Methodenartikel

TCR-signaalsterkte en -duur bij activatie en differentiatie van primaire muis CD8+ T-cellen: een gestandaardiseerde in vitro benadering

90 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/71979

⸱

25 augustus 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Guangdong Province Key Laboratory of Immune Regulation and Immunotherapy, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 2Institute of Immunology, Third Military Medical University, 3Institute for Immunology and Pathogenesis, College of Basic Medicine, Chongqing Medical University, 4Center for Immune Ageing and Rejuvenation, Department of Rheumatology and Immunology, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een systematische methode voor het activeren van primaire naïeve muize-CD8+ T-cellen+ T-cellen met behulp van een graduele TCR-stimulatiebenadering, waardoor een uitgebreide analyse van de proliferatie, activatie en cytokinproductie van CD8 mogelijk wordt+ T-cellen bij verschillende TCR-signaalintensiteiten.

Samenvatting

De intensiteit en duur van de T-celreceptor (TCR)-signaalintensiteit zijn kritieke determinanten voor de activatie, proliferatie en functionele differentiatie van CD8⁺ T-cellen. Echter, gestandaardiseerde in vitro-modellen die systematisch vergelijken hoe variërende TCR-signaalinputs het lot van de T-cel bepalen, blijven beperkt. Deze studie presenteert een reproduceerbare methode voor het in vitro activeren van primaire muiz T-cellen met behulp van plaatgebonden anti-CD3 en oplosbare anti-CD28, aangevuld met interleukine-2 (IL-2), en onderzoekt hoe het moduleren van de anti-CD3-concentratie (signaalsterkte) en de stimulatietijd (signaalduur) de activatieresultaten van T-cellen beïnvloedt. We beschrijven een protocol voor het isoleren van naïeve T-cellen uit C57BL/6-muizen, gevolgd door stimulatie over een reeks anti-CD3-concentraties (0,1–10 µg/mL) en tijdsduuren (6–48 h). We hebben flowcytometrische analyse uitgevoerd om vroege TCR-geïnduceerde signalering te beoordelen via intracellulair gefosforyleerd S6-ribosomaal eiwit (p-S6) als readout voor de activiteit van het mechanistic target of rapamycin complex 1 (mTORC1), en vervolgens stroomafwaartse gebeurtenissen geëvalueerd, waaronder oppervlakte-activatiemarkers (CD69, CD25, ICOS, PD-1), cellulaire proliferatie via verdunning van violette proliferatie-trackingkleurstof (CTV), en de expressie van effector-moleculen (Granzym B, TNF-α) als indicatoren voor functionele differentiatie. De methode biedt een duidelijke, stapsgewijze visuele gids voor het uitvoeren van reproduceerbare T-celstimulaties, waardoor onderzoekers kunnen ontleden hoe specifieke TCR-signaalparameters de beslissingen over het lot van de T-cel sturen. Deze benadering ondersteunt niet alleen mechanistische studies naar T-celactivatie en -differentiatie, maar biedt ook een platform voor het optimaliseren van T-celconditionering voor adoptieve immunotherapie en in vitro priming-assays. Door videodemonstraties te integreren met een gedetailleerde protocolbeschrijving, zal dit protocol de methodologische transparantie en reproduceerbaarheid in het T-celimmunologisch onderzoek verbeteren.

Inleiding

T-cellen zijn onontbeerlijk voor beschermende immuunresponsen tegen pathogenen en tumoren. Naive T-cellen worden actief in een rusttoestand gehouden om hun overleving en persistentie op lange termijn te waarborgen1. Na stimulatie door antigenen verlaten T-cellen deze rusttoestand, waarna zij clonale expansie en effector-differentiatie ondergaan2. Signalering van de T-celreceptor (TCR) dient als het kernproces voor het initiëren en reguleren van adaptieve immuunresponsen3. Bij specifieke herkenning van peptide-major histocompatibility complex (pMHC)-moleculen, gepresenteerd op het oppervlak van antigeenpresenterende cellen (APC's), wordt een cascade van signaleringsgebeurtenissen in gang gezet, wat de clonale expansie en functionele differentiatie van T-cellen stimuleert4,5,6.

De intensiteit van TCR-stimulatie, bepaald door sleutelfactoren zoals antigeenaffiniteit, aviditeit en concentratie, speelt een cruciale rol bij het bepalen van de omvang van T-celactivatie, de verwerving van effectorfuncties en het differentiatietraject naar verschillende effector- of memory T-celpopulaties7,8,9. Huidige in vitro-modellen voor het onderzoek naar TCR-afhankelijke T-celactivatie maken voornamelijk gebruik van plaatgebonden of bead-geconjugeerde anti-CD3- en anti-CD28-antilichamen, die gelijktijdig zowel TCR-ligatie als costimulerende signalen leveren10,11. Hoewel dergelijke systemen veelvuldig worden gebruikt, maken ze doorgaans gebruik van slechts één, vaak verzadigende concentratie van het anti-CD3-antilichaam, waardoor enkel een binaire alles-of-nietsvergelijking van T-celactivatie mogelijk is, in plaats van het vastleggen van het dynamische bereik aan TCR-signaalsterktes dat haalbaar is met een getitreerde gradiënt van stimuli12,13.

Het hierin beschreven protocol biedt een gestandaardiseerd en reproduceerbaar in vitro systeem om systematisch te evalueren hoe graduele TCR-signaalsterktes de activatie, proliferatie en functionele fenotypes van primaire muze CD8+ T-cellen moduleren, met behulp van getitreerde anti-CD3-gradiënten (0,1–10 µg/mL) en een constante hoeveelheid anti-CD28 (1 µg/mL). Deze aanpak is gebaseerd op multiparametrische flowcytometrie die zowel upstream signalering vastlegt — via intracellulair gefosforyleerd S6 ribosomaal eiwit (p-S6) als read-out van de activiteit van het mechanistic target of rapamycin complex 1 (mTORC1) — als downstream cellulaire uitkomsten, waaronder proliferatie gevolgd via CTV-dilutie, activatiemarkers op het celoppervlak (CD69, CD25, inducible T-cell costimulatory [ICOS], programmed cell death protein 1 [PD-1]) en expressie van effectormoleculen (Granzyme B, tumor necrosis factor-alpha [TNF-α]), over een tijdsverloop van 6 tot 48 h.

Ons protocol maakt gebruik van een gradiëntconcentratie van plaatgebonden anti-CD3-antilichamen om de stimulatie-intensiteit nauwkeurig te moduleren, waardoor de differentiële TCR-bindingsaviditeit die onder fysiologische omstandigheden wordt waargenomen, wordt nagebootst. De methode bereikt een hoge efficiëntie in TCR-crosslinking en een robuuste activatie van primaire rustende T-cellen. De gestandaardiseerde coatingprocedure zorgt voor een uniforme antilichaamverdeling op het platoppervlak, wat leidt tot een consistente stimulatie van cellen binnen dezelfde batch en een uitstekende experimentele reproduceerbaarheid. Dit formaat biedt een kostenefficiënte en operationeel eenvoudige benadering voor T-celactivatie.

