Effect van Tuina op de expressie en slaapgedrag van hypothalamische Orexine-A in een rattenmodel van primaire slapeloosheid

Samenvatting

Deze studie onderzoekt of Tuina slapeloosheid verlicht in een rattenmodel door de expressie van hypothalamische orexine-A te reguleren, met behulp van gedragsanalyses, immunohistochemie en realtime kwantitatieve PCR.

Samenvatting

Slapeloosheid is een veelvoorkomende slaapstoornis die leidt tot een verminderde functie overdag en een verhoogd risico op comorbiditeiten, wat de kwaliteit van leven van patiënten aanzienlijk beïnvloedt. Huidige behandelingen, voornamelijk cognitieve gedragstherapie en farmacotherapie, worden beperkt door kwesties zoals drugsafhankelijkheid, tolerantie en terugtrekkingsrebound. Tuina-therapie is aangetoond het zenuw-, endocriene en immuunsysteem te reguleren, terwijl het orexinesysteem een belangrijke regelaar is van de slaap-waakcyclus. Dit heeft geleid tot het onderzoek of Tuina slapeloosheid verlicht door het hypothalamische orexinesysteem te moduleren. Dit protocol beschrijft de methoden van Tuina-interventie in een rattenmodel van primaire slapeloosheid veroorzaakt door de aangepaste meervoudige platform wateromgevingsmethode. We verdeelden 64 Wistar-ratten in vier groepen: controle, model, Tuina en orexine-antagonist. Gedragsbeoordelingen (open veldtest, pentobarbital-geïnduceerde slaaptest) werden uitgevoerd, en de expressie van Orexine-A in de hypothalamus werd vastgesteld via realtime kwantitatieve PCR en immunohistochemie. Het protocol heeft als doel de effectiviteit van Tuina te evalueren en het mogelijke mechanisme te onderzoeken dat verband houdt met het orexinesysteem, en biedt een referentie voor de toepassing en mechanistische studie van Tuina bij slaapstoornissen.

Inleiding

Slapeloosheid, gekenmerkt door ontevredenheid over slaapduur of -kwaliteit die leidt tot beperkingen overdag, is een veelvoorkomend wereldwijd gezondheidsprobleem met een aanzienlijke last voor individuen en zorgsystemen ^1,2. In China is de prevalentie van slapeloosheid opmerkelijk hoog, wat^{de impact op} de volksgezondheid verder verergert. Deze stoornis wordt geassocieerd met verminderde cognitieve functie, een verhoogd risico op hart- en vaatziekten en een hoge comorbiditeit met psychiatrische aandoeningen zoals depressie en angst ^4,5. De huidige klinische behandeling is voornamelijk gebaseerd op cognitieve gedragstherapie en farmacotherapie, met name benzodiazepines en niet-benzodiazepine sedativa-hypnotica. Hun langdurige toepassing wordt echter beperkt door medicijnafhankelijkheid, tolerantie, residuele effecten overdag en ontwenningsverschijnselen, wat de noodzaak van effectieve niet-farmacologische alternatieven benadrukt⁶. In de klinische praktijk is Tuina bijzonder geschikt voor patiënten met chronische primaire slapeloosheid die niet-farmacologische interventies zoeken, vooral voor ouderen met een hoog risico op medicatieafslaving, evenals zwangere of borstvoedende vrouwen⁷.

Als hoeksteen van externe therapie in de traditionele Chinese geneeskunde heeft Tuina unieke voordelen aangetoond bij de behandeling van slapeloosheid⁸. Meta-analytisch bewijs toont aan dat Tuina aanzienlijk beter presteert dan medicijnen of alleen acupunctuur in totale effectieve ratio (OR = 4,12), slaapkwaliteit en angst-depressieve toestanden, met een hoge veiligheid^{van 9}. Specifieke Tuina-protocollen bieden duidelijke voordelen: traditionele Tuina bereikt 89,5% effectiviteit bij slijmhitte-insomnia, buikwrijving verlaagt de terugvalpercentages tot 14,7% (tegenover 38,2% bij conventionele Tuina)¹⁰. De driedelige Tuina-methode verhoogt de effectiviteit van kruidentherapie van 80,49% naar 92,68% en verbetert de slaaparchitectuur en neurotransmitterprofielen¹¹. Klinische studies en systematische reviews hebben bevestigd dat Tuina de slaapkwaliteit aanzienlijk kan verbeteren, angst- en depressiescores kan verlagen en serumniveaus van neurotransmitters zoals 5-hydroxytryptamine (5-HT)¹² kan moduleren. Men denkt dat de therapeutische effecten worden bemiddeld door holistische regulatie van het neuro-endocriene-immuunnetwerk. Recent onderzoek richt zich steeds meer op het orexinesysteem, een belangrijk neuropeptidesysteem dat afkomstig is van de laterale hypothalamus en cruciaal is voor het bevorderen en behouden van waakzaamheid^. Abnormale overactiviteit van orexineneuronen wordt geassocieerd met de pathofysiologie van slapeloosheid, terwijl remming van deze route therapeutisch potentieel¹⁴ heeft getoond. Voorlopig bewijs suggereert dat manipulaties zoals buikwrijving het hersenniveau van Orexine-A bij slaaptekort ratten^kunnen beïnvloeden, maar een systematisch onderzoek naar de vraag of Tuina zijn anti-slapeloosheidseffecten specifiek uitoefent door het orexinesysteem te moduleren, ontbreekt.

Daarom heeft deze studie, gebaseerd op een rattenmodel van primaire slapeloosheid, als doel om: (1) De verbetering van slaapgedrag te evalueren na gestandaardiseerde Tuina-interventie met behulp van gedragstoetsen; en (2) Het onderliggende mechanisme onderzoeken door te onderzoeken of het effect van Tuina samenhangt met de downregulatie van Orexine-A-expressie in de hypothalamus, waarbij de effectiviteit wordt vergeleken met die van een orexinereceptorantagonist. Dit onderzoek heeft als doel experimenteel bewijs te leveren voor het centrale mechanisme van Tuina bij de behandeling van slapeloosheid.

