Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Onderzoeksartikel

N6-methyladenosine modificatie van Rab27A bevordert osteoporose door de osteoclastdifferentiatie in het ovariectomiseerde muismodel te beïnvloeden

50 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/71964

⸱

11 augustus 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 2Department of Orthopedics, The People's Hospital of Pengzhou, 3Department of Clinical Skills Center, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 4Southwest Medical University, 5Stem Cell Immunity and Regeneration Key Laboratory of Luzhou, Affiliated Hospital of Southwest Medical University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

YTHDC1 bevordert de cytoplasmatische export van m6A-gemodificeerde Rab27A, terwijl IGF2BP2 Rab27A in het cytoplasma stabiliseert, waardoor de differentiatie van osteoclast wordt versterkt en bijdraagt aan osteoporose.

Samenvatting

De ontwikkeling van nieuwe therapieën voor osteoporose heeft steeds meer aandacht gekregen. Rab27A wordt opgereguleerd tijdens osteoclastdifferentiatie, en N6-methyladenosine (m6A) modificatie is uitgegroeid tot een belangrijke epigenetische regulator bij orthopedische aandoeningen. Bio-informatische analyses voorspelden dat Rab27A meerdere m6A-modificatieplaatsen bevat en interageert met verschillende m6A-geassocieerde eiwitten. Knockdown-experimenten werden uitgevoerd om de rol van Rab27A in osteoclastdifferentiatie en osteoporose te evalueren met behulp van een ovariectomeerd (OVX) muismodel. Rab27A-depletie verminderde osteoporose en verhoogde het botvormingspercentage van 14,73% naar 28,13% (P < 0,05) bij OVX-muizen. Western blotting en kwantitatieve PCR toonden aan dat Rab27A knockdown de eiwit- en mRNA-expressie van de osteoclastmarkers TRAP, NFATc1 en c-FOS verminderde, waardoor de osteoclastdifferentiatie van beenmerg-afgeleide macrofagen (BMM's) geïnduceerd door macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) en receptoractivator van nucleaire factor-κB ligand (RANKL) werd onderdrukt. TRAP-kleuring toonde verder aan dat een uitputting van Rab27A de activiteit van TRAP significant verminderde van 24,1% naar 12,9% (P < 0,01) na M-CSF en RANKL-inductie. RNA-immunoprecipitatie-assays bevestigden interacties tussen Rab27A en de m6A-lezereiwitten YTHDC1 en IGF2BP2. Nucleaire en cytoplasmatische fractionering toonde aan dat YTHDC1 de cytoplasmatische export van m6A-gemodificeerde Rab27A faciliteert. Daarnaast toonden q-PCR- en western blot-analyses aan dat knockdown van ofwel YTHDC1 of IGF2BP2 de expressie van Rab27A verminderde en de expressie van TRAP, NFATc1 en c-FOS verminderde, waardoor de osteoclastdifferentiatie geïnduceerd door M-CSF en RANKL werd onderdrukt. Gezamenlijk geven deze bevindingen aan dat door YTHDC1 gemedieerde cytoplasmatische export en IGF2BP2-gemedieerde stabilisatie van m6A-gemodificeerde Rab27A osteoclastdifferentiatie bevorderen en bijdragen aan botverlies in het OVX-muismodel.

Inleiding

Osteoporose (OP) is een veelvoorkomende skeletaandoening die wordt gekenmerkt door achteruitgang van de botmicroarchitectuur en verminderde botmineralendichtheid, wat wereldwijd leidt tot een verhoogd risico op breuken 1,2,3. Osteoporotische fracturen komen het vaakst voor in de onderarm, humerus, heup en wervelkolom en komen vooral voor bij oudere volwassenen. Deze breuken verzwakken de kwaliteit van leven aanzienlijk en leggen aanzienlijke fysieke, psychologische en sociaaleconomische lasten op voor patiënten, hun families en zorgsystemen3. Daarom blijven preventie, beheer en behandeling van osteoporose belangrijke klinische en volksgezondheidsprioriteiten.

Er zijn verschillende therapeutische strategieën ontwikkeld voor osteoporose en kunnen over het algemeen worden ingedeeld in twee categorieën: botvormende middelen en anti-resorptieve therapieën 4,5. Traditionele anti-resorptieve middelen zijn bisfosfonaten, raloxifeen en strontiumranelaat, terwijl nieuwere middelen denosumab, odanacatib en saracatinib zijn. Botvormende therapieën omvatten parathyreoïdhormoon (PTH 1–84), terwijl verschillende aanvullende kandidaten, zoals MK-5442, AMG 785 en BHQ 880, nogklinische ontwikkeling ondergaan. Hoewel deze behandelingen effectief kunnen zijn, zijn veel daarvan geassocieerd met significante bijwerkingen, beperkte langetermijneffectiviteit of beperkingen op langdurig gebruik 4,6,7,8,9. Langdurige toediening van aminobisfosfonaten en denosumab kan bijvoorbeeld de normale botremodelleringbelemmeren. Daarom blijft het identificeren van veiligere en effectievere therapeutische doelen een belangrijk doel in osteoporoseonderzoek.

Rab-eiwitten zijn belangrijke regulatoren van intracellulaire vesikeltransport en celsignalering en nemen deel aan diverse biologische processen, waaronder virale infectie, autofagie en cytoskeletorganisatie10. In de afgelopen jaren is er steeds meer aandacht geweest voor de rol van Rab-familie-eiwitten in botmetabolisme en osteoporose. Rab44 is gerapporteerd als het regulerend van osteoclastdifferentiatie door het moduleren van intracellulaire Ca2⁺-signalering en het activeren van de nucleaire factor van geactiveerde T-cellen 1 (NFATc1) in receptoractivator van nucleaire factor-κB ligand (RANKL)-behandelde macrofagen11. Osteoclasten zijn meerkernige cellen afkomstig van macrofagen-voorlopers en spelen essentiële rollen bij botresorptie en skelethomeostase 12,13,14,15,16,17,18,19. Daarom is het begrijpen van de moleculaire mechanismen die osteoclastdifferentiatie reguleren cruciaal voor het ontwikkelen van nieuwe therapeutische benaderingen voor osteoporose.

Rab27A is een belangrijk lid van de Rab GTPase-familie en wordt veel tot expressie gebracht in secretorische en immuuncellen. Het speelt een cruciale rol bij blaastransport, exocytose en intracellulaire signalering 20,21,22,23,24,25,26,27. Eerdere studies hebben aangetoond dat Rab27A eosinofieldegranulatie reguleert tijdens luchtwegontsteking en de vesiculaire mobilisatie die geassocieerd wordt met NADPH oxidase-activiteit in geactiveerde macrofagencontroleert 20.23. Opmerkelijk is dat steeds meer bewijs aangeeft dat de expressie van Rab27A significant wordt opgereguleerd tijdens osteoclastdifferentiatie. Shimada-Sugawara et al. rapporteerden dat de expressie van Rab27A toeneemt tijdens de differentiatie van beenmerg-afgeleide macrofagen (BMM's) tot osteoklasten, wat wijst op een mogelijke rol in osteoclastogenese28. Gezamenlijk suggereren deze bevindingen dat Rab27A de vorming en functie van osteoclasten kan beïnvloeden door het reguleren van vesiculaire verkeers- en intracellulaire signaalroutes28,29.

N6-methyladenosine (m6A) is de meest voorkomende interne RNA-modificatie in eukaryote boodschapper-RNA's en niet-coderende RNA's en dient als een cruciale regulator van RNA-metabolisme en genexpressie. Als de eerste geïdentificeerde mRNA-modificatie bij zoogdieren is m6A betrokken bij tal van biologische processen, waaronder RNA-stabiliteit, splicing, transport en translatie. Wang et al. toonden aan dat m6A-modificaties, die vaak voorkomen binnen geconserveerde sequentiemotieven, worden herkend door YTH-domeinhoudende eiwitten en bijdragen aan de regulatie van mRNA-stabiliteit en metabolisme30. Bovendien is m6A-modificatie betrokken bij diverse biologische functies, waaronder genoomstabiliteit, transcriptieregulatie, chromatineorganisatie, kankerprogressie en immuunresponsen31. Recente studies hebben ook belangrijke rollen van m6A-signalering bij botgerelateerde ziekten en osteoporose32 benadrukt.

Onder m6A-lezereiwitten functioneert YTHDC1 als een nucleaire lezer die RNA-verwerking en nucleaire export reguleert, terwijl het insuline-achtige groeifactor 2 mRNA-bindend eiwit 2 (IGF2BP2) m6A-gemodificeerde transcripten in het cytoplasma stabiliseert. Chen et al. toonden aan dat YTHDC1 de nucleaire export van m6A-gemodificeerde circNSUN2 bevordert, die vervolgens met IGF2BP2 interageert om HMGA2-mRNA te stabiliseren en colorectale kankermetastase33 te bevorderen. Deze bevindingen suggereren dat gecoördineerde regulatie door YTHDC1 en IGF2BP2 een algemeen mechanisme kan zijn dat het lot van m6A-gemodificeerde transcripten controleert.

De huidige studie onderzocht voorspelde m6A-modatieplaatsen binnen Rab27A mRNA en onderzocht de interacties met YTHDC1 en IGF2BP2. Van YTHDC1 werd vastgesteld dat het de nucleaire export van m6A-gemodificeerde Rab27A-transcripten vergemakkelijkte, terwijl IGF2BP2 interageerde met Rab27A in het cytoplasma en de stabiliteit ervan verbeterde. Door dit regulerende mechanisme bevorderde Rab27A de differentiatie van osteoclast en droeg het bij aan de progressie van osteoporose. Gezamenlijk identificeren de bevindingen een voorheen niet erkende m6A-afhankelijke regulatieroute die YTHDC1, IGF2BP2 en Rab27A omvat bij osteoclastdifferentiatie. Deze resultaten bieden nieuwe inzichten in de moleculaire pathogenese van osteoporose en kunnen de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën vergemakkelijken gericht op m6A-gemedieerde regulatie van Rab27A.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door de Commissie voor Dierbescherming en Benutting van het Affiliated Hospital van Southwest Medical University (Goedkeuringsnr. 2024-Ethics-042). Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de ARRIVE-richtlijnen, de Britse Animals (Scientific Procedures) Act 1986 en bijbehorende richtlijnen, EU-richtlijn 2010/63/EU, en de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publicatie nr. 8023, herzien 1978). Muizen werden willekeurig toegewezen aan experimentele groepen en de toewijzingsvolgorde werd voor de onderzoeker verborgen. Alle gegevensverzameling en -analyses, inclusief histologische evaluatie, micro-computertomografie (micro-CT) beeldanalyse en statistische analyses, werden uitgevoerd door onderzoekers die blind waren voor groepstoewijzing. Geen dieren of monsters werden uitgesloten van de analyses. Alle reagentia, apparatuur, software en andere middelen die in dit protocol worden gebruikt, staan vermeld in de Materiaalkunde.

1. Constructie van het Ovariectomiemodel (OVX)

Vierentwintig vrouwelijke wildtype C57BL/6 muizen van 8 weken oud werden gebruikt om een osteoporosemodel op te zetten. Na een acclimatisatieperiode van één week werden muizen willekeurig toegewezen aan de Sham- of OVX-groep. Het OVX-model werd vastgesteld door bilaterale ovariectomie zoals eerder beschreven 34,35. Sham-opererende muizen ondergingen een chirurgische blootstelling van de eierstokken zonder verwijdering.

Voor intrafemorale genafgifte werden lentivirale vectoren die sh-Rab27A of sh-NC expressief uitdrukken, 7 dagen na de OVX-operatie geïnjecteerd, zoals eerder gerapporteerd36,37. Kort gezegd werden geconcentreerde lentivirale deeltjes (1 × 106 transducerende eenheden/mL) via de patellaire route in het dijbeen geïnjecteerd met een 22-gauge naald onder narcose. Elke muis kreeg 20 μL lentivirale suspensie. De incisie werd vervolgens gehecht en de dieren werden gedurende het herstel gemonitord.

Alle dierproeven werden uitgevoerd onder specifieke ziekteverwekkervrije omstandigheden. Femure monsters werden 8 weken na de operatie afgenomen. Minstens zes muizen per groep werden gebruikt voor histologische analyses en RNA- of eiwitextractie.

2. In-vivo micro-CT beeldvorming

Micro-computertomografie (micro-CT) werd uitgevoerd om de morfologie van het trabeculaire bot te evalueren. Het rechter scheenbeen van elke muis werd in vivo gescand vóór de OVX-operatie op 14 weken leeftijd. Vervolgscans werden wekelijks uitgevoerd tot de leeftijd van 22 weken. Minstens zes muizen per groep werden opgenomen in de micro-CT-analyse.

Muizen werden verdoofd met intraperitoneale natriumpentobarbital (50 mg/kg lichaamsgewicht). Voldoende anesthesie werd bevestigd door het ontbreken van de teenpnijpreflex en door continue monitoring van de ademhalingsfrequentie, en deze werd gedurende de hele beeldvorming gehandhaafd. Alle euthanasieprocedures werden uitgevoerd in overeenstemming met het goedgekeurde dierenprotocol, institutionele richtlijnen voor dierenwelzijn en nationale regelgeving voor laboratoriumdieren euthanasie.

Op 24-jarige leeftijd werden muizen geëuthanaseerd door cervicale ontwrichting na diepe anesthesie, en beide scheenbeen werden geoogst voor ex vivo scanning met hetzelfde beeldvormingsprotocol. De scanparameters omvatten een voxelgrootte van 10,4 μm, een spanning van 55 kV, een stroom van 145 μA, een gezichtsveld van 32 mm, 1500/750 monsters per projectie en een integratietijd van 100 ms.

Beelden werden verwerkt met een derde-orde polynomiale beam-hardening correctie-algoritme gekalibreerd tegen een 1200 mg HA/cm3 phantom. Botvolumefractie (BV/TV), trabeculaire dikte (Tb.Th) en trabeculaire aantal (Tb.N) werden gekwantificeerd in de distale femorale metafyse die zich 1,0 mm proximaal van de groeiplaat bevindt.

3. Plasmidtransfectie

sh-Rab27A- en sh-NC-plasmiden werden gegenereerd en gebruikt voor de productie van lentivirussen. Lentivirale verpakkingsplasmiden en shRNA-constructies werden volgens de instructies van de fabrikant co-transfecteerd in HEK293T cellen. Virale titers werden bepaald vóór intrafemorale toediening, zoals eerder beschreven36. Er werden drie onafhankelijke biologische replicaten uitgevoerd.

4. Hematoxyline- en eosinekleuring (HE)

Femorale monsters werden 24 uur gefixeerd in 4% paraformaldehyde, 4 weken gedecalcificeerd in 10% EDTA, cryobeschermd in 30% sucrose/PBS, ingebed in paraffine en gesneden op een dikte van 5 μm. Weefseldoorsneden werden gekleurd met hematoxyline en eosine en onderzocht met een lichtmicroscoop. Er werden minstens zes muizen per groep geanalyseerd.

5. Tartraatbestendige zuurfosfatase (TRAP) kleuring

TRAP-kleuring van femorale secties werd uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant38. TRAP-activiteit in beenmerg-afgeleide macrofagen (BMM's) werd geëvalueerd met behulp van een TRAP-kleuringsassay. Rijpe osteoclasten werden gedefinieerd als TRAP-positieve multinucleaire cellen met ten minste drie kernen. Er werden drie onafhankelijke biologische replicaten uitgevoerd, elk met drie technische replicaten.

6. q-PCR

Totaal RNA werd geïsoleerd met behulp van TRIzol-reagens volgens de instructies van de fabrikant. Complementair DNA werd gesynthetiseerd met reverse transcriptase en onderworpen aan kwantitatieve realtime PCR met behulp van SYBR Green-chemie. Er werden drie onafhankelijke biologische replicaten uitgevoerd, elk met drie technische replicaten.

De primerreeksen waren als volgt:

Rab27A: F, TTCCTGCTTCTGTTCGACCT; R, GGCAGCACTGGTTTCAAAAT

VAL: F, TGTTGACAGCGGTCCATCTA; R, CCTCCTTCTTAACCCGAAGC

NFATc1: F, GGTGCTGTCTGGCCATAACT; R, GCGGAAAGGTGGTATCTCAA

C-FOS: F, TACTACCATTCCAGCCGA; R, GCTGTCACCGTGGGGATAAA

YTHDC1: F, GAAGTGGAAGCTCTGCATCAG; R, TTGATCTTTTCGGACAGCACG

IGF2BP2: F, GACTACCCCGACCAGAACTG; R, GAGGCGGGATGTTCCGAATC

β-actine: F, GGGAAATCGTGGTGACATTAAG; R, TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG

7. Western-blotting

Cellen of weefsels werden gelyseerd met behulp van een RIPA-buffer aangevuld met proteaseremmers. De eiwitconcentraties werden bepaald met behulp van een Bradford-assay. Gelijke hoeveelheden eiwit (20 μg) werden gescheiden door SDS-PAGE en overgebracht naar polyvinylidienfluoride (PVDF) of nitrocellulosemembranen. De membranen werden 1 uur lang geblokkeerd met 5% magere melk bij kamertemperatuur en 's nachts geïncubeerd bij 4 °C met primaire antilichamen tegen TRAP, NFATc1, c-FOS, Rab27A, YTHDC1, IGF2BP2 of β-actine. Na het wassen werden membranen geïncubeerd met de juiste secundaire antilichamen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Eiwitbanden werden visualiseerd met standaard detectieprocedures. Er werden drie onafhankelijke biologische replicaten uitgevoerd.

8. Celcultuur

Macrofagen (BMM's) afkomstig van beenmerg werden geïsoleerd zoals eerder beschreven39. Beenmergcellen die uit muisdijbeen werden geoogst, werden 's nachts gekweekt in α-minimaal essentieel medium, aangevuld met 10% foetaal rundserum, 30 ng/mL macrofagenkoloniestimulerende factor (M-CSF) en 1% penicilline/streptomycine bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO₂. Niet-hechtende cellen werden verzameld en gekweekt in een stromaalcelvrij systeem met 30 ng/mL M-CSF. Na 3 dagen werden adherente cellen als BMM's geoogst en verder gekweekt in aanwezigheid van 30 ng/mL M-CSF en 50 ng/mL receptoractivator van nucleaire factor-κB ligand (RANKL) gedurende 72 uur om osteoclastdifferentiatie te induceren.

9. RNA-interferentie (RNAi)

Kleine interfererende RNA's (siRNA's) werden gesynthetiseerd en getransfecteerd met behulp van een lipide-gebaseerd transfectie-reagens volgens de instructies van de fabrikant. Cellen werden gezaaid met een dichtheid van 2 × 104 cellen per put in platen met zes putjes vóór transfectie. Er werden drie onafhankelijke biologische replicaten uitgevoerd.