Er moeten echter bepaalde beperkingen van deze aanpak worden erkend. Stimulatie door middel van anti-CD3/CD28-antilichamen verschilt aanzienlijk van de in vivo fysiologische context. Hoewel experimentele methoden die uitsluitend agonistische anti-CD3- en anti-CD28-antilichamen gebruiken om T-celactivatie te beoordelen effectieve read-outs van activatie kunnen verschaffen, slagen ze er niet in om de interacties tussen antigeenpresenterende cellen en T-cellen, evenals de co-stimulerende micro-omgeving die onder fysiologische omstandigheden optreden, volledig te reproduceren14.

Ondanks deze beperkingen biedt dit protocol een systematisch en reproduceerbaar platform dat dient als een waardevol en toegankelijk instrument voor het onderzoeken van T-celresponsen die afhankelijk zijn van de TCR-signaalsterkte, en kan het complexere antigeenspecifieke modellen aanvullen.

Protocol

Alle dierproeven in deze studie zijn goedgekeurd door de Commissie voor Dierenzorg en -gebruik van de Third Military Medical University.

1. Voorbereiding van reagentia en platen

  1. Bereid plaatgebonden anti-CD3 voor in steriele PBS in concentraties van 0,1, 0,5, 1, 5 en 10 µg/mL.
  2. Voeg 50 µL van de anti-CD3 coatingoplossing per well toe aan vlakbodem 96-wells platen.
  3. Verzegel de platen met sealingfilm en incubeer deze overnight bij 4 °C.
  4. Aspireer de coatingoplossing en was elke well tweemaal met 200 µL steriele PBS voordat de cellen worden toegevoegd.

2. Isolatie van naïeve CD8+ T-cellen uit muis milt

  1. Select mannelijke C57BL/6 muizen van 6–8 weken oud (gekocht bij Sibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.) en euthanaseer deze door CO2 inhalatie gevolgd door cervicale dislocatie. De muizen worden gehuisvest onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden met een licht/donker-cyclus van 12 uur en vrije toegang tot voedsel en water. Er worden minimaal 3 muizen per onafhankelijk experiment gebruikt.
  2. Inciteer voorzichtig het peritoneum met een chirurgische schaar om de milt bloot te leggen, pak de milt vast en oog deze met een pincet, en plaats deze in een opvangschaal met voorkoeld RPMI 1640 aangevuld met 2% foetaal runderserum (FBS) (R2). Houd de schaal op ijs tot de dissociatie.
    OPMERKING: Verzamel alle dierkadavers en celkweekafval in daarvoor bestemde biohazard-zakken en autoclaveer deze bij 121 °C gedurende 20 min vóór afvoer.
  3. Verwijder de milt uit de opvangschaal en breng deze over in een schaal van 60 mm met 3 mL van 1 × ammoniumchloride-kalium (ACK) lysisbuffer.
  4. Bereid een single-cell suspensie door de milt voorzichtig door een celzeef van 70 µm te drukken met de zuiger van een spuit van 3 mL.
  5. Incubeer de suspensie 1 min bij kamertemperatuur (RT) en voeg vervolgens 3 mL voorkoeld R2-medium toe om de ammoniumchloride-kalium (ACK) lysisbuffer te neutraliseren.
  6. Breng de celsuspensie over naar een conische buis van 15 mL en centrifugeer bij 500 × g gedurende 5 min bij 4 °C.
  7. Aspireer na centrifugatie het supernatant en resuspendeer de pellet in 10 mL flowcytometrie-kleuringsbuffer (PBS met 2% FBS).
  8. Filter de suspensie door een celzeef van 70 µm in een nieuwe conische buis van 15 mL en centrifugeer vervolgens opnieuw bij 500 × g gedurende 5 min bij 4 °C.
    OPMERKING: Natriumazide moet worden weggelaten uit de flowcytometrie-kleuringsbuffer om de cellevensvatbaarheid voor functionele assays te behouden. Alle monsters moeten bij 4 °C worden bewaard en onmiddellijk worden geanalyseerd.
  9. Aspireer het supernatant en resuspendeer de celpellet in 200 µL biotinyleerde antilichaamcocktail per muismilt (bevattend anti-CD16/32 (Fc block), anti-TER-119, anti-CD19, anti-CD4, anti-B220, anti-NK1.1, anti-Ly-6G, anti-CD11b, anti-CD11c, anti-CD49b, anti-CD44 en anti-F4/80).
  10. Incubeer 25 min op ijs waarbij de buis elke 5 min voorzichtig wordt omgekeerd om een grondige menging te garanderen.
  11. Was de cellen met een groot volume flowcytometrie-kleuringsbuffer, centrifugeer bij 500 × g gedurende 5 min en gooi het supernatant weg.
  12. Resuspendeer de pellet in hetzelfde volume flowcytometrie-kleuringsbuffer als gebruikt voor de biotinyleerde antilichaamcocktail, voeg streptavidine-gecoate magnetische beads toe in de helft van dat volume en incubeer 15 min op ijs waarbij de buis elke 5 min voorzichtig wordt omgekeerd om een grondige menging te garanderen.
  13. Centrifugeer de buis kort, plaats deze 2–3 min op een magneethouder en breng het supernatant (verrijkte naïeve CD8+ T-cellen) voorzichtig over naar een nieuwe conische buis van 15 mL.
  14. Was de verzamelde cellen één keer met flowcytometrie-kleuringsbuffer en centrifugeer opnieuw bij 500 × g gedurende 5 min.
  15. Gooi het supernatant weg en resuspendeer de pellet in RPMI 1640 aangevuld met 10% FBS (R10) voor verdere toepassingen.

3. Labeling met violete proliferatie-volgkleurstof (CTV) voor het volgen van proliferatie

  1. Bereid de 2 × verse CTV-werkoplossing (10 µM) onmiddellijk voor gebruik. Meng de 5 mM CTV-stockoplossing (in dimethylsulfoxide [DMSO]) volledig door te vortexen en verdun deze verder met steriele PBS om een uiteindelijke concentratie van 10 µM te verkrijgen.
    WAARSCHUWING: Hanteer de CTV-stockoplossing (bereid in DMSO) met nitrilhandschoenen in een zuurkast, aangezien DMSO de huidabsorptie van toxische verbindingen vergemakkelijkt. Vermijd inademing en huidcontact.
  2. Resuspendeer de helft van de geïsoleerde naïeve CD8+ T-cellen in vooraf gekoelde PBS bij een dichtheid van 8 × 107 cellen/mL.
  3. Voeg snel een gelijk volume 2 × CTV-werkoplossing (10 µM) toe aan de celsuspensie en meng goed door te pipetteren, wat resulteert in een uiteindelijke CTV-concentratie van 5 µM.
  4. Incubeer de cellen bij RT in het donker gedurende 20 min, waarbij de buizen elke 5 min voorzichtig worden omgekeerd om een grondige menging te waarborgen.
  5. Voeg 5 volumes kweekmedium (bevattend ten minste 10% FBS) toe aan de cellen en incubeer 5 min op ijs om eventuele vrije kleurstof te verwijderen.
  6. Centrifugeer de cellen bij 500 × g gedurende 5 min en resuspendeer het pellet in vers voorverwarmd compleet medium R10 aangevuld met anti-CD28 (uiteindelijke concentratie: 1 µg/mL) en IL-2 (uiteindelijke concentratie: 10 ng/mL).
  7. Voeg 250 µL celsuspensie (bevattende 6 × 105 cellen) toe aan elke put van de vooraf gecoate 96-wellplaten.
  8. Kweek de cellen bij 37 °C met 5% CO₂ gedurende maximaal 48 u.