Protocol

Alle experimentele procedures en dierenwelzijnsbeoordelingen zijn goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van de Xinjiang Medical University (ethisch goedkeuringsnummer: IACUC-20020158). Het protocol volgt de institutionele richtlijnen voor dierenverzorging en gebruik. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Diervoorbereiding

1. Huisdieren 64 specifieke pathogenevrije (SPF) Wistar-ratten (lichaamsgewicht 250 g ± 50 g, gelijke geslachtsverdeling) in een SPF-barrièresysteem bij 18–22 °C met een licht-donkercyclus van 12 uur. Voorzien van voedsel en water ad libitum.
2. Na 1 week adaptief voeden worden ratten willekeurig verdeeld in 4 groepen (n = 16 per groep): controle (Groep A), model (Groep B), Tuina (Groep C) en antagonist (Groep D).

2. Vaststelling van het primaire slapeloosheidsmodel

OPMERKING: Behalve in Groep A ondergaan ratten in Groepen B, C en D de volgende modelleringsprocedure.

1. Bereid een plastic cilindrische container voor (bovendiameter: 30 cm, hoogte: 40 cm) als rattenbak.
2. Bevestig een cilindrisch platform (diameter: 6 cm, hoogte: 10 cm) aan de onderkant van de container.
3. Voeg water toe aan de container totdat het waterniveau 1 cm onder het platformoppervlak ligt. Houd de watertemperatuur op 20 °C.
4. Plaats een cirkelvormig ijzeren gaas (diameter: 25 cm, gaasgrootte: 1 cm) horizontaal in de container, 15 cm boven het platform. Bevestig het gaas aan de rand van de container met dunne ijzeren draden.
5. Leg drinkwater en voedsel op het ijzeren gaas. Verver dagelijks water en maak de container schoon en desinfecteer hem.
6. Plaats één rat per container op het platform gedurende 8 opeenvolgende dagen.

3. Modelevaluatie met behulp van pentobarbital natrium synergetische slaaptest

1. De pentobarbitalnatriumoplossing wordt bereid door direct ultrazuiver water toe te voegen. Weeg 1,0 g poeder, voeg gesteriliseerd ultrazuiver water toe aan 100 mL, los op en filter op 0,22 μm om een oplossing van 1% (10 mg/mL) te verkrijgen.
2. Op dag 9 injecteer je alle ratten intraperitoneaal met pentobarbitale natriumoplossing op de minimale drempeldosis die slaap induceert (bepaald in voorlopige experimenten).
3. Record slaaplatentie (tijd van injectie tot het eerste verlies van de rechtstaande reflex) en slaapduur (tijd van verlies tot herstel van de herstelreflex). Definieer verlies van de rechtstaande reflex voor 1 minuut als het begin van de slaap, en het herstel als het einde van de slaap.

4. Tuina-interventie

OPMERKING: Interventies beginnen op de dag na succesvolle modelevaluatie en gaan dagelijks door gedurende 14 opeenvolgende dagen. Groep A en Groep B ondergaan dagelijks 10 minuten vasthoudendheid in een fixatieframe. Operators krijgen een grondige training voorafgaand aan het experiment om consistentie in kracht, frequentie en ritme te waarborgen.

1. Voor Groep C zet je de rat in rugligging op een operatietafel.
2. Zet voorzichtig de vier ledematen van de rat vast met de vijf vingers van de linkerhand, waarbij de buik volledig wordt gestrekt.
3. Voer abdominale Tuina uit met de rechterhand: gebruik de pulpa van de distale falanx van de middelvinger om kracht uit te oefenen op het Guanyuan-punt (CV4, gelegen 25 mm onder de navel). Houd de resterende vier vingers natuurlijk gestrekt.
4. Drijf de middelvinger aan met kleine anterolaterale cirkelbewegingen vanuit het schoudergewricht, waarbij tegen de klok in cirkelvormige translatiewrijving op de buik wordt uitgevoerd.
5. Volg een gesloten cirkelvormig pad gevormd door Jiuwei (CV15, 5 mm onder het xifoid-uitsteeksel), Guanyuan (CV4) en bilaterale Daimai-punten (GB26, middenpunt tussen het vrije uiteinde van de^12e rib en de iliacale kam bovenaan de rand).
6. Houd een vloeiende, gelijkmatige, continue cirkelbeweging aan bij 5–7 cycli per minuut.
7. Voer 5 minuten tegen de klok in manipulatie uit, daarna 5 minuten met de klok mee.
8. Zorg dat de kracht stabiel en stevig is, zodat de rat rustig blijft en niet worstelt. Breng de interventie eenmaal per dag toe gedurende 14 dagen.

5. Antagonistische administratie

1. Voor Groep D dient u MK-4305 (10 mg/kg) in via intragastrische gavage eenmaal daags gedurende 14 dagen. Los MK-4305 op in normale zoutoplossing om een oplossing van 5 mL te bereiden.

