor visualisatie en topologische analyse. Netwerkeigenschappen werden berekend met de ingebouwde NetworkAnalyzer-tool (Tools → Network Analysis → Analyze Network). De berekende meetwaarden omvatten graad, tussenheid centraliteit en nabijheidscentraliteit. Knooppuntgroottes werden met behulp van een continue mappingfunctie naar gradenwaarden afgebeeld (knooppuntgrootte = 20+ graad × 3, maximale grootte = 80).
Hub-doelen werden geïdentificeerd door alle knooppunten te rangschikken op graadwaarden in dalende volgorde. Knooppunten met hogere graadwaarden werden als centraaler binnen het netwerk beschouwd. Geïsoleerde knooppunten (graad = 0) werden uitgesloten van de visualisatie. De netwerkindeling was in concentrische cirkels gerangschikt vanaf het midden naar buiten volgens de knooppuntconnectiviteit, en knooppuntkleuren werden in kaart gebracht met een blauw-cyaan gradiënt die overeenkwam met toenemende graadwaarden. Het resulterende netwerk werd gebruikt om de kerndoelen van de hub te identificeren die betrokken zijn bij de potentiële therapeutische effecten van SSD tegen jicht.
Genontologie (GO) Verrijkingsanalyse
Op basis van de geïdentificeerde overlappende doelgenen werd GO functionele verrijkingsanalyse uitgevoerd met R. Vereiste Bioconductor-pakketten werden geïnstalleerd in het standaard R-bibliotheekpad en geladen in de analyseomgeving. Het kruisende genbestand werd opgeslagen in de projectmap (D:\GO), en de werkmap werd gedefinieerd met behulp van de setwd()-functie.
Genidentificatieconversie en -annotatie werden uitgevoerd met behulp van het Bioconductor-pakketorg. Hs.eg.db (versie 3.20.0). Officiële gensymbolen werden omgezet naar Entrez-gen-ID's met behulp van de bitr()-functie in het clusterProfiler verrijkingsanalysepakket (versie 4.21.0). Alleen genen met unieke één-op-één mappingen werden behouden voor downstream analyses, terwijl ambigue of niet-gemapte vermeldingen werden uitgesloten.
GO-verrijkingsanalyse werd uitgevoerd met behulp van het verrijkingsanalysepakket. De enrichGO()-functie werd gebruikt met de ontologiecategorieën Biologisch Proces (BP), Cellulaire Component (CC) en Moleculaire Functie (MF). De statistische significantie werd bepaald met behulp van de Benjamini–Hochberg meervoudige testcorrectiemethode, waarbij een aangepaste P-waarde < 0,05 als significant werd beschouwd.
Voor elke ontologiecategorie werden significant verrijkte termen gerangschikt volgens de verrijkingsfactor:
EF = (genenaantal / totale achtergrondgenen) ÷ (termgrootte / totale genoomgenen)
De top 10 termen werden geselecteerd voor gedetailleerde analyse. Wanneer identieke verrijkingsfactoren optraden, werden termen met lagere aangepaste P-waarden hoger gerangschikt.
Verrijkingsresultaten werden gevisualiseerd met ggplot2 (versie 3.5.1) en enrichplot (versie 1.24.0). Bubbeldiagrammen en staafdiagrammen werden gegenereerd met behulp van de dotplot() en barplot() functies. De bubbelgrootte vertegenwoordigde het aantal verrijkte genen, terwijl kleur overeenkwam met verrijkingssignificantie uitgedrukt als −log10 (aangepaste P-waarde). Standaard plotparameters werden overal gebruikt.
KEGG Padverrijkingsanalyse
KEGG-padverrijkingsanalyse van de snijdende doelen van SSD en jicht werd uitgevoerd met R en het eerder beschreven verrijkingsanalysepakket. Gensymbolen werden omgezet in KEGG-compatibele identificaties met behulp van de bitr()-functie die door het verrijkingsanalysepakket werd geleverd, waarbij KEGG als annotatiebron diende. Padverrijkingsanalyse werd uitgevoerd met behulp van de enrichKEGG()-functie gebaseerd op de hypergeometrische test. De statistische significantie werd bepaald met behulp van de Benjamini–Hochberg (BH) meervoudige testcorrectiemethode, en paden met een aangepaste P-waarde < 0,05 werden als significant verrijkt beschouwd.
Verrijkingsresultaten werden geëxporteerd naar Microsoft Excel-compatibele werkboekbestanden met behulp van het openxlsx-pakket (versie 4.2.8.1) en de write.xlsx()-functie voor latere beoordeling en het opstellen van figuren.
Vervolgens werd er een multilevel target–pathway-interactienetwerk opgebouwd met behulp van de netwerkvisualisatiesoftware. Netwerkgegevens werden geïmporteerd met Bestand → Import → Network from File. Knooppunten bestonden uit doelgenknooppunten en significant verrijkte KEGG-routeknooppunten (BH-gecorrigeerde P-waarde < 0,05), terwijl randen gedocumenteerde associaties vertegenwoordigden tussen doelgenen en verrijkte routes die tijdens verrijkingsanalyse waren geïdentificeerd. Netwerkvisualisatie werd uitgevoerd met het Style-paneel van de netwerkvisualisatiesoftware, waarbij doelgenen als grijze ellipsen werden weergegeven en paden als cyan rechthoeken. Er werden geen extra plugins gebruikt. Het netwerk werd handmatig gegenereerd vanuit de verrijkingsuitvoertabel om de relaties tussen kerndoelen en significant verrijkte paden te visualiseren.
Moleculaire koppelvalidatie
De 3D-structuurbestanden (MOL2-formaat) van de top 10 actieve componenten, gerangschikt op doelconnectiviteit in het "drug–component–target–disease"-netwerk, werden gedownload uit de TCMSP-database. Doelconnectiviteit werd gedefinieerd als de knooppuntgraad (d.w.z. het aantal directe verbindingen tussen een actief component en doelgenen in het netwerk). Actieve componenten werden in aflopende volgorde gerangschikt op basis van graadwaarden, en de top 10 componenten werden geselecteerd voor moleculaire dockinganalyse.
De kristalstructuren van de top 10 hub-doeleiwitten die zijn geïdentificeerd uit het PPI-netwerk zijn verkregen uit de RCSB Protein Data Bank (PDB) op 23 januari 2026. De soort was beperkt tot Homo sapiens. Voor elk doeleiwit werd de structuur met de hoogste kristallografische resolutie (laagste Å-waarde), zonder mutaties, en co-gekristalliseerd met een native ligand of inhibitor, bij voorkeur geselecteerd. Als meerdere structuren aan deze criteria voldeden, werd de structuur met de hoogste resolutie en de meest volledige eiwitsequentiedekking geselecteerd. De volgende PDB-structuren werden gebruikt: 1GKC (MMP9), 5WHH (BCL2), 2P33 (JUN), 1RHJ (CASP3), 1WT5 (EGFR), 7APJ (AKT1), 1DU3 (TNF), 1T4Q (IL1B), 4NI9 (IL6) en 9CKJ (TP53).
Moleculaire dockingsimulaties werden uitgevoerd met behulp van de CB-Dock 2 online server (webversie, geraadpleegd op 23 januari 2026), die AutoDock Vina als docking-engine gebruikt. Eiwitstructuren werden automatisch voorverwerkt door de server, inclusief het verwijderen van heteroatomen en het voorbereiden van receptorstructuren. Liganden werden geüpload in MOL2-formaat. Sjabloononafhankelijke holtedetectie werd gebruikt, waarbij vijf potentiële bindingskaaviteiten automatisch voor elke eiwitstructuur werden geïdentificeerd. Koppelingsberekeningen werden uitgevoerd met behulp van de standaardparameters van de dockingmotor: exhaustiviteit = 8, energiebereik = 4, en maximaal aantal bindingsmodi = 9.
Voor elk doel-samengesteld paar werd het koppelen onafhankelijk uitgevoerd binnen elk van de vijf gedetecteerde holtes. Dockinghoudingen werden geëvalueerd met behulp van de docking engine scoringfunctie, en de pose met de laagste bindingsenergie binnen elke holte bleef als de representatieve conformatie voor die caviteit. Van de vijf representatieve conformaties werd de koppelhouding met de wereldwijd laagste bindingsenergie gekozen als het definitieve koppelingsresultaat voor dat doel-samengestelde paar en gebruikt voor latere analyses.
De laagste bindingsenergiewaarde die voor elk koppelingsresultaat werd verkregen, werd vastgelegd in een spreadsheet en geïmporteerd in het Weishengxin online plotplatform (geraadpleegd op 23 januari 2026) om een heatmap te genereren met standaardparameters. De heatmap gebruikte een geel-rood kleurgradiënt, complete-linkage hiërarchische clustering en Euclidische afstand als clusteringmetriek.
Waterstofbindingsinteracties werden automatisch geïdentificeerd door de analysemodule van de dockingserver op basis van geometrische criteria. Een waterstofbinding werd gedefinieerd als een interactie met een donor–acceptor afstand ≤ 3,5 Å en een donor–waterstof–acceptor hoek ≥ 120°. Waterstofbruggen werden weergegeven als stippellijnen in zowel tweedimensionale als driedimensionale interactiediagrammen. Het doel-eiwit-actieve componentpaar met de wereldwijd laagste bindingsenergie van alle koppelingscombinaties werd geselecteerd voor gedetailleerde interactieanalyse. Deze selectie was gebaseerd op een enkel doel-compound paar in plaats van een individuele koppelpose en was bedoeld om de sterkst voorspelde interactie binnen het netwerk te identificeren. De uiteindelijke representatieve dockinghouding die overeenkomt met dit doel-compound paar werd gebruikt voor visualisatie en interactieanalyse.
Driedimensionale en tweedimensionale interactiediagrammen werden gegenereerd met respectievelijk ChimeraX versie 1.5 en LigPlot+ versie 2.2. In ChimeraX werden eiwitten weergegeven met de standaard cartoonrepresentatie, liganden in stick-modus, waterstofbruggen als gestreepte lijnen en het standaard kleurenschema toegepast. In LigPlot+ werd waterstofbindingidentificatie uitgevoerd met het HBPLUS-algoritme met een donor-acceptor afstand drempel van 3,9 Å en een hoekdrempel van 90°. Alle andere visualisatieparameters werden behouden op hun standaardinstellingen.