4. CTV-detectie via flowcytometrie

  1. Verzamel de cellen in een 96-well plaat met ronde bodem op 6, 36 en 48 u. Centrifugeer 5 min bij 500 × g en was twee keer met flowcytometrie-kleuringsbuffer.
  2. Incubeer de cellen voor oppervlaktekleuring 30 min op ijs in het donker met 50 µL van een antilichaamcocktail bestaande uit anti-CD8, fixeerbare levensvatigheidsdye en anti-CD44.
    OPMERKING: Verzamel alle supernatanten die fluorofoor-geconjugeerde antilichamen bevatten in aangewezen afvalcontainers aangevuld met 0,5% natriumhypochloriet voor descontaminatie en voer deze af volgens de institutionele protocollen voor biologisch gevaarlijk afval.
  3. Was de cellen twee keer met flowcytometrie-kleuringsbuffer en resuspendeer ze in 200 µL flowcytometrie-kleuringsbuffer voor acquisitie met de flowcytometer.
  4. Voer de acquisitie van de monsters uit op een flowcytometer uitgerust met drie lasers. Bereid enkelkleur-controlebuisjes voor met gekleurde cellen om de compensatieparameters in te stellen.
  5. Pas de volgende gating-strategie toe: sluit debris uit door gating op forward-scatter (FSC) versus side-scatter (SSC), elimineer doubletten door singlet-gating, en selecteer levensvatbare (fixeerbare levensvatigheidsdye-negatieve) CD8+ T-cellen voor analyse.
  6. Verzamel ten minste 1 × 104 gegate CD8+ T-cel-events per monster. Analyseer de gegevens met de flowcytometrie-analysesoftware en bereken het aandeel cellen dat één of meer delingen heeft ondergaan met behulp van de proliferatieanalysemodule.

5. Oppervlakte- en intracellulaire kleuring voor activatie en signalering

  1. Resuspendeer een andere helft van de naïeve CD8+ T-cellen in R10 aangevuld met anti-CD28 (1 µg/mL) en IL-2 (10 ng/mL) op een concentratie van 2,4 × 106 cellen/mL.
  2. Voeg 250 µL van de celsuspensie (6 × 105 cellen) toe aan elke well van de vooraf gecoate 96-well platen.
  3. Kweek de cellen bij 37 °C met 5% CO₂ gedurende maximaal 48 u.
  4. Verzamel de cellen op de aangegeven tijdstippen (6, 10, 12, 24 en 36 u) in een 96-well plaat met ronde bodem.
    OPMERKING: 6 u legt de vroege TCR-signalering (phospho-S6) en CD69 vast; dat laatste wordt aanvullend beoordeeld bij 12, 24 en 36 u om de volledige kinetiek vast te leggen. CD25, PD-1 en ICOS worden gemonitord bij 10, 12, 24 en 36 u; het tijdstip van 48 u is gereserveerd voor proliferatie (Sectie 4) en cytokinedetectie (Sectie 6).
  5. Centrifugeer 1 min bij 500 × g en resuspendeer de celpellet in 200 µL flowcytometrie-kleuringsbuffer.
  6. Centrifugeer 1 min bij 500 × g en aspireer het supernatant. Was de cellen tweemaal met 200 µL flowcytometrie-kleuringsbuffer.
  7. Voor oppervlaktekleuring: incubeer de cellen gedurende 30 min op ijs in het donker met 50 µL van een antilichaamcocktail bestaande uit anti-CD69, anti-CD25, anti-CD8, anti-PD-1, anti-ICOS en een fixeerbare levensvatbaarheidskleurstof.
  8. Was de cellen driemaal met flowcytometrie-kleuringsbuffer om ongebonden antilichamen te verwijderen.
  9. Resuspendeer de celpellet in 200 µL 1% paraformaldehyde en fixeer de cellen 15 min bij RT in het donker.
    WAARSCHUWING: Voer alle stappen met paraformaldehyde uit in een zuurkast om inademing van dampen te voorkomen. Verzamel al het vloeibare afval dat fixatief bevat in een aparte container die is gemarkeerd voor de afvoer van gevaarlijke chemicaliën.
  10. Centrifugeer 1 min bij 500 × g en was eenmaal met flowcytometrie-kleuringsbuffer.
  11. Warm 5 × lyse/fixatiebuffer voor bij RT en bereid een 1 × werkoplossing met gedestilleerd water.
  12. Voeg 200 µL werkoplossing (1 × lyse/fixatiebuffer) toe aan elke well en incubeer de cellen 30 min bij RT in het donker.
  13. Was tweemaal met 1 × permeabilisatie/wasbuffer voor phospho-epitoopkleuring. Resuspendeer de pellet met 1 × permeabilisatie/wasbuffer voor phospho-epitoopkleuring en incubeer 10 min bij RT in het donker.
  14. Centrifugeer 1 min bij 500 × g en gooi de supernatanten weg.
  15. Voor intracellulaire kleuring: incubeer de cellen gedurende 60 min bij RT in het donker met 50 µL van een antilichaamcocktail bestaande uit anti-p-S6.
  16. Was de cellen driemaal met 1 × permeabilisatie/wasbuffer voor phospho-epitoopkleuring.
  17. Voor kleuring met secundaire antilichamen: incubeer de cellen gedurende 30 min op ijs in het donker met 50 µL van een antilichaamcocktail bestaande uit een anti-konijn secundair antilichaam.
  18. Was de cellen driemaal met 1 × permeabilisatie/wasbuffer voor phospho-epitoopkleuring en was eenmaal met flowcytometrie-kleuringsbuffer.
  19. Resuspendeer de celpellet in 200 µL flowcytometrie-kleuringsbuffer en analyseer de monsters op dezelfde flowcytometer.
  20. Pas dezelfde gating-strategie toe als beschreven in Sectie 4.5 en verzamel ten minste 1 × 104 CD8+ T-cellen per monster.
  21. Analyseer de mediane fluorescentie-intensiteit (MFI) voor elke marker met behulp van flowcytometrie-analysesoftware.