6. Open veldtest

1. Na de interventieperiode wordt de open veldtest uitgevoerd met een zwarte kubusvormige doos (basis: 100 cm × 100 cm, hoogte: 40 cm). Verdeel de vloer in 25 gelijke vakjes met grijze lijnen (16 perifere, 9 centrale).
2. Plaats de rat in het centrale vierkant en begin met timen.
3. Registreer de totale afgelegde afstand, aantal grootmaak-episodes en tijd in het centrale gebied meer dan 3 minuten met behulp van een beeldacquisitiesysteem.
4. Na elke test verwijder je de ontlasting en maak je de vloer en binnenmuren schoon met 75% ethanol.
5. Werking van beeldacquisitiesysteem
   1. Stel het beeldacquisitiesysteem in. Plaats een digitale CCD-camera (resolutie: 1280 × 720 pixels; beeldsnelheid: 25 fps) verticaal 1,5 m boven het open veld. Verbind de camera met een computer via een USB-interface.
   2. Configureer de trackingsoftware en analyse-instellingen. Voer geautomatiseerde tracking uit met behulp van gedragsvideo-analysesoftware. Stel de trackingparameters als volgt in:
      1. Definieer de tracking focus als het middelpunt (massamiddelpunt) van de rat.
      2. Stel de framerate in op 25 fps voor zowel beeldopname als analyse.
      3. Kalibreer de ruimtelijke resolutie zodat elke pixel overeenkomt met 1,5 mm werkelijke afstand op basis van de afmetingen van het open veld en de videoresolutie.
      4. Stel de achtergrond-subtractiedrempel in op 15 grijsniveaus (bereik: 0–255) om de rat van de achtergrond te onderscheiden.
      5. Stel de minimale gebeurtenisduur in op 0,2 s (5 frames) om vals-positieve detecties veroorzaakt door ruis te minimaliseren.
      6. Verdeel het open veld virtueel in 5 × 5 vierkanten met gelijke oppervlakte (zones 1–25). Definieer de centrale zone als Zones 7, 8, 9, 12, 13, 14, 17, 18 en 19 (de centrale 3 × 3 vierkanten, wat 36% van het totale oppervlak vertegenwoordigt). Definieer de perifere zone als de overgebleven vierkanten.
   3. Noteer de volgende outputparameters: totale afgelegde afstand (mm), gemiddelde snelheid (mm/s), tijd die onbeweeglijk is doorgebracht (s), tijd besteed aan bewegen (s), tijd doorgebracht in elke zone(s), afstand die in elke zone wordt verplaatst (mm), aantal ingangen in elke zone en aantal opgroeiepisodes. Controleer handmatig grootfok-episodes.

7. Perfusie voor immunohistochemie

OPMERKING: Gebruik 4 ratten uit elke groep voor immunohistochemie.

1. Maak 0,9% zoutoplossing (voorverwarmd tot 37 °C) en 4% paraformaldehydeoplossing (bewaard bij 4 °C).
2. Ratten diep verdoofen met intraperitoneale urethaan (25% oplossing, 0,6 mL/100 g lichaamsgewicht). Bevestig verlies van pedaal-, hoornvlies- en rechtstaande reflexen.
3. Bevestig de rat op rug op een schuimplaat. Open snel de borstholte door door huid, fascia en borstbeen te snijden.
4. Trek het hart voorzichtig terug om de aorta bloot te leggen. Steek een naald door de apex van de linker ventrikel in de aorta totdat de naaldpunt zichtbaar is in het aorta-lumen. Zorg ervoor dat de naald, linkerventrikel en aorta horizontaal zijn uitgelijnd.
5. Klem de aorta en naald samen met hemostatische tang. Knip onmiddellijk het rechter atrium af om bloed te laten stromen.
6. Perfusie met 150–200 mL voorverwarmde 0,9% zoutoplossing (37 °C). Succesvolle perfusie wordt aangetoond door blancheer van de lever, mesenterium en voorpoten, en heldere vloeistof uit het rechter atrium.
7. Schakel over op koude 4% paraformaldehyde (4 °C) en perfuseer 400 mL. Voer de eerste perfusie snel uit totdat er fasciculaties van de hele lichaamspieren en versteviging van ledematen optreden. Verlaag dan de debiet tot 2 druppels per seconde totdat alle fixatiemiddel is doorgeperst.
8. Bevestig succesvolle fixatie wanneer de hersenen bleek en stevig lijken.

8. Hersendissectie

1. Na de perfusie onthoofd je de rat en verwijder je voorzichtig de hele hersenen uit de schedel.
2. Incatief de schedel langs de sagittale hechting met een schaar. Pel pariëtale en achterhoofdsbotten af met botrongeuren.
3. Til voorzichtig de hersenen op met een spatel, snijd de schedel- en oogzenuwen door met een fijne schaar.
4. Voor immunohistochemie: Onmiddellijk de hele hersenen overbrengen naar 4% paraformaldehyde en postfixeren bij 4 °C gedurende 24 uur.
5. Voor realtime kwantitatieve PCR: spoel het hersenoppervlak met voorgekoelde zoutoplossing, dep het droog met filterpapier, vries 5–10 minuten in vloeibare stikstof en bewaar bij –80 °C. Voer alle stappen op ijs uit.

9. Immunohistochemische kleuring

1. Inbed hypothalamisch weefsel in paraffine en snijd coronale secties op een dikte van 4–5 μm met behulp van een microtoom. Bevestig secties op anti-drop glijbanen en bak op 65 °C gedurende 1,5–2 uur.
2. Dewax secties in xyleen I en II (elk 10 min). Rehydrateer via gegradueerd ethanol: anhydre ethanol I en II (5 minuten elk), daarna 95%, 90%, 80%, 70% ethanol (5 minuten elk), daarna gedestilleerd water (5 min).
3. Voer antigeenwinning uit door secties in een kokende 0,01 M citraatbuffer (pH 6,0) in een snelkookpan te plaatsen. Verwarm tot het drukventiel omhoog komt, en zet dan de verwarming uit. Laat het 10 minuten weken en laat het dan natuurlijk afkoelen tot kamertemperatuur.
4. Inactiveer endogene peroxidase door secties te dompelen in verse 3% H₂O₂ gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was 3 × met PBS (5 minuten per stuk).
5. Cirkel weefsel met een immunohistochemiepen. Breng konijn anti-HCRT/Orexin-A polyklonaal antilichaam aan (verdunning 1:50, ~50 μL per preparat). Incubeer een nacht op 4 °C in een bevochtigde bak.
6. De volgende dag 20 minuten op kamertemperatuur opwarmen. Was 3 × met PBS (5 minuten per stuk).
7. Breng mierikswortelperoxidase-gelabelde secundaire antistoffen aan. Incubeer 20 minuten op kamertemperatuur. Was 3 × met PBS (3 minuten per stuk).
8. Breng een werkoplossing aan met mierikswortelperoxidase-gelabelde streptavidine. Incubeer 20 minuten op kamertemperatuur. Was 3 × met PBS (5 minuten per stuk).
9. Bereid DAB-chromogeenoplossing voor (0,85 mL gedestilleerd water + 50 μL elk van reagentia A, B, C). Breng aan op secties en ontwikkel deze 3–10 minuten bij kamertemperatuur, waarbij je onder een microscoop monitort. Stop de reactie door het 3 minuten in kraanwater te dompelen.
10. Tegenkleuring met hematoxyline gedurende 3 minuten. Differentieer in 1% zoutzuuralcohol gedurende 1–2 s. Blauw in kraanwater gedurende 5 minuten.
11. Dehydrateer via gedestilleerd water (3 min), 70%, 80%, 90%, 95% ethanol (3 minuten elk) en watervrij ethanol I en II (elk 5 min). Maak het schoon in xyleen I en II (elk 5 minuten).
12. Breng neutrale balsem en deklaag aan. Droog de nacht op 37 °C.
13. Observeer en fotografeer secties met een lichtmicroscoop (40×, 100×, 200×, 400×). Tel Orexin-A positieve cellen (bruine korrelige precipitatie in cytoplasma) met behulp van ImageJ.
14. Bereken de totale score (0–12) als kleuringsintensiteitsscore (0 = negatief, 1 = lichtgeel, 2 = lichtbruin, 3 = donkerbruin) vermenigvuldigd met een positieve celpercentage (0 = 0%, 1 = 1–25%, 2 = 26–50%, 3 = 51–75%, 4 = 76–100%). Definieer 1–5 als lage expressie, 6–12 als hoge expressie.

10. Real-time kwantitatieve PCR voor Orexin-A mRNA

1. RNA-verwerking na weefselontdooiing moet onder RNase-vrije omstandigheden plaatsvinden. De specifieke RNase-vrije vereisten zijn als volgt:
   1. Werkomgeving: Gebruik een speciale RNA-werkruimte die is afgeweinigd met een RNase-decontaminant en blootgesteld aan UV-bestraling.
   2. Verbruiksartikelen: Gebruik gecertificeerde RNase-vrije centrifugebuizen en pipettoppen, of week ze in 0,1% DEPC-water gevolgd door autoclaven.
   3. Reagentia: Gebruik een RNase-vrije lysisbuffer en met DEPC behandeld water.
   4. Werking: Draag gedurende de procedure poedervrije handschoenen, wissel regelmatig van handschoen en vermijd direct contact met de binnenkant van verbruiksartikelen en de monsters.
   5. Experimentele procedure
      OPMERKING: Tijdens de RNA-extractie en reverse transcriptie-stappen moeten alle verbruiksmaterialen en hulpmiddelen die in contact komen met RNA- of reverse transcriptie-reagentia RNase-vrij zijn. In de PCR-amplificatiefase, aangezien cDNA een dubbelstrengige structuur is en RNase dubbelstrengig DNA niet kan afbreken, hoeven verbruiksartikelen en instrumenten in dit stadium alleen vrij te zijn van DNase en andere onzuiverheden die PCR-reacties kunnen remmen; aanvullende behandeling zonder RNase is niet nodig. Maal bevroren hypothalamisch weefsel onder vloeibare stikstof. Weeg 50–100 mg weefselpoeder in een buisje met 1 mL Trizol. Meng en zet het 15 minuten op kamertemperatuur.
2. Voeg 200 μL chloroform toe, meng door inversie en sta 5 minuten op kamertemperatuur. Centrifugeer op 12.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
3. Breng de bovenste waterige fase over naar een nieuwe buis. Voeg een gelijke hoeveelheid isopropanol toe, meng en laat het 35 minuten op –20 °C staan. Centrifugeer op 12.000 × g gedurende 15 minuten op 4 °C. Gooi het supernatant weg.
4. Was het neerslag met 75% ethanol, centrifugeer op 12.000 × g gedurende 15 minuten op 4 °C. Gooi het supernatant weg en herhaal de wasbeurt één keer.
5. Luchtdroog neerslaan bij kamertemperatuur. Los op in RNase-vrij water.
6. Meet RNA-concentratie en zuiverheid (A260/A280-verhouding 1,8–2,1). Beoordeel de integriteit met 1% agarosegelelektroforese (duidelijke 28S- en 18S-banden, zwakke of afwezige 5S-band).
7. Bereid een omgekeerde transcriptiereactie voor (20 μL): 800 ng totaal RNA, 1 μL Random Primer (0,1 μg/μL), 10 μL 2× TS Reactiemix, 1 μL TransScript RT/RI Enzyme Mix, 1 μL gDNA Remover en RNase-vrij water per volume.
8. Incubeer bij 25 °C gedurende 10 minuten, daarna 85 °C gedurende 5 seconden om eerstestreng cDNA te synthetiseren. Verdun cDNA 1:1 met RNase-vrij water.
9. Bereid qPCR-reactie voor (10 μL): 5 μL EvaGreen 2× qPCR MasterMix, 0,3 μL vooraanwaartse primer (10 μM), 0,3 μL omgekeerde primer (10 μM), 1 μL cDNA-sjabloon, RNase-vrij water op volume. Rijd in drievoud.
   OPMERKING: Primers: Orexin-A-F: 5'-CGCCAGAAGACGTGTTCCT-3'; Orexine-A-R: 5'-GCCGCTTTCCCAGAGTGAG-3' (productlengte 88 bp); β-Actin-F: 5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3'
   β-Actine-R: 5'-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3' (productlengte 150 bp).
10. Voer qPCR-programma uit: 95 °C gedurende 30 seconden (voor denaturatie); 40 cycli van 95 °C voor 5 seconden (denaturatie) en 60 °C voor 30 seconden (gloeien/verlenging).
11. Controleer de amplificatie- en smeltcurves. Voer 5 μL product uit op 2% agarosegel om de specificiteit te bevestigen.
12. Bereken de relatieve Orexine-A mRNA-expressie met de 2^{⁻ΔΔCt-methode} met β-Actine als interne controle.