De doelsequenties waren als volgt:

si-Rab27A: GGACUUAAUCAUCTAAGAGAAUGGAA

si-YTHDC1: GCAAGGAGUGUUAUCUUAATT

si-IGF2BP2: CCGUUAACCAACAAGCCAATT

10. Immunofluorescentie

De cellen werden 20 minuten gefixeerd met 4% paraformaldehyde en 10 minuten permeabilisiseerd met 0,1% Triton X-100. Na 30 minuten blokken met 5% rundereserumalbumine, werden cellen 's nachts geïncubeerd met primaire antilichamen bij 4 °C.

Na het wassen werden fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichamen 30 minuten bij kamertemperatuur aangebracht. Kernen werden tegengekleurd met DAPI en beelden werden gemaakt met behulp van confocale microscopie. Er werden drie onafhankelijke biologische replicaten uitgevoerd.

11. Nucleaire en cytoplasmatische scheiding

Nucleaire en cytoplasmatische fracties werden geïsoleerd volgens de instructies van de fabrikant. Cellen werden 10 minuten op ijs gelyseerd en 3 minuten gecentrifugeerd bij 500 × g bij 4 °C. Het supernatant met cytoplasmatische componenten werd verzameld, terwijl de pellet met kernen werd gewassen en apart verwerkt.

12. RNA-bindende eiwitimmunoprecipitatie (RIP)

RNA-immunoprecipitatie (RIP) assays werden uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. Kort werden cellen 30 minuten op ijs gelyseerd. Na centrifugatie werden de supernatanten 's nachts geïncubeerd met antilichamen en eiwit A/G agarosekralen. Na het wassen werden immunoprecipitatieve eiwitten geanalyseerd met western blotting, en co-immunoprecipiteerd RNA werd geanalyseerd met kwantitatieve realtime PCR. Er werden drie onafhankelijke biologische replicaten uitgevoerd.

13. Rab27A mRNA stabiliteitsassay

Totaal RNA werd op de aangegeven tijdstippen na IGF2BP2 knockdown verwijderd. Vervolgens werden omgekeerde transcriptie en kwantitatieve realtime PCR uitgevoerd. De Rab27A mRNA-niveaus werden genormaliseerd naar de overeenkomstige si-NC-groep bij 0 uur. Er werden drie onafhankelijke biologische replicaten uitgevoerd.

14. Statistische analyse

Alle experimenten werden onafhankelijk uitgevoerd met ten minste drie biologische replicata. Voor q-PCR, RNA-interferentie, TRAP-kleuring, western blotting en andere celgebaseerde assays omvatte elke biologische replicatie drie technische replicaten, tenzij anders gespecificeerd. De gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde ± standaarddeviatie (SD).

Statistische analyses werden uitgevoerd met GraphPad Prism versie 9.0 en SPSS-software. Vergelijkingen tussen twee groepen werden uitgevoerd met behulp van een tweezijdige Student's t-test. Vergelijkingen tussen meerdere groepen werden geanalyseerd met behulp van een tweerichtingsvariantieanalyse (ANOVA), gevolgd door Tukey's multiple comparison post hoc test om te corrigeren voor meervoudige vergelijkingen. Een P-waarde < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Knockdown van Rab27A verminderde osteoporose in vivo.

Om de rol van Rab27A bij osteoporose te onderzoeken, werd Rab27A knockdown uitgevoerd in een eierrot (OVX) muismodel dat eerder gerapporteerd is met methoden34,40. Het algemene onderzoeksontwerp wordt samengevat in Figuur 1. Micro-computertomografie toonde aan dat botmineraaldichtheid, botvolum...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Osteoclastdifferentiatie speelt essentiële rollen bij botremodellering, botresorptie, breukherstel en skelethomeostase12˒15˒17˒18˒42˒43. Overmatige osteoclastactiviteit is een belangrijke factor in osteoporose, waardoor het identificeren van regulerende routes die osteoclastdifferentiatie reguleren een belangrijk onderzoeksdoel is. Verschillende ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs geven geen concurrerende financiële belangen of belangenconflicten aan.

Dankbetuigingen

Dit werk werd financieel ondersteund door het Wetenschappelijk en Technologisch Strategisch Samenwerkingsproject tussen het Pengzhou Volksziekenhuis en de Southwest Medical University (subsidienummer 2023PZXNYD01) aan Lian Tang.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
4% ParaformaldehydeThermo Fisher ScientificA5818101Tissue and cell fixation
Alexa Fluor 488 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-11001Fluorescent secondary antibody for immunofluorescence; RRID: AB_2534069
Alexa Fluor 546 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-11035Fluorescent secondary antibody for immunofluorescence; RRID: AB_2534093
Bovine serum albumin (BSA)MerckA2153Blocking reagent
Bradford Protein AssayMerckB6916Protein quantification
C57BL/6JSlac miceShanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd.—Female, 8 weeks old; RRID: MGI:2159769
c-FOS antibodyAbcamab222699Primary antibody for western blotting; RRID: AB_2891049
Confocal laser scanning microscope (SP8)Leica MicrosystemsSP8Immunofluorescence image acquisition; RRID: SCR_018169
DAPIThermo Fisher ScientificD3571Nuclear counterstain for immunofluorescence; RRID: AB_2307445
EDTAMerckV900081-500GTissue decalcification reagent
EosinSolarbioG1100Histological cytoplasmic stain
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher ScientificA5669701Cell culture supplement
GraphPad PrismGraphPad SoftwareVersion 9.0Statistical analysis software; RRID: SCR_002798
HematoxylinCell Signaling Technology#14166Histological nuclear stain
IBM SPSS StatisticsIBMWindows versionStatistical analysis software; RRID: SCR_016479
IGF2BP2 antibodyProteintech11601-1-APPrimary antibody for western blotting and immunofluorescence; RRID: AB_2122672
Inverted light microscope (DMi8)Leica MicrosystemsDMi8Histological image acquisition; RRID: SCR_026672
Lentiviral titer quantification kitTakara Bio631235Lentiviral titer determination
Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000015Plasmid transfection reagent
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778150siRNA transfection reagent
M-CSFMedChemExpressHY-P7085Osteoclast differentiation factor
Micro-computed tomography systemScanco MedicalVivaCT80Bone morphometric analysis
M-MLV Reverse TranscriptasePromegaM1701cDNA synthesis
NFATc1 antibodySanta Cruz Biotechnologysc-7294Primary antibody for western blotting; RRID: AB_2152503
PARIS KitThermo Fisher ScientificAM1556Nuclear and cytoplasmic fractionation
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122Antibiotic supplement for cell culture
Power SYBR Green Master MixThermo Fisher Scientific4367659Quantitative real-time PCR
Protease inhibitor cocktailThermo Fisher Scientific78429Prevention of protein degradation
Protein A/G agarose beadsMerckIP05Immunoprecipitation
PVDF membraneThermo Fisher Scientific88520Protein transfer membrane for western blotting
Rab27A antibodyAbcamab55667Primary antibody for western blotting and immunofluorescence; RRID: AB_945112
RANKLMedChemExpressHY-P7425Osteoclast differentiation factor
Real-time PCR systemApplied BiosystemsABI7900HTQuantitative real-time PCR instrument
RIPA bufferThermo Fisher Scientific78501Protein extraction buffer
RNA Immunoprecipitation (RIP) KitMilliporeRIP-12RXNRNA immunoprecipitation assay
SDS-PAGE reagentsThermo Fisher ScientificBT041210BOXProtein electrophoresis
shRNA plasmidsRiboBio—Gene silencing by RNA interference
Small interfering RNAs (siRNAs)GenePharma—Gene silencing by RNA interference
SRAMPOnline resource—Prediction of m6A modification sites; RRID: SCR_024500
StarBase (ENCORI)Online resource—RNA interaction prediction database; RRID: SCR_016303
TRAP antibodyAbcamab2391Primary antibody for western blotting; RRID: AB_303034
TRAP staining kitMerck387ADetection of osteoclast activity
Triton X-100Thermo Fisher Scientific85111Cell permeabilization reagent
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific15596026CNTotal RNA isolation
YTHDC1 antibodyAbcamab122340Primary antibody for western blotting; RRID: AB_11128253
α-MEMFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation139-15651Cell culture medium
β-Actin antibodyMerckA5441Loading control for western blotting; RRID: AB_476744

Referenties

  1. Kanis JA. Assessment of fracture risk and its application to screening for postmenopausal osteoporosis: synopsis of a WHO report. WHO Study Group. Osteoporos Int. 1994;4(6):368-81.
  2. Leslie WD, Morin SN. Osteoporosis epidemiology 2013: implications for diagnosis, risk assessment, and treatment. Curr Opin Rheumatol. 2014;26(4):440-6.
  3. Chen P, Li Z, Hu Y. Prevalence of osteoporosis in China: a meta-analysis and systematic review. BMC Public Health. 2016;16(1):1039. doi: 10.1186/s12889-016-3712-7.
  4. Sambrook P, Cooper C. Osteoporosis. Lancet. 2006;367(9527):2010-8.
  5. Rachner TD, Khosla S, Hofbauer LC. Osteoporosis: now and the future. Lancet. 2011;377(9773):1276-87.
  6. Bone HG, et al. 10 years of denosumab treatment in postmenopausal women with osteoporosis: results from the phase 3 randomised FREEDOM trial and open-label extension. Lancet Diabetes Endocrinol. 2017;5(7):513-23.
  7. Siris ES, et al. Impact of osteoporosis treatment adherence on fracture rates in North America and Europe. Am J Med. 2009;122(2 Suppl):S3-13.
  8. Cheung EYN, Tan KCB, Cheung CL, Kung AWC. Osteoporosis in East Asia: Current issues in assessment and management. Osteoporos Sarcopenia. 2016;2(3):118-33.
  9. Kohno N, et al. Zoledronic acid significantly reduces skeletal complications compared with placebo in Japanese women with bone metastases from breast cancer: a randomized, placebo-controlled trial. J Clin Oncol. 2005;23(15):3314-21.
  10. Stenmark H. Rab GTPases as coordinators of vesicle traffic. Nat Rev Mol Cell Biol. 2009;10(8):513-25.
  11. Yamaguchi Y, et al. Rab44, a novel large Rab GTPase, negatively regulates osteoclast differentiation by modulating intracellular calcium levels followed by NFATc1 activation. Cell Mol Life Sci. 2018;75(1):33-48.
  12. Xiang Q, et al. Beyond resorption: osteoclasts as drivers of bone formation. Cell Regen. 2024;13(1):22. doi: 10.1186/s13619-024-00205-0.
  13. Teitelbaum SL. Bone resorption by osteoclasts. Science. 2000;289(5484):1504-8.
  14. Suda T, Takahashi N, Martin TJ. Modulation of osteoclast differentiation. Endocr Rev. 1992;13(1):66-80.
  15. Durdan MM, Azaria RD, Weivoda MM. Novel insights into the coupling of osteoclasts and resorption to bone formation. Semin Cell Dev Biol. 2022;123:4-13.
  16. Boyle WJ, Simonet WS, Lacey DL. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 2003;423(6937):337-42.
  17. Tosun B, et al. Osteoclasts and Macrophages-Their Role in Bone Marrow Cavity Formation During Mouse Embryonic Development. J Bone Miner Res. 2022;37(9):1761-74.
  18. Xie H, et al. PDGF-BB secreted by preosteoclasts induces angiogenesis during coupling with osteogenesis. Nat Med. 2014;20(11):1270-8.
  19. Hattner R, Epker BN, Frost HM. Suggested sequential mode of control of changes in cell behaviour in adult bone remodelling. Nature. 1965;206(983):489-90.
  20. Kim JD, et al. An essential role for Rab27a GTPase in eosinophil exocytosis. J Leukoc Biol. 2013;94(6):1265-74.
  21. Goishi K, Mizuno K, Nakanishi H, Sasaki T. Involvement of Rab27 in antigen-induced histamine release from rat basophilic leukemia 2H3 cells. Biochem Biophys Res Commun. 2004;324(1):294-301.
  22. Johnson JL, et al. Munc13-4 restricts motility of Rab27a-expressing vesicles to facilitate lipopolysaccharide-induced priming of exocytosis in neutrophils. J Biol Chem. 2011;286(7):5647-56.
  23. Ejlerskov P, et al. NADPH oxidase is internalized by clathrin-coated pits and localizes to a Rab27A/B GTPase-regulated secretory compartment in activated macrophages. J Biol Chem. 2012;287(7):4835-52.
  24. Kariya Y, et al. Rab27a and Rab27b are involved in stimulation-dependent RANKL release from secretory lysosomes in osteoblastic cells. J Bone Miner Res. 2011;26(4):689-703.
  25. Johnson JL, et al. Rab27a and Rab27b regulate neutrophil azurophilic granule exocytosis and NADPH oxidase activity by independent mechanisms. Traffic. 2010;11(4):533-47.
  26. Yokoyama K, et al. Rab27a negatively regulates phagocytosis by prolongation of the actin-coating stage around phagosomes. J Biol Chem. 2011;286(7):5375-82.
  27. Jancic C, et al. Rab27a regulates phagosomal pH and NADPH oxidase recruitment to dendritic cell phagosomes. Nat Cell Biol. 2007;9(4):367-78.
  28. Shimada-Sugawara M, et al. Rab27A regulates transport of cell surface receptors modulating multinucleation and lysosome-related organelles in osteoclasts. Sci Rep. 2015;5:9620. doi: 10.1038/srep09620.
  29. Johnson JL, et al. Vesicular trafficking through cortical actin during exocytosis is regulated by the Rab27a effector JFC1/Slp1 and the RhoA-GTPase-activating protein Gem-interacting protein. Mol Biol Cell. 2012;23(10):1902-16.
  30. Wang X, et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 2014;505(7481):117-20.