6. Intracellulaire cytokineblokkering en detectie

  1. Voeg 5 u voor de oogst 100 µL per well vers R10 toe, aangevuld met PMA (50 ng/mL), ionomycine (1 µg/mL), proteintransportremmers (monensine) (1:1000) en proteintransportremmers (op basis van brefeldine A) (1:1000). Meng voorzichtig en plaats de platen terug in de incubator bij 37 °C om de cytokinesecretie te blokkeren en intracellulaire accumulatie mogelijk te maken.
  2. Verzamel de cellen op het gewenste tijdstip in een 96-well plaat met ronde bodem.
  3. Centrifugeer 1 min bij 500 × g en resuspendeer de celpellet in 200 µL flowcytometrie-kleuringsbuffer.
  4. Centrifugeer 1 min bij 500 × g en aspireer het supernatant. Was tweemaal met 200 µL flowcytometrie-kleuringsbuffer.
  5. Voor de kleuring van oppervlaktemarkers worden de cellen gedurende 30 min op ijs in het donker geïncubeerd met 50 µL van een antilichaamcocktail bestaande uit anti-CD44, anti-CD8 en een fixeerbare levensvatbaarheidsdye.
  6. Was driemaal met flowcytometrie-kleuringsbuffer om ongebonden antilichamen te verwijderen.
  7. Permeabiliseer de cellen door 200 µL fixatie- en permeabilisatieoplossing toe te voegen en incubeer deze 30 min op ijs in het donker.
    WAARSCHUWING: Voer alle stappen waarbij fixatie-/permeabilisatieoplossing (bevattend paraformaldehyde) wordt gebruikt uit in een zuurkast om inademing van dampen te voorkomen. Verzamel al het vloeibare afval dat fixatief bevat in een aparte container gemarkeerd voor de afvoer van gevaarlijke chemicaliën.
  8. Centrifugeer 1 min bij 500 × g en gooi het supernatant weg bij het gevaarlijk chemisch afval.
  9. Was de cellen driemaal met 1 × permeabilisatie/wasbuffer.
  10. Voor intracellulaire cytokinekleuring worden de cellen gedurende 30 min op ijs in het donker geïncubeerd met 50 µL van een antilichaamcocktail bestaande uit anti-TNF-α en anti-Granzyme B.
  11. Was de cellen driemaal met 1 × permeabilisatie/wasbuffer om ongebonden antilichamen te verwijderen en voer een laatste wasbeurt uit met flowcytometrie-kleuringsbuffer.
  12. Resuspendeer de celpellet in 200 µL flowcytometrie-kleuringsbuffer en analyseer de monsters op dezelfde flowcytometer.
  13. Pas dezelfde gating-strategie toe als beschreven in sectie 4.5 en verzamel ten minste 1 × 104 CD8+ T-cellen per monster. Analyseer het percentage positiviteit en de MFI voor elke marker met behulp van flowcytometrie-analysesoftware.

Resultaten

Om de effecten van verschillende anti-CD3-stimulatie-intensiteiten op de T-celactivatie te onderzoeken, hebben we muizenmiltcellen geïsoleerd en CD8+ T-cellen gezuiverd voor in vitro culturen, waarna we T-celactivatie-assays en flowcytometrische analyses hebben uitgevoerd. Voor de data-analyse werden lymfocyten eerst gegated met een combinatie van FSC-A en SSC-A, gevolgd door het gaten van singlets via FSC-H en FSC-W, en vervolgens SSC-H met SSC-W. Levende CD8+ T-cellen werden verder gegated met behulp van CD8 in combinatie met een fixeerbare levensvatbaarheidsverf voor verdere analyse (Figuur 1A).

Om te valideren dat het systeem voor stimulatie met plaatgebonden antilichamen T-cellen in vitro effectief activeert, hebben we de fosforylering van ribosomaal eiwit S6 (p-S6) onderzocht, een goed vastgestelde downstream-indicator van mTORC1-activiteit en een convergentiepunt voor de PI3K-mTOR- en MEK-ERK MAPK-signaalpaden downstream van TCR-signalering15,16. In overeenstemming met deze bevindingen observeerden we een dosisafhankelijke toename van p-S6-niveaus 6 uur na stimulatie bij toenemende anti-CD3-concentraties (0,1–10 µg/mL) (Figuur 1B), wat bevestigt dat het plaatgebonden anti-CD3-systeem de TCR-mTORC1-S6-as activeert op een manier die afhankelijk is van de signaalsterkte. Deze vroege fosforyleringsgebeurtenis is consistent met de activering van mTORC1-afhankelijke metabole paden die de daaropvolgende T-celproliferatie en effector-differentiatie ondersteunen.

De celproliferatie werd beoordeeld via CTV-verdunnings-flowcytometrie na TCR-stimulatie met graduele anti-CD3-concentraties (0,1–10 µg/mL) op drie tijdspunten na stimulatie: 6, 36 en 48 u. Op het vroege signalerings-tijdspunt van 6 u werd slechts een minimale proliferatieve verdunning waargenomen bij alle stimulatiecondities. Tegen 36 u slaagde de groep met lage-dosissimulatie (0,1 µg/mL) er nog steeds niet in om een wezenlijke clonale expansie op te wekken, terwijl de groepen met gemiddelde en hoge doses duidelijk gescheiden CTV-verdunningspieken vertoonden (5 en 10 µg/mL), wat wees op het begin van de celcyclusprogressie. Na 48 u waren de differentiële proliferatieve fenotypes over de verschillende stimulatieconcentraties het meest uitgesproken. Zwakke TCR-stimulatie (0,1 µg/mL) resulteerde in slechts 1,25% prolifererende cellen en een enkele onverdunde CTV-piek, wat duidde op een suboptimale activatie. Gemiddelde stimulatie (1–5 µg/mL) induceerde drie gescheiden divisiepieken, waarbij de prolifererende fracties toenamen van 70,8% tot 84,0%. Sterke stimulatie (10 µg/mL) bereikte de hoogste prolifererende fractie (89,5%), vertoonde het maximale aantal divisiegeneraties en demonstreerde de detectie van proliferatiesaturatie (Figuur 2).

Vervolgens hebben we de expressie van de vroege activatiemarkers CD69 en CD25 onderzocht. Opvallend genoeg toonde de huidige studie een snelle en dosisafhankelijke upregulatie van de CD69-expressie aan, gebaseerd op de mediane fluorescentie-intensiteit (MFI). Bij gemiddelde en sterke stimulatie (5 en 10 µg/mL) steeg CD69 snel na 24 h, gevolgd door een geleidelijke daling tussen 24 en 36 h. Echter, bij zwakke stimulatie (0,1, 0,5 en 1 µg/mL) steeg CD69 progressief gedurende het gehele stimulatievenster. Het bovenstaande kinetische expressieprofiel van CD69 is consistent met de rol ervan als vroege T-celactivatiemarker (Figuur 3A)17. Interessant genoeg observeerden we dat de CD25-expressie een progressieve toename vertoonde op een dosis- en tijdsafhankelijke wijze (Figuur 3B). In overeenstemming met eerder onderzoek verliep de upregulatie van CD25 trager dan die van CD69, vooral bij optimale stimulatie18,19.

Om het regulerende effect van de sterkte van de TCR-stimulatie op de expressie van inhiberende receptoren en co-stimulatoire moleculen in CD8+ T-cellen verder te onderzoeken, hebben we de expressieniveaus van PD-1 en ICOS geanalyseerd. De induceerbare expressie van PD-1 is afhankelijk van hoog-intensieve TCR-stimulatie. In de groep met laag-intensieve stimulatie (0,5–1 µg/mL) werd PD-1 gedurende de gehele stimulatieperiode op een laag niveau tot expressie gebracht. In contrast hiermee nam in de groep met medium- tot hoog-intensieve stimulatie (5–10 µg/mL) de expressie van PD-1 geleidelijk toe vanaf 10 h en bereikte deze een piek bij 36 h (Figuur 4A). De expressie van ICOS steeg eveneens in overeenkomst met de toenemende stimulatiesterkte en bereikte het maximale niveau bij 5–10 µg/mL na 36 h (Figuur 4B). Deze resultaten suggereren dat hoog-intensieve TCR-stimulatie de expressieniveaus van PD-1 en ICOS significant kan upreguleren.