11. Statistische analyse

1. Gebruik SPSS 26.0 voor data-analyse. Druk alle gegevens uit als gemiddelde ± standaarddeviatie. Voor vergelijkingen tussen twee groepen gebruik je onafhankelijke steekproeven t-test als de gegevens normaal verdeeld zijn; anders gebruik je de Mann-Whitney U-test.
2. Voor vergelijkingen tussen meerdere groepen gebruik je eenrichtings-ANOVA met een LSD post-hoctest voor homogene varianties of Tamhane's test voor heterogene varianties. Als gegevens niet normaal verdeeld zijn, gebruik dan de Kruskal-Wallis H-test. Beschouw P < 0,05 als statistisch significant.

Resultaten

Tabel 1 toont dat vergeleken met groep A de slaaplatentie in groepen B, C en D significant verlengd was, en de slaapduur significant werd verkort na modellering, wat aangeeft dat het primaire slapeloosheidsmodel van ratten succesvol was gevestigd. De bevindingen in Tabel 2 en Tabel 3 bieden voorlopige ondersteuning voor het therapeutische effect van Tuina bij de behandeling van slapeloosheid. De Open Field Test (OFT) is een van de meest klassieke en meest gebruikte paradigma's in de gedragsneurowetenschap voor het evalueren van angstachtig gedrag bij knaagdieren¹⁵. Uit onderzoek blijkt dat voorkeur voor het vierhoekgebied een gevoelige indicator is voor het meten van angstachtig gedrag, en dat het bij matige tot lage niveaus van angst meer discriminerend kan zijn dan de indicator voor het centrale gebied. De ratten in het slapeloosheidsmodel vertoonden significant angstachtig gedrag en veranderingen^{in verkennend} gedrag, terwijl de Tuina-interventie het angstachtige gedrag bij deze ratten effectief verlichtte. De moleculaire biologische resultaten in Tabel 4 en Tabel 5, en Figuur 1, tonen verder aan dat Tuina effectief de overexpressie van Orexine-A in de hypothalamus van insomnia-modelratten verlaagt.

Figuur 1: Resultaten van immunohistochemische kleuring van Orexin-A in de hypothalamus van ratten in elke groep (40×, 100×, 200×, 400×). (A) Orexine-A positieve neuronen werden waargenomen in het hypothalamische weefsel van de ratten, waarbij ze verschenen als donkerbruine korrelige signalen. De kleurintensiteitsscore was 3 punten, het percentage positieve cellen was 40% (binnen het bereik van 26%–50%, met 2 punten), en de totale score was 6 punten, wat binnen het hoge expressiebereik valt. (B) Het aantal Orexine-A positieve neuronen in het hypothalamische weefsel van de rat was significant verhoogd ten opzichte van de normale groep, met een dichtere verdeling van positieve cellen. De kleurintensiteitsscore was 3 punten (donkerbruin), het percentage positieve cellen bereikte 80% (binnen het bereik van 76%–100%, met 4 punten), en de totale score was 12 punten, wat binnen het hoge expressiebereik valt. (C) Het aantal Orexin-A positieve neuronen in het rat-hypothalamische weefsel was verminderd ten opzichte van de modelgroep. De kleurintensiteitsscore was 3 punten (donkerbruin), het percentage positieve cellen was 75% (binnen het bereik van 51%–75%, met 3 punten), en de totale score was 9 punten, wat binnen het bereik van hoge expressie valt. (D) Het aantal Orexine-A positieve neuronen in het hypothalamische weefsel van de rat was ook verminderd ten opzichte van de modelgroep. De kleurintensiteitsscore was 3 punten (donkerbruin), het percentage positieve cellen was 60% (binnen het bereik van 51%–75%, met 3 punten), en de totale score was 9 punten, wat binnen het hoge expressiebereik valt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Groep	Slaaplatentie / min	Slaapduur / min
A	4.13 ± 1.80	49,75 ± 38,46
B	6,31 ± 2,80*	22.13 ± 11.41*
C	6,33 ± 2,60*	24,93 ± 14,43*
D	6,53 ± 1,90*	24,73 ± 17,59*

Tabel 1: Vergelijking van door pentobarbital natrium geïnduceerde slaaptests tussen groepen na modellering. * geeft P < 0,05 aan vergeleken met de controlegroep.

Groep	Rijfrequentie	Onbeweeglijkheidstijd(en)	Voortbewegingstijd (s)	Voortbewegingsafstand (m)	Tijd in Center Zone (s)	Afstand in de middenzone (m)	Tijd in Corner Zone (s)	Afstand in de hoekzone (m)	Tijd in Corner Zone (s)	Afstand in de laterale zone (m)
A	1,875 ± 0,835	76.700 ± 34.324	103.350 ± 34.307	18.318 ± 16.314	8.750 ± 7.718	2.937 ± 5.112	103.000 ± 28.582	6.315 ± 3.893	56.600 ± 27.772	6,705 ± 3,666
B	7.125 ± 5.668	31.513 ± 10.964	148.488 ± 10.964	22.399 ± 9.159	16.275 ± 10.703	3.244 ± 2.991	75.088 ± 21.561	6.578 ± 1.972	85.463 ± 23.374	11.724 ± 4.959
T-waarde	-2.592	3.547	-3.545	-0.617	-1.613	-0.146	2.205	-0.171	-2.249	-2.302
P-waarde	0.035	0.007*	0.007*	0.547	0.129	0.886	0.045*	0.867	0.041*	0.037*

Tabel 2: Analyse van de invloed van elk indicatorniveau tussen de controlegroep (A) en de modelgroep (B).* geeft P < 0,05 vergeleken met de controlegroep.

Groep	Rijfrequentie	Onbeweeglijkheidstijd(en)	Voortbewegingstijd (s)	Voortbewegingsafstand (m)	Tijd in Center Zone (s)	Afstand in de middenzone (m)	Tijd in Corner Zone (s)	Afstand in de hoekzone (m)	Tijd in Corner Zone (s)	Afstand in de laterale zone (m)
B	5.875 ± 2.295	29.819 ± 12.871	150.219 ± 12.867	19.165 ± 8.054	24.838 ± 13.068	3.178 ± 2.438	69.075 ± 13.992	5,823 ± 1,422	83.019 ± 15.464	9.878 ± 4.393
C	6,357 ± 0,627	35.993 ± 32.237	144.021 ± 32.246	23.291 ± 4.873	14.321 ± 3.774	3.106 ± 2.214	87.057 ± 12.658 △	8.087 ± 1.496 △	68.943 ± 9.240	10.420 ± 1.225
D	6,667 ± 1,633	30.808 ± 15.389	149.200 ± 15.380	18.584 ± 4.969	27.792 ± 12.460	3.085 ± 1.114	74.600 ± 22.248	5.744 ± 1.291▲	74.192 ± 17.011	9.465 ± 3.380

Tabel 3: Analyse van de invloed van elk indicatorniveau tussen de modelgroep (B), Tuina-groep (C) en antagonistgroep (D). ^△P < 0,05 vergeleken met de modelgroep (B); ^▲P < 0,05 vergeleken met de Tuina-groep (C).

Groep	Orexin-A
A	1.011 ± 0.173
B	10.436 ± 2.512△
C	2,392 ± 0,998▲
D	3,227 ± 1,703▲

Tabel 4: Orexine-A mRNA-expressieniveaus in het hypothalamische weefsel. ^△P < 0,05 vergeleken met de controlegroep (A); ^▲P < 0,05 vergeleken met de modelgroep (B).

Groep	Orexin-A
	Intensiteit van het vleken	Percentage positieve cellen	Percentage Score	Partituur
A	3	40%	2	6
B	3	80%	4	12
C	3	75%	3	9
D	3	60%	3	9

Tabel 5: Immunohistochemische kleuringsscores van Orexin-A in de hypothalamus van ratten in elke groep. Criteria voor kleuringsintensiteit: 0 = negatieve kleuring (kleurloos), 1 = lichtgeel, 2 = lichtbruin, 3 = donkerbruin. Percentage positieve cellen voor de scorecriteria: 0 = 0%, 1 = 1%–25%, 2 = 26%–50%, 3 = 51%–75%, 4 = 76%–100%. Totale score = kleurintensiteitsscore × procentuele score. Totale scores van 1–5 werden gedefinieerd als lage expressie, en scores van 6–12 als hoge expressie.

Discussie

Deze studie had als doel de effectiviteit van Tuina in een primair slapeloosheidsmodel te beoordelen en het potentiële mechanisme te onderzoeken dat verband houdt met het hypothalamische orexinesysteem. De huidige bevindingen tonen aan dat een gestandaardiseerd Tuina-protocol de slaaplatentie en duur aanzienlijk verbeterde, angstachtig gedrag verminderde en effectief de overexpressie van Orexine-A op zowel mRNA- als eiwitniveaus in de hypothalamus verlaagde. Opmerkelijk was het effect van Tuina vergelijkbaar met dat van de orexinereceptorantagonist MK-4305, wat suggereert dat modulatie van het orexinesysteem een cruciaal mechanisme kan zijn waardoor Tuina slapeloosheid verlicht.

In vergelijking met farmacologische interventies biedt Tuina, als niet-invasieve externe therapie, voordelen op het gebied van veiligheid, minimale bijwerkingen en patiëntnaleving^12,18. De therapeutische voordelen voor slapeloosheid worden ondersteund door klinisch bewijs dat verbeteringen in slaapkwaliteit en psychologische toestand aantoont^18,19. Het mechanisme is veelzijdig en omvat regulatie van de hypothalamus-hypofyse-bijnieras, homeostase van het autonome zenuwstelsel en belangrijke neurotransmitters zoals 5-HT^18,20. De resultaten breiden dit begrip uit door het orexinesysteem als specifiek doelwit aan te wijzen. Orexineneuronen zijn centrale drijfveren van waakzaamheid, en hun hyperprikkelbaarheid is gekoppeld aan slaapinstabiliteit 21,22,23. De afbouw van orexine-A die na Tuina is waargenomen, lijkt consistent te zijn met het effect van het nieuwe slapeloosheidsmedicijn dubbele orexinereceptorantagonist, wat een mogelijke convergente route tussen farmacologische en niet-farmacologische interventies benadrukt ^24,25.

Hoewel deze studie voortbouwt op ons eerder gepubliceerde werk over abdominale Tuina en orexine-A regelgeving²⁵, vertegenwoordigt het huidige manuscript een aanzienlijke uitbreiding en methodologische verfijning voorbij het oorspronkelijke rapport. Specifiek vergroot deze studie de steekproefgrootte tot 64 ratten om de statistische kracht te vergroten en introduceert een uitgebreide reeks gedragsbeoordelingen, waaronder de open veldtest en pentobarbital-geïnduceerde slaaptesten, om de slaaparchitectuur en angstachtig gedrag systematisch te evalueren, die in de vorige studie niet werden behandeld. In tegenstelling tot het eerdere werk, dat zich sterk richtte op oxidatieve stress en klassieke neurotransmitters, geeft dit artikel prioriteit aan de functionele validatie van het orexinesysteem via geïntegreerde gedragsuitkomsten en moleculaire assays, en dient als een op zichzelf staand mechanistisch onderzoek dat de eerdere bevindingen aanvult in plaats van repliceert.

Het experimentele ontwerp hield zich aan de TCM-theorie door zich te richten op de buik en specifieke acupunkturen zoals Guanyuan (CV 4), waarvan wordt aangenomen dat het de oer-Qi versterkt en de viscerale functie reguleert, binnen een gesloten-lus manipulatiepad^26,27. De parameters (frequentie, duur, verloop) werden gestandaardiseerd op basis van voorlopig werk om consistentie en reproduceerbaarheid te waarborgen, een cruciaal aspect voor mechanistische dierstudies¹².

Dit protocol heeft echter beperkingen. Ten eerste werd de interventie op één tijdstip na het modelleren uitgevoerd. Toekomstige studies moeten verschillende interventieduur en frequenties onderzoeken om een optimale "dosis-respons" relatie voor Tuina vast te stellen. Ten tweede is deze studie een observationeel onderzoeksontwerp. Hoewel er een correlatie werd gevonden tussen Tuina en verminderde expressie van Orexine-A en gedragsverbetering, is het nog steeds onduidelijk of deze associatie een direct of indirect effect is van Tuina of andere factoren. Toekomstig onderzoek kan experimentele strategieën gebruiken zoals gen-knockout, chemogenetische remming of antagonistblokkade om verder te verifiëren of Tuina het slapeloosheidsgedrag verbetert door de expressie van Orexin-A te reguleren, en zo het causale mechanisme te verduidelijken. Ten slotte stelde deze studie geen schijnoperatie of placebo-interventie controlegroep vast. Deze studie heeft dit echter meegenomen tijdens het ontwerp, en alle groepen dieren kregen hetzelfde niveau van grijp- en fixatieoperaties, die tot op zekere hoogte werden gecontroleerd voor de invloed van niet-specifieke stressfactoren. Daarnaast werden de frequentie, intensiteit en actieroute van het Tuina-programma in deze studie gestandaardiseerd op basis van voorlopige experimenten om consistentie en reproduceerbaarheid van de interventie te waarborgen. Toekomstig onderzoek moet zich richten op het ontwikkelen van rigoureuze controlemethoden, zoals het gebruik van niet-contactsimulatie of minimale tactiele stimulatie, om de specifieke effecten van Tuina-operaties te verduidelijken.

Belangrijke stappen die cruciaal zijn voor het succes van dit protocol zijn: ten eerste, strikte controle van de watertemperatuur en platformafmetingen in de aangepaste meervoudige platform wateromgevingsmethode; ten tweede, pre-experimentele titratie van de subdrempel pentobarbitale natriumdosis; ten derde, standaardisatie van Tuina-manipulatieparameters (frequentie van 5–7 cycli/min, tegen de klok in en dan met de klok mee voor 5 minuten elk) en training van de operator; en ten vierde, snelle bevriezing van hypothalamisch weefsel in vloeibare stikstof, gevolgd door RNase-vrije behandeling om de stabiliteit van Orexin-A mRNA te waarborgen.

Mogelijke aanpassingen zijn onder andere: ten eerste de ontwikkeling van een geautomatiseerd mechanisch Tuina-apparaat om de variabiliteit tussen operators te verminderen; ten tweede het gebruik van EEG/EMG-telemetrie ter vervanging van de pentobarbitale natriumslaaptest, waardoor continue monitoring van de slaapfase mogelijk is; en ten derde de combinatie van chemogenetische of optogenetische benaderingen om de noodzaak van orexineneuronen te verifiëren voor het bemiddelen van de effecten van Tuina.

De reproduceerbaarheid van dit protocol wordt ondersteund door: gedetailleerde operationele trajecten en parameters, het gebruik van een positieve controlegeneesmiddel, dual-dimensionale detectie op zowel eiwit- als mRNA-niveau, en rigoureuze statistische rapportage. De praktische bruikbaarheid ervan komt tot uiting in de volgende aspecten: lage apparatuurvereisten voor gedragstests zonder de noodzaak van dure telemetriesystemen; een totale experimentele cyclus van slechts 8 dagen voor modellering en 14 dagen voor Tuina-interventie, die binnen 4 weken wordt afgerond, wat goed aansluit bij de financieringscycli en laboratoriumschema's van de meeste routinematige onderzoeksprojecten en snelle gegevensverzameling en methodologische validatie mogelijk maakt. Bovendien wordt het Tuina-manipulatieprotocol duidelijk gekwantificeerd in termen van operationeel traject (CV15 → CV4 → bilaterale GB26 → terugkeer naar CV15), frequentie (5–7 cycli/min), richtingsvolgorde (tegen de klok in gevolgd door met de klok mee) en duur (10 minuten per sessie). Deze specificaties stellen verschillende operators in staat de techniek na korte training te beheersen, waardoor het risico op slechte reproduceerbaarheid door individuele verschillen die vaak worden gezien in handmatige manipulatiestudies worden verminderd.

Tijdens de implementatie van dit protocol kunnen verschillende veelvoorkomende problemen ontstaan en worden passende probleemoplossingsmaatregelen aanbevolen. Ten eerste kunnen ratten van het platform vallen tijdens de aangepaste procedure in de wateromgeving met meerdere platforms. Dit wordt meestal veroorzaakt door een extreem glad platformoppervlak. De oplossing is om het platformoppervlak licht te ruw met fijn schuurpapier om de wrijving te vergroten. Daarnaast mag elke container slechts één rat huisvesten om wederzijdse verstoring te voorkomen. Ten tweede kan de slaaptest voor pentobarbital natrium geen significante verschillen tussen groepen laten zien. De oplossing is om de minimale subdrempeldosis te hertitreren in stappen van 5 mg/kg tijdens pilotexperimenten met een aparte cohort dieren (3–4 per groep). Injecties moeten elke dag op hetzelfde tijdstip worden uitgevoerd (bij voorkeur tussen 9:00 en 11:00 uur) om circadiane variatie te minimaliseren. Ten derde kunnen ratten worstelen of vocaliseren tijdens Tuina-manipulatie, wat meestal wijst op overmatig geweld of onjuiste fixatie. De operator moet de uitgeoefende kracht verminderen totdat de rat kalm blijft zonder te worstelen. Voorafgaande training met een drukgevoelige dummy wordt aanbevolen om de krachttoepassing te standaardiseren. De rat moet op rug worden geplaatst met alle vier de ledematen voorzichtig maar stevig vastgezet, zodat de buik volledig zichtbaar is. Ten vierde ontstaat grote variabiliteit in het percentage Orexin-A positieve cellen binnen dezelfde experimentele groep vaak door inconsistente doorsnedevlakken over de hypothalamus, subjectieve telbias of batch-tot-batch variatie in kleuring. De aanbevolen oplossing is om het anatomische niveau te standaardiseren door te verwijzen naar een rattenhersenatlas (bijv. Paxinos & Watson), waarbij coronale doorsneden van bregma –1,8 mm tot –3,3 mm worden verzameld voor hypothalamische analyse. Twee onafhankelijke waarnemers die blind zijn voor groepstoewijzing moeten celtelling uitvoeren, en de gemiddelde waarde moet worden gebruikt. Alle monsters voor een gegeven uitkomstmaat moeten in dezelfde batch worden gekleurd, en semi-geautomatiseerde drempelanalyse met ImageJ wordt aangemoedigd om de subjectiviteit van de waarnemer te verminderen.

Concluderend stelde deze studie een gestandaardiseerd Tuina-interventieprotocol en een evaluatiesysteem met meerdere niveaus vast in een primair slapeloosheidsmodel. Het levert overtuigend bewijs dat Tuina slapeloosheidsgedrag verbetert, mogelijk via een mechanisme waarbij hypothalamische Orexin-A overexpressie wordt onderdrukt. Dit methodologisch kader biedt niet alleen een reproduceerbaar paradigma voor het onderzoeken van de centrale mechanismen van Tuina, maar biedt ook een referentie voor mechanistische studies van andere niet-farmacologische interventies voor slaapstoornissen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
5x All-In-One RT MasterMix	abm	G492	cDNA-synthese
Acetylcholine (Ach)	Nanjing Jiancheng	A105-1	ELISA-reagens
Adhesion microscope slides	Jiangsu ShiTai Experimental Equipment Co., Ltd.	N/A	Weefselsectiemontage
Agarose	Sangon Biotech (Shanghai)	A811BA0014	Gelelektroforese
Anhydrous ethanol	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.	N/A	Weefseldroger
Antibody diluent	Beijing ZSGB-Bio Technology Co., Ltd.	ZLI-9029	Primaire antilichaamverdunning
Basket	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	N/A	Glijplaathouder
Citrate powder	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	MVS-0066	Antigeenherstelbuffervoorbereiding
Coverslip	Jiangsu ShiTai Experimental Equipment Co., Ltd.	N/A	Microscopie
DAB chromogen kit	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	DAB-1031	Chromogene detectie
DEPC	Sangon Biotech (Shanghai)	B417BA0001	RNase-vrije behandeling
Dopamine (DA)	Wuhan Huamei Bioengineering Co., Ltd.	CSB-E08660r	ELISA-reagens
Electrophoresis cell	Beijing Liuyi Instrument Factory	DYCZ-21	Gelelektroforese
Electrophoresis power supply	Beijing Liuyi Instrument Factory	DYY-6C	Gelelektroforese
EvaGreen Express 2× qPCR MasterMix-Low Rox	abm	G891 / MasterMix-EL	qPCR-reagens
Gamma-aminobutyric acid (γ-GABA)	AMOKE	AE91068Ra	Neurotransmitter ELISA-reagens
Gel imaging system	Shanghai Tanon	2500	Geldocumentatie
H2O2 (30%)	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.	N/A	Endogene peroxidaseblokkade
Hematoxylin staining solution	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	CTS-1097	Counterstain
High-speed refrigerated centrifuge	Shanghai Lishen Scientific Equipment Co., Ltd.	Nefuqe 15R	Centrifugeren van monsters
Histamine (HIS)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	EH171-1	ELISA-reagens
Hot air drying oven	Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.	DHG-serie	Drogen van monsters
IHC staining humidity chamber	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	BOX-1001	Vochtige incubatiekamer
Immunohistochemistry staining kit	Beijing ZSGB-Bio Technology Co., Ltd.	SP9000	IHC-kleuring
Incubator	Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.	DNP-9272	Temperatuurgestuurde incubatie
Induction cooker	Guangdong Midea Living Electric Manufacturing Co., Ltd.	C21-RK2101	Verwarmingsbron
Microplate reader	Bio-Rad, China	xMark	Absorbantiemeting
Microscope	Nikon	E200	Microscoopbeeldvorming
MK-4305	Meilun Bio	MB3773	Experimenteel reagens
Neutral balsam	Beijing ZSGB-Bio Technology Co., Ltd.	ZLI-9555	Montagemedium
Norepinephrine (NA)	Nanjing Jiancheng	H096	ELISA-reagens
Nucleic acid and protein quantifier	Beijing Kaiao	K5500	Nucleïnezuurkwantificering
Orexin A	Wuhan Huamei Bioengineering Co., Ltd.	CSB-E08860r	ELISA-reagens
PCR thermal cycler	Bio-Rad, USA	MyCycler Thermal Cycler	PCR-amplificatie
Phosphate-buffered saline (PBS)	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	PBS-0060/0061	Wasbuffer
Pipette	Eppendorf, Germany	Dragon lab	Vloeistofverraging
Pressure cooker	Zhejiang Supor Co., Ltd.	YW20F1	Antigeenherstel
Protein quantification kit	TransGen Biotech	DQ111-01	BCA-eiwitanalysekit
Rabbit anti-HCRT (Orexin-A) polyclonal antibody	Sangon Biotech (Shanghai)	D163595	Primair antilichaam
Real-time PCR instrument	ABI (Thermo Fisher)	QuantStudio 6 Flex	qPCR-analyse
Refrigerator	Hefei Meiling Co., Ltd.	BCD-249LCK	Monsteropslag
Serotonin (5-HT)	Wuhan Huamei Bioengineering Co., Ltd.	CSB-E08364r	ELISA-reagens
Staining jar	Generic	N/A	Container voor het kleuren van glijplaatjes
Super immunohistochemistry pen	Fuzhou Maxim Biotechnologies Co., Ltd.	PEN-0002	Hydrofobe barrièrepen
Trans2K DNA Marker	TransGen Biotech	BM101	DNA-ladder
TRIzol Reagent	Ambion	15596026	RNA-extractie
Vortex mixer	Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co., Ltd.	GL-88B	Laboratoriummixer
Xylene	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.	N/A	Deparaffinisatie