Bloedafname uit de staartslagader bij ratten onder isofluraan-anesthesie maakt een gecontroleerde collectie van relatief grote bloedvolumes mogelijk met minimale stress. Het snelle herstel en de geschiktheid voor herhaalde afname maken deze methode ideaal voor longitudinale studies waarbij betrouwbare fysiologische parameters vereist zijn.
Snelverslag
Bloedafname uit de staartslagader bij met isofluraan geanestheseerde ratten vermindert stress en verbetert de betrouwbaarheid
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Deze methode beschrijft bloedafname via de staartslagader bij ratten onder isofluraan-anesthesie. Het gebruik van isofluraan minimaliseert defensieve bewegingen, waardoor een gecontroleerde procedure met lage stress voor zowel het dier als de onderzoeker mogelijk wordt. Verdere voordelen zijn het snelle herstel van de dieren na afname vanwege de kortwerkende eigenschappen van isofluraan, de mogelijkheid om relatief grote hoeveelheden bloed uit één punctieplaats te verzamelen en de geschiktheid van de techniek voor herhaalde bloedafnames. Daarnaast kan de snelle arteriële bloedstroom de kans op stollingsartefacten verminderen, hoewel dit in de huidige studie niet specifiek is geëvalueerd. De resultaten werden vastgesteld als onderdeel van een farmacokinetische studie. De bloedafname was succesvol bij alle dieren, wat resulteerde in een slagingspercentage van 100%. Er werd geen significant gewichtsverlies waargenomen 24 h na de bloedafname, en de dieren vertoonden een snel herstel zonder zichtbare tekenen van distress of procedure-gerelateerde complicaties. Over het algemeen is deze aanpak zeer geschikt voor experimentele settings waar betrouwbare en reproduceerbare bloedafname met minimale hanteerstress vereist is. Na een korte leerfase bleek de procedure betrouwbaar voor routinematig experimenteel gebruik. Echter, de potentiële invloed van isofluraan-anesthesie op bloedgas-, metabole en endocriene parameters moet worden meegewogen bij de planning van experimenten en de interpretatie van de resultaten.
Inleiding
Bloedafname is een cruciale techniek bij experimenteel onderzoek met ratten om fysiologische en farmacokinetische parameters te beoordelen. Aanbevolen technieken zijn onder meer staartincisie, afname uit de laterale staartader, de vena saphena, de sublinguale vene, de vena jugularis en de sinus retro-orbitalis, alsmede catheterisatie1,2,3,4,5,6,7. De keuze van de methode hangt echter af van de gewenste resultaten, en elke methode kent inherente beperkingen.
Bemonstering via de laterale staartvene en staartincisies kunnen beperkte volumes opleveren, terwijl retro-orbitale bemonstering, hoewel efficiënt, invasiever is, het herstel beïnvloedt1 en risico's op weefselbeschadiging4,8 en ethische bezwaren met zich meebrengt. Bemonstering uit de vena saphena vereist fixatie en het scheren van de punctieplaats2, wat stress kan induceren en de experimentele resultaten kan beïnvloeden. Herhaalde bloedafnames uit de vena saphena kunnen bovendien uitdagend zijn vanwege de korte lengte van de vene en hemostase. Hetzelfde geldt voor de sublinguale vene. Hoewel grote bloedvolumes snel verkregen kunnen worden via een punctie van de vena jugularis, bestaat er een risico op longletsel dat leidt tot een pneumothorax. Daarnaast moet de punctie blind worden uitgevoerd6, aangezien de vene niet zichtbaar is.
In deze context worden verfijnde methoden die het lijden van dieren minimaliseren en tegelijkertijd een goede monsterkwaliteit waarborgen steeds belangrijker. Bloedafname uit de staartslagader onder isofluraan-anesthesie biedt zo'n benadering. Het gebruik van kortwerkende inhalatieanesthesie vermindert hanteerstress en vergemakkelijkt een gecontroleerde procedure. Daarnaast wordt verwacht dat arteriële bloedafname kwalitatief goede bloedmonsters oplevert met een verminderd risico op coagulatieartefacten vanwege de snelle bloedstroom. De techniek is bijzonder geschikt voor herhaalde afnames en longitudinale onderzoeksontwerpen, aangezien dieren snel herstellen en fysiologische verstoringen tot een minimum worden beperkt. Over het algemeen combineert deze methode technische betrouwbaarheid met een verbeterd dierenwelzijn en is deze daarom zeer geschikt voor experimentele settings waarbij nauwkeurige en reproduceerbare bloedmetingen vereist zijn.
Protocol
Alle experimenten waarbij de gepresenteerde methode werd gebruikt, zijn goedgekeurd door de ethische commissie van de Medische Universiteit van Wenen en het Oostenrijkse Ministerie van Onderwijs, Wetenschap en Onderzoek.
1. Voorbereiding
OPMERKING: Bereid alle benodigde materialen voor voordat de anesthesie wordt toegediend om een vlot en efficiënt verloop van de procedure te garanderen.
- Vul de spuit met 3,2% citraat (de hoeveelheid hangt af van de gewenste parameters) om bloedstolling te voorkomen.
- Stel de zuurstofstroom in op 0,5 L/min en richt deze op de inductiekamer en het masker.
- Sluit de slang die aan het masker is verbonden af om ervoor te zorgen dat het inductiegas en de zuurstof uitsluitend naar de kamer worden geleid.
- Haal de rat uit de kooi en plaats deze in de inductiekamer.
- Sluit het deksel van de inductiekamer en zorg ervoor dat de staart of de poten van de rat niet bekneld raken.
- Stel de isofluraan in op 3% (afhankelijk van het slangensysteem) en handhaaf dit tot het dier geen spontane bewegingen meer vertoont en het righting-reflex verdwijnt.
- Schud de kamer voorzichtig heen en weer om het verlies van het righting-reflex te bevestigen.
- Sluit de slang die aan de box is verbonden af om het gas en de zuurstof naar het masker om te leiden.
- Open het deksel van de kamer en haal de rat eruit.
- Plaats de rat in rugligging op het warmtekussen (38 °C) met de neus in het masker (Figuur 1).
- Reinig de staart met water en droog deze af met vloeipapier.
- Desinfecteer de staart met alcohol.
- Bevestig de afwezigheid van het interdigitale reflex door te knijpen tussen de tenen van de achterpoot van de rat en te controleren of er geen terugtrekkingsreactie optreedt.
Figuur 1: Positie van de rat. De rat wordt op de rug geplaatst met de neus in het anesthesiemasker. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Bloedafname
OPMERKING: De slagader bevindt zich aan de ventrale zijde van de staart. De optimale punctieplaats bevindt zich tussen het middelste en het distale deel van de staart. De slagader wordt primair geïdentificeerd aan de hand van de anatomische positie, maar bij licht gepigmenteerde ratten (bijv. Sprague Dawley) kan de ventrale staartslagader af en toe zichtbaar zijn als een vaal blauw vat. In dat geval kan de ventrale staartslagader meestal gemakkelijk worden geïdentificeerd bij de basis van de staart door de anatomische positie in de ventrale middellijn. Zodra deze is geïdentificeerd, kan het verloop distaal worden gevolgd naar de beoogde punctieplaats.
- Volg de arterie van proximaal naar distaal.
- Positioneer de schuine zijde van de naald naar boven.
- Voer de naald in onder een hoek van ongeveer 30 ° (Figuur 2).
- Schuif de naald craniaal op en vervolgens parallel aan de staart (Figuur 2).
- Trek het bloed op in de spuit (Figuur 2).
OPMERKING: Indien de naald gemakkelijk kan worden opgeschoven, onttrek dan het vereiste volume bloed in overeenstemming met de geldende richtlijnen. Als de bloeddruk te laag is voor afname, verlaag dan de isofluraanconcentratie naar 2.5% en herhaal de procedure zonder de naald uit de punctieplaats te verwijderen. Voor elke volgende bloedafname dient de punctieplaats craniaal ten opzichte van de vorige plaats te worden gepositioneerd. - Gebruik een wattenstaafje om op de injectieplaats te drukken voordat de naald wordt verwijderd.
- Schakel de gasanesthesie uit en controleer de insteekplaats.
OPMERKING: Zodra het bloeden is gestopt, kan de rat worden teruggeplaatst in de thuiskooi.
Figuur 2: Punctieplaats. De punctieplaats bevindt zich ventraal tussen het middelste en het distale derde deel van de staart; de naald dient in een hoek van 30° te worden ingebracht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Bloedverwerking
- Giet het verzamelde bloed in een buis.
- Bewaar het bloed op ijs tot aan de centrifugatie.
Resultaten
De gegevens die in dit methodeartikel worden gepresenteerd, zijn verkregen tijdens een farmacokinetische studie. Er werden uitsluitend mannelijke Sprague Dawley-ratten in de leeftijd van 6–8 weken, met een lichaamsgewicht variërend van 393 g tot 429 g, geïncludeerd. Op dag 0 werd een enkel bloedmonster (0,3 mL) afgenomen uit de staartslagader. Het lichaamsgewicht werd genoteerd vlak voor de bloedafname en opnieuw 24 u na de bemonstering. Het anesthetische gas werd snel uitgeademd en de dieren herstelden zich spoedig. Kort daarna begonnen ze te eten en vertoonden ze geen tekenen van een verslechterde algemene gezondheidstoestand. De ratten vertoonden geen tekenen van stress of angst wanneer ze uit de kooi werden gehaald voor de daaropvolgende bloedafname. Ook werd er in de dagen na de procedure geen defensief gedrag waargenomen. Wanneer de procedure correct werd uitgevoerd, waren er geen hematomen zichtbaar op de staart. De dieren vertoonden geen tekenen van pijn, noch direct na de bloedafname, noch in de daaropvolgende dagen, en de punctieplaatsen op hun staarten waren bij aanraking eveneens pijnloos. Er werd geen afname van het lichaamsgewicht waargenomen binnen 24 u na de bloedafname. Het gemiddelde lichaamsgewicht steeg van 409 g op dag 0 naar 419 g op dag 1, wat overeenkomt met een gemiddelde gewichtstoename van 2,6% ±± 1,1%, wat suggereert dat de bloedafnameprocedure goed werd getolereerd (Figuur 3).
Figuur 3: Verandering in lichaamsgewicht. Lichaamsgewicht (g) vóór (d0) en 24 u na (d1) bloedafname bij ratten (n = 12). Er werd geen afname van het lichaamsgewicht waargenomen na de bloedafname. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussie
De gepresenteerde techniek voor bloedafname uit de staartslagslagader is bijzonder geschikt voor studies die herhaaldelijke bloedafname of relatief grote bloedvolumina vereisen. In vergelijking met afname uit de staartvene faciliteert deze techniek het verzamelen van grotere bloedvolumes vanuit één enkele punctieplaats en kan het praktische voordelen bieden bij herhaaldelijke afname, aangezien herhaaldelijke venepunctie uitdagender kan worden door de vorming van hematomen en een verminderde toegankelijkheid van de vene. Volgens de aanbevelingen van Die Gesellschaft für Versuchstierkunde / Society of Laboratory Animal Science (GV-SOLAS) en de Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA) mag een enkele bloedafname 10% van het circulerende bloedvolume niet overschrijden, terwijl herhaaldelijke dagelijkse afname beperkt moet blijven tot ongeveer 1% van het circulerende bloedvolume per 24 h, gevolgd door een passende herstelperiode. De beschreven techniek maakt het mogelijk om deze aanbevolen afnamevolumes op een betrouwbare en reproduceerbare manier te verkrijgen, waardoor deze geschikt is voor zowel enkelvoudige als herhaaldelijke bloedafnameprotocollen.
Een ideale techniek voor bloedafname moet voldoende bloedvolumes leveren voor de beoogde analyses, terwijl procedurele stress wordt geminimaliseerd en hoogwaardige monsters worden gegarandeerd. Bloedafname uit de retro-orbitale veneuze plexus en de sublinguale vene kan leiden tot stollingsproblemen als gevolg van weefseltrauma8,9, wat suboptimaal zou zijn voor stollingsonderzoeken. Evenzo kunnen druppeltechnieken — zoals het "uitmelken" van de staartvene — ook leiden tot bemonsterringsgeïnduceerde coagulatie. In vergelijking met deze bemonsteringsmethoden lijkt arterieel bloed dat via de staart wordt verkregen minder gevoelig voor voortijdige stolling. Dit kan worden toegeschreven aan het snelle afnameproces, de afwezigheid van weefseltrauma en het directe contact van het bloed met citraat in de spuit, wat coagulatie effectief voorkomt. Andere technieken, zoals punctie van de vena jugularis, brengen een risico op orgaanschade met zich mee1,6 en aanbevolen catheterisatieprocedures vereisen algehele anesthesie, gevolgd door postoperatieve zorg en wondbehandeling. Regelmatig spoelen van de katheter is noodzakelijk om blokkades te voorkomen, en er bestaat altijd het risico dat dieren de katheter verwijderen.
Bloedafname uit de caudale arterie vereist een korte sedatie, aangezien de dieren in rugligging moeten worden geplaatst en de punctie pijnlijk is, waardoor defensieve bewegingen waarschijnlijk zijn. Het gebruik van isofluraan-anesthesie minimaliseert defensieve bewegingen, waardoor de procedure op een gecontroleerde en efficiënte wijze kan worden uitgevoerd. Hierdoor kan de bloedafname snel worden voltooid, wat de totale belasting voor het dier vermindert in vergelijking met venapunctietechnieken via de staartвена, waarbij het langer kan duren om de gewenste hoeveelheid bloed te verzamelen. Het uitblijven van defensieve bewegingen vermindert bovendien de kans op herhaalde naaldsteekjes. Belangrijk is dat de dieren de procedure niet bewust ervaren, snel herstellen en over het algemeen kort na de afname terugkeren naar hun normale gedrag1. Na de bloedafname herstelden de dieren zich snel van de isofluraan-anesthesie en hervatten zij doorgaans kort daarna hun normale gedrag. In de huidige studie vertoonde het lichaamsgewicht, gemeten 24 h na de bloedafname, een lichte toename vergeleken met de baseline, wat suggereert dat de voedselinname niet nadelig werd beïnvloed door de procedure en wat wijst op een probleemloos herstel op korte termijn.
Isofluraan staat erom bekend de bloeddruk te verlagen10,11, wat veneuze bloedafname kan bemoeilijken door een verminderde veneuze vulling. In tegenstelling hiermee vereist veneuze afname zonder anesthesie fixatie1,2, wat aanzienlijke stress kan veroorzaken en potentieel de experimentele resultaten kan beïnvloeden. Daarnaast veroorzaakt stress vasoconstrictie, wat de bloedafname eveneens kan bemoeilijken. Een verlaagde bloeddruk kan ook de arteriële afname beïnvloeden; naar onze ervaring kan dit probleem echter eenvoudig worden beheerst door de Isofluraan-concentratie aan te passen, waardoor een voldoende bloedstroom voor afname behouden blijft.
Isofluraan staat echter ook bekend om zijn invloed op fysiologische parameters, in het bijzonder bloedgaswaarden, als gevolg van ademhalingsdepressie12,13. Isofluraan kan de ademhalingsfunctie en gasuitwisseling beïnvloeden, waardoor de arteriële zuurstof- en kooldioxidegehaltes potentieel kunnen veranderen. Diverse studies hebben aangetoond dat isofluraan ook metabole en endocriene parameters kan beïnvloeden, waaronder bloedglucose, lactaat, insuline, corticosteron en het lipidenmetabolisme14,15,16. Desondanks is aangetoond dat isofluraan minder veranderingen in stress-gerelateerde parameters induceert dan verschillende andere anesthetische schema's; bovendien biedt het de voordelen van een snelle inductie, een korte hersteltijd en nauwkeurige controle over de diepte van de anesthesie, waardoor het zeer geschikt is voor routinematige bloedafnameprocedures14. Bijgaand dient de potentiële invloed van isofluraan in overweging te worden genomen bij het plannen en interpreteren van experimenten, aangezien arteriële bloedmonsters die onder anesthesie zijn afgenomen mogelijk de fysiologische baselinecondities niet nauwkeurig weerspiegelen. Voor farmacokinetische studies zijn deze effecten echter vaak van gering belang in vergelijking met de voordelen van het verkrijgen van reproduceerbare bloedmonsters terwijl stress door hantering wordt geminimaliseerd.
Een aanvullend aandachtspunt is de beroepsmatige blootstelling van de experimentator aan isofluraan. Aangezien het systeem niet volledig gesloten is, bestaat er een risico op blootstelling aan anesthetisch gas tijdens de procedure. Werken onder een laminaire flowkast of met geschikte afzuigsystemen zou de blootstelling minimaliseren, maar dergelijke apparatuur is mogelijk niet in alle experimentele settings beschikbaar.
Over het geheel genomen vormt de beschreven techniek een waardevol alternatief voor conventionele methoden van bloedafname, waarbij een goede monsterkwaliteit wordt gecombineerd met verminderde stress en verbeterde hanteercondities. Het biedt duidelijke voordelen op het gebied van dierenwelzijn en procedurele efficiëntie. De geschiktheid ervan hangt uiteindelijk af van de specifieke onderzoeksvraag, maar het is bijzonder voordelig in experimentele settings waar betrouwbare bloedparameters en minimale fysiologische verstoring essentieel zijn.
Openbaarmakingen
De auteur heeft geen belangenconflicten om te melden.
Dankbetuigingen
De auteur wenst bedanken Katharina Tillmann voor het inspireren haar om deze methode te publiceren.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Anesthesiesysteem | Dräger | https://www.draeger.com/en-us_us/Productfinder/Anaesthesia/Anaesthesia-Machines#products | Gasnarcose |
| Citraat Vacuette (Natriumcitraat 3,2%) | Greiner Bio-One | 454332 | Anticoagulans |
| Eppendorf Tube 1,5 mL | Eppendorf | 3,01,25,150 | Bloedopslag |
| Isofluraan vloeistof (Isospire) | Dechra | Gasnarcose | |
| Naald (25 G ´ 5/8'') | BD Microlance | 300600 | Bloedafname |
| Spuit 1 mL (Tuberculine Luer) | Chirana | CHTUB01 | Bloedafname |
| Thermomaquet 2000 | Maquet | Thermomaquet 2000 | Verwarmingssysteem |
| Zelletten Cellulose Gaasje 5 cm ´ 4 cm | Lohmann&Rauscher | Hemostase |
Referenties
- Toft, M., Peterson, M. H., Dragsted, N., Hansen, A. K. The impact of different blood sampling methods on laboratory rats under different types of anaesthesia. Laboratory Animals. 40, 261-274 (2006).
- Hem, A., Smith, A. J., Solberg, P. Saphenous vein puncture for blood sampling of the mouse, rat, hamster, gerbil, guineapig, ferret and mink. Laboratory Animals. 32, 364-368 (1998).
- Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S. P., Sørensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Laboratory Animals. 52 (3), 253-264 (2018).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
- National Institutes of Health, Office of Animal Care and Use. . Guidelines for survival blood collection in mice and rats. , (2025).
- Xu, Y., Zhu, Y., Lin, J., Borlak, J. Serial blood collection in anaesthetised rats: Enhancing animal welfare without the need for jugular vein catheterisation. Regul Toxicol Pharmacol. 164, 105988 (2026).
- Fluttert, M., Dalm, S., Oitzl, M. S. A refined method for sequential blood sampling by tail incision in rats. Laboratory Animals. 34, 372-378 (2000).
- Salemink, P. J. M., Korsten, J., de Leeuw, P. Prothrombin times and activated partial thromboplastin times in toxicology: a comparison of different blood withdrawal sites for Wistar rats. Comp Haematol Int. 4, 173-176 (1994).
- Seibel, J., et al. Comparison of haematology, coagulation and clinical chemistry parameters in blood samples from the sublingual vein and vena cava in Sprague-Dawley rats. Laboratory Animals. 44, 344-351 (2010).
- Albrecht, M., et al. Influence of repeated anaesthesia on physiological parameters in male Wistar rats: a telemetric study about isoflurane, ketamine-xylazine and a combination of medetomidine, midazolam and fentanyl. BMC Vet Res. 10, 310 (2014).
- Janssen, B. J. A., et al. Effects of anesthetics on systemic hemodynamics in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287, H1618-H1624 (2004).
- Flecknell, P. . Laboratory animal anaesthesia. , (2009).
- Tsukamoto, A., et al. Combining isoflurane anesthesia with midazolam and butorphanol in rats. Exp Anim. 65 (3), 223-230 (2016).
- Arnold, M., Langhans, W. Effects of anesthesia and blood sampling techniques on plasma metabolites and corticosterone in the rat. Physiol Behav. 99, 592-598 (2010).
- Rauch, E., Ari, C., D'Agostino, D. P., Kovács, Z. Exogenous ketone supplement administration abrogated isoflurane-anesthesia-induced increase in blood glucose level in female WAG/Rij rats. Nutrients. 16 (10), 1477 (2024).
- Wren-Dail, M. A., et al. Effect of isoflurane anesthesia on circadian metabolism and physiology in rats. Comp Med. 67 (2), 122-132 (2017).
Herprints en machtigingen
Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken
Toestemming aanvragen