Onderzoeksartikel

N6-methyladenosine modificatie van Rab27A bevordert osteoporose door de osteoclastdifferentiatie in het ovariectomiseerde muismodel te beïnvloeden

30 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/71964

⸱

11 augustus 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 2Department of Orthopedics, The People's Hospital of Pengzhou, 3Department of Clinical Skills Center, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 4Southwest Medical University, 5Stem Cell Immunity and Regeneration Key Laboratory of Luzhou, Affiliated Hospital of Southwest Medical University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

YTHDC1 bevordert de cytoplasmatische export van m6A-gemodificeerde Rab27A, terwijl IGF2BP2 Rab27A in het cytoplasma stabiliseert, waardoor de differentiatie van osteoclast wordt versterkt en bijdraagt aan osteoporose.

Samenvatting

De ontwikkeling van nieuwe therapieën voor osteoporose heeft steeds meer aandacht gekregen. Rab27A wordt opgereguleerd tijdens osteoclastdifferentiatie, en N6-methyladenosine (m6A) modificatie is uitgegroeid tot een belangrijke epigenetische regulator bij orthopedische aandoeningen. Bio-informatische analyses voorspelden dat Rab27A meerdere m6A-modificatieplaatsen bevat en interageert met verschillende m6A-geassocieerde eiwitten. Knockdown-experimenten werden uitgevoerd om de rol van Rab27A in osteoclastdifferentiatie en osteoporose te evalueren met behulp van een ovariectomeerd (OVX) muismodel. Rab27A-depletie verminderde osteoporose en verhoogde het botvormingspercentage van 14,73% naar 28,13% (P < 0,05) bij OVX-muizen. Western blotting en kwantitatieve PCR toonden aan dat Rab27A knockdown de eiwit- en mRNA-expressie van de osteoclastmarkers TRAP, NFATc1 en c-FOS verminderde, waardoor de osteoclastdifferentiatie van beenmerg-afgeleide macrofagen (BMM's) geïnduceerd door macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) en receptoractivator van nucleaire factor-κB ligand (RANKL) werd onderdrukt. TRAP-kleuring toonde verder aan dat een uitputting van Rab27A de activiteit van TRAP significant verminderde van 24,1% naar 12,9% (P < 0,01) na M-CSF en RANKL-inductie. RNA-immunoprecipitatie-assays bevestigden interacties tussen Rab27A en de m6A-lezereiwitten YTHDC1 en IGF2BP2. Nucleaire en cytoplasmatische fractionering toonde aan dat YTHDC1 de cytoplasmatische export van m6A-gemodificeerde Rab27A faciliteert. Daarnaast toonden q-PCR- en western blot-analyses aan dat knockdown van ofwel YTHDC1 of IGF2BP2 de expressie van Rab27A verminderde en de expressie van TRAP, NFATc1 en c-FOS verminderde, waardoor de osteoclastdifferentiatie geïnduceerd door M-CSF en RANKL werd onderdrukt. Gezamenlijk geven deze bevindingen aan dat door YTHDC1 gemedieerde cytoplasmatische export en IGF2BP2-gemedieerde stabilisatie van m6A-gemodificeerde Rab27A osteoclastdifferentiatie bevorderen en bijdragen aan botverlies in het OVX-muismodel.

Inleiding

Osteoporose (OP) is een veelvoorkomende skeletaandoening die wordt gekenmerkt door achteruitgang van de botmicroarchitectuur en verminderde botmineralendichtheid, wat wereldwijd leidt tot een verhoogd risico op breuken 1,2,3. Osteoporotische fracturen komen het vaakst voor in de onderarm, humerus, heup en wervelkolom en komen vooral voor bij oudere volwassenen. Deze breuken verzwakken de kwaliteit van leven aanzienlijk en leggen aanzienlijke fysieke, psychologische en sociaaleconomische lasten op voor patiënten, hun families en zorgsystemen3. Daarom blijven preventie, beheer en behandeling van osteoporose belangrijke klinische en volksgezondheidsprioriteiten.

Er zijn verschillende therapeutische strategieën ontwikkeld voor osteoporose en kunnen over het algemeen worden ingedeeld in twee categorieën: botvormende middelen en anti-resorptieve therapieën 4,5. Traditionele anti-resorptieve middelen zijn bisfosfonaten, raloxifeen en strontiumranelaat, terwijl nieuwere middelen denosumab, odanacatib en saracatinib zijn. Botvormende therapieën omvatten parathyreoïdhormoon (PTH 1–84), terwijl verschillende aanvullende kandidaten, zoals MK-5442, AMG 785 en BHQ 880, nogklinische ontwikkeling ondergaan. Hoewel deze behandelingen effectief kunnen zijn, zijn veel daarvan geassocieerd met significante bijwerkingen, beperkte langetermijneffectiviteit of beperkingen op langdurig gebruik 4,6,7,8,9. Langdurige toediening van aminobisfosfonaten en denosumab kan bijvoorbeeld de normale botremodelleringbelemmeren. Daarom blijft het identificeren van veiligere en effectievere therapeutische doelen een belangrijk doel in osteoporoseonderzoek.

Rab-eiwitten zijn belangrijke regulatoren van intracellulaire vesikeltransport en celsignalering en nemen deel aan diverse biologische processen, waaronder virale infectie, autofagie en cytoskeletorganisatie10. In de afgelopen jaren is er steeds meer aandacht geweest voor de rol van Rab-familie-eiwitten in botmetabolisme en osteoporose. Rab44 is gerapporteerd als het regulerend van osteoclastdifferentiatie door het moduleren van intracellulaire Ca2⁺-signalering en het activeren van de nucleaire factor van geactiveerde T-cellen 1 (NFATc1) in receptoractivator van nucleaire factor-κB ligand (RANKL)-behandelde macrofagen11. Osteoclasten zijn meerkernige cellen afkomstig van macrofagen-voorlopers en spelen essentiële rollen bij botresorptie en skelethomeostase 12,13,14,15,16,17,18,19. Daarom is het begrijpen van de moleculaire mechanismen die osteoclastdifferentiatie reguleren cruciaal voor het ontwikkelen van nieuwe therapeutische benaderingen voor osteoporose.

Rab27A is een belangrijk lid van de Rab GTPase-familie en wordt veel tot expressie gebracht in secretorische en immuuncellen. Het speelt een cruciale rol bij blaastransport, exocytose en intracellulaire signalering 20,21,22,23,24,25,26,27. Eerdere studies hebben aangetoond dat Rab27A eosinofieldegranulatie reguleert tijdens luchtwegontsteking en de vesiculaire mobilisatie die geassocieerd wordt met NADPH oxidase-activiteit in geactiveerde macrofagencontroleert 20.23. Opmerkelijk is dat steeds meer bewijs aangeeft dat de expressie van Rab27A significant wordt opgereguleerd tijdens osteoclastdifferentiatie. Shimada-Sugawara et al. rapporteerden dat de expressie van Rab27A toeneemt tijdens de differentiatie van beenmerg-afgeleide macrofagen (BMM's) tot osteoklasten, wat wijst op een mogelijke rol in osteoclastogenese28. Gezamenlijk suggereren deze bevindingen dat Rab27A de vorming en functie van osteoclasten kan beïnvloeden door het reguleren van vesiculaire verkeers- en intracellulaire signaalroutes28,29.

