Expressie van het m6A-reader-eiwit YTHDC2 in niet-kleincellige longkanker in een Chinese klinische cohort

Samenvatting

Deze studie evalueert de expressie van YTHDC2 in niet-kleincellige longkanker met behulp van bio-informatica en qRT-PCR. Hoewel databaseanalyses wijzen op downregulatie en prognostische relevantie, toont klinische validatie geen significant verschil aan. De bevindingen benadrukken inconsistenties, wat duidt op een beperkte diagnostische nauwkeurigheid en de noodzaak voor verdere validatie vóór klinische toepassing.

Samenvatting

Niet-kleincellig longcarcinoom (NSCLC) blijft wereldwijd een belangrijke oorzaak van kankergerelateerde mortaliteit, waarbij slechts beperkte biomarkers beschikbaar zijn voor vroege diagnose en prognose. De N6-methyladenosine (m6A) RNA-modificatie en de bijbehorende reader-eiwitten, zoals YTHDC2, spelen een cruciale rol bij genregulatie en tumorigenese. Deze studie beoogt het expressieprofiel van YTHDC2 in NSCLC-weefsels te evalueren middels bio-informatica en kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR), de relatie tussen YTHDC2 en clinicopathologische kenmerken te beoordelen en de potentiële klinische en biologische relevantie voor toekomstig onderzoek te verkennen. Genexpressie- en overlevingsgegevens uit databases werden geanalyseerd op prognostische nauwkeurigheid. De expressie van YTHDC2 werd gekwantificeerd in NSCLC-weefsels binnen een Chinese klinische cohort en de clinicopathologische kenmerken werden geanalyseerd. Analyses van publieke databases toonden aan dat YTHDC2 downgereguleerd was in NSCLC-weefsels (p < 0,05) en geassocieerd was met de overleving van patiënten, hoewel de prognostische prestatie gering was (AUC ≈ 0,5). qRT-PCR-analyse van 19 gepaarde tumor- en aangrenzende normale weefsels toonde geen statistisch significant verschil (p = 0,537) in YTHDC2-expressie tussen kankercellen en aangrenzende weefsels. In zijn geheel suggereren de analyses van publieke databases dat YTHDC2 mogelijk downgereguleerd is en een potentiële prognostische relevantie heeft bij NSCLC, maar onafhankelijke klinische validatie in onze cohort bevestigde geen significante differentiële expressie. Deze bevindingen benadrukken de aanzienlijke heterogeniteit tussen grootschalige datasets en real-world cohorts, wat aangeeft dat YTHDC2 waarschijnlijk niet als betrouwbare op zichzelf staande diagnostische of prognostische biomarker kan dienen en mogelijk integratie met aanvullende moleculaire markers vereist voor klinische toepasbaarheid.

Inleiding

Niet-kleincellige longkanker (NSCLC), waaronder plaveiselcelcarcinoom en adenocarcinoom vallen, is de meest gediagnosticeerde vorm van longkanker en een belangrijke oorzaak van kankersterfte wereldwijd¹. Mondiale kankerstatistieken tonen aan dat longkanker een van de belangrijkste oorzaken is van sterfte door kanker². Recente ontwikkelingen in diagnostiek, chirurgie, radiotherapie en moleculaire doelgerichte therapie hebben de prognose van NSCLC niet significant verbeterd, omdat de primaire diagnose vaak in een laat stadium wordt gesteld en de ziekte in de vroege stadia vaak asymptomatisch is³. Dit onderstreept de noodzaak van nieuwe biomarkers om NSCLC-patiënten te identificeren, de prognose te bepalen en de effectiviteit van de behandeling te beoordelen.

m6A is de eerste geïdentificeerde en meest voorkomende RNA-modificatie in eukaryoten en is betrokken bij RNA-stabiliteit, translatie en transcriptie⁴. m6A-modificaties zijn dynamisch en omkeerbaar, gefaciliteerd door methyltransferases (writers), demethylases (erasers) en specifieke bindeiwitten (readers)⁵. Hiervan moduleert YTHDC2, een belangrijk m6A-reader-eiwit, de RNA-stabiliteit en de translatiesnelheid⁶. Recente studies geven aan dat YTHDC2 betrokken is bij de regulatie van meerdere kankertypen, hetzij door celgroei en invasie te onderdrukken, of door celdood te induceren⁷. Onderzoeken hebben ook de klinische relevantie van andere m6A-reader-eiwitten, waaronder YTHDF1, YTHDF2 en YTHDC1, benadrukt bij de progressie van longkanker, immuunregulatie en prognose, wat het belang onderstreept van het systematisch evalueren van individuele m6A-readers in onafhankelijke patiëntcohorten^8,9,10. Bij NSCLC zijn er significant lage niveaus van YTHDC2, wat geassocieerd is met hoge tumorstadia, lymfekliermetastasen en een slechte prognose voor patiënten, wat erop wijst dat het een anti-tumorfactor zou kunnen zijn¹¹. In vitro- en in vivo-experimenten tonen ook aan dat een hoge expressie van YTHDC2 celproliferatie en metastase bij longkanker remt⁷.

In deze studie werd de regulatie van YTHDC2 in NSCLC onderzocht via geïntegreerde computationele analyses en experimentele validatie via qRT-PCR. Ook de relatie tussen de expressie van YTHDC2 en clinicopathologische kenmerken en de prognose van de patiënt werd onderzocht. Ondanks toenemend bewijs uit openbare databases dat wijst op dysregulatie van YTHDC2 in NSCLC, hebben gepubliceerde studies tegenstrijdige bevindingen gerapporteerd over de omvang en klinische significantie van deze dysregulatie, en onafhankelijke validatie in goed gekarakteriseerde klinische cohorten uit de praktijk, met name in Aziatische populaties, blijft beperkt. Bovendien steunden de meeste eerdere studies hoofdzakelijk op openbare transcriptomische datasets of experimentele modellen, waarbij relatief weinig studies bioinformatische bevindingen integreerden met onafhankelijke klinische validatie. Door grootschalige openbare transcriptomische analyses te combineren met onafhankelijke qRT-PCR-validatie in een Chinese klinische cohort, beoogde deze studie de reproduceerbaarheid van eerdere bevindingen te beoordelen en de translationele kloof tussen analyses van openbare databases en klinische monsters uit de praktijk te overbruggen. Daarom was het doel van deze studie om de expressie van YTHDC2 systematisch te evalueren met behulp van geïntegreerde bioinformatische en klinische validatiebenaderingen, en om de potentiële biologische en klinische relevantie ervan in NSCLC te beoordelen. Er werd verondersteld dat de expressie van YTHDC2 gedysreguleerd is in NSCLC, en dat de integratie van bioinformatische analyses met onafhankelijke klinische validatie een betrouwbaardere beoordeling van de diagnostische en prognostische significantie zou bieden dan beide benaderingen afzonderlijk.

Protocol

De studie werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van de Hainan Medical University (goedkeuringsnummer HMC1984.24) en was in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki (zoals herzien in 2013).

Studiedeelnemers

Er is een studie uitgevoerd onder 50 longkankerpatiënten die tussen 2017 en 2024 werden gediagnosticeerd in het Sanya Central Hospital in de provincie Hainan, waarbij de Chinese Medical Association Clinical Guidelines for the Diagnosis and Treatment of Lung Cancer (2024 editie) werden gehanteerd. De CSCO-stadiëring (2024) werd afgestemd op de AJCC 8e editie voor vergelijkbaarheid tussen studies, zoals gevalideerd in Chinese cohorten¹², waarbij twee onafhankelijke oncologische beoordelingen werden uitgevoerd om consistentie te waarborgen. Het proces van patiëntselectie, de beschikbaarheid van weefsel, de beoordeling van de RNA-kwaliteit en de uiteindelijke inclusie van monsters voor qRT-PCR-analyse zijn samengevat in Figuur 1.

Studiegegevens

In deze studie werd bio-informatica gebruikt om de expressieniveaus van YTHDC2 in NSCLC en de relatie daarvan met clinicopathologische kenmerken te analyseren, wat inzicht biedt in potentiële mechanismen. De bio-informatische analyses werden uitsluitend uitgevoerd met gebruik van publiek toegankelijke RNA-sequencinggegevens van The Cancer Genome Atlas (TCGA), inclusief longadenocarcinoom (LUAD), plaveiselcelcarcinoom van de long (LUSC) en overeenkomstige normale longweefselmonsters die zijn gedownload via het GDC Data Portal (https://portal.gdc.cancer.gov/). De gedownloade dataset bevatte RNA-sequencing expressiegegevens samen met beschikbare klinische variabelen (patiënt-identifier, monster-identifier, leeftijd, geslacht, pathologisch stadium, overlevingsstatus en totale overlevingstijd) voor in aanmerking komende TCGA-LUAD en TCGA-LUSC gevallen. Monsters waarvoor geen genexpressie- of overlevingsinformatie beschikbaar was, werden uitgesloten van de daaropvolgende overlevings- en ROC-analyses. De in deze studie gebruikte dataset is opgenomen als Supplementary File 1. Voor de bio-informatische analyses zijn geen klinische monsters gebruikt die in het Sanya Central Hospital zijn verzameld. Gedetailleerde procedures voor de GEPIA-, Kaplan–Meier Plotter- en survivalROC-analyses worden beschreven in de onderstaande sectie Bio-informatische analyse. De volledige bio-informatische workflow, inclusief data-acquisitie, preprocessing, genexpressieanalyse, overlevingsanalyse en ROC-analyse, is samengevat in Figuur 2.

Inclusie- en exclusiecriteria

De in- en uitsluitingscriteria van de patiënten worden gepresenteerd in Tabel 1. Een poweranalyse met behulp van software voor statistische poweranalyse bepaalde dat ten minste 26 gevallen per groep een power van 80% zouden bieden om een matige effectgrootte te detecteren (d = 0.8, α = 0.05, tweezijdig). Hoewel de initiële werving gericht was op 50 paren in de longkankergroep, omvatte de uiteindelijke qRT-PCR analyse 30 tumorstalen en 19 stalen van aangrenzend normaal weefsel na uitsluiting op basis van weefsel- of RNA-kwaliteit. Deze afname in steekproefomvang weerspiegelt klinische beperkingen in de praktijk en benadrukt het belang van RNA-integriteit en weefselbeschikbaarheid in translationele studies. Bij n = 19 voor vergelijkingen is de minimaal detecteerbare effectgrootte d = 1.0 (80% power, α = 0.05). Hiermee was het experiment voldoende gepowered om grote, maar geen kleine tot matige verschillen in de expressie van YTHDC2 te detecteren.

Weefselmonsters en kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR)

De pathologische diagnoses werden in een dubbelblind onderzoek vastgesteld door twee verschillende pathologen. De tumorzuiverheid werd geschat door pathologen (>70% maligne cellen) en bevestigd via ESTIMATE (TCGA). Aanliggend normaal weefsel werd macro-gedissecteerd om stromale contaminatie te minimaliseren. De histologische typen longkanker omvatten longadenocarcinoom en plaveiselcelcarcinoom, met 26 gevallen van longadenocarcinoom en 4 gevallen van plaveiselcelcarcinoom. De klinische stadiëring van de 50 longkankerpatiënten werd uitgevoerd volgens de stadiëringscriteria zoals beschreven in de “Chinese Medical Association Clinical Guidelines for Lung Cancer (2024 Edition)”. Pathologisch bevestigde NSCLC-monsters (n = 50) waren representatief voor de typische klinische distributies (zie Tabel 2). Van de 50 aanvankelijk opgenomen patiënten voldeden 30 tumorweefselmonsters en 19 bijbehorende monsters van aanliggend normaal weefsel aan de RNA-kwaliteitscriteria. Omdat gepaarde statistische analyse matchende monsters van dezelfde patiënt vereist, werd de vergelijking van de expressie in tumorweefsel versus aanliggend normaal weefsel uitgevoerd met de 19 beschikbare matchende paren. Deze klinische monsters werden uitsluitend gebruikt voor experimentele validatie via qRT-PCR en werden onafhankelijk geanalyseerd van de publieke TCGA-datasets die werden gebruikt voor de bioinformatische analyse. Deze geselecteerde monsters werden direct na pathologische bevestiging verwerkt en gehanteerd onder RNase-vrije omstandigheden voorafgaand aan de RNA-extractie. Deze subset weerspiegelt de gevallen waarin zowel een adequate weefselhoeveelheid als hoogwaardig totaal RNA (RNA integrity number, RIN >7.0) verkregen konden worden. De concentratie en zuiverheid van het totaal RNA werden gemeten vóór de reverse transcriptie, en alleen monsters met een adequate RNA-kwaliteit (RIN >7.0) werden opgenomen voor downstream analyse. Gelijke hoeveelheden totaal RNA werden reverse-getranscribeerd naar complementair DNA (cDNA) volgens het protocol van de fabrikant voorafgaand aan de kwantitatieve PCR. Dit proces waarborgde de validiteit van de geanalyseerde genexpressiedata. De qRT-PCR-experimenten werden uitgevoerd op een real-time PCR thermocycler met behulp van een probe-gebaseerde kwantitatieve PCR-assay. Alle reacties werden in triplikaat uitgevoerd, samen met no-template controls om de analytische reproduceerbaarheid te garanderen. PCR-amplificatie werd uitgevoerd onder de volgende cycleringscondities: een initiële enzymactivatie/-denaturatiestap bij 95°C gedurende 10 min, gevolgd door 40 cycli van denaturatie bij 95°C gedurende 15 s en annealing/extensie bij 60°C gedurende 60 s. Fluorescentiesignalen werden verzameld aan het einde van elke amplificatiecyclus. Alle reagentia en verbruiksartikelen werden betrokken van commerciële leveranciers (zie Tabel van Materialen). De primer- en probe-sequenties gebruikt in qRT-PCR zijn opgenomen in Tabel 3.

Bioinformatica-analyse

GEPIA-databaseanalyse van YTHDC2-genexpressie

De GEPIA-database werd gebruikt om de expressie van YTHDC2 in NSCLC te analyseren. De GEPIA-webserver (http://gepia.cancer-pku.cn/) werd via een webbrowser benaderd. De module Expression DIY werd geselecteerd, het gensymbool "YTHDC2" werd ingevoerd, de LUAD- en LUSC-datasets werden geselecteerd, de standaard normalisatieparameters werden behouden en boxplots van de differentiële expressie werden direct via de GEPIA-interface gegenereerd. Statistische significantie werd gedefinieerd als p < 0,05.

Kaplan-Meier plotter database voor overlevingsanalyse van longkankerpatiënten

In deze studie werd de relatie tussen de expressie van YTHDC2 en de prognose bij longkankerpatiënten geanalyseerd met behulp van de Kaplan-Meier Plotter-database. De dataset voor longkanker werd geselecteerd, het gensymbool "YTHDC2" werd ingevoerd, de automatisch geselecteerde optie voor de beste afkapwaarde (best cutoff) werd toegepast, en Kaplan-Meier-curves voor de algehele overleving en de overleving na progressie werden gegenereerd met de standaardanalyse-instellingen. Patiënten werden automatisch gestratificeerd in groepen met een hoge en lage expressie op basis van de optimale afkapwaarde zoals bepaald door het Kaplan-Meier Plotter-platform, en hazard ratio's met de bijbehorende 95% betrouwbaarheidsintervallen werden gegenereerd met de standaardinstellingen van het platform.

Het uitvoeren van R-pakketten in R-software voor het plotten van ROC-curves

RNA-sequencing expressiedata en de bijbehorende klinische metadata voor in aanmerking komende TCGA-LUAD en TCGA-LUSC gevallen werden gedownload van het GDC Data Portal. De gedownloade datasets werden samengevoegd op basis van de patiëntidentificatie en geïmporteerd in R voor verdere analyses. Het survivalROC-pakket werd gebruikt om tijdsafhankelijke ROC-curven te genereren voor voorspellingsmomenten van 1, 3 en 5 jaar, en de bijbehorende area under the curve (AUC) waarden werden berekend om de prognostische prestatie van YTHDC2-expressie te evalueren. Alleen TCGA-LUAD en TCGA-LUSC patiënten met beschikbare RNA-seq expressie- en overlevingsinformatie werden opgenomen in de survival ROC-analyse. De lokale klinische cohort werd niet gebruikt voor overlevingsvoorspelling omdat langetermijnfollow-upgegevens niet beschikbaar waren.

Tissue-expressie van YTHDC2 via qRT-PCR

Om de genexpressieniveaus te analyseren, werd qRT-PCR uitgevoerd. Gelijke volumes cDNA werden aan elke reactie toegevoegd volgens de door de fabrikant aanbevolen reactiecondities. Amplificatie werd uitgevoerd met behulp van een probe-gebaseerde kwantitatieve PCR-assay, en fluorescentiegegevens werden automatisch verzameld aan het einde van elke amplificatiecyclus. Kort samengevat bestond het RNA-extractieproces uit verschillende stappen, waaronder monsterpreparatie, deparaffinisatie, verwijdering van resterende vloeistof, digestie met proteinase K, incubatie, centrifugatie, DNase-behandeling, toevoeging van DNase I en ethanolprecipitatie. Het monster werd vervolgens gebonden aan een silica-gebaseerde RNA-zuiveringskolom en gecentrifugeerd bij 8,000 × g gedurende 30 s. De kolom werd vervolgens gewassen met wasbuffer 1, wasbuffer 2 en wasbuffer 2 verdund met ethanol, en gedroogd bij 13,000 × g gedurende 2 min. Het RNA werd vervolgens geëlueerd door 70 µL RNase-vrij water toe te voegen aan het centrum van het kolommembraan, gevolgd door centrifugatie bij 13,000 × g gedurende 1 min. Elk primerpaar vertoonde een enkel amplificatieproduct, wat werd bevestigd door smeltkrompanalyse voordat de relatieve genexpressie werd berekend. De primerefficiëntie (90–110%) werd gevalideerd met behulp van standaardcurves voorafgaand aan de monsteranalyse. Smeltkrompanalyses bevestigden de aanwezigheid van enkelvoudige ampliconen en de afwezigheid van primerdimeren. De relatieve YTHDC2-expressie werd berekend met de 2^-ΔCt-methode, waarbij Ct-waarden werden genormaliseerd ten opzichte van het endogene referentiegen GAPDH. Omdat expressiewaarden werden gepresenteerd als genormaliseerde expressieniveaus in plaats van fold-changes ten opzichte van een kalibratiemonster, worden de resultaten gerapporteerd als 2^−ΔCt-waarden. GAPDH werd geselecteerd als housekeepinggen omdat de expressie ervan een minimale variabiliteit vertoonde (CV < 5%) vergeleken met de geteste alternatieven (ACTB, CV = 12%; 18S rRNA, CV = 18%), wat consistent is met de selectiecriteria voor referentiegenen in m6A-studies.

Statistische analyse

Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van statistische software, inclusief het maken van grafieken en schema's. Om kwantitatieve en categorische gegevens over de expressie van het YTHDC2-gen bij NSCLC-patiënten te analyseren, werd R-software gebruikt voor bio-informatica-analyses en het genereren van ROC-curves. ROC-curves en de AUC werden gebruikt om de diagnostische prestaties van de YTHDC2-expressie bij het voorspellen van overleving te evalueren. Voor regressiegebaseerde analyses werden, waar van toepassing, effectschattingen (odds ratio's) met de bijbehorende 95% betrouwbaarheidsintervallen gerapporteerd. De Wilcoxon signed-rank test werd gebruikt om de YTHDC2-expressie tussen gepaarde tumor- en aangrenzende normale weefselmonsters te vergelijken, terwijl Pearson-correlatieanalyse werd gebruikt om het verband tussen de YTHDC2-expressie en clinicopathologische kenmerken te beoordelen. Correlatiecoëfficiënten (r) en de bijbehorende p-waarden werden gerapporteerd. Omdat de qRT-PCR-gegevens bestonden uit gepaarde tumor- en aangrenzende normale weefselmonsters van dezelfde patiënten en de genexpressiegegevens niet normaal verdeeld waren, werd de Wilcoxon signed-rank test gebruikt om de YTHDC2-expressieniveaus tussen gepaarde weefsels te vergelijken. Deze test gaat niet uit van een normale verdeling van de gegevens en wordt veelvuldig gebruikt voor scheve biologische data. Alle statistische tests waren tweezijdig, en p <0,05 werd beschouwd als statistisch significant. Continue variabelen werden vóór de analyse getoetst op normaliteit. Continue variabelen worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie of mediaan (interkwartielafstand), naar gelang de situatie.

Resultaten

Expressie van het YTHDC2-gen in tumoren op basis van de TCGA-database

Figuur 3 illustreert de associatie tussen NSCLC en YTHDC2 door de expressieniveaus van YTHDC2 in verschillende kankersoorten te onderzoeken met behulp van de GDC-tool in de TCGA-database.

Expressie van het YTHDC2-gen in NSCLC in de GEPIA-database

483 weefselmonsters van longadenocarcinoom, 347 monsters van normaal longweefsel, 486 weefselmonsters van plaveiselcelcarcinoom van de long en 338 monsters van normaal longweefsel werden verkregen via aanvullende screening van de expressieniveaus van YTHDC2 in longadenocarcinoom (LUAD) en plaveiselcelcarcinoom van de long (LUSC) binnen de GEPIA-database. Door middel van statistische analyses werd vastgesteld dat zowel weefsels van longadenocarcinoom als van plaveiselcelcarcinoom van de long aanzienlijk lagere niveaus van YTHDC2-expressie vertoonden dan normaal longweefsel (p < 0,05), zoals geïllustreerd in Figuur 4.

GEPIA-analyse van YTHDC2-expressie over pathologische stadia

De GEPIA-database (Gene Expression Profiling Interactive Analysis) werd gebruikt om een stadiumplot te genereren ter evaluatie van de differentiële expressie van YTHDC2 over de verschillende stadia van NSCLC. Zoals getoond in Figuur 5, werden er geen statistisch significante verschillen in YTHDC2-expressie waargenomen over de pathologische stadia van NSCLC (p = 0,644).

Kaplan-Meier-analyse van YTHDC2 en overleving bij longkanker

De Kaplan-Meier Plotter-database werd gebruikt om een Kaplan-Meier overlevingsanalyse van het YTHDC2-gen uit te voeren. Volgens de resultaten hadden patiënten met een hoge YTHDC2-expressie een significant hogere algehele overleving (OS) dan patiënten met een lage expressie (p < 0,05). Zoals getoond in Figuur 6A (OS), hadden longkankerpatiënten die hogere niveaus van YTHDC2 tot expressie brachten een betere prognose, en dit verschil was statistisch significant (p < 0,05). Volgens Figuur 6B (PPS) had de groep met een hoge YTHDC2-expressie een betere prognose dan de groep met een lage expressie in de dataset voor overleving na progressie (PPS); het verschil was statistisch significant (p < 0,05).

Overlevingspercentage-voorspellingsmodel voor YTHDC2

Tijdsafhankelijke ROC-analyse op basis van TCGA RNA-seq expressie- en overlevingsgegevens onthulde een beperkte voorspellende waarde van enkel YTHDC2-expressie voor de overleving bij NSCLC, met AUC-waarden van 0,50 (95% BI: 0,38-0,62), 0,51 (95% BI: 0,39-0,63), 0,52 (95% BI: 0,40-0,64) en 0,52 (95% BI: 0,39–0,65) na respectievelijk 1, 3, 5 en 8 jaar (Figuur 7). Alle betrouwbaarheidsintervallen van de AUC bevatten 0,5, wat wijst op een prestatie die gelijkwaardig is aan toeval. Deze bevindingen geven aan dat YTHDC2-expressie alleen geen onderscheidend vermogen heeft voor overlevingsvoorspelling en niet als op zichzelf staande prognostische biomarker moet worden beschouwd. Integratie met clinicopathologische variabelen of multi-gen signaturen kan de voorspellende prestaties verbeteren.

YTHDC2-expressie in kankertegenovergesteld aan normale weefsels via qRT-PCR

De expressie van het YTHDC2-gen werd onderzocht in zowel maligne als aangrenzende normale weefsels van NSCLC-patiënten met behulp van qRT-PCR. De genormaliseerde YTHDC2-expressie (2^−ΔCt) was 3,24 ± 2,34 in maligne weefsels en 3,60 ± 1,70 in nabijgelegen normale weefsels. Er was geen significant verschil in YTHDC2-expressie tussen 19 gepaarde NSCLC-tumorweefsels en de bijbehorende aangrenzende normale weefsels (p = 0,537), zoals weergegeven in Figuur 8. Hoewel bio-informatica-analyse van grote datasets wees op een significante downregulatie van YTHDC2 bij NSCLC, toonde qRT-PCR in onze cohort geen significant verschil, wat wijst op potentiële discrepanties als gevolg van cohortgrootte, monsterheterogeniteit en technische variabiliteit. Daarnaast geeft de lage AUC (0,5) aan dat YTHDC2 alleen geen diagnostische of prognostische nauwkeurigheid bezit.

YTHDC2-expressie en klinisch-pathologische kenmerken bij NSCLC

Deze studie omvatte 50 personen met NSCLC. Er waren 32 mannelijke patiënten (64,00%) en 18 vrouwelijke patiënten (36,00%), met een gemiddelde leeftijd van 63,10 ± 9,85 jaar. De leeftijd varieerde van 37 tot 86 jaar. Van de patiënten hadden er 25 in het verleden gerookt en 25 hadden nog nooit gerookt. Wat betreft de pathologische typen waren er negen gevallen van plaveiselcelcarcinoom (18,00%) en eenenveertig gevallen van longadenocarcinoom (82,0%). Op basis van de CSCO-klinische stadiëring bevonden 22 patiënten zich in stadium III–IV (44,00%) en 28 patiënten in stadium I–II (56,00%). Vierentwintig patiënten hadden geen lymfekliermetastasen, terwijl zesentwintig personen (54,00%) dit wel hadden. Negen patiënten hadden slecht gedifferentieerde kankers (18,00%), terwijl 41 patiënten goed tot matig gedifferentieerde tumoren hadden (82,00%).

De associatie tussen klinisch-pathologische kenmerken en YTHDC2-expressieniveaus in NSCLC-weefsels werd onderzocht. Er werden verschillen in YTHDC2-expressie waargenomen tussen pathologische subtypen en op basis van de status van lymfekliermetastasen (p < 0,05). Omdat er echter slechts vier monsters van plaveiselcelcarcinoom beschikbaar waren, dient de vergelijking van de pathologische subtypen voorzichtig te worden geïnterpreteerd en als verkennend te worden beschouwd. Zoals getoond in Figuren 9A,B, was de YTHDC2-expressie significant hoger in plaveiselcelcarcinoom dan in longadenocarcinoom en significant hoger in NSCLC-weefsels met lymfekliermetastasen dan in weefsels zonder lymfekliermetastasen (5,70 ± 2,53 vs. 3,83 ± 0,91, p = 0,027). Omdat er echter slechts vier monsters van plaveiselcelcarcinoom waren opgenomen, dient de vergelijking tussen pathologische subtypen met voorzichtigheid te worden geïnterpreteerd en als verkennend te worden beschouwd in afwachting van validatie in grotere cohorten. Een hogere YTHDC2-expressie bij patiënten met lymfekliermetastasen kan wijzen op een potentiële associatie tussen YTHDC2 en de status van lymfekliermetastasen; deze bevinding moet echter voorzichtig worden geïnterpreteerd vanwege de beperkte steekproefgrootte en vereist validatie in grotere onafhankelijke cohorten. Leeftijd, rookgeschiedenis, CSCO-klinisch stadium en histologische differentiatie hadden daarentegen geen significante invloed op de YTHDC2-expressie (p > 0,05). Aanvullende informatie is opgenomen in Tabel 4, Tabel 5 en Figuur 9.

Binaire logistische regressie van lymfekliermetastase bij NSCLC

In overeenstemming met de correlatieanalyse was de expressie van YTHDC2 significant geassocieerd met lymfekliermetastase (p < 0,05). Met lymfekliermetastase als afhankelijke variabele en leeftijd, geslacht, rookgeschiedenis, tumorstadium, pathologisch type, YTHDC2-expressieniveau en differentiatiegraad als onafhankelijke variabelen werd een binaire logistische regressieanalyse uitgevoerd bij NSCLC-patiënten. De resultaten toonden aan dat de expressie van YTHDC2 bij NSCLC-patiënten significant geassocieerd was met lymfekliermetastase (p = 0,027, OR = 2,286, 95% CI: 1,101–4,748).

In de algemene klinische gegevens was het tumorstadium van NSCLC-patiënten statistisch significant gecorreleerd met lymfekliermetastasen (p = 0,007, OR = 27, 95% BI: 2,504-291,186). Echter, leeftijd, geslacht, rookgeschiedenis, pathologisch type en differentiatiegraad waren niet significant gecorreleerd met lymfekliermetastasen bij NSCLC (p > 0,05), zoals weergegeven in Tabel 6.

Beschikbaarheid van gegevens: De datasets die de bevindingen van deze studie ondersteunen, zijn beschikbaar in de Zenodo-repository (DOI: 10.5281/zenodo.21409961). De repository bevat de TCGA klinische metadata, monsterannotaties, specificaties voor gegevensopvraag en het analysemanifest dat is gebruikt voor de bio-informatische analyses. Aanvullende gegevens zijn op redelijk verzoek verkrijgbaar via de corresponderende auteur.

Figuur 1: Stroomdiagram van patiëntselectie en weefselinclusie voor qRT-PCR-analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Workflow van de bio-informatica-analyses die zijn uitgevoerd om de expressie van YTHDC2 en de prognostische betekenis bij NSCLC te evalueren Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Expressie van het YTHDC2-gen in de TCGA-database. De expressieniveaus van YTHDC2 in longadenocarcinoom (LUAD) en longplaveiselcelcarcinoom (LUSC) werden vergeleken met die in normaal longweefsel met behulp van RNA-sequencinggegevens verkregen uit The Cancer Genome Atlas (TCGA) via het Genomic Data Commons (GDC) Data Portal en geanalyseerd met het GEPIA-webplatform. De gegevens werden geanalyseerd via het GEPIA-platform. Statistische significantie werd bepaald met een p-waarde < 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Differentiële expressie van YTHDC2 in NSCLC op basis van GEPIA-databaseanalyse. Expressieniveaus van YTHDC2 in longadenocarcinoom (LUAD) en longplaveiscelcarcinoom (LUSC) werden vergeleken met die in normaal longweefsel met behulp van gegevens van The Cancer Genome Atlas (TCGA) en Genotype-Tissue Expression (GTEx) projecten via het GEPIA-platform. Boxplots representeren genormaliseerde genexpressieniveaus. Statistische significantie werd bepaald met een p-waarde < 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Analyse van de stadiumgewijze expressie van YTHDC2 in NSCLC met behulp van de GEPIA-database. Expressieniveaus van YTHDC2 werden geanalyseerd over verschillende pathologische stadia (I–IV) van NSCLC via het GEPIA-platform. De stadiumplot illustreert de variatie in genexpressie over de tumorstadia. Er werden geen statistisch significante verschillen in YTHDC2-expressie waargenomen tussen de stadia (p = 0,644). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Kaplan–Meier-overlevingsanalyse van YTHDC2-expressie bij NSCLC-patiënten (Kaplan–Meier Plotter). (A) Algehele overleving (OS): Kaplan–Meier-overlevingscurves die de algehele overleving vergelijken bij NSCLC-patiënten gestratificeerd in groepen met een hoge (n = 140) en lage (n = 364) YTHDC2-expressie, gebruikmakend van de optimale afkapinstelling (“auto-select best cutoff”) geleverd door de Kaplan–Meier Plotter-tool. De log-rank toets werd gebruikt om de statistische significantie te beoordelen (p = 0,0093); hazard ratio (HR) = 0,61; 95% betrouwbaarheidsinterval (CI): 0,42–0,89. Verhoogde YTHDC2-expressie is geassocieerd met een significant betere algehele overleving. (B) Overleving na progressie (PPS): Kaplan–Meier-overlevingscurves die de overleving na progressie vergelijken bij NSCLC-patiënten gestratificeerd in groepen met een hoge (n = 181) en lage (n = 296) YTHDC2-expressie, gebruikmakend van de optimale afkapinstelling (“auto-select best cutoff”) geleverd door de Kaplan–Meier Plotter-tool. De log-rank toets werd gebruikt voor statistische vergelijking (p = 4,2 × 10⁻⁵); hazard ratio (HR) = 0,63 (95% betrouwbaarheidsinterval: 0,51–0,79). Hoge YTHDC2-expressie is geassocieerd met een significant langere overleving na progressie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Voorspellingsmodel voor de overlevingskans van YTHDC2. Receiver operating characteristic (ROC)-curves die de voorspellende nauwkeurigheid van YTHDC2 voor de totale overleving bij TCGA-LUAD- en TCGA-LUSC-patiënten evalueren met beschikbare RNA-seq expressie- en overlevingsgegevens op tijdstippen van 1, 3, 5 en 8 jaar. AUC-waarden: 1 jaar = 0,50, 3 jaar = 0,51, 5 jaar = 0,52 en 8 jaar = 0,52. De gestreepte diagonale lijn geeft toeval aan (AUC = 0,5). Analyse uitgevoerd met het survival ROC-pakket in R. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: YTHDC2-expressie in gepaarde NSCLC-tumorweefsels en aangrenzende normale weefsels gemeten via qRT-PCR. De relatieve YTHDC2-expressie werd berekend met de 2^–ΔCt methode en genormaliseerd naar GAPDH. Expressiewaarden representeren genormaliseerde expressieniveaus in plaats van fold-changes ten opzichte van een kalibratiecel. Statistische analyse werd uitgevoerd met de 19 beschikbare gematchte paren van tumor- en aangrenzend normaal weefsel voor gepaarde vergelijking. Gegevens worden gepresenteerd als individuele gepaarde waarnemingen met gemiddelde ± standaarddeviatie. Verschillen tussen gepaarde monsters werden geanalyseerd met de Wilcoxon-toets voor gepaarde steekproeven (p = 0,537). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9: Associatie tussen YTHDC2-expressie en clinicopathologische kenmerken bij NSCLC-patiënten. (A) YTHDC2-expressie in verschillende pathologische typen, waarbij een hogere expressie wordt gezien in plaveiselcelcarcinomen dan in adenocarcinomen (p < 0,05). (B) YTHDC2-expressie op basis van de status van lymfekliermetastasen, waarbij een hogere expressie wordt aangetoond bij patiënten met lymfekliermetastasen dan bij patiënten zonder metastasen (p < 0,05). (C) YTHDC2-expressie over verschillende histologische differentiatiegraden, zonder statistisch significant verschil (p = 0,181). (D) YTHDC2-expressie over CSCO-klinische stadia, zonder statistisch significant verschil (p = 0,08). YTHDC2-expressieniveaus werden gemeten via kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) en berekend met de 2^–ΔCt methode, genormaliseerd ten opzichte van GAPDH. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Statistische vergelijkingen werden uitgevoerd met de Wilcoxon rank-sum test. *p < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Nr.	Inclusiecriteria	Exclusiecriteria
1	Leeftijd ≥18 jaar, ongeacht het geslacht.	Diagnose van andere maligniteiten.
2	Bevestigde NSCLC-diagnose volgens de Clinical Guidelines for Lung Cancer (editie 2024) van de Chinese Medical Association.	Aanwezigheid van chronische respiratoire of cardiovasculaire aandoeningen (bijv. COPD, pulmonale hartziekte, hartfalen).
3	Beschikbaarheid van volledige klinische gegevens, inclusief demografische gegevens, serumtumormarkers en contrast-CT-beelden van de thorax, met ondertekende geïnformeerde toestemming.	Ernstige orgaandysfunctie, inclusief nierinsufficiëntie (eGFR <30 ml/min/1.73m²) of levercirrose.
4	Behandelingsnaïve patiënten zonder voorafgaande tumorgerichte therapieën.	Speciale populaties, waaronder zwangere vrouwen of vrouwen die borstvoeding geven (bevestigd door β-hCG-testen waar van toepassing).
5	Beschikbaarheid van adequate tumor- en/of aangrenzende weefselmonsters geschikt voor moleculaire analyse.	Slechte monsterkwaliteit, inclusief onvoldoende weefsel of gedegradeerd RNA (bevestigd door beoordeling door een patholoog).

Tabel 1: In- en exclusiecriteria voor NSCLC-patiënten in de studie

Weefseltype	Geanalyseerde gepaarde monsters (n)	Relatieve expressie (Gemiddelde ± SD)
Tumorweefsel	19	3.24 ± 2.34
Gematched aangrenzend normaal weefsel	19	3.60 ± 1.70

Tabel 2: Expressie van YTHDC2 in gepaarde NSCLC-tumor- en aangrenzende normale weefsels. De relatieve expressie van YTHDC2 werd gemeten met de 2^–ΔCt methode en genormaliseerd naar GAPDH. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). De statistische vergelijking van de 19 gematchte paren tumor- en aangrenzend normaal weefsel werd uitgevoerd met de Wilcoxon-toets voor gepaarde steekproeven (p = 0,537).

Doelgen	Primer/Sonde	Volgorde (5′→3′)
YTHDC2	Voorwaarts (F)	CCTGTCACCAATAAAGAGCG
	Omgekeerd (R)	CACTGGAATCTGAGGTATGCC
	Sonde (P)	AGCAAGACAAGTGGGCGACTCAA
GAPDH	Forward (F)	AATCCCATCACCATCTTCCAG
	Omgekeerde (R)	ATGACCCTTTTGGCTCCC
	Sonde (P)	CCAGCATCGCCCCACTTGATTTT

Tabel 3: Primer- en probe-sequenties gebruikt voor kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR). De expressie van YTHDC2 werd gekwantificeerd met behulp van TaqMan-chemie, met GAPDH als interne controle.

Kenmerk	Categorie	n	%
Pathologisch type	Adenocarcinoom	41	82
	Plaveiselcelcarcinoom	9	18
CSCO-stadiëring	I–II	28	56
	III–IV	22	44
Lymfekliermetastase	Nee	24	48
	Ja	26	52
Graad van differentiatie	Lage differentiatie	9	18
	Matige–hoge differentiatie	41	82
Leeftijd	≥60 jaar	36	72
	<60 jaar	14	28
Geslacht	Man	32	64
	Vrouw	18	36
Rookgeschiedenis	Ja	25	50
	Nee	25	50

Tabel 4: Klinische en pathologische kenmerken van NSCLC-patiënten. Gegevens worden gepresenteerd als aantallen (n) en percentages (%) op basis van de totale studiepopulatie (n = 50).

Klinicopathologische kenmerken	Groep	n	YTHDC2-expressie (Gemiddelde ± SD)	p-waarde
Weefseltype	Tumor	30	3.24 ± 2.34	0.537
	Aangrenzend normaal weefsel	19	3.60 ± 1.70
Pathologisch type	Adenocarcinoom	26	4.13 ± 1.29	0.022*
	Plaveiselcelcarcinoom	4	7.50 ± 3.41
CSCO-stadiëring	I–II	22	4.29 ± 1.94	0.08
	III–IV	8	5.05 ± 1.51
Lymfekliermetastasen	Nee	19	3.83 ± 0.91	0.027*
	Ja	11	5.70 ± 2.53
Histologische differentiatie	Matig tot goed gedifferentieerd	25	4.33 ± 1.90	0.181
	Slecht gedifferentieerd	5	5.18 ± 1.60
Leeftijd	≥60 jaar	20	4.62 ± 2.10	0.835
	<60 jaar	10	4.16 ± 1.12
Rookgeschiedenis	Ja	12	4.62 ± 2.40	0.845
	Nee	18	4.38 ± 1.40

Tabel 5: Associatie tussen YTHDC2-expressie en clinicopathologische kenmerken bij NSCLC-patiënten. YTHDC2-expressie werd gemeten via qRT-PCR en berekend met de 2^–ΔCt-methode, genormaliseerd naar GAPDH. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Groepsgroottes (n) vertegenwoordigen het aantal geanalyseerde geldige monsters. Statistische vergelijkingen tussen groepen werden uitgevoerd met de Wilcoxon rank-sum test. *p < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.

Variabele	β	Wald	p-waarde	OR	95% BI
Leeftijd (≥60 vs <60)	0.07	0.01	0.93	1.08	0.20–5.68
Geslacht (Vrouw vs Man)	0.53	0.4	0.525	1.7	0.33–8.67
Rookgeschiedenis (Ja vs Nee)	0.54	0.46	0.496	1.71	0.36–8.09
Tumorstadium (III–IV vs I–II)	3.3	7.38	0.007*	27	2.50–291.18
Differentiatie (Slecht vs Matig–goed)	–1.29	1.62	0.204	0.28	0.04–2.02
YTHDC2 expressie	0.83	4.91	0.027*	2.29	1.10–4.75

Tabel 6: Multivariabele logistische regressieanalyse van factoren geassocieerd met lymfekliermetastasen bij NSCLC-patiënten. Binaire logistische regressie werd uitgevoerd met lymfekliermetastasen als afhankelijke variabele. Odds ratio's (OR's) met 95% betrouwbaarheidsintervallen (BI) zijn weergegeven. Referentiecategorieën: leeftijd (<60 jaar), geslacht (man), rookgeschiedenis (nee), tumorstadium (I–II) en differentiatie (matig–goed). *p < 0,05 duidt op statistische significantie.

Discussie

YTHDC2, het grootste N6-methyladenosine (m6A) bindende eiwit in de YTH-familie, is uniek vanwege zijn ATP-afhankelijke RNA-helicase-activiteit, wat het onderscheidt als een belangrijke regulator van het RNA-metabolisme¹³. In tegenstelling tot andere leden van de YTH-familie komt YTHDC2 voor in zowel de nucleus als het cytoplasma, waar het de mRNA-translatie en RNA-stabiliteit reguleert¹⁴. Eerdere experimentele studies hebben aangetoond dat YTHDC2 de progressie van longadenocarcinoom (LUAD) onderdrukt door de mRNA-expressie van ADIRF en MRPL12 te remmen, apoptose te verhogen en celproliferatie en metastase te verminderen^15,16. Eerdere experimentele studies hebben ook gesuggereerd dat YTHDC2 lncRNA's zoals ZNRD1-AS1 stabiliseert om LUAD-proliferatie te onderdrukken en m6A-gemodificeerde mRNA's zoals CYLD en SLC7A11 moduleert, waardoor de NF-κB-signaleringsroute, cysteine-opname en antioxidantprocessen worden geremd, terwijl ferroptose en antikankeractiviteit worden bevorderd^17,18.

In deze studie werden de expressie en klinische significantie van het m6A-reader-eiwit YTHDC2 in NSCLC onderzocht met behulp van een integratieve aanpak die bio-informatische analyses en experimentele validatie combineert. Deze bio-informatische analyse van de TCGA- en GEPIA-databanken onthulde een significante downregulatie van YTHDC2 in NSCLC-tumorgeweven vergeleken met normaal longweefsel, waarbij een hogere YTHDC2-expressie geassocieerd was met een verbeterde algehele overleving en overleving na progressie, wat wijst op een potentiële prognostische rol. Opvallend genoeg slaagden onze qRT-PCR-experimenten met de 19 beschikbare gepaarde tumor- en aangrenzende normale weefselmonsters in de huidige cohort er niet in om een statistisch significant verschil in YTHDC2-expressie tussen tumor- en aangrenzend normaal weefsel aan te tonen. Deze discrepantie benadrukt de uitdagingen bij het vertalen van bevindingen uit grootschalige publieke datasets naar onafhankelijke klinische cohorten en onderstreept de noodzaak voor een voorzichtige interpretatie van in silico-analyses. Het begrijpen van de redenen achter deze verschillen is cruciaal voor een nauwkeurige evaluatie van het nut van YTHDC2 als biomarker en therapeutisch doelwit bij NSCLC. De focus van de huidige studie op YTHDC2 sluit aan bij de unieke helicase-activiteit ervan onder de YTH-readers¹⁹, maar recente pan-cancer analyses onthullen contextafhankelijke rollen voor andere familieleden. Zo toonden Li et al. aan dat YTHDF1/2 upregulated zijn in de meeste kankersoorten (bijv. LIHC, LUAD) en correleren met een slechte prognose, terwijl YTHDC1/2 tumor-suppressieve effecten vertonen in KIRC en BRCA²⁰. Opmerkelijk is dat de oncogene rol van YTHDF1 via Wnt/β-catenin-activatie contrasteert met de anti-metastatische functie van YTHDC2 in NSCLC, wat de noodzaak van subtype-specifieke biomarkerstrategieën benadrukt. Vergeleken met gevestigde prognostische markers (bijv. PD-L1 voor respons op immunotherapie) kan de voorspellende kracht van YTHDC2 worden vergroot door het te combineren met andere m6A-regulatoren (bijv. METTL3, YTHDF1) of immuuncheckpoint-genen, zoals gesuggereerd door pan-cancer immuuninfiltratie-analyses. Hoewel eerdere studies suggereren dat YTHDC2 de NF-κB/CYLD-route reguleert¹², werd de huidige studie beperkt door het ontbreken van validatie op eiwitniveau middels immunohistochemie of Western blotting, evenals het ontbreken van functionele validatie. Toekomstig werk zou knockdown-assays moeten combineren met m6A-sequencing om directe targets in kaart te brengen.

Eerdere analyses onthulden dat de expressie van YTHDC2 verlaagd is in NSCLC-weefsels en correleert met een slechte prognose²¹. Kaplan-Meier-analyse wees op een langere overleving bij patiënten met een hogere YTHDC2-expressie, maar ROC-curve-analyse suggereerde een beperkte voorspellende waarde voor overleving²⁰. De overlevings-ROC-analyse in de huidige studie werd uitgevoerd met gebruik van TCGA RNA-seq expressie- en overlevingsgegevens, aangezien langetermijn-follow-upinformatie niet beschikbaar was voor onze lokale klinische cohort. Belangrijk is dat de lage AUC-waarden (~0,5) die in deze studie werden waargenomen, suggereren dat de expressie van YTHDC2 onvoldoende sensitiviteit en specificiteit bezit voor klinisch gebruik als standalone biomarker²². Deze beperking stemt overeen met opkomend bewijs dat single-gene biomarkers vaak onvoldoende zijn voor complexe ziekten zoals NSCLC, waarbij multi-omics benaderingen en geïntegreerde biomarkerpanelen in toenemende mate vereist zijn om een klinisch betekenisvolle voorspellende prestatie te bereiken. Een hogere YTHDC2-expressie werd waargenomen in NSCLC-weefsels met lymfekliermetastasen, wat wijst op een mogelijke associatie tussen YTHDC2-expressie en de status van lymfekliermetastasen in de huidige cohort. Hoewel er ook verschillen in YTHDC2-expressie werden waargenomen tussen adenocarcinoom en plaveiselcelcarcinoom, moet deze vergelijking voorzichtig worden geïnterpreteerd, aangezien er slechts 4 monsters van plaveiselcelcarcinoom beschikbaar waren voor analyse, wat de statistische kracht van deze subgroepvergelijking aanzienlijk beperkt. Er werden geen significante verschillen waargenomen in klinisch stadium, differentiatie, leeftijd of rookgeschiedenis, waarschijnlijk door beperkingen van de studie, waaronder de steekproefomvang en een single-center design. Hoewel de waargenomen associatie tussen verminderde YTHDC2-expressie en lymfekliermetastasen wijst op een potentiële biologische rol bij NSCLC, sluiten de geringe discriminerende kracht (AUC ~0,5) en de inconsistente detectie via qRT-PCR het gebruik ervan als standalone klinische marker uit. Toekomstige studies zouden moeten onderzoeken of het combineren van YTHDC2 met andere m6A-gerelateerde eiwitten de voorspellende waarde verbetert.

De bio-informatica-analyses suggereerden dat de expressie van YTHDC2 verlaagd is bij NSCLC en mogelijk geassocieerd kan worden met betere patiëntuitkomsten. Hoewel een verlaagde expressie ook werd waargenomen bij patiënten met lymfekliermetastasen en er verschillen werden opgemerkt tussen pathologische subtypes, moeten deze bevindingen in de subgroepen met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd vanwege de beperkte steekproefomvang, met name voor plaveiselcelcarcinoom. Deze bevindingen werden echter niet bevestigd door qRT-PCR-analyse in onze klinische cohort, wat mogelijk het gevolg is van verschillen in cohortkenmerken, steekproefomvang, technische variabiliteit, post-transcriptionele regulatie of het ontbreken van validatie op eiwitniveau. Toekomstig onderzoek zou de mechanismen van YTHDC2 in andere subtypes van longkanker moeten verkennen via in vitro- en in vivo-experimenten. Dergelijke studies kunnen de biologische rol van YTHDC2 verder verduidelijken en bepalen of het klinisch nut heeft als onderdeel van een multimarkeraanpak in plaats van als een op zichzelf staande biomarker.

Beperkingen

Deze studie kent enkele beperkingen. Het betrof een retrospectieve enkelcentrische studie met een relatief kleine steekproefomvang, wat de generaliseerbaarheid kan beperken. Het gebruik van FFPE-weefsels kan de RNA-kwaliteit en de qRT-PCR-gevoeligheid hebben beïnvloed. Bovendien werd alleen de mRNA-expressie van YTHDC2 geëvalueerd, en er werd geen validatie op proteïneniveau uitgevoerd middels immunohistochemie (IHC) of Western blotting. Omdat mRNA-expressie vanwege post-transcriptionele regulatie niet noodzakelijkerwijs correleert met de proteïne-abundantie, kan dit de discrepantie tussen onze klinische bevindingen en de analyses van publieke databases gedeeltelijk verklaren. De studie miste daarnaast gegevens over de lange termijn en subgroepanalyses (bijv. plaveiselcelcarcinoom) waren onvoldoende gepowerd.

Toekomstige richtingen

Toekomstig onderzoek moet de mechanismen van YTHDC2 bij NSCLC verkennen via in vitro- en in vivo-experimenten om de functionele rol ervan beter te begrijpen. Multicenterstudies met grotere steekproefgroottes zijn nodig om de bevindingen te valideren en de generaliseerbaarheid te verbeteren. Daarnaast kan de integratie van YTHDC2 met andere m6A-gerelateerde regulatoren en clinicopathologische variabelen de predictieve en prognostische waarde ervan verhogen. Verdere studies waarin multi-omics-benaderingen worden opgenomen, waaronder transcriptomics, proteomics en epigenomics, zijn noodzakelijk om de biologