Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

DNA-FISH-metafase verspreidt zich om extrachromosomaal DNA te onderscheiden van homogene kleuringsgebieden in menselijke kankercellijnen

414 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/71970

⸱

4 augustus 2026

 ,  , 
1Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

We rapporteren een DNA-FISH metafaseverspreidingsprotocol dat visueel het aantal locuskopieën en locatie binnen het genoom detecteert. Deze aanpak maakt enkelcelresolutie van amplificatietoestanden mogelijk, specifiek in kankercellijnen die extrachromosomaal DNA bevatten en gebieden homogeen kleuren.

Samenvatting

Whole-genome sequencing identificeert focale DNA-amplificaties met basenparresolutie, maar kan niet bepalen of geamplificeerde sequenties zich bevinden op extrachromosomaal DNA (ecDNA, ook bekend als double minutes) of binnen chromosomaal geïntegreerde homogene kleuringsgebieden (HSR's). DNA-fluorescentie in situ hybridisatie (DNA-FISH) metafasespreads blijven de gouden standaard voor het onderscheiden van deze amplificatietoestanden bij enkelcelresolutie. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor DNA-FISH metafaseverspreiding met behulp van menselijke kankercellijnen, waaronder celkweek, metafase-arrestatie, hypotonische behandeling, fixatie, chromosoomverspreiding, fluorescerende probe-hybridisatie en fluorescentiebeeldvorming. Het protocol bevat tussenliggende kwaliteitscontrolestappen om succesvolle chromosoomverspreiding te verifiëren en de metafase-verspreidingskwaliteit te optimaliseren, waardoor de workflow toegankelijk wordt voor laboratoria zonder gespecialiseerde cytogenetica-expertise. De resultaten tonen een duidelijke visualisatie van ecDNA- en HSR-amplificatietoestanden met behulp van locus-specifieke probes en illustreren veelvoorkomende technische artefacten die de interpretatie kunnen beïnvloeden. Dit protocol biedt een robuuste en reproduceerbare benadering voor het bestuderen van de structurele organisatie van oncogenamplificatie in kankercellen.

Inleiding

Het menselijk genoom is niet alleen georganiseerd door zijn sequentie, maar ook door zijn structuur, en veranderingen in zowel de sequentie als de structuur kunnen leiden tot kanker 1,2,3,4. Oncogenamplificatie komt voor in ongeveer 40% van alle tumoren, waar het bijdraagt aan tumorinitiatie, groei, metastase en geneesmiddelresistentie5. In sommige gevallen worden versterkte oncogenen gedragen op extrachromosomale DNA's (ecDNA's, ook wel double minutes genoemd), die circulaire, zelfreplicerende, dubbelstrengs DNA-elementen zijn die zich buiten de lineaire chromosomen 6,7,8,9 bevinden. ecDNA's zijn honderden kilobasen tot megabases in grootte 10,11. Door het ontbreken van centromeren segregeren ze asymmetrisch tijdens de mitose, wat leidt tot wel 100+ kopieën in één kern: 12,13,14,15,16,17,18. Deze ongelijke segregatie veroorzaakt variabiliteit in kopienummers tussen dochtercellen, wat leidt tot snelle tumorevolutie en een slechte patiëntuitkomst17,19.

ecDNA's bestaan in een dynamische relatie met homogene kleuringsgebieden (HSR's) (Figuur 1A)8,18. HSR's zijn focale, intrachromosomale amplificaties die kunnen ontstaan door de re-integratie van ecDNA's in één locus in het genoom: 8,10,18,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. Deze twee toestanden, ecDNA's en HSR's, kunnen onderling omzetten, wat aantoont dat oncogenamplificatie structureel plastischis 24,25,32,33. Deze interconversie heeft therapeutische relevantie omdat ecDNA's kunnen overgaan naar de HSR-toestand in aanwezigheid van medicijnen 32,33,34,35,36,37,38. Cellen die deze overgang naar de HSR-toestand ondergaan, worden vervolgens resistent tegen het geneesmiddel onder therapeutische druk33. HSR's lijken ook vaker voor te komen bij kwaadaardige tumoren dan bij goedaardige tumoren39. Ondanks hun klinische relevantie richten geen enkele door de FDA goedgekeurde strategieën zich op de HSR-toestand, deels omdat methoden om deze amplificatiestructuren te onderscheiden nog steeds onderbenut blijven.

Hoewel ecDNA- en HSR-toestanden verschillende klinische gevolgen hebben, kunnen huidige sequencingbenaderingen ze niet betrouwbaar onderscheiden. Whole-genome sequencing (WGS) identificeert nu geamplificeerde regio's met basenparresolutie40. WGS is waardevol geweest bij het definiëren van de sequentiesamenstelling van ecDNA's en HSR's, maar ten koste van de ruimtelijke resolutie. In tegenstelling tot traditionele cytogenetische benaderingen kan WGS alleen niet bepalen of een versterkte sequentie op ecDNA's zit of geïntegreerd is in een chromosoom als een HSR 41,42,43. Als gevolg daarvan blijven methoden die de ruimtelijke context van versterking behouden essentieel om de biologie van deze verschillende toestanden te begrijpen.

De afgelopen 40 jaar hebben DNA-fluorescentie in situ hybridisatie (DNA-FISH) metafase-spreads gediend als gouden standaard voor het identificeren en onderscheiden van ecDNA en HSR-amplificatiestaten 42,44,45,46. Sterker nog, ecDNA's en HSR's werden eerst geïdentificeerd en gekarakteriseerd door middel van metafase-gebaseerde cytogenetische analyses 7,47. Voor het wijdverbreide gebruik van fluorescerende probes werd in situ hybridisatie uitgevoerd met radiogelabelde DNA-probes, die ook zijn gebruikt om ecDNA's en HSR's48,49 te visualiseren. Naarmate WGS aan populariteit won, werden DNA-FISH metafase-spreads minder gebruikelijk. Veel aspecten van de workflow zijn verspreid over de cytogenetische literatuur, en geoptimaliseerde protocollen worden doorgaans behouden binnen individuele onderzoeksgroepen of cytogeneticalabs die de methode als proprietary50,51 behandelen. Hier beschrijven we een DNA-FISH metafase verspreidingsprotocol om de amplificatietoestand visueel op enkelcelniveau te onderscheiden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle kweekprocedures voor menselijke cellen werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen.

1. Cellen in metafase arresteren met Colcemid (N-methyl-N-deacetyl-colchicine)

  1. Begin met ongeveer 2,0 × 106–2,0 × 107 kankercellen of andere gekweekte cellen. Te weinig cellen zorgen voor minder metafaseverspreidingen, terwijl te veel cellen kunnen leiden tot onvoldoende fixatie.
  2. Bepaal de geschikte Colcemid-incubatietijd voor het experimentele systeem. De incubatietijd beïnvloedt het aantal verkregen metafase-spreads en de chromosoomlengte, en optimale omstandigheden variëren per celtype.
    OPMERKING: Kortere incubatietijden resulteren in minder cellen die in metafase worden gestopt op het moment van verzameling. Langere incubatietijden leveren meer gecondenseerde chromosomen met kortere armen, wat de analyse moeilijker maakt. Voor kankercellijnen met een ongeveer 24 uur verdubbelingstijd zorgen incubatietijden variërend van 45 minuten tot 's nachts voor geschikte metafaseverspreidingen. Optimaliseer de incubatietijd voor cellen met langzamere verdubbelingstijden. Een incubatie van 2 uur is over het algemeen voldoende om een voldoende aantal metafasespreads te produceren met chromosoomlengtes die geschikt zijn voor analyse.
  3. Bereken de hoeveelheid Colcemide die nodig is om een uiteindelijke concentratie van 10 μL/mL in het juiste celkweekmedium te bereiken.
    OPMERKING: Houd cellen in logaritmische groei door ze minstens 24 uur voor metafase-stop te laten passeren of te zaaien. Behandel cellen met Colcemide wanneer de culturen 70%–90% samenvloeiing bereiken.
  4. Verdun de Colcemid-bouillonoplossing 1:1 met steriel ultrazuiver water. Voeg het juiste volume toe aan de kweek en laat het 45 minuten tot een nacht incuberen in een celkweekincubator.

2. Oogstcellen

  1. Maak verse Carnoy's fixatiemiddel (3:1 methanol: azijnzuur). Houd de fixatief tijdens het fixatieproces op ijs.
  2. Maak een verse 0,075 M KCl-oplossing en verwarm deze in een waterbad van 37 °C.
  3. Verzamel de cellen als een pellet en registreer het aantal cellen. Gebruik deze waarde om het uiteindelijke herophangingsvolume te berekenen.
    OPMERKING: Loskoppel adherente cellen door trypsinisatie. Breng suspensiecellen direct over in 15 mL centrifugebuizen. Voer Colcemid en Colcemid-bevattende media af volgens de institutionele richtlijnen voor gevaarlijk afval.
  4. Was de cellen met PBS.
  5. Sussen de cellen voorzichtig opnieuw in 10 mL warme 0,075 M KCl en meng door een zachte inversie. Deze hypotone behandeling zwelt de cellen op, waardoor ze kunnen barsten en de chromosomen tijdens de preparatie van de dia.
  6. Incubeer de cellen in een waterbad van 37 °C gedurende 30 minuten.
  7. Voeg langzaam 2 ml ijskoude Carnoy's fixatief toe terwijl je de suspensie voorzichtig mengt door inversie.
  8. Laat de cellen 5 minuten staan.
  9. Centrifugeer op 500 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).
  10. Aspireer voorzichtig het supernatant of verwijder het met een pipet.
  11. Voeg langzaam 10 ml ijskoude Carnoy's fixatiemiddel toe in stappen van 0,5 ml terwijl je na elke toevoeging voorzichtig mengt.
  12. Laat de cellen 10 minuten staan bij RT.
  13. Centrifugeer op 650 × g gedurende 5 minuten op RT.
  14. Herhaal stappen 2.10–2.13 twee keer
  15. Laat tijdens de laatste wasbeurt de cellen hangen in Carnoy's fixatiemiddel.
    PAUZE: Bewaar de vaste cel suspensie bij −20 °C of ga direct naar sectie 3.
    OPMERKING: Voor monsters met minder dan ongeveer 3 × 106 cellen , voer fixatie uit in 1,5 mL microcentrifugebuizen in plaats van grotere conische buizen. Verminder de volumes van 0,075 M KCl en Carnoy's fixatieve factor met 10 keer, terwijl alle incubatietijden, temperaturen en centrifugatiecondities behouden blijven.

3. Tafelblad laat vallen

  1. Haal het monster van −20 °C en ontdooi het tot RT.
  2. Centrifugeer op 800 × g voor 7 minuten bij RT.
  3. Label de glazen glaasjes en leg ze op ijs.
  4. Met behulp van het celaantal dat vóór fixatie is verkregen, bereken je het volume van Carnoy's fixatiemiddel dat nodig is om de pellet opnieuw te suspenderen bij een uiteindelijke concentratie van ongeveer 5 × 106 cellen/mL. Na centrifugatie verwijder je voorzichtig de supernatant met een pipet, waarbij het berekende volume fixatief boven de pellet blijft.
  5. Suspendeer de vaste cellen in Carnoy's fixatief opnieuw met een P1000-pipet.
  6. Plaats ongeveer 300 μL van de vaste cel suspensie in een 1,5 mL microcentrifugebuis.
  7. Suss het monster grondig opnieuw met een P200-pipet door meerdere keren op en neer te pipetten.
  8. Aspireer 60 μL van de resuspendeerde cellen met een P200-pipet.
  9. Houd de pipetpunt ongeveer 1 m boven de glazen glijbaan op ijs en richt op het midden van de slede.
  10. Doseer langzaam één druppel van de celsuspensie op de slide.
    OPMERKING: Markeer de vallocatie aan de rand van de slide met een ethanolbestendige marker om identificatie tijdens volgende stappen te vergemakkelijken.
  11. Laat de cellen 10 minuten op ijs drogen.
  12. Plaats de glaasjes op een slide-incubator op 80 °C gedurende 10 minuten.
  13. Verwijder de glaasjes met een tang en laat ze afkoelen.
  14. Bekijk de dia's met een fasecontrastmicroscoop met een doel van 10× of 20×. Bevestig de aanwezigheid van meerdere goed verspreide metafase-spreads zonder overmatige overlapping.

4. Voorbehandeling van de glijbaan

  1. Maak Coplin-potten klaar voor de wasstappen
    1. Bereid elk reagens vers: 70% azijnzuur (40 mL), PBS (40 mL), PBS (45 mL), 70% ethanol (40 mL), 85% ethanol (40 mL) en 100% ethanol (40 mL).
  2. Plaats de glazen glaasjes 2 minuten in 70% azijnzuur.
  3. Plaats de glazen slides in 40 ml PBS gedurende 30 seconden.
  4. Plaats de glazen glaasjes 5 minuten in 45 mL PBS.
  5. Dehydrateer de glasglijbanen achtereenvolgens in 70%, 85% en 100% ethanol gedurende elk 1 minuut.
  6. Laat de dia's 10 minuten aan de lucht drogen bij RT.

5. Bereid de sonde voor

OPMERKING: Dit protocol gebruikt commercieel verkrijgbare locus-specifieke DNA-FISH-probes die hybridiseren naar een genomisch gebied van belang.

  1. Kies een probe die gericht is op de versterkte locus die onderzocht wordt. Ontdooi de sonde en hybridisatiebuffer volgens de instructies van de fabrikant. Laat de sonde RT bereiken voordat je hem gebruikt.
  2. Bereid een probemengsel voor met 1 μL probe en 4 μL hybridisatiebuffer voor elke glasglaas.
    OPMERKING: De optimale concentratie van de probe kan afhangen van de fabrikant en de probe. De hier gespecificeerde concentratie is geoptimaliseerd volgens de probes die in deze studie zijn gebruikt. Optimaliseer echter de concentratie van de probe voor elke nieuwe locus.
  3. Breng 5 μL van het probe/hybridisatiebuffermengsel aan op het midden van elke droplocatie op de glazen sleuf.
    OPMERKING: Sondes zijn lichtgevoelig. Minimaliseer de lichtblootstelling gedurende de resterende procedure door de dia's tussen de stappen en tijdens het verwerken van andere dia's in een donkere lade op te bergen.
  4. Leg voorzichtig een dekmantel over het monster.
  5. Sluit de randen van de deklaag af met rubbercement.
  6. Plaats de glazen glaasjes in een vochtige kamer.
  7. Hybridiseer de sonde volgens het protocol van de fabrikant. Laat hybridisatie 's nachts plaatsvinden (12–18 uur).

6. Post-hybridisatiewashes, tegenkleuring, montage en imaging

  1. Maak Coplin-potten klaar voor de wasstappen
    1. Bereid elk reagens vers: 2× SSC (40 mL), 0,4× SSC (40 mL), 70% ethanol (40 mL), 85% ethanol (40 mL), 100% ethanol (40 mL) en PBS (45 mL).
    2. Bereid SSC voor en bewaar deze als een 20× voorraadoplossing (3 M NaCl, 0,3 M natriumcitraat, pH 7,0). Om 1 L te bereiden, los 175,3 g NaCl en 88,2 g natriumcitraat op in 1 L ultrazuiver water. Verdunn de voorraad om werkoplossingen van 2× SSC en 0,4× SSC te bereiden indien nodig.
  2. Verwarm de 0,4× SSC-oplossing tot 72 °C in een waterbad.
  3. Verwijder de glazen schuilen uit de vochtige kamer en verwijder voorzichtig het rubberlijm.
  4. Plaats de glazen glijplaten in 2× SSC voor 2 minuten bij RT. Verwijder voorzichtig de coverslips.
  5. Plaats de glazen glaasjes in voorverwarmde 0,4× SSC op 72 °C gedurende 2 minuten.
  6. Plaats de glazen dia's in 2× SSC voor 1 minuut bij RT.
  7. Dehydrateer de glasglijbanen achtereenvolgens in 70%, 85% en 100% ethanol gedurende elk 1 minuut.
  8. Laat de dia's 10 minuten in het donker aan de lucht drogen bij RT.
  9. Verdun 1 mg/mL DAPI 1:1000 in PBS tot een eindvolume van 1 mL.
    OPMERKING: Deze aliquot kan tot 1 week op 4 °C worden bewaard.
  10. Pipette 10 μL van de verdunde DAPI op elke glazen sleuf op de gemarkeerde valplaats.
  11. Leg voorzichtig een dekmantel over het monster om ervoor te zorgen dat de DAPI-oplossing gelijkmatig wordt verdeeld.
  12. Breng de glijbanen 5–10 minuten in het donker uit.
  13. Plaats de glazen dia's 30 seconden in PBS.
  14. Verwijder de dekmantels.
  15. Plaats de glazen dia's 2 minuten in PBS.
  16. Dehydrateer de glazen glaasjes door ze kort te dopen in 70%, 85% en 100% ethanol voor ongeveer 10 seconden per stuk.
  17. Laat de dia's 10 minuten in het donker aan de lucht drogen bij RT.
  18. Voeg 15 μL montagemedium toe aan elke glazen glijbaan en plaats er een dekmantel bovenop.
  19. Laat het opbouwmedium gelijkmatig verspreiden en dep vervolgens voorzichtig overtollig weg.
  20. Sluit de randen van de deklaag af met nagellak.
  21. Laat de nagellak 15 minuten drogen bij RT in het donker.
    PAUZE: Bewaar de dia's op 4 °C voor langdurige opslag.
  22. Stel je de dia's voor.
    OPMERKING: De beelden zijn gemaakt met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop met een 60× olie-onderdompelingsobjectief.
  23. Verzamel meerdere z-stacks voor elk fluorescentiekanaal om het signaal over de volledige diepte van de metafaseverspreiding op te vangen.
  24. Deconvleer de beeldstacks met behulp van een maximum-likelihood-schattingsalgoritme om de signaalhelderheid te verbeteren en onscherpe fluorescentie te verminderen.
  25. Verwerk en analyseer de uiteindelijke beelden in ImageJ, en selecteer het optimale brandpuntsvlak voor elke metafaseverspreiding voordat je downstream analyseert.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dit protocol (Figuur 1B) levert schone, goed verspreide, intacte metafasechromosomen op die geschikt zijn voor cytogenetische analyse, waarbij chromosomen en DNA-FISH-signalen duidelijk zichtbaar zijn met fluorescentiemicroscopie. Het gebruik van een brightfield/fasecontrastmicroscoop met lage vergroting (10× of 20×) is een belangrijke kwaliteitscontrolestap om te verifiëren dat kernen zijn gebarsten en chromosomen zijn verspreid (Figuur...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Ondanks hun goed gevestigde voordelen worden DNA-FISH metafasespreads onderbenut in het tijdperk van WGS. De fysieke organisatie van amplified DNA is functioneel significant, omdat het het biologische gedrag en therapeutische respons kan beïnvloeden 61,62,63,64. Focaal geamplificeerde oncogenen kunnen bestaan op ecDNA of binnen HSR's, en deze twee amplificatiet...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door NIH R00HG011467 en CPRIT RR23004 aan G.S.E. Imaging voor dit project werd ondersteund door de Integrated Microscopy Core aan het Baylor College of Medicine met financiering van het NIH (P30 DK056338, P30 CA125123, S10OD030414). De auteurs bedanken Dr. Pawel Stankiewicz voor zijn advies in het vroege proces. De auteurs bedanken ook Dr. Paul Mischel (Stanford University) voor het leveren van de GBM39ec- en GBM39hsr-cellenlijnen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
15-mL conische centrifugeelke bronNACentrifugatie. 
15-mL conische buizenelke bronNACelcollectie.
200 proof ethanolelke bronNAWasstappen. 
Azijnzuur, glashelder, 99,7%Millipore Sigma695092Carnoys fixatie en wasstappen op de dia.
Antifade montagemediumFisherScientificNC9265087Diamontage na voltooide diavoorbereiding
Biologische veiligheidskast met vacuumontsluitingelke bronNAChemische opslag.
Colcemid (N-methyl-N-deacetyl-colchicine)Millipore Sigma10295892001Bindt tubuline, arresteert cellen in metafase.
Coplin-pottenelke bronNAWasstappen. 
DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindole)Milipore SigmaD8417-1MGFluorescente DNA-kleuring.
EGFR/CON7 FISH-sonde Empire GenomicsEGFR-CHR07Locus-specifieke fluorescente sonde. 
Elmer's rubbercementelke bronNADe dekplaat tijdens overnachtelijke sondehybridisatie op zijn plaats houden.
Etanolbestendige permanente markerelke bronNADialabeling.
Fluorescente microscoopelke bronNADiabeeldvorming. 
Glazen Dekplaat, 22 x 22mmThermoFisher50-143-780Sondehybridisatie op de dia.
Glazen Dia, voorgereinigdVWR48311-703Om metafase-uitstrekkingen te laten vallen en DNA-FISH uit te voeren.
Bevochtigde CO2-incubatorelke bronNALive-celincubatie.
HybridisatiebufferEmpire GenomicsHyb-BufferBuffer gebruikt met sonde. 
IJsemmerelke bronNACarnoy's fixatie koud houden. 
KCl (2M)ThermoFisherAM9640GCellen opzwellen voor fixatie. 
Methanol, 99,9%, HPLC-kwaliteitMillipore Sigma1060351000Voor Carnoys fixatie. 
Microcentrifugeelke bronNACentrifugatie. 
Microcentrifugebuisjeselke bronNAVoor cellen tijdens fixatie en voor sondebereiding. 
MYC / SE 8 SondeLeicaKI-10106Locus-specifieke fluorescente sonde. 
PBS, pH 7,4Gibco10010-023Wasstappen. 
Phasecontrastmicroscoopelke bronNABeeldvorming van metafase-uitstrekkingen direct na het laten vallen
Pipettipselke bronNAPipetteren.
NatriumchlorideMillipore SigmaS9888Voor SSC-buffer.
NatriumcitraatMillipore Sigma567446Voor SSC-buffer.
Steriele ultrapure waterelke bronNAWasstappen. 
ThermoBrite programmeerbare dia-incubatorelke bronNADia-incubatie.
Tangelke bronNAVoor wasstappen op de dia. 
Waterbadelke bronNAVoor KCl-incubatie. 

Referenties

  1. Albertson DG. Gene amplification in cancer. Trends Genet. 2006;22:447-455.
  2. Bagci O, Kurtgöz S. Amplification of cellular oncogenes in solid tumors. N Am J Med Sci. 2015;7:341-346.
  3. Schimke RT, et al. Gene amplification and drug resistance in cultured animal cells. Cancer Treat Rev. 1984;11:9-17.
  4. Baker TM, Waise S, Tarabichi M, Van Loo P. Aneuploidy and complex genomic rearrangements in cancer evolution. Nat Cancer. 2024;5:228-239.
  5. Ohshima K, et al. Integrated analysis of gene expression and copy number identified potential cancer driver genes with amplification-dependent overexpression in 1,454 solid tumors. Sci Rep. 2017;7:641.
  6. Pecorino LT, Verhaak RGW, Henssen A, Mischel PS. Extrachromosomal DNA (ecDNA): An origin of tumor heterogeneity, genomic remodeling, and drug resistance. Biochem Soc Trans. 2022;50:1911-1920.
  7. Cox D, Yuncken C, Spriggs AI. Minute chromatin bodies in malignant tumours of childhood. Lancet. 1965;286:55-58.
  8. Kohl NE, et al. Transposition and amplification of oncogene-related sequences in human neuroblastomas. Cell. 1983;35:359-367.
  9. Giollant M, et al. Characterization of double minute chromosomes' DNA content in a human high-grade astrocytoma cell line using comparative genomic hybridization and fluorescence in situ hybridization. Hum Genet. 1996;98:265-270.
  10. Stephens PJ, et al. Massive genomic rearrangement acquired in a single catastrophic event during cancer development. Cell. 2011;144:27-40.
  11. Zhang CZ, et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 2015;522:179-184.
  12. Lange JT, et al. The evolutionary dynamics of extrachromosomal DNA in human cancers. Nat Genet. 2022;54:1527-1533.
  13. Turner KM, et al. Extrachromosomal oncogene amplification drives tumour evolution and genetic heterogeneity. Nature. 2017;543:122-125.
  14. Wu S, et al. Circular ecDNA promotes accessible chromatin and high oncogene expression. Nature. 2019;575:699-703.
  15. Deshpande V, et al. Exploring the landscape of focal amplifications in cancer using AmpliconArchitect. Nat Commun. 2019;10:392.
  16. Levan A, Levan G. Have double minutes functioning centromeres? Hereditas. 1978;88:81-92.
  17. Stöber MC, et al. Intercellular extrachromosomal DNA copy-number heterogeneity drives neuroblastoma cell state diversity. Cell Rep. 2024;43:114711.
  18. Kaufman RJ, Brown PC, Schimke RT. Amplified dihydrofolate reductase genes in unstably methotrexate-resistant cells are associated with double minute chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 1979;76:5669-5673.
  19. Kim H, et al. Extrachromosomal DNA is associated with oncogene amplification and poor outcome across multiple cancers. Nat Genet. 2020;52:891-897.
  20. Schlesinger HR, et al. Establishment and characterization of human neuroblastoma cell lines. Cancer Res. 1976;36:3094-3100.
  21. Balaban-Malenbaum G, Gilbert F. Double minute chromosomes and the homogeneously staining regions in chromosomes of a human neuroblastoma cell line. Science. 1977;198:739-741.
  22. Gilbert F, et al. Homogeneously staining region in a retinoblastoma cell line: Relevance to tumor initiation and progression. J Natl Cancer Inst. 1981;67:301-306.
  23. Quinn LA, Moore GE, Morgan RT, Woods LK. Cell lines from human colon carcinoma with unusual cell products, double minutes, and homogeneously staining regions. Cancer Res. 1979;39:4914-4924.
  24. Montgomery KT, Biedler JL, Spengler BA, Melera PW. Specific DNA sequence amplification in human neuroblastoma cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1983;80:5724-5728.
  25. Singer MJ, et al. Amplification of the human dihydrofolate reductase gene via double minutes is initiated by chromosome breaks. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97:7921-7926.
  26. Shimizu N. Gene amplification and the extrachromosomal circular DNA. Genes (Basel). 2021;12:1533.
  27. Carroll SM, et al. Double minute chromosomes can be produced from precursors derived from a chromosomal deletion. Mol Cell Biol. 1988;8:1525-1533.
  28. Alitalo K, et al. Homogeneously staining chromosomal regions contain amplified copies of an abundantly expressed cellular oncogene (c-myc) in malignant neuroendocrine cells from a human colon carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 1983;80:1707-1711.
  29. George DL, Powers VE. Amplified DNA sequences in Y1 mouse adrenal tumor cells: Association with double minutes and localization to a homogeneously staining chromosomal region. Proc Natl Acad Sci U S A. 1982;79:1597-1601.
  30. Storlazzi CT, et al. Gene amplification as double minutes or homogeneously staining regions in solid tumors: Origin and structure. Genome Res. 2010;20:1198-1206.
  31. Biedler JL, Meyers MB, Spengler BA. Homogeneously staining regions and double minute chromosomes, prevalent cytogenetic abnormalities of human neuroblastoma cells. In: Fedoroff S, Hertz L, editors. Advances in Cellular Neurobiology. Academic Press; New York, NY; 1983. p. 267-307.
  32. Shoshani O, et al. Chromothripsis drives the evolution of gene amplification in cancer. Nature. 2021;591:137-141.
  33. Nathanson DA, et al. Targeted therapy resistance mediated by dynamic regulation of extrachromosomal mutant EGFR DNA. Science. 2014;343:72-76.
  34. Song K, et al. Plasticity of extrachromosomal and intrachromosomal BRAF amplifications in overcoming targeted therapy dosage challenges. Cancer Discov. 2022;12:1046-1069.
  35. Kang X, et al. Extrachromosomal DNA replication and maintenance couple with the DNA damage pathway in tumors. Cell. 2025;188:3405-3421.e27.
  36. Pommier Y, Nussenzweig A, Takeda S, Austin C. Human topoisomerases and their roles in genome stability and organization. Nat Rev Mol Cell Biol. 2022;23:407-427.
  37. Coquelle A, et al. Expression of fragile sites triggers intrachromosomal mammalian gene amplification and sets boundaries to early amplicons. Cell. 1997;89:215-225.
  38. Coquelle A, et al. A new role for hypoxia in tumor progression: Induction of fragile site triggering genomic rearrangements and formation of complex double minutes and homogeneously staining regions. Mol Cell. 1998;2:259-265.
  39. Mandahl N, Mertens F, Mitelman F. Gene amplification in neoplasia: A cytogenetic survey of 80,131 cases. Genes Chromosomes Cancer. 2024;63:e23214.
  40. Roepman P, et al. Clinical validation of whole genome sequencing for cancer diagnostics. J Mol Diagn. 2021;23:816-833.
  41. Ho SS, Urban AE, Mills RE. Structural variation in the sequencing era. Nat Rev Genet. 2020;21:171-189.
  42. Rajkumar U, et al. EcSeg: Semantic segmentation of metaphase images containing extrachromosomal DNA. iScience. 2019;21:428-435.
  43. Purshouse K, Pollard SM, Bickmore WA. Imaging extrachromosomal DNA (ecDNA) in cancer. Histochem Cell Biol. 2024;162:53-64.
  44. Shapiro DN, et al. Detection of N-myc gene amplification by fluorescence in situ hybridization: Diagnostic utility for neuroblastoma. Am J Pathol. 1993;142:1339-1346.
  45. Krupina K, et al. Chromothripsis and ecDNA initiated by N4BP2 nuclease fragmentation of cytoplasm-exposed chromosomes. Science. 2025;390:1156-1163.
  46. Trask BJ, Hamlin JL. Early dihydrofolate reductase gene amplification events in CHO cells usually occur on the same chromosome arm as the original locus. Genes Dev. 1989;3:1913-1925.
  47. Biedler JL, Spengler BA. A novel chromosome abnormality in human neuroblastoma and antifolate-resistant Chinese hamster cell lines in culture. J Natl Cancer Inst. 1976;57:683-695.
  48. Nunberg JH, Kaufman RJ, Schimke RT, Urlaub G. Amplified dihydrofolate reductase genes are localized to a homogeneously staining region of a single chromosome in a methotrexate-resistant Chinese hamster ovary cell line. Proc Natl Acad Sci U S A. 1978;75:5553-5556.
  49. Gapski GR, et al. Synthesis of a fluorescent derivative of amethopterin. J Med Chem. 1975;18:526-528.
  50. Verma RS, Babu A. Tissue culture techniques and chromosome preparation. In: Human Chromosomes: Manual of Basic Techniques. Pergamon Press; 1989. p. 4-45.
  51. Moorhead PS, et al. Chromosome preparations of leukocytes cultured from human peripheral blood. Exp Cell Res. 1960;20:613-616.
  52. Ohara H, Terasima T. Colcemid effects on mitotic synchrony and synchronized cells. Cell Struct Funct. 1976;1:187-195.
  53. Kaufman RJ, Brown PC, Schimke RT. Loss and stabilization of amplified dihydrofolate reductase genes in mouse sarcoma S-180 cell lines. Mol Cell Biol. 1981;1:1084-1093.
  54. Marsden CG, Dragon JA, Wallace SS, Sweasy JB. Base excision repair variants in cancer. Methods Enzymol. 2017;591:119-157.
  55. Nichols A, et al. Chromosomal tethering and mitotic transcription promote ecDNA nuclear inheritance. Mol Cell. 2025;85:2839-2853.e8.
  56. Henegariu O, et al. Improvements in cytogenetic slide preparation: Controlled chromosome spreading, chemical aging, and gradual denaturing. Cytometry. 2001;43:101-109.
  57. Lichter P, et al. Delineation of individual human chromosomes in metaphase and interphase cells by in situ suppression hybridization using recombinant DNA libraries. Hum Genet. 1988;80:224-234.
  58. Pinkel D, et al. Fluorescence in situ hybridization with human chromosome-specific libraries: Detection of trisomy 21 and translocations of chromosome 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 1988;85:9138-9142.
  59. Sumner AT, Evans HJ, Buckland RA. New technique for distinguishing between human chromosomes. Nature New Biol. 1971;232:31-32.
  60. Howe B, Umrigar A, Tsien F. Chromosome preparation from cultured cells. J Vis Exp. 2014;e50203.
  61. Cavalli G, Misteli T. Functional implications of genome topology. Nat Struct Mol Biol. 2013;20:290-299.
  62. Kosak ST, Groudine M. Form follows function: The genomic organization of cellular differentiation. Genes Dev. 2004;18:1371-1384.
  63. Sehgal P, Chaturvedi P. Chromatin and cancer: Implications of disrupted chromatin organization in tumorigenesis and its diversification. Cancers (Basel). 2023;15:466.
  64. Misteli T. Beyond the sequence: Cellular organization of genome function. Cell. 2007;128:787-800.
  65. Zhu Y, et al. Oncogenic extrachromosomal DNA functions as mobile enhancers to globally amplify chromosomal transcription. Cancer Cell. 2021;39:694-707.
  66. Hung KL, et al. ecDNA hubs drive cooperative intermolecular oncogene expression. Nature. 2021;600:731-736.
  67. Taghbalout A, et al. Extrachromosomal DNA associates with nuclear condensates and reorganizes chromatin structures to enhance oncogenic transcription. Cancer Cell. 2025;43:2191-2205.e6.
  68. Hsu TC, Pomerat CM. Mammalian chromosomes in vitro: II. A method for spreading the chromosomes of cells in tissue culture. J Hered. 1953;44:23-30.
  69. Erwin GS, Bhimsaria D, Eguchi A, Ansari AZ. Mapping polyamide-DNA interactions in human cells reveals a new design strategy for effective targeting of genomic sites. Angew Chem. 2014;126:10288-10292.
  70. Erwin GS, et al. Synthetic genome readers target clustered binding sites across diverse chromatin states. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016;113:E7418-7427.
  71. Erwin GS, et al. Synthetic transcription elongation factors license transcription across repressive chromatin. Science. 2017;358:1617-1622.
  72. Erwin GS, et al. Recurrent repeat expansions in human cancer genomes. Nature. 2023;613:96-102.
  73. Shimizu N, Kanda T, Wahl GM. Selective capture of acentric fragments by micronuclei provides a rapid method for purifying extrachromosomally amplified DNA. Nat Genet. 1996;12:65-71.
  74. Jaworski JJ, et al. ecDNA replication is disorganized and vulnerable to replication stress. Nucleic Acids Res. 2025;53:gkaf711.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

BiologieEditie 234Editie 234Lege waardeEditieFluorescentie in situ hybridisatieMetafase-spreidingChromosoomecDNAExtrachromosomaal DNAHomogeen kleurende regioHSRKaryotypeGenamplificatie
DNA-FISH-metafase verspreidt zich om extrachromosomaal DNA te onderscheiden van homogene kleuringsgebieden in menselijke kankercellijnen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.