N6-methyladenosine (m6A) is de meest voorkomende interne RNA-modificatie in eukaryote boodschapper-RNA's en niet-coderende RNA's en dient als een cruciale regulator van RNA-metabolisme en genexpressie. Als de eerste geïdentificeerde mRNA-modificatie bij zoogdieren is m6A betrokken bij tal van biologische processen, waaronder RNA-stabiliteit, splicing, transport en translatie. Wang et al. toonden aan dat m6A-modificaties, die vaak voorkomen binnen geconserveerde sequentiemotieven, worden herkend door YTH-domeinhoudende eiwitten en bijdragen aan de regulatie van mRNA-stabiliteit en metabolisme30. Bovendien is m6A-modificatie betrokken bij diverse biologische functies, waaronder genoomstabiliteit, transcriptieregulatie, chromatineorganisatie, kankerprogressie en immuunresponsen31. Recente studies hebben ook belangrijke rollen van m6A-signalering bij botgerelateerde ziekten en osteoporose32 benadrukt.

Onder m6A-lezereiwitten functioneert YTHDC1 als een nucleaire lezer die RNA-verwerking en nucleaire export reguleert, terwijl het insuline-achtige groeifactor 2 mRNA-bindend eiwit 2 (IGF2BP2) m6A-gemodificeerde transcripten in het cytoplasma stabiliseert. Chen et al. toonden aan dat YTHDC1 de nucleaire export van m6A-gemodificeerde circNSUN2 bevordert, die vervolgens met IGF2BP2 interageert om HMGA2-mRNA te stabiliseren en colorectale kankermetastase33 te bevorderen. Deze bevindingen suggereren dat gecoördineerde regulatie door YTHDC1 en IGF2BP2 een algemeen mechanisme kan zijn dat het lot van m6A-gemodificeerde transcripten controleert.

De huidige studie onderzocht voorspelde m6A-modatieplaatsen binnen Rab27A mRNA en onderzocht de interacties met YTHDC1 en IGF2BP2. Van YTHDC1 werd vastgesteld dat het de nucleaire export van m6A-gemodificeerde Rab27A-transcripten vergemakkelijkte, terwijl IGF2BP2 interageerde met Rab27A in het cytoplasma en de stabiliteit ervan verbeterde. Door dit regulerende mechanisme bevorderde Rab27A de differentiatie van osteoclast en droeg het bij aan de progressie van osteoporose. Gezamenlijk identificeren de bevindingen een voorheen niet erkende m6A-afhankelijke regulatieroute die YTHDC1, IGF2BP2 en Rab27A omvat bij osteoclastdifferentiatie. Deze resultaten bieden nieuwe inzichten in de moleculaire pathogenese van osteoporose en kunnen de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën vergemakkelijken gericht op m6A-gemedieerde regulatie van Rab27A.

Protocol

Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door de Commissie voor Dierbescherming en Benutting van het Affiliated Hospital van Southwest Medical University (Goedkeuringsnr. 2024-Ethics-042). Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de ARRIVE-richtlijnen, de Britse Animals (Scientific Procedures) Act 1986 en bijbehorende richtlijnen, EU-richtlijn 2010/63/EU, en de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publicatie nr. 8023, herzien 1978). Muizen werden willekeurig toegewezen aan experimentele groepen en de toewijzingsvolgorde werd voor de onderzoeker verborgen. Alle gegevensverzameling en -analyses, inclusief histologische evaluatie, micro-computertomografie (micro-CT) beeldanalyse en statistische analyses, werden uitgevoerd door onderzoekers die blind waren voor groepstoewijzing. Geen dieren of monsters werden uitgesloten van de analyses. Alle reagentia, apparatuur, software en andere middelen die in dit protocol worden gebruikt, staan vermeld in de Materiaalkunde.

1. Constructie van het Ovariectomiemodel (OVX)

Vierentwintig vrouwelijke wildtype C57BL/6 muizen van 8 weken oud werden gebruikt om een osteoporosemodel op te zetten. Na een acclimatisatieperiode van één week werden muizen willekeurig toegewezen aan de Sham- of OVX-groep. Het OVX-model werd vastgesteld door bilaterale ovariectomie zoals eerder beschreven 34,35. Sham-opererende muizen ondergingen een chirurgische blootstelling van de eierstokken zonder verwijdering.

Voor intrafemorale genafgifte werden lentivirale vectoren die sh-Rab27A of sh-NC expressief uitdrukken, 7 dagen na de OVX-operatie geïnjecteerd, zoals eerder gerapporteerd36,37. Kort gezegd werden geconcentreerde lentivirale deeltjes (1 × 106 transducerende eenheden/mL) via de patellaire route in het dijbeen geïnjecteerd met een 22-gauge naald onder narcose. Elke muis kreeg 20 μL lentivirale suspensie. De incisie werd vervolgens gehecht en de dieren werden gedurende het herstel gemonitord.

Alle dierproeven werden uitgevoerd onder specifieke ziekteverwekkervrije omstandigheden. Femure monsters werden 8 weken na de operatie afgenomen. Minstens zes muizen per groep werden gebruikt voor histologische analyses en RNA- of eiwitextractie.

2. In-vivo micro-CT beeldvorming

Micro-computertomografie (micro-CT) werd uitgevoerd om de morfologie van het trabeculaire bot te evalueren. Het rechter scheenbeen van elke muis werd in vivo gescand vóór de OVX-operatie op 14 weken leeftijd. Vervolgscans werden wekelijks uitgevoerd tot de leeftijd van 22 weken. Minstens zes muizen per groep werden opgenomen in de micro-CT-analyse.

Muizen werden verdoofd met intraperitoneale natriumpentobarbital (50 mg/kg lichaamsgewicht). Voldoende anesthesie werd bevestigd door het ontbreken van de teenpnijpreflex en door continue monitoring van de ademhalingsfrequentie, en deze werd gedurende de hele beeldvorming gehandhaafd. Alle euthanasieprocedures werden uitgevoerd in overeenstemming met het goedgekeurde dierenprotocol, institutionele richtlijnen voor dierenwelzijn en nationale regelgeving voor laboratoriumdieren euthanasie.

Op 24-jarige leeftijd werden muizen geëuthanaseerd door cervicale ontwrichting na diepe anesthesie, en beide scheenbeen werden geoogst voor ex vivo scanning met hetzelfde beeldvormingsprotocol. De scanparameters omvatten een voxelgrootte van 10,4 μm, een spanning van 55 kV, een stroom van 145 μA, een gezichtsveld van 32 mm, 1500/750 monsters per projectie en een integratietijd van 100 ms.

Beelden werden verwerkt met een derde-orde polynomiale beam-hardening correctie-algoritme gekalibreerd tegen een 1200 mg HA/cm3 phantom. Botvolumefractie (BV/TV), trabeculaire dikte (Tb.Th) en trabeculaire aantal (Tb.N) werden gekwantificeerd in de distale femorale metafyse die zich 1,0 mm proximaal van de groeiplaat bevindt.

3. Plasmidtransfectie

sh-Rab27A- en sh-NC-plasmiden werden gegenereerd en gebruikt voor de productie van lentivirussen. Lentivirale verpakkingsplasmiden en shRNA-constructies werden volgens de instructies van de fabrikant co-transfecteerd in HEK293T cellen. Virale titers werden bepaald vóór intrafemorale toediening, zoals eerder beschreven36. Er werden drie onafhankelijke biologische replicaten uitgevoerd.

4. Hematoxyline- en eosinekleuring (HE)

Femorale monsters werden 24 uur gefixeerd in 4% paraformaldehyde, 4 weken gedecalcificeerd in 10% EDTA, cryobeschermd in 30% sucrose/PBS, ingebed in paraffine en gesneden op een dikte van 5 μm. Weefseldoorsneden werden gekleurd met hematoxyline en eosine en onderzocht met een lichtmicroscoop. Er werden minstens zes muizen per groep geanalyseerd.