Ten slotte hebben we de functionele capaciteit van gestimuleerde T-cellen onderzocht na restimulatie met PMA en ionomycine op 24 u en 48 u na stimulatie. Na 24 u hebben we de productie van TNF-α en Granzyme B gekwantificeerd en waargenomen dat de frequenties van TNF-α+, Granzyme B+ en TNF-α+Granzyme B+ cellen geleidelijk toenamen op een anti-CD3 dosisafhankelijke wijze (Figuur 5A, B). Overeenkomstig vertoonde de MFI van TNF-α en Granzyme B ook een concentratieafhankelijke toename en bereikte deze een maximum bij hoog-intensieve stimulatie (10 µg/mL) (Figuur 5C), wat wijst op dosisafhankelijke vroege effectordifferentiatie aangestuurd door graduele TCR-signaalsterkte. Na 48 u keerde dit patroon echter merkbaar om. Hogere anti-CD3 concentraties reduceerden de percentages TNF-α+Granzyme B+ cellen significant en downreguleerden de expressieniveaus van effectormoleculen per cel.

Alle getoonde gegevens zijn representatief voor 3 onafhankelijke experimenten. Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van een eenweg- of tweeweg-ANOVA met de post-hoc test van Tukey; gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. De cellevensvatbaarheid was consistent hoger dan 90%, en er werden minimaal 1 × 104 live CD8+ T-celgebeurtenissen per monster verzameld.

Flowcytometriegegevens: gating-diagrammen van celpopulaties, histogrammen voor eiwitkwantificering en staafdiagram.
Figuur 1: In vitro activatie en flowcytometrische analyse van CD8+ T-cellen. (A) Gezuiverd CD8+ T-cellen uit muisspleenocyten werden in vitro gestimuleerd met variërende concentraties anti-CD3 (0,1–10 µg/mL) gecombineerd met een vaste concentratie anti-CD28 (1 µg/mL) gedurende 6 tot 48 uur, gevolgd door flowcytometrische analyse van de cellulaire activatie. Cellulair debris werd uitgesloten door gating op forward scatter (FSC) en side scatter (SSC), dubletten werden uitgesloten via singlet-gating, en fixeerbare levensvatbaarheidsverf-negatieve, CD8+ T-cellen werden tot slot gegated voor downstream-analyses.B) Fosforylering van ribosomaal eiwit S6 (p-S6) in CD8+ T-cellen 6 uur na stimulatie met de aangegeven concentraties anti-CD3 (0,1–10 µg/mL) plus constant anti-CD28 (1 µg/mL). Representatief histogram (links) en samenvatting van de MFI (rechts). De flowcytometrie-plots zijn representatief voor 3 onafhankelijke experimenten. De gegevens tonen het gemiddelde ± SEM. Statistiek: repeated-measures eenweg-ANOVA met Tukey's post-hoc test. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0,001; ns, niet significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Celproliferatietest, histogram, waarin CTV wordt afgezet tegen het proliferatiepercentage over de tijd.
Figuur 2Proliferatieanalyse van primaire muis CD8-cellen op basis van een violete proliferatie-trackingskleurstof (CTV)+ T-cellen onder gegradeerde TCR-stimulatie. CD8+ Met CTV gelabelde T-cellen die in vitro zijn gestimuleerd met anti-CD3 in gradiëntconcentraties van 0,1–10 µg/mL gedurende 6 tot 48 uur. De celproliferatie werd beoordeeld op basis van de verdunning en attenuatie van CTV-fluorescentie in CD8+ T-cellen via flowcytometrische analyse. Histogrammen tonen de CTV-fluorescentieverdeling van elke concentratiegroep, waarbij het percentage cellen dat één of meer delingen ondergaat, is aangegeven. De flowcytometrie-plots zijn representatief voor 3 onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Flowcytometrie-analyse, CD69- en CD25-expressie, histogram en lijndiagram, immuuncelactivatie.
Figuur 3: Expressiekinetiek van vroege activatiemarkers CD69 en CD25 op CD8+ T-cellen+ T-cellen na anti-CD3-stimulatie. Naïeve CD8+ T-cellen werden gestimuleerd met plaatgebonden anti-CD3 in de aangegeven concentraties (0,1–10 µg/mL) plus constant anti-CD28 (1 µg/mL). CD69 werd gemeten op 6, 12, 24 en 36 u; CD25 op 10, 12, 24 en 36 u en geanalyseerd via flowcytometrie. De linkerpanelen tonen representatieve histogrammen op de aangegeven tijdstippen; de rechterpanelen presenteren de dynamische veranderingen in MFI over de tijd. (A) CD69. (B) CD25. Flowcytometrie-plots zijn representatief voor 3 onafhankelijke experimenten. Gegevens tonen het gemiddelde ± SEM. Statistiek: repeated-measures two-way ANOVA met Tukey's post-hoc toets. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0,001; ns, niet significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Flowcytometrie-analyse, PD-1- en ICOS-expressie, histogrammen en grafieken, cellulaire respons over tijd.
Figuur 4: Expressiekinetiek van de inhiberende receptor PD-1 en het costimulerende molecuul ICOS op CD8+ T-cellen na anti-CD3-stimulatie. Naïeve CD8+ T-cellen werden gestimuleerd met plaatgebonden anti-CD3 bij de aangegeven concentraties (0,1–10 µg/mL) plus constant anti-CD28 (1 µg/mL). Cellen werden geoogst op 10, 12, 24 en 36 uur en geanalyseerd via flowcytometrie. De linkerpanelen tonen representatieve histogrammen op de aangegeven tijdstippen; de rechterpanelen presenteren de dynamische veranderingen in MFI over de tijd. (A) PD-1. (B) ICOS. Flowcytometrie-plots zijn representatief voor 3 onafhankelijke experimenten. Gegevens tonen gemiddelde ± SEM. Statistiek: repeated-measures two-way ANOVA met Tukey's post-hoc test. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0,01; ns, niet significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten van flowcytometrie-analyse, TNF-α- en Granzym B-expressie, staaf- en spreidingsdiagrammen, immunologische studie.
Figuur 5: Intracellulaire cytokineproductie door CD8+ T-cellen zijn afhankelijk van de TCR-sterkte. Naïeve CD8+ T-cellen werden gestimuleerd met toenemende concentraties anti-CD3 (0,1–10 µg/mL) plus constant anti-CD28 (1 µg/mL). Op 24 u en 48 u na stimulatie werden de cellen geoogst na een incubatie van 5 u met eiwittransportremmers (monensine en brefeldine A) in aanwezigheid van PMA en ionomycine om cytokinesecretie te blokkeren en intracellulaire accumulatie mogelijk te maken. (A) Contourplots tonen de frequenties van TNF-α- en Granzyme B-positieve cellen bij elke aangegeven concentratie en tijdstip. Niet-gestimuleerde cellen dienden als negatieve controle. (B) De proporties TNF-α+, Granzym B+, en TNF-α+ Granzym B+ cellen. (CDe MFI van TNF-α en Granzyme B. De flowcytometrie-plots zijn representatief voor 3 onafhankelijke experimenten. De gegevens tonen het gemiddelde ± SEM. Statistiek: repeated-measures two-way ANOVA met Tukey's post-hoc test. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0,01; ns, niet significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Dit protocol biedt een systematische en reproduceerbare methode voor het bestuderen van T-celresponsen die afhankelijk zijn van de sterkte van het TCR-signaal. De gefaseerde anti-CD3-coatingstrategie maakt een nauwkeurige controle over de stimulatie-intensiteit mogelijk, waardoor onderzoekers de kwantitatieve relatie tussen de TCR-input en de downstream functionele uitkomsten kunnen analyseren. Belangrijke procedurele punten omvatten de zuivering van naïeve CD8⁺ T-cellen, nauwkeurige gradiëntcontrole van de anti-CD3-coatingconcentratie en strikte normalisatie van het aantal cellen per putje. Om de vergelijkbaarheid van gegevens tussen experimenten te waarborgen, raden we aan om consistente instrumentinstellingen, compensatiematrices en gating-strategieën te gebruiken, en indien mogelijk dezelfde antilichaamlots en batches fixeerbare levensvatbaarheidsstiften toe te passen. De betrouwbaarheid van deze kritieke stappen bepaalt direct of experimentele resultaten accuraat de effecten van variërende TCR-stimulatie-intensiteiten op de fenotypische dynamiek van T-cellen kunnen weerspiegelen.