  31. Boulias K, Greer EL. Biological roles of adenine methylation in RNA. Nat Rev Genet. 2023;24(3):143-60.
  32. Wu Y, et al. Mettl3-mediated m(6)A RNA methylation regulates the fate of bone marrow mesenchymal stem cells and osteoporosis. Nat Commun. 2018;9(1):4772. doi: 10.1038/s41467-018-06898-4.
  33. Chen RX, et al. N(6)-methyladenosine modification of circNSUN2 facilitates cytoplasmic export and stabilizes HMGA2 to promote colorectal liver metastasis. Nat Commun. 2019;10(1):4695. doi: 10.1038/s41467-019-12651-2.
  34. Wu X, et al. Caffeic acid 3,4-dihydroxy-phenethyl ester suppresses receptor activator of NF-kappaB ligand-induced osteoclastogenesis and prevents ovariectomy-induced bone loss through inhibition of mitogen-activated protein kinase/activator protein 1 and Ca2+-nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1 signaling pathways. J Bone Miner Res. 2012;27(6):1298-308.
  35. Luo J, et al. Regulation of bone formation and remodeling by G-protein-coupled receptor 48. Development. 2009;136(16):2747-56.
  36. Jing H, et al. Epigenetic inhibition of Wnt pathway suppresses osteogenic differentiation of BMSCs during osteoporosis. Cell Death Dis. 2018;9(2):176. doi: 10.1038/s41419-017-0231-0.
  37. Yang C, et al. TET2 regulates osteoclastogenesis by modulating autophagy in OVX-induced bone loss. Autophagy. 2022;18(12):2817-29.
  38. Blumer MJ, et al. Role of tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) in long bone development. Mech Dev. 2012;129(5-8):162-76.
  39. Sakai E, et al. Suppression of RANKL-dependent heme oxygenase-1 is required for high mobility group box 1 release and osteoclastogenesis. J Cell Biochem. 2012;113(2):486-98.
  40. Roberts BC, et al. PTH(1-34) treatment and/or mechanical loading have different osteogenic effects on the trabecular and cortical bone in the ovariectomized C57BL/6 mouse. Sci Rep. 2020;10(1):8889. doi: 10.1038/s41598-020-65921-1.
  41. Roundtree IA, et al. YTHDC1 mediates nuclear export of N(6)-methyladenosine methylated mRNAs. Elife. 2017;6. doi: 10.7554/eLife.31311.
  42. Flick LM, et al. Effects of receptor activator of NFkappaB (RANK) signaling blockade on fracture healing. J Orthop Res. 2003;21(4):676-84.
  43. Takeyama K, Chatani M, Takano Y, Kudo A. In-vivo. imaging of the fracture healing in medaka revealed two types of osteoclasts before and after the callus formation by osteoblasts. Dev Biol. 2014;394(2):292-304.
  44. Yamada H, et al. Effects of 16-month treatment with the cathepsin K inhibitor ONO-5334 on bone markers, mineral density, strength and histomorphometry in ovariectomized cynomolgus monkeys. Bone. 2016;86:43-52.
  45. McClung MR, et al. Odanacatib for the treatment of postmenopausal osteoporosis: results of the LOFT multicentre, randomised, double-blind, placebo-controlled trial and LOFT Extension study. Lancet Diabetes Endocrinol. 2019;7(12):899-911.
  46. Tao R, et al. Advances in immune mechanisms and developing immune-targeted therapies for osteoporosis: A systematic review. Pharmacol Res. 2025;218:107835. doi: 10.1016/j.phrs.2025.107835.
  47. Qi Z, Luo J, Xiao Z, Yang D. Functional roles of immune cells in osteoporosis. Front Immunol. 2025;16:1698283. doi: 10.3389/fimmu.2025.1698283.
  48. Krzewski K, Cullinane AR. Evidence for defective Rab GTPase-dependent cargo traffic in immune disorders. Exp Cell Res. 2013;319(15):2360-7.
  49. Adnani L, et al. Immune cell infiltration into brain tumor microenvironment is mediated by Rab27-regulated vascular wall integrity. Sci Adv. 2025;11(21):eadr6940. doi: 10.1126/sciadv.adr6940.
  50. Brauer N, et al. Immunodeficiency with susceptibility to lymphoma with complex genotype affecting energy metabolism (FBP1, ACAD9) and vesicle trafficking (RAB27A). Front Immunol. 2023;14:1151166. doi: 10.3389/fimmu.2023.1151166.
  51. Ramadass M, Catz SD. Molecular mechanisms regulating secretory organelles and endosomes in neutrophils and their implications for inflammation. Immunol Rev. 2016;273(1):249-65.
  52. Menasche G, et al. Mutations in RAB27A cause Griscelli syndrome associated with haemophagocytic syndrome. Nat Genet. 2000;25(2):173-6.
  53. Prashar A, Schnettger L, Bernard EM, Gutierrez MG. Rab GTPases in Immunity and Inflammation. Front Cell Infect Microbiol. 2017;7:435. doi: 10.3389/fcimb.2017.00435.
  54. Stinchcombe JC, et al. Rab27a is required for regulated secretion in cytotoxic T lymphocytes. J Cell Biol. 2001;152(4):825-34.
  55. Catz SD. The role of Rab27a in the regulation of neutrophil function. Cell Microbiol. 2014;16(9):1301-10.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

BeenmergmacrofagenTRAP-kleuringWestern blotYTHDC1IGF2BP2
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.