5. Tartraatbestendige zuurfosfatase (TRAP) kleuring

TRAP-kleuring van femorale secties werd uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant38. TRAP-activiteit in beenmerg-afgeleide macrofagen (BMM's) werd geëvalueerd met behulp van een TRAP-kleuringsassay. Rijpe osteoclasten werden gedefinieerd als TRAP-positieve multinucleaire cellen met ten minste drie kernen. Er werden drie onafhankelijke biologische replicaten uitgevoerd, elk met drie technische replicaten.

6. q-PCR

Totaal RNA werd geïsoleerd met behulp van TRIzol-reagens volgens de instructies van de fabrikant. Complementair DNA werd gesynthetiseerd met reverse transcriptase en onderworpen aan kwantitatieve realtime PCR met behulp van SYBR Green-chemie. Er werden drie onafhankelijke biologische replicaten uitgevoerd, elk met drie technische replicaten.

De primerreeksen waren als volgt:

Rab27A: F, TTCCTGCTTCTGTTCGACCT; R, GGCAGCACTGGTTTCAAAAT

VAL: F, TGTTGACAGCGGTCCATCTA; R, CCTCCTTCTTAACCCGAAGC

NFATc1: F, GGTGCTGTCTGGCCATAACT; R, GCGGAAAGGTGGTATCTCAA

C-FOS: F, TACTACCATTCCAGCCGA; R, GCTGTCACCGTGGGGATAAA

YTHDC1: F, GAAGTGGAAGCTCTGCATCAG; R, TTGATCTTTTCGGACAGCACG

IGF2BP2: F, GACTACCCCGACCAGAACTG; R, GAGGCGGGATGTTCCGAATC

β-actine: F, GGGAAATCGTGGTGACATTAAG; R, TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG

7. Western-blotting

Cellen of weefsels werden gelyseerd met behulp van een RIPA-buffer aangevuld met proteaseremmers. De eiwitconcentraties werden bepaald met behulp van een Bradford-assay. Gelijke hoeveelheden eiwit (20 μg) werden gescheiden door SDS-PAGE en overgebracht naar polyvinylidienfluoride (PVDF) of nitrocellulosemembranen. De membranen werden 1 uur lang geblokkeerd met 5% magere melk bij kamertemperatuur en 's nachts geïncubeerd bij 4 °C met primaire antilichamen tegen TRAP, NFATc1, c-FOS, Rab27A, YTHDC1, IGF2BP2 of β-actine. Na het wassen werden membranen geïncubeerd met de juiste secundaire antilichamen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Eiwitbanden werden visualiseerd met standaard detectieprocedures. Er werden drie onafhankelijke biologische replicaten uitgevoerd.

8. Celcultuur

Macrofagen (BMM's) afkomstig van beenmerg werden geïsoleerd zoals eerder beschreven39. Beenmergcellen die uit muisdijbeen werden geoogst, werden 's nachts gekweekt in α-minimaal essentieel medium, aangevuld met 10% foetaal rundserum, 30 ng/mL macrofagenkoloniestimulerende factor (M-CSF) en 1% penicilline/streptomycine bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO₂. Niet-hechtende cellen werden verzameld en gekweekt in een stromaalcelvrij systeem met 30 ng/mL M-CSF. Na 3 dagen werden adherente cellen als BMM's geoogst en verder gekweekt in aanwezigheid van 30 ng/mL M-CSF en 50 ng/mL receptoractivator van nucleaire factor-κB ligand (RANKL) gedurende 72 uur om osteoclastdifferentiatie te induceren.

9. RNA-interferentie (RNAi)

Kleine interfererende RNA's (siRNA's) werden gesynthetiseerd en getransfecteerd met behulp van een lipide-gebaseerd transfectie-reagens volgens de instructies van de fabrikant. Cellen werden gezaaid met een dichtheid van 2 × 104 cellen per put in platen met zes putjes vóór transfectie. Er werden drie onafhankelijke biologische replicaten uitgevoerd.

De doelsequenties waren als volgt:

si-Rab27A: GGACUUAAUCAUCTAAGAGAAUGGAA

si-YTHDC1: GCAAGGAGUGUUAUCUUAATT

si-IGF2BP2: CCGUUAACCAACAAGCCAATT

10. Immunofluorescentie

De cellen werden 20 minuten gefixeerd met 4% paraformaldehyde en 10 minuten permeabilisiseerd met 0,1% Triton X-100. Na 30 minuten blokken met 5% rundereserumalbumine, werden cellen 's nachts geïncubeerd met primaire antilichamen bij 4 °C.

Na het wassen werden fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichamen 30 minuten bij kamertemperatuur aangebracht. Kernen werden tegengekleurd met DAPI en beelden werden gemaakt met behulp van confocale microscopie. Er werden drie onafhankelijke biologische replicaten uitgevoerd.

11. Nucleaire en cytoplasmatische scheiding

Nucleaire en cytoplasmatische fracties werden geïsoleerd volgens de instructies van de fabrikant. Cellen werden 10 minuten op ijs gelyseerd en 3 minuten gecentrifugeerd bij 500 × g bij 4 °C. Het supernatant met cytoplasmatische componenten werd verzameld, terwijl de pellet met kernen werd gewassen en apart verwerkt.

12. RNA-bindende eiwitimmunoprecipitatie (RIP)

RNA-immunoprecipitatie (RIP) assays werden uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. Kort werden cellen 30 minuten op ijs gelyseerd. Na centrifugatie werden de supernatanten 's nachts geïncubeerd met antilichamen en eiwit A/G agarosekralen. Na het wassen werden immunoprecipitatieve eiwitten geanalyseerd met western blotting, en co-immunoprecipiteerd RNA werd geanalyseerd met kwantitatieve realtime PCR. Er werden drie onafhankelijke biologische replicaten uitgevoerd.

13. Rab27A mRNA stabiliteitsassay

Totaal RNA werd op de aangegeven tijdstippen na IGF2BP2 knockdown verwijderd. Vervolgens werden omgekeerde transcriptie en kwantitatieve realtime PCR uitgevoerd. De Rab27A mRNA-niveaus werden genormaliseerd naar de overeenkomstige si-NC-groep bij 0 uur. Er werden drie onafhankelijke biologische replicaten uitgevoerd.

14. Statistische analyse

Alle experimenten werden onafhankelijk uitgevoerd met ten minste drie biologische replicata. Voor q-PCR, RNA-interferentie, TRAP-kleuring, western blotting en andere celgebaseerde assays omvatte elke biologische replicatie drie technische replicaten, tenzij anders gespecificeerd. De gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde ± standaarddeviatie (SD).

Statistische analyses werden uitgevoerd met GraphPad Prism versie 9.0 en SPSS-software. Vergelijkingen tussen twee groepen werden uitgevoerd met behulp van een tweezijdige Student's t-test. Vergelijkingen tussen meerdere groepen werden geanalyseerd met behulp van een tweerichtingsvariantieanalyse (ANOVA), gevolgd door Tukey's multiple comparison post hoc test om te corrigeren voor meervoudige vergelijkingen. Een P-waarde < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

Knockdown van Rab27A verminderde osteoporose in vivo.

Om de rol van Rab27A bij osteoporose te onderzoeken, werd Rab27A knockdown uitgevoerd in een eierrot (OVX) muismodel dat eerder gerapporteerd is met methoden34,40. Het algemene onderzoeksontwerp wordt samengevat in Figuur 1. Micro-computertomografie toonde aan dat botmineraaldichtheid, botvolumefractie (BV/TV), trabeculaire dikte (Tb.Th) en trabeculair aantal (Tb.N) significant verminderd waren bij OVX-muizen vergeleken met Sham-controles (Figuur 2A). Deze bevindingen bevestigden het succesvolle vestigen van het osteoporosemodel. Rab27A knockdown herstelde significant alle gemeten botstructurele parameters, wat wijst op verzwakking van door OVX veroorzaakt botverlies en microarchitecturale achteruitgang (Figuur 2A).

Histologisch onderzoek ondersteunde deze bevindingen verder. Hematoxyline- en eosine kleuring toonden duidelijk trabeculair botverlies en verstoring van de trabeculaire architectuur bij OVX-muizen vergeleken met de Sham-groep (Figuur 2B). Daarentegen verlichtte de uitputting van Rab27A de trabeculaire achteruitgang en herstelde gedeeltelijk de botmorfologie (Figuur 2B). Aangezien Rab27A betrokken is bij osteoclastdifferentiatie28, werd osteoclastactiviteit geëvalueerd door tartrateresistente zuurfosfatase (TRAP) kleuring. De activiteit van TRAP was duidelijk verhoogd bij OVX-muizen ten opzichte van Sham-controles en was significant verminderd na de knockdown van Rab27A (Figuur 2C).

De expressie van osteoclast-geassocieerde markers werd vervolgens onderzocht. Western blot-analyse toonde aan dat de eiwitniveaus van Rab27A, TRAP, NFATc1 en c-FOS significant verhoogd waren bij OVX-muizen en verminderd na een uitputting van Rab27A (Figuur 2D). Consistente resultaten werden verkregen op transcriptieniveau, waarbij kwantitatieve realtime PCR (q-PCR) vergelijkbare expressiepatronen toonde voor Rab27A, TRAP, NFATc1 en c-FOS mRNA-expressie (Figuur 2E).

figure-results-1
Figuur 1: Schematisch overzicht van het experimentele ontwerp en het voorgestelde regulerende mechanisme ten grondslag aan YTHDC1- en IGF2BP2-gemedieerde regulatie van m6A-gemodificeerde Rab27A tijdens osteoclastdifferentiatie en osteoporoseprogressie. Een ovariectomeerd (OVX) muismodel en receptoractivator van nucleaire factor-κB ligand (RANKL)/macrofagen koloniestimulerende factor (M-CSF)-geïnduceerde osteoclastdifferentiatiemodel werden gebruikt om de rol van Rab27A in osteoclastogenese te onderzoeken. Rab27A knockdown-, nucleaire en cytoplasmatische fractionering en RNA-immunoprecipitatie-assays werden uitgevoerd om osteoclastdifferentiatiemarkers (TRAP, NFATc1 en c-FOS), Rab27A-expressie en subcellulaire lokalisatie te evalueren. YTHDC1 faciliteerde de cytoplasmatische export van m6A-gemodificeerde Rab27A, terwijl IGF2BP2 Rab27A in het cytoplasma stabiliseerde. Samen bevorderden deze gecoördineerde regulerende mechanismen de differentiatie van osteoclast en droegen ze bij aan botverlies in het OVX-model. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Knockdown van Rab27A verminderde osteoporose in vivo. (A) Trabeculaire botmorfometrische analyse. Botmineraaldichtheid, botvolumefractie (BV/TV), trabeculaire dikte (Tb.Th) en trabeculair getal (TBN) werden gekwantificeerd. **P < 0,01, ***P < 0,001. (B) Histologische beoordeling van het femorale trabeculaire bot na uitputting van Rab27A. Hematoxyline- en eosinekleuring (HE) werd uitgevoerd om structurele veranderingen in het distale dijbeen te evalueren. OVX- en OVX + sh-NC-groepen dienden als controles. Schaalbalk = 50 μm. ***P < 0,001. (C) TRAP-kleuring van dijbeensecties. De activiteit van TRAP werd geëvalueerd om de osteoclastactiviteit te beoordelen. OVX- en OVX + sh-NC-groepen dienden als controles. Schaalbalk = 50 μm. ***P < 0,001. (D–E) Expressie van Rab27A, TRAP, NFATc1 en c-FOS na Rab27A-uitputting. Eiwitexpressie werd bepaald door western blotting (D), en mRNA-expressie werd bepaald door q-PCR (E). β-actine diende als laadregeling. **P < 0,01, ***P < 0,001. De Sham-groep onderging chirurgische blootstelling van de eierstokken zonder ovariectomie, terwijl de OVX-groep een bilaterale ovariectomie onderging. sh-NC, negatieve controle korte haarspeld-RNA. Zes muizen werden in elke experimentele groep opgenomen. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Knockdown van Rab27A-onderdrukte osteoclastdifferentiatie van BMM's geïnduceerd door M-CSF en RANKL

Om de rol van Rab27A tijdens osteoclastogenese verder te evalueren, werden beenmerg-afgeleide macrofagen (BMM's) gestimuleerd met macrofagenkoloniestimulerende factor (M-CSF) en receptoractivator van nucleaire factor-κB-ligand (RANKL) om osteoclastdifferentiatie te induceren28.

Kwantitatieve realtime PCR- en western blot-analyses toonden aan dat M-CSF- en RANKL-stimulatie Rab27A mRNA en eiwitexpressie significant verhoogde, terwijl transfectie met si-Rab27A effectief de expressie van Rab27A verminderde (Figuur 3A, B). TRAP-kleuring toonde een duidelijke toename van osteoclastactiviteit na behandeling met M-CSF en RANKL. Rab27A knockdown verminderde de TRAP-activiteit significant vergeleken met de geïnduceerde groep (Figuur 3C).

De expressie van osteoclastdifferentiatiemarkers werd vervolgens onderzocht. Kwantitatieve realtime PCR-analyse toonde aan dat de niveaus van TRAP, NFATc1 en c-FOS mRNA significant verhoogd waren na osteoclastinductie en verminderd door Rab27A-depletie (Figuur 3D). Vergelijkbare resultaten werden op eiwitniveau waargenomen door western blotting (Figuur 3E).

figure-results-3
Figuur 3: Knockdown van Rab27A-onderdrukte osteoclastdifferentiatie van beenmerg-afgeleide macrofagen (BMM's) geïnduceerd door M-CSF en RANKL. (A–B) Expressie van Rab27A na osteoclastinductie. Rab27A mRNA (A) en eiwit (B) niveaus werden respectievelijk bepaald door q-PCR en western blotting. β-actine diende als laadregeling. P < 0,001. (C) TRAP-kleuring van BMM-afgeleide osteoclasten. Verhoogde TRAP-activiteit veroorzaakt door M-CSF en RANKL werd onderdrukt na de knockdown van Rab27A. Schaalbalk = 50 μm. ***P < 0,001. (D–E) Expressie van osteoclastdifferentiatiemarkers na Rab27A-depletie. TRAP-, NFATc1- en c-FOS-mRNA-niveaus werden bepaald door q-PCR (D), en eiwitniveaus werden bepaald door western blotting (E). β-actine diende als laadregeling. **P < 0,01, ***P < 0,001. Controle, onbehandelde cellen; si-NC, negatieve controle siRNA. Er werden drie onafhankelijke biologische replicaten uitgevoerd. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De cytoplasmatische export van m6A-gemodificeerde Rab27A werd gefaciliteerd door YTHDC1

Om de mogelijke rol van m6A-modificatie in de regulatie van Rab27A te onderzoeken, werden bio-informatische analyses uitgevoerd. Meerdere voorspelde m6A-modiatieplaatsen werden geïdentificeerd in het Rab27A-transcript (Figuur 4A). Daarnaast suggereerde interactievoorspellingsanalyse mogelijke associaties tussen Rab27A en de m6A-lezereiwitten YTHDC1 en IGF2BP2 (Figuur 4B).

Om de interactie tussen YTHDC1 en Rab27A mRNA te valideren, werden RNA-immunoprecipitatie (RIP) assays uitgevoerd. Rab27A mRNA was significant verrijkt in complexen die geimmunoprecipiteerd waren met het anti-YTHDC1-antilichaam vergeleken met de immunoglobuline G (IgG) controle (Figuur 4C).

Omdat YTHDC1 fungeert als een nucleaire m6A-lezer die betrokken is bij RNA-export41, werden nucleaire en cytoplasmatische fractionatie-assays uitgevoerd. YTHDC1 knockdown verhoogde significant de nucleaire retentie van Rab27A mRNA terwijl de cytoplasmatische abundantie werd verminderd (Figuur 4D).

Het effect van YTHDC1 op de expressie van Rab27A werd verder geëvalueerd. Kwantitatieve realtime PCR-analyse toonde aan dat YTHDC1-depletie de expressie van Rab27A mRNA verminderde (Figuur 4E). Consistent toonde western blot-analyse een verminderde expressie van Rab27A-eiwitten na YTHDC1-knockdown (Figuur 4F).

figure-results-4
Figuur 4: De cytoplasmatische export van m6A-gemodificeerde Rab27A werd mogelijk gemaakt door YTHDC1. (A) Voorspelde m6A-modificatielocaties binnen Rab27A geïdentificeerd met behulp van de SRAMP-voorspellingstool. (B) Voorspelde interacties tussen Rab27A en de m6A-lezereiwitten YTHDC1 en IGF2BP2 geïdentificeerd met StarBase. (C) RNA-immunoprecipitatie (RIP) assay die de interactie tussen YTHDC1 en Rab27A mRNA aantoont. **P < 0,01. IgG diende als negatieve controle. Rab27A-verrijking werd genormaliseerd naar het percentage input. De YTHDC1 immunoblotband weerspiegelt de efficiëntie van immunoprecipitatie. (D) Nucleaire en cytoplasmatische fractionatieanalyse die verhoogde kernretentie van Rab27A aantoont na YTHDC1 knockdown. **P < 0,01, ***P < 0,001. (E–F) Expressie van YTHDC1 en Rab27A na YTHDC1 knockdown. mRNA-expressie werd bepaald door q-PCR (E), en eiwitexpressie werd bepaald door western blotting (F). β-actine diende als laadregeling. **P < 0,01. si-NC, negatieve controle siRNA. Er werden drie onafhankelijke biologische replicaten uitgevoerd. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Stabilisatie van Rab27A door interactie met IGF2BP2

De interactie tussen IGF2BP2 en Rab27A werd onderzocht met behulp van RIP-assays. Rab27A mRNA was significant verrijkt in complexen die immunoprecipiteerd waren met anti-IGF2BP2 antilichamen vergeleken met de IgG-controle, wat wijst op een associatie tussen IGF2BP2 en Rab27A mRNA (Figuur 5A).

Immunofluorescentieanalyse toonde co-lokalisatie van IGF2BP2 en Rab27A voornamelijk binnen het cytoplasma (Figuur 5B). Om het functionele effect van IGF2BP2 op Rab27A-expressie te bepalen, werd IGF2BP2 gesilenced met siRNA. Kwantitatieve realtime PCR-analyse toonde een significante vermindering van Rab27A mRNA-niveaus na IGF2BP2 uitputting (Figuur 5C). In overeenstemming met deze bevindingen toonde western blot-analyse een verminderde expressie van Rab27A-eiwitten na IGF2BP2 knockdown (Figuur 5D).

Het effect van IGF2BP2 op de stabiliteit van Rab27A mRNA werd vervolgens geëvalueerd. IGF2BP2 uitputting verkortte de halveringstijd van Rab27A mRNA aanzienlijk en verminderde de transcriptstabiliteit (Figuur 5E).

figure-results-5
Figuur 5: Stabilisatie van Rab27A door interactie met IGF2BP2. (A) RNA-immunoprecipitatietest die de associatie tussen IGF2BP2 en Rab27A mRNA aantoont. IgG diende als negatieve controle. Rab27A-verrijking werd genormaliseerd naar het percentage input. P < 0,001. (B) Immunofluorescentieanalyse die co-lokalisatie van Rab27A en IGF2BP2 in het cytoplasma aantoont. De kernen werden tegengekleurd met DAPI. Schaalbalk = 20 μm. (C–D) Downregulatie van Rab27A na IGF2BP2 uitputting. Rab27A mRNA-niveaus werden bepaald door q-PCR (C), en eiwitniveaus werden bepaald door western blotting (D). β-actine diende als laadregeling. **P < 0,01, ***P < 0,001. (E) Rab27A mRNA-stabiliteit na IGF2BP2 knockdown. Rab27A mRNA-niveaus werden genormaliseerd naar de overeenkomstige si-NC-groep bij 0 uur. **P < 0,01. si-NC, negatieve controle siRNA. Er werden drie onafhankelijke biologische replicaten uitgevoerd. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Stilte van YTHDC1 of IGF2BP2 onderdrukte osteoclastdifferentiatie van BMM's geïnduceerd door M-CSF en RANKL

Om de functionele relatie tussen YTHDC1, IGF2BP2 en Rab27A tijdens osteoclastdifferentiatie verder te onderzoeken, werden knockdown-experimenten uitgevoerd in BMM's.

M-CSF en RANKL-stimulatie verhoogden significant de mRNA-expressie van Rab27A, YTHDC1 en IGF2BP2 (Figuur 6A). Overeenkomstig was de eiwitexpressie van deze moleculen ook verhoogd na osteoclastinductie (Figuur 6B). Het stilhouden van ofwel YTHDC1 of IGF2BP2 verminderde de expressie van Rab27A significant, terwijl het neerzetten van de ene regulator de expressie van de andere niet wezenlijk beïnvloedde.

TRAP-kleuring toonde aan dat uitputting van YTHDC1 of IGF2BP2 de osteoclastactiviteit geïnduceerd door M-CSF en RANKL significant onderdrukte (Figuur 6C). Bovendien toonde kwantitatieve realtime PCR-analyse een verminderde expressie van TRAP, NFATc1 en c-FOS na YTHDC1 of IGF2BP2 knockdown (Figuur 6D). Western blot-analyse bevestigde overeenkomstige reducties op eiwitniveau (Figuur 6E).

Gezamenlijk geven deze bevindingen aan dat YTHDC1 en IGF2BP2 osteoclastdifferentiatie bevorderen door regulatie van de expressie van Rab27A.

figure-results-6
Figuur 6: Stilte van YTHDC1 of IGF2BP2 onderdrukte osteoclastdifferentiatie van BMM's geïnduceerd door M-CSF en RANKL. (A–B) Expressie van Rab27A na YTHDC1 of IGF2BP2 knockdown. Rab27A mRNA (A) en eiwit (B) niveaus werden respectievelijk bepaald door q-PCR en western blotting. β-actine diende als laadregeling. P < 0,001. (C) TRAP-kleuring die onderdrukking van osteoclastactiviteit na YTHDC1 of IGF2BP2 uitputting aantoont. Schaalbalk = 50 μm. **P < 0,01, ***P < 0,001. (D–E) Expressie van osteoclastdifferentiatiemarkers na YTHDC1 of IGF2BP2 depletie. TRAP-, NFATc1- en c-FOS-mRNA-niveaus werden bepaald door q-PCR (D), en eiwitniveaus werden bepaald door western blotting (E). β-actine diende als laadregeling. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Controle, onbehandelde cellen; si-NC, negatieve controle siRNA. Er werden drie onafhankelijke biologische replicaten uitgevoerd. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

BESCHIKBAARHEID GEGEVENS:

De datasets die tijdens de huidige studie zijn gebruikt en/of geanalyseerd (inclusief western blot-gegevens, beeldvormingsdatasets, kwantitatieve analyses en bronbestanden) zijn verstrekt in Supplementair Bestand 1.

Aanvullend Bestand 1: De datasets en ruwe gegevens van deze studie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Osteoclastdifferentiatie speelt essentiële rollen bij botremodellering, botresorptie, breukherstel en skelethomeostase12˒15˒17˒18˒42˒43. Overmatige osteoclastactiviteit is een belangrijke factor in osteoporose, waardoor het identificeren van regulerende routes die osteoclastdifferentiatie reguleren een belangrijk onderzoeksdoel is. Verschillende anti-resorptieve therapieën gericht op de osteoclastfunctie hebben klinische effectiviteit aangetoond 6,44,45. Zo is denosumab in verband gebracht met een verminderde breukincidentie en een gunstig veiligheidsprofiel6, terwijl de cathepsine K-remmer ONO-5334 gunstige effecten heeft getoond op botmineralendichtheid en botsterkte bij ovariectomiseerde niet-menselijke primaten44. De huidige studie identificeerde een eerder niet erkend m6A-afhankelijk regulerend mechanisme waarbij YTHDC1, Rab27A en IGF2BP2 betrokken is, dat osteoclastdifferentiatie en de progressie van osteoporose bevordert. Deze bevindingen bieden nieuwe inzichten in de moleculaire regulatie van osteoclastogenese en suggereren potentiële therapeutische doelwitten voor osteoporose.

Rab27A is eerder betrokken geweest bij osteoclastdifferentiatie en botresorptie door regulatie van vesiculaire transport en intracellulaire signalering en kan ook invloed uitoefenen op door RANKL-geïnduceerde signaalcascades via endosomale recycling van belangrijke receptoren28,29. In overeenstemming met deze rapporten was de expressie van Rab27A duidelijk verhoogd tijdens osteoclastdifferentiatie, terwijl uitputting van Rab27A osteoclastdifferentiatie in vitro onderdrukte en osteoporose-geassocieerd botverlies in vivo verlichtte. Deze bevindingen ondersteunen een cruciale rol van Rab27A in de osteoclastbiologie en breiden eerdere observaties verder uit door aan te tonen dat de activiteit van Rab27A wordt gereguleerd via m6A-afhankelijke mechanismen. Gezamenlijk suggereren de bevindingen dat m6A-gemodificeerde Rab27A deze processen op post-transcriptieniveau kan reguleren en daardoor de botresorptieve activiteit kan beïnvloeden.

Steeds meer bewijs wijst erop dat m6A-modificatie bijdraagt aan de ontwikkeling en progressie van botgerelateerde ziekten32. Bio-informatische analyses identificeerden meerdere veronderstelde m6A-modiatieplaatsen binnen Rab27A mRNA (Figuur 4A), en functionele studies toonden aan dat YTHDC1 en IGF2BP2 de expressie van Rab27A en de differentiatie van osteoclast reguleren (Figuren 4–6). Deze bevindingen suggereren dat m6A-modificatie een belangrijk regulatief mechanisme is dat de functie van Rab27A tijdens osteoclastogenese reguleert. Omdat meerdere voorspelde m6A-locaties binnen Rab27A zijn geïdentificeerd, moeten toekomstige studies bepalen of individuele locaties of combinaties van locaties nodig zijn voor de regulatie van Rab27A. De constructie van m6A-deficiënte Rab27A-mutanten en daaropvolgende reddingsexperimenten zouden direct bewijs leveren voor het functionele belang van m6A-modificatie in dit pad.

Mechanistisch toonde de huidige studie aan dat YTHDC1 interageert met Rab27A mRNA en de export ervan van kernenergie vergemakkelijkt. Na cytoplasmatische translocatie associeert IGF2BP2 direct met Rab27A mRNA en verbetert het de transcriptstabiliteit. Daardoor verminderde de uitputting van ofwel YTHDC1 of IGF2BP2 de expressie van Rab27A en onderdrukte het de osteoclastdifferentiatie. Deze bevindingen ondersteunen een model waarin YTHDC1 en IGF2BP2 samenwerken om de expressie van Rab27A te behouden door het coördineren van mRNA-transport en stabiliteit. Dit regulerende mechanisme vergroot het huidige begrip van m6A-gemedieerde regulatie van osteoclastdifferentiatie en identificeert meerdere componenten van deze route als potentiële therapeutische doelwitten.

Verschillende beperkingen moeten worden erkend. Ten eerste, hoewel is aangetoond dat Rab27A osteoclastdifferentiatie reguleert, zijn de potentiële effecten op de osteoblastfunctie nog niet onderzocht. Omdat bothomeostase afhangt van de balans tussen osteoclast-gemedieerde botresorptie en osteoblast-gemedieerde botvorming, moeten toekomstige studies evalueren of Rab27A ook invloed heeft op osteoblastdifferentiatie of -activiteit. Ten tweede baseerde de huidige studie zich voornamelijk op functieverlies-benaderingen. Complementaire overexpressie van Rab27A, YTHDC1 en IGF2BP2, samen met reddingsexperimenten met m6A-deficiënte Rab27A-mutanten, zou het voorgestelde reguleringsmodel verder versterken. Ten derde, hoewel verschillende vermeende m6A-locaties binnen Rab27A mRNA zijn voorspeld met bio-informatische benaderingen, blijven de specifieke locaties die verantwoordelijk zijn voor de regulatie van de functie van Rab27A onbekend en vereisen ze experimentele validatie. Tot slot zijn aanvullende studies nodig om te bepalen of andere m6A-lezerseiwitten, RNA-bindende eiwitten of signaalroutes deelnemen aan de regulatie van Rab27A tijdens osteoclastdifferentiatie.

Immuunregulatie is uitgegroeid tot een belangrijk onderdeel van osteoporose pathogenese46,47. Rab27A heeft gevestigde functies in de secretie van immuuncellen, het vrijgeven van cytotoxische granulaten, degranulatie van neutrofilen en de regulatie van de weefselmicro-omgeving 48,49,50,51,52,53,54,55. Verder onderzoek naar de relatie tussen Rab27A, immuunregulatie en bothomeostase kan extra inzicht geven in de pathogenese van osteoporose.

Toekomstige onderzoeken moeten prioriteit geven aan verschillende belangrijke gebieden. Ten eerste is systematische mutagenese van de voorspelde m6A-plaatsen binnen Rab27A vereist om de functionele bindingsplaatsen te identificeren die betrokken zijn bij YTHDC1- en IGF2BP2-gemedieerde regulatie. Ten tweede zal overexpressie van Rab27A, YTHDC1 en IGF2BP2, samen met reddingsexperimenten met m6A-deficiënte Rab27A-mutanten, essentieel zijn om de directe bijdrage van de YTHDC1/Rab27A/IGF2BP2 regulerende as vast te stellen. Ten derde zal validatie van dit pad in aanvullende osteoporosemodellen en evaluatie van de functie van Rab27A in osteoblasten belangrijk zijn om de huidige bevindingen verder te onderbouwen.

Concluderend identificeerde de huidige studie een nieuwe YTHDC1/Rab27A/IGF2BP2 regulerende as die osteoclastdifferentiatie en de progressie van osteoporose bevordert. YTHDC1 faciliteerde de nucleaire export van m6A-gemodificeerd Rab27A mRNA, terwijl IGF2BP2 de stabiliteit van Rab27A mRNA in het cytoplasma verbeterde. Deze gecoördineerde regulatoire gebeurtenissen verhoogden de expressie van Rab27A en bevorderden de osteoclastogenese. Gezamenlijk vergroten de bevindingen het huidige begrip van m6A-gemedieerde regulatie bij osteoporose en vormen ze een basis voor het ontwikkelen van therapeutische strategieën gericht op de YTHDC1/Rab27A/IGF2BP2 route.