In dit protocol hebben we gebruikgemaakt van plaatgebonden antistimulatie, waarbij anti-CD3-antilichamen direct op het oppervlak van de kweekplaat worden gecoat om het TCR-CD3-complex te crosslinken. Deze aanpak is kosteneffectief, zorgt voor een uniforme antilichaamverdeling, minimale variabiliteit tussen de wells en een uitstekende reproduceerbaarheid. Opmerkelijk is dat de titratie van de coatconcentraties van de antilichamen een precieze, graduele modulatie van de stimulatie-intensiteit mogelijk maakt; een kenmerk dat dit systeem onderscheidt van stimulatie met geconjugeerde beads, waarbij de liganddichtheid doorgaans vaststaat op een verzadigingsniveau, wat fijne signaleringsmodulatie beperkt14. Echter zorgt plaatgebonden stimulatie voor suprafysiologische en aanhoudende TCR-crosslinking, wat fundamenteel verschilt van de transiënte, affiniteitsafhankelijke interactie die wordt geïnduceerd door peptide-MHC-complexen op antigeenpresenterende cellen. Hoewel pMHC-gebaseerde stimulatie fysiologisch relevanter is, is deze technisch veeleisend, vereist het gespecialiseerde expertise voor de productie van multimeren en brengt het aanzienlijk hogere kosten met zich mee. Voor de celisolatie hebben we negatieve immunomagnetische selectie toegepast, wat eenvoudig, snel en kosteneffectief is. Hoewel dit een lagere zuiverheid oplevert in vergelijking met FACS, voorkomt het de mechanische stress en fluorescentielabeling die de fysiologische staat van gesorteerde cellen kunnen beïnvloeden20,21.

Belangrijke problemen die kunnen optreden tijdens de uitvoering van het protocol zijn een lage zuiverheid van de sortering, zwakke proliferatie, CTV-geïnduceerde cytotoxiciteit, een slechte levensvatbaarheid na kweek en inconsistente kleuring. Bij een lage zuiverheid dient men te zorgen voor voldoende menging van de cellen met de gebiotinyleerde antilichaamcocktail en streptavidine-gecoate beads, de magnetische scheidingstijd indien nodig te verlengen en de bead-antilichaamverhouding te optimaliseren voor elke nieuwe partij reagentia. Indien er minimale proliferatie wordt waargenomen, zelfs bij de hoogste anti-CD3 concentratie, moet de levensvatbaarheid en zuiverheid (met name CD44hi contaminatie) van de geïsoleerde naive cellen worden geverifieerd, de anti-CD3 coatingprocedure worden bevestigd (platen afdichten met sealfilm tijdens de overnacht-incubatie bij 4 °C en zorgen voor een uniforme antilichaamdekking) en de IL-2 concentratie worden gevalideerd, aangezien dit cytokine essentieel is voor de ondersteuning van T-cel expansie. Bij CTV-geïnduceerde cytotoxiciteit moet de kleuringsconcentratie worden verlaagd terwijl een heldere resolutie van de divisiepieken behouden blijft, en moet worden gewaarborgd dat de quenching-stap strikt op ijs gedurende de volledige 5 min wordt uitgevoerd om resterende vrije kleurstof te verwijderen22,23. Bij een slechte levensvatbaarheid na kweek dient de celdichtheid te worden gecontroleerd, moet voldoende mediumvolume worden gegarandeerd en moet een steriele techniek worden gehanteerd. Indien inconsistente kleuring of een hoge flowcytometrische variabiliteit wordt waargenomen, moeten antilichaamcocktails als master-mixen worden bereid, alle gekleurde monsters tegen licht worden beschermd en dezelfde antilichaampartijen en batches fixeerbare levensvatbaarheidsverf worden gebruikt over de replicates.

Desalniettemin kent dit protocol bepaalde beperkingen. Als in vitro-systeem kan het de complexe weefselmicro-omgeving, cellulaire interacties of het cytokineniveau van secundaire lymfoïde organen niet volledig nabootsen. Het kweekvenster is beperkt tot 48 h, waardoor de analyse beperkt blijft tot vroege activeringsgebeurtenissen en beoordeling van laatstadium-differentiatie, uitputting of geheugenvorming wordt uitgesloten. Bovendien leunt het protocol zwaar op flowcytometrische resultaten, die een strikte standaardisatie vereisen van instrumentinstellingen, compensatiematrices en gating-strategieën over onafhankelijke experimenten heen. Verder zijn de bevindingen verkregen met dit anti-CD3/CD28-gebaseerde systeem uitsluitend afgeleid van CD8+ T-cellen en zijn ze mogelijk niet direct generaliseerbaar naar CD4+ T-cellen, waarvan bekend is dat de activatiedrempels, co-stimulatievereisten en downstream-differentiatietrajecten verschillen12,24,25. Daarnaast kan de basale activatietoestand van T-cellen variëren tussen individuele muizenkolonies vanwege verschillen in commensale microbiota, wat een potentiële bron van interlaboratoriumvariabiliteit vormt die in overweging moet worden gebracht bij het interpreteren van resultaten over verschillende studies.

Het hier beschreven gegradeerde stimulatiesysteem stelt onderzoekers in staat om de TCR-signaalsterkte af te stemmen op specifieke experimentele doelstellingen, gebaseerd op de verschillende responspatronen die worden waargenomen in diverse read-outs. Deze gegevens tonen aan dat de keuze van de anti-CD3-concentratie en het oogsttijdstip geleid moet worden door de specifieke biologische vraagstelling. Voor markers van vroege activatie is de upregulatie van CD69 al detecteerbaar vanaf 6–12 h bij alle concentraties, maar vertoont deze een verschillende kinetiek: hoge concentraties (5–10 µg/mL) induceren een snelle piek gevolgd door een daling, terwijl lage concentraties (0.5–1 µg/mL) leiden tot een geleidelijke, aanhoudende toename. Voor proliferatie-assays zijn concentraties onder 1 µg/mL suboptimaal en kunnen deze dienen als interne negatieve controles, terwijl 5–10 µg/mL betrouwbaar een robuuste clonale expansie induceren die detecteerbaar is via CTV-verdunning na 48 h. De expressie van de co-inhibitoire receptor PD-1 en het co-stimulerende molecuul ICOS vereist hoog-intensieve stimulatie (5–10 µg/mL) en piekt na 36 h, wat aangeeft dat studies naar deze moleculen eerdere tijdstippen of lagere doses moeten vermijden. Voor read-outs van effectorfuncties (TNF-α en Granzyme B) is de relatie tussen de stimulatiesterkte en de cytokinproductie tijdsafhankelijk en volgt deze een kenmerkend bifasisch patroon. Na 24 h schaalt de productie van effectormoleculen positief mee met de anti-CD3-concentratie, waarbij hogere doses leiden tot een grotere cytokinoutput. Na 48 h zijn de absolute niveaus van cytokin-producerende cellen in alle condities weliswaar aanzienlijk verhoogd vergeleken met 24 h, maar keert de dosis-responserelatie om: lagere stimulatieconcentraties (0.5–1 µg/mL) leveren relatief hogere frequenties van TNF-α⁺ Granzyme B⁺ cellen op dan hoge doses (5–10 µg/mL). Deze inversie suggereert dat aanhoudende sterke TCR-signalering, hoewel het de initiële effectordifferentiatie bevordert, een relatieve beperking kan opleggen aan het behoud van de cytokinproductiecapaciteit per cel, wat mogelijk wijst op het begin van activatie-geïnduceerde uitputtingsverschijnselen of hyporesponsiviteit.

Samen positioneren deze empirische waarnemingen ons protocol als een referentiekader waarmee gebruikers stimuleringscondities kunnen preselecteren op basis van specifieke downstream-eindpunten, waardoor de efficiëntie van het experimentele ontwerp en de interpreteerbaarheid van de gegevens worden verbeterd. Naast fundamentele mechanistische studies kan dit systeem ook bijdragen aan de optimalisatie van protocollen voor T-cel-expansie voor adoptieve immunotherapie, waarbij een nauwkeurige regulering van de TCR-signaalsterkte kan helpen bij het sturen van de differentiatie naar gunstige effector- of memory-fenotypes26,27,28.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te melden.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (No. T2394504, LY) en het Chief Scientist Research Startup Fund van Lilin Ye (No. R2045, LY).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
15 mL conische buisLabgicCD-002-15ASteriele 15 mL conische centrifugebuis
4% paraformaldehydeBeyotimeP00994% waterig fixatief voor het conserveren van cellen vóór kleuring
60 mm schaalLabgic1221160 mm celkweekschaal
70 µm celzeefLabgicBS-70-CS70 µm nylon-mesh zeef voor het bereiden van single-cell suspensies
96-well round-bottom plaatBeyotimeFPT01696-well round-bottom plaat voor celkweek en kleuring
ACK lysisbufferBeyotimeC3702Op ammoniumchloride gebaseerde lysisbuffer voor rode bloedcellen
anti-muis CD25Biolegend101910APC-geconjugeerd anti-muis CD25 antilichaam, kloon 3C7, voor flowcytometrie
anti-muis CD28Bio X CellBE0015-1Gezuiverd anti-muis CD28 antilichaam, kloon 37.51, voor T-cel costimulatie
anti-muis CD3Bio X CellBP0001-1Gezuiverd anti-muis CD3ε antilichaam, kloon 145-2C11, voor T-cel activatie
anti-muis CD69BD Biosciences553237PE-geconjugeerd anti-muis CD69 antilichaam voor kleuring van activatiemarkers
anti-muis CD8Invitrogen17-0081-82APC-geconjugeerd anti-muis CD8a antilichaam, kloon 53-6.7, voor flowcytometrie
anti-muis GZMBBiolegend372212PerCP/Cyanine5.5-geconjugeerd anti-mens/muis granzyme B antilichaam, kloon QA16A02, voor intracellulaire flowcytometrie
anti-muis ICOSBD Biosciences565886BV421-geconjugeerd anti-muis ICOS (CD278) antilichaam voor flowcytometrie
anti-muis PD-1Biolegend135220BV605-geconjugeerd anti-muis PD-1 (CD279) antilichaam, kloon 29F.1A12, voor flowcytometrie
anti-muis TNF-αInvitrogen46-7321-82PerCP-eFluor 710-geconjugeerd anti-muis TNF-α antilichaam, kloon MP6-XT22, voor intracellulaire flowcytometrie
anti-muis/mens CD44Biolegend103030PE/Cyanine7-geconjugeerd anti-muis/mens CD44 antilichaam, kloon IM7, voor flowcytometrie
biotine anti-muis CD11bBiolegend101204Biotine-geconjugeerd anti-muis CD11b antilichaam voor lineagedepletie
biotine anti-muis CD11cBiolegend117304Biotine-geconjugeerd anti-muis CD11c antilichaam voor lineagedepletie
biotine anti-muis CD16/32Biolegend156604Biotine-geconjugeerd anti-muis CD16/32 antilichaam voor lineagedepletie
biotine anti-muis CD19Biolegend115504Biotine-geconjugeerd anti-muis CD19 antilichaam voor lineagedepletie
biotine anti-muis CD4Biolegend100508Biotine-geconjugeerd anti-muis CD4 antilichaam voor lineagedepletie
biotine anti-muis CD44Biolegend103004Biotine-geconjugeerd anti-muis CD44 antilichaam voor lineagedepletie
biotine anti-muis CD45RBiolegend103204Biotine-geconjugeerd anti-muis CD45R/B220 antilichaam voor lineagedepletie
biotine anti-muis CD49bInvitrogen13-5971-85Biotine-geconjugeerd anti-muis CD49b antilichaam voor lineagedepletie
biotine anti-muis F4/80Biolegend123106Biotine-geconjugeerd anti-muis F4/80 antilichaam voor lineagedepletie
biotine anti-muis Ly6GBiolegend127604Biotine-geconjugeerd anti-muis Ly6G antilichaam voor lineagedepletie
biotine anti-muis NK1.1Biolegend108704Biotine-geconjugeerd anti-muis NK1.1 antilichaam voor lineagedepletie
biotine anti-muis TER119Biolegend116204Biotine-geconjugeerd anti-muis TER-119 antilichaam voor lineagedepletie
C57BL/6 muizenSibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.N/A6–8 weken oude mannelijke muizen gebruikt voor de experimenten
Koolstofdioxide (CO2) incubatorThermo Fisher3120Bevochte CO2 incubator voor mammale celkweek
CellTrace Violet kleurstofInvitrogenC34557Violette fluorescerende kleurstof voor het monitoren van celproliferatie
DMSOSigmaD2650Dimethylsulfoxide; oplosmiddel voor het bereiden van reagentia-stamoplossingen
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secundair Antilichaam, Alexa Fluor™ 488InvitrogenA-21206Alexa Fluor 488-geconjugeerd donkey anti-rabbit IgG (H+L) secundair antilichaam
D-PBSVivaCell BiosciencesC3590-0500Dulbecco’s fosfaatgebufferde zoutoplossing voor wassen en bereiding van reagentia
Foetaal runderserum (FBS)GibcoC11995500BTSersumsupplement voor mammale celkweekmedium
Fixeerbare ViabiliteitskleurstofInvitrogen65-0865-14Fixeerbare viabiliteitskleurstof voor het uitsluiten van dode cellen tijdens flowcytometrie
Fixatie- en Permeabilisatie-oplossingBD Biosciences51-2090KZFixatie- en permeabilisatiereagens voor intracellulaire kleuring
Flat-bottom 96-well plaatLabgic1151096-well flat-bottom plaat voor celkweek en stimulatie-assays
FlowcytometerBD BiosciencesLSRFortessa-3 laserDrie-laser flowcytometer voor multicolor fluorescentie-acquisitie
Golgi PlugBD Biosciences51-2301KZOp Brefeldine A gebaseerde eiwittransportremmer voor intracellulaire cytokinekleuring
Golgi StopBD Biosciences51-2092KZOp monensine gebaseerde eiwittransportremmer voor intracellulaire cytokinekleuring
Ionomycine calciumsaltSigmaI3909-1MLCalciumionofoor gebruikt met PMA voor celstimulatie
Perm/Wash BufferBD Biosciences51-20911KZPermeabilisatie- en wasbuffer voor intracellulaire kleuring
Phosflow Lyse/Fix BufferBD Biosciences5580495× buffer voor gelijktijdige lysis van rode bloedcellen en fixatie van leukocyten
Phosflow Perm/Wash Buffer IBD Biosciences557885Op methanol gebaseerde permeabilisatiebuffer voor intracellulaire fosfoproteïnekleuring
Phospho-S6 Ribosomaal Proteïne (Ser235/236) (D57.2.2E) Konijn Monoclonaal AntilichaamCell Signaling4858SKonijn monoclonaal antilichaam tegen phospho-S6 ribosomaal proteïne (Ser235/236), kloon D57.2.2E
PMASigmaP1585-1MGPhorbol 12-myristaat 13-acetaat; activator gebruikt voor ex vivo celstimulatie
Recombinant Muis Interleukine-2Gibco200-02-50UGRecombinant muis interleukine-2 voor T-celkweek en expansie
RPMI 1640Life-LabAC01L064Roswell Park Memorial Institute 1640 medium voor mammale celkweek
Streptavidine Magnetische BeadsBEAVER22307Streptavidine-gecoate magnetische beads voor biotine-antilichaam-gebaseerde celdepletie
Flowcytometrie kleuringsbufferNiet gespecificeerdNiet gespecificeerdFlowcytometrie kleuringsbuffer; leverancier of bereidingsformule werd niet verstrekt
Parafilm M laboratoriumfolieAmcorPM996Flexibele zelfafdichtende laboratoriumfolie voor het afdichten van platen, buizen en kweekvaten
Lyse/Fix BufferBD Biosciences5580495× buffer voor gelijktijdige lysis van rode bloedcellen en fixatie van leukocyten
FlowJoBD Biosciencesv10.8.1Software, versie 10.8.1, voor flowcytometrie data-analyse

Referenties

  1. De Boer RJ, Yates AJ. Modeling T cell fate. Annu Rev Immunol. 2023;41:513–32.
  2. Chapman NM, Boothby MR, Chi H. Metabolic coordination of T cell quiescence and activation. Nat Rev Immunol. 2020;20(1):55–70.
  3. Liu D, et al. Key links in the physiological regulation of the immune system and disease induction: T cell receptor-CD3 complex. Biochem Pharmacol. 2024;227:116441.
  4. Mariuzza RA, Agnihotri P, Orban J. The structural basis of T-cell receptor (TCR) activation: an enduring enigma. J Biol Chem. 2020;295(4):914–25.
  5. Smith-Garvin JE, Koretzky GA, Jordan MS. T cell activation. Annu Rev Immunol. 2009;27:591–619.
  6. Brownlie RJ, Zamoyska R. T cell receptor signalling networks: branched, diversified and bounded. Nat Rev Immunol. 2013;13(4):257–69.
  7. Au-Yeung BB, et al. Quantitative and temporal requirements revealed for Zap70 catalytic activity during T cell development. Nat Immunol. 2014;15(7):687–94.
  8. Daniels MA, et al. Thymic selection threshold defined by compartmentalization of Ras/MAPK signalling. Nature. 2006;444(7120):724–9.
  9. Snook JP, Kim C, Williams MA. TCR signal strength controls the differentiation of CD4+ effector and memory T cells. Sci Immunol. 2018;3(25):eaas9103.
  10. Flaherty S, Reynolds JM. Mouse naïve CD4+ T cell isolation and in vitro differentiation into T cell subsets. J Vis Exp. 2015;(98):e52739.
  11. Trickett A, Kwan YL. T cell stimulation and expansion using anti-CD3/CD28 beads. J Immunol Methods. 2003;275(1–2):251–5.
  12. Kaech SM, Wherry EJ, Ahmed R. Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development. Nat Rev Immunol. 2002;2(4):251–62.
  13. Gottschalk RA, et al. Distinct NF-κB and MAPK activation thresholds uncouple steady-state microbe sensing from anti-pathogen inflammatory responses. Cell Syst. 2016;2(6):378–90.
  14. Gjergjova F, et al. A fine-tuned comprehensive overview of antibody-driven ex vivo assays for primary murine T cell activation. J Immunol Methods. 2026;548:114055.
  15. Rosenlehner T, et al. Reciprocal regulation of mTORC1 signaling and ribosomal biosynthesis determines cell cycle progression in activated T cells. Sci Signal. 2024;17(859):eadi8753.
  16. Salmond RJ, Emery J, Okkenhaug K, Zamoyska R. MAPK, phosphatidylinositol 3-kinase, and mammalian target of rapamycin pathways converge at the level of ribosomal protein S6 phosphorylation to control metabolic signaling in CD8 T cells. J Immunol. 2009;183(11):7388–97.
  17. Motamedi M, Xu L, Elahi S. Correlation of transferrin receptor (CD71) with Ki67 expression on stimulated human and mouse T cells: the kinetics of expression of T cell activation markers. J Immunol Methods. 2016;437:43–52.
  18. Kalia V, et al. Prolonged interleukin-2Ralpha expression on virus-specific CD8+ T cells favors terminal-effector differentiation in vivo. Immunity. 2010;32(1):91–103.
  19. Caruso A, et al. Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation. Cytometry. 1997;27(1):71–6.
  20. Sutermaster BA, Darling EM. Considerations for high-yield, high-throughput cell enrichment: fluorescence versus magnetic sorting. Sci Rep. 2019;9(1):227.
  21. Llufrio EM, Wang L, Naser FJ, Patti GJ. Sorting cells alters their redox state and cellular metabolome. Redox Biol. 2018;16:381–7.
  22. Quah BJ, Parish CR. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J Immunol Methods. 2012;379(1–2):1–14.
  23. Lemieszek MB, Findlay SD, Siegers GM. CellTrace Violet flow cytometric assay to assess cell proliferation. Methods Mol Biol. 2022;2508:101–14.
  24. Whitmire JK, Ahmed R. Costimulation in antiviral immunity: differential requirements for CD4+ and CD8+ T cell responses. Curr Opin Immunol. 2000;12(4):448–55.
  25. Seder RA, Darrah PA, Roederer M. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nat Rev Immunol. 2008;8(4):247–58.
  26. Carbone F, et al. Cellular and molecular signaling towards T cell immunological self-tolerance. J Biol Chem. 2024;300(4):107134.
  27. Daniels MA, Teixeiro E. TCR signaling in T cell memory. Front Immunol. 2015;6:617.
  28. Knudson KM, et al. Cutting edge: the signals for the generation of T cell memory are qualitatively different depending on TCR ligand strength. J Immunol. 2013;191(12):5797–801.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

CD8 T cellenin vitro stimulatieanti CD3 stimulatieanti CD28 costimulatieflowcytometrieisolatie van na eve T cellenmTORC1 activiteitT celdifferentiatie
Video binnenkort beschikbaar
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.