Openbaarmakingen

De auteurs geven geen concurrerende financiële belangen of belangenconflicten aan.

Dankbetuigingen

Dit werk werd financieel ondersteund door het Wetenschappelijk en Technologisch Strategisch Samenwerkingsproject tussen het Pengzhou Volksziekenhuis en de Southwest Medical University (subsidienummer 2023PZXNYD01) aan Lian Tang.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
4% ParaformaldehydeThermo Fisher ScientificA5818101Tissue and cell fixation
Alexa Fluor 488 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-11001Fluorescent secondary antibody for immunofluorescence; RRID: AB_2534069
Alexa Fluor 546 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-11035Fluorescent secondary antibody for immunofluorescence; RRID: AB_2534093
Bovine serum albumin (BSA)MerckA2153Blocking reagent
Bradford Protein AssayMerckB6916Protein quantification
C57BL/6JSlac miceShanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd.—Female, 8 weeks old; RRID: MGI:2159769
c-FOS antibodyAbcamab222699Primary antibody for western blotting; RRID: AB_2891049
Confocal laser scanning microscope (SP8)Leica MicrosystemsSP8Immunofluorescence image acquisition; RRID: SCR_018169
DAPIThermo Fisher ScientificD3571Nuclear counterstain for immunofluorescence; RRID: AB_2307445
EDTAMerckV900081-500GTissue decalcification reagent
EosinSolarbioG1100Histological cytoplasmic stain
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher ScientificA5669701Cell culture supplement
GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersion 9.0Statistical analysis software; RRID: SCR_002798
HematoxylinCell Signaling Technology#14166Histological nuclear stain
IBM SPSS StatisticsIBMWindows versionStatistical analysis software; RRID: SCR_016479
IGF2BP2 antibodyProteintech11601-1-APPrimary antibody for western blotting and immunofluorescence; RRID: AB_2122672
Inverted light microscope (DMi8)Leica MicrosystemsDMi8Histological image acquisition; RRID: SCR_026672
Lentiviral titer quantification kitTakara Bio631235Lentiviral titer determination
Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000015Plasmid transfection reagent
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778150siRNA transfection reagent
M-CSFMedChemExpressHY-P7085Osteoclast differentiation factor
Micro-computed tomography systemScanco MedicalVivaCT80Bone morphometric analysis
M-MLV Reverse TranscriptasePromegaM1701cDNA synthesis
NFATc1 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-7294Primary antibody for western blotting; RRID: AB_2152503
PARIS KitThermo Fisher ScientificAM1556Nuclear and cytoplasmic fractionation
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122Antibiotic supplement for cell culture
Power SYBR Green Master MixThermo Fisher Scientific4367659Quantitative real-time PCR
Protease inhibitor cocktailThermo Fisher Scientific78429Prevention of protein degradation
Protein A/G agarose beadsMerckIP05Immunoprecipitation
PVDF membraneThermo Fisher Scientific88520Protein transfer membrane for western blotting
Rab27A antibodyAbcamab55667Primary antibody for western blotting and immunofluorescence; RRID: AB_945112
RANKLMedChemExpressHY-P7425Osteoclast differentiation factor
Real-time PCR systemApplied BiosystemsABI7900HTQuantitative real-time PCR instrument
RIPA bufferThermo Fisher Scientific78501Protein extraction buffer
RNA Immunoprecipitation (RIP) KitMilliporeRIP-12RXNRNA immunoprecipitation assay
SDS-PAGE reagentsThermo Fisher ScientificBT041210BOXProtein electrophoresis
shRNA plasmidsRiboBio—Gene silencing by RNA interference
Small interfering RNAs (siRNAs)GenePharma—Gene silencing by RNA interference
SRAMPOnline resource—Prediction of m6A modification sites; RRID: SCR_024500
StarBase (ENCORI)Online resource—RNA interaction prediction database; RRID: SCR_016303
TRAP antibodyAbcamab2391Primary antibody for western blotting; RRID: AB_303034
TRAP staining kitMerck387ADetection of osteoclast activity
Triton X-100Thermo Fisher Scientific85111Cell permeabilization reagent
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific15596026CNTotal RNA isolation
YTHDC1 antibodyAbcamab122340Primary antibody for western blotting; RRID: AB_11128253
α-MEMFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation139-15651Cell culture medium
β-Actin antibodyMerckA5441Loading control for western blotting; RRID: AB_476744

Referenties

  1. Kanis JA. Assessment of fracture risk and its application to screening for postmenopausal osteoporosis: synopsis of a WHO report. WHO Study Group. Osteoporos Int. 1994;4(6):368-81.
  2. Leslie WD, Morin SN. Osteoporosis epidemiology 2013: implications for diagnosis, risk assessment, and treatment. Curr Opin Rheumatol. 2014;26(4):440-6.
  3. Chen P, Li Z, Hu Y. Prevalence of osteoporosis in China: a meta-analysis and systematic review. BMC Public Health. 2016;16(1):1039. doi: 10.1186/s12889-016-3712-7.
  4. Sambrook P, Cooper C. Osteoporosis. Lancet. 2006;367(9527):2010-8.
  5. Rachner TD, Khosla S, Hofbauer LC. Osteoporosis: now and the future. Lancet. 2011;377(9773):1276-87.
  6. Bone HG, et al. 10 years of denosumab treatment in postmenopausal women with osteoporosis: results from the phase 3 randomised FREEDOM trial and open-label extension. Lancet Diabetes Endocrinol. 2017;5(7):513-23.
  7. Siris ES, et al. Impact of osteoporosis treatment adherence on fracture rates in North America and Europe. Am J Med. 2009;122(2 Suppl):S3-13.
  8. Cheung EYN, Tan KCB, Cheung CL, Kung AWC. Osteoporosis in East Asia: Current issues in assessment and management. Osteoporos Sarcopenia. 2016;2(3):118-33.
  9. Kohno N, et al. Zoledronic acid significantly reduces skeletal complications compared with placebo in Japanese women with bone metastases from breast cancer: a randomized, placebo-controlled trial. J Clin Oncol. 2005;23(15):3314-21.
  10. Stenmark H. Rab GTPases as coordinators of vesicle traffic. Nat Rev Mol Cell Biol. 2009;10(8):513-25.
  11. Yamaguchi Y, et al. Rab44, a novel large Rab GTPase, negatively regulates osteoclast differentiation by modulating intracellular calcium levels followed by NFATc1 activation. Cell Mol Life Sci. 2018;75(1):33-48.
  12. Xiang Q, et al. Beyond resorption: osteoclasts as drivers of bone formation. Cell Regen. 2024;13(1):22. doi: 10.1186/s13619-024-00205-0.
  13. Teitelbaum SL. Bone resorption by osteoclasts. Science. 2000;289(5484):1504-8.
  14. Suda T, Takahashi N, Martin TJ. Modulation of osteoclast differentiation. Endocr Rev. 1992;13(1):66-80.
  15. Durdan MM, Azaria RD, Weivoda MM. Novel insights into the coupling of osteoclasts and resorption to bone formation. Semin Cell Dev Biol. 2022;123:4-13.
  16. Boyle WJ, Simonet WS, Lacey DL. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 2003;423(6937):337-42.
  17. Tosun B, et al. Osteoclasts and Macrophages-Their Role in Bone Marrow Cavity Formation During Mouse Embryonic Development. J Bone Miner Res. 2022;37(9):1761-74.
  18. Xie H, et al. PDGF-BB secreted by preosteoclasts induces angiogenesis during coupling with osteogenesis. Nat Med. 2014;20(11):1270-8.
  19. Hattner R, Epker BN, Frost HM. Suggested sequential mode of control of changes in cell behaviour in adult bone remodelling. Nature. 1965;206(983):489-90.
  20. Kim JD, et al. An essential role for Rab27a GTPase in eosinophil exocytosis. J Leukoc Biol. 2013;94(6):1265-74.
  21. Goishi K, Mizuno K, Nakanishi H, Sasaki T. Involvement of Rab27 in antigen-induced histamine release from rat basophilic leukemia 2H3 cells. Biochem Biophys Res Commun. 2004;324(1):294-301.
  22. Johnson JL, et al. Munc13-4 restricts motility of Rab27a-expressing vesicles to facilitate lipopolysaccharide-induced priming of exocytosis in neutrophils. J Biol Chem. 2011;286(7):5647-56.
  23. Ejlerskov P, et al. NADPH oxidase is internalized by clathrin-coated pits and localizes to a Rab27A/B GTPase-regulated secretory compartment in activated macrophages. J Biol Chem. 2012;287(7):4835-52.
  24. Kariya Y, et al. Rab27a and Rab27b are involved in stimulation-dependent RANKL release from secretory lysosomes in osteoblastic cells. J Bone Miner Res. 2011;26(4):689-703.
  25. Johnson JL, et al. Rab27a and Rab27b regulate neutrophil azurophilic granule exocytosis and NADPH oxidase activity by independent mechanisms. Traffic. 2010;11(4):533-47.
  26. Yokoyama K, et al. Rab27a negatively regulates phagocytosis by prolongation of the actin-coating stage around phagosomes. J Biol Chem. 2011;286(7):5375-82.
  27. Jancic C, et al. Rab27a regulates phagosomal pH and NADPH oxidase recruitment to dendritic cell phagosomes. Nat Cell Biol. 2007;9(4):367-78.
  28. Shimada-Sugawara M, et al. Rab27A regulates transport of cell surface receptors modulating multinucleation and lysosome-related organelles in osteoclasts. Sci Rep. 2015;5:9620. doi: 10.1038/srep09620.
  29. Johnson JL, et al. Vesicular trafficking through cortical actin during exocytosis is regulated by the Rab27a effector JFC1/Slp1 and the RhoA-GTPase-activating protein Gem-interacting protein. Mol Biol Cell. 2012;23(10):1902-16.
  30. Wang X, et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 2014;505(7481):117-20.
  31. Boulias K, Greer EL. Biological roles of adenine methylation in RNA. Nat Rev Genet. 2023;24(3):143-60.
  32. Wu Y, et al. Mettl3-mediated m(6)A RNA methylation regulates the fate of bone marrow mesenchymal stem cells and osteoporosis. Nat Commun. 2018;9(1):4772. doi: 10.1038/s41467-018-06898-4.
  33. Chen RX, et al. N(6)-methyladenosine modification of circNSUN2 facilitates cytoplasmic export and stabilizes HMGA2 to promote colorectal liver metastasis. Nat Commun. 2019;10(1):4695. doi: 10.1038/s41467-019-12651-2.
  34. Wu X, et al. Caffeic acid 3,4-dihydroxy-phenethyl ester suppresses receptor activator of NF-kappaB ligand-induced osteoclastogenesis and prevents ovariectomy-induced bone loss through inhibition of mitogen-activated protein kinase/activator protein 1 and Ca2+-nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1 signaling pathways. J Bone Miner Res. 2012;27(6):1298-308.
  35. Luo J, et al. Regulation of bone formation and remodeling by G-protein-coupled receptor 48. Development. 2009;136(16):2747-56.
  36. Jing H, et al. Epigenetic inhibition of Wnt pathway suppresses osteogenic differentiation of BMSCs during osteoporosis. Cell Death Dis. 2018;9(2):176. doi: 10.1038/s41419-017-0231-0.
  37. Yang C, et al. TET2 regulates osteoclastogenesis by modulating autophagy in OVX-induced bone loss. Autophagy. 2022;18(12):2817-29.
  38. Blumer MJ, et al. Role of tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) in long bone development. Mech Dev. 2012;129(5-8):162-76.
  39. Sakai E, et al. Suppression of RANKL-dependent heme oxygenase-1 is required for high mobility group box 1 release and osteoclastogenesis. J Cell Biochem. 2012;113(2):486-98.
  40. Roberts BC, et al. PTH(1-34) treatment and/or mechanical loading have different osteogenic effects on the trabecular and cortical bone in the ovariectomized C57BL/6 mouse. Sci Rep. 2020;10(1):8889. doi: 10.1038/s41598-020-65921-1.
  41. Roundtree IA, et al. YTHDC1 mediates nuclear export of N(6)-methyladenosine methylated mRNAs. Elife. 2017;6. doi: 10.7554/eLife.31311.
  42. Flick LM, et al. Effects of receptor activator of NFkappaB (RANK) signaling blockade on fracture healing. J Orthop Res. 2003;21(4):676-84.
  43. Takeyama K, Chatani M, Takano Y, Kudo A. In-vivo. imaging of the fracture healing in medaka revealed two types of osteoclasts before and after the callus formation by osteoblasts. Dev Biol. 2014;394(2):292-304.
  44. Yamada H, et al. Effects of 16-month treatment with the cathepsin K inhibitor ONO-5334 on bone markers, mineral density, strength and histomorphometry in ovariectomized cynomolgus monkeys. Bone. 2016;86:43-52.
  45. McClung MR, et al. Odanacatib for the treatment of postmenopausal osteoporosis: results of the LOFT multicentre, randomised, double-blind, placebo-controlled trial and LOFT Extension study. Lancet Diabetes Endocrinol. 2019;7(12):899-911.
  46. Tao R, et al. Advances in immune mechanisms and developing immune-targeted therapies for osteoporosis: A systematic review. Pharmacol Res. 2025;218:107835. doi: 10.1016/j.phrs.2025.107835.
  47. Qi Z, Luo J, Xiao Z, Yang D. Functional roles of immune cells in osteoporosis. Front Immunol. 2025;16:1698283. doi: 10.3389/fimmu.2025.1698283.
  48. Krzewski K, Cullinane AR. Evidence for defective Rab GTPase-dependent cargo traffic in immune disorders. Exp Cell Res. 2013;319(15):2360-7.
  49. Adnani L, et al. Immune cell infiltration into brain tumor microenvironment is mediated by Rab27-regulated vascular wall integrity. Sci Adv. 2025;11(21):eadr6940. doi: 10.1126/sciadv.adr6940.
  50. Brauer N, et al. Immunodeficiency with susceptibility to lymphoma with complex genotype affecting energy metabolism (FBP1, ACAD9) and vesicle trafficking (RAB27A). Front Immunol. 2023;14:1151166. doi: 10.3389/fimmu.2023.1151166.
  51. Ramadass M, Catz SD. Molecular mechanisms regulating secretory organelles and endosomes in neutrophils and their implications for inflammation. Immunol Rev. 2016;273(1):249-65.
  52. Menasche G, et al. Mutations in RAB27A cause Griscelli syndrome associated with haemophagocytic syndrome. Nat Genet. 2000;25(2):173-6.
  53. Prashar A, Schnettger L, Bernard EM, Gutierrez MG. Rab GTPases in Immunity and Inflammation. Front Cell Infect Microbiol. 2017;7:435. doi: 10.3389/fcimb.2017.00435.
  54. Stinchcombe JC, et al. Rab27a is required for regulated secretion in cytotoxic T lymphocytes. J Cell Biol. 2001;152(4):825-34.
  55. Catz SD. The role of Rab27a in the regulation of neutrophil function. Cell Microbiol. 2014;16(9):1301-10.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

BeenmergmacrofagenTRAP kleuringWestern blotYTHDC1IGF2BP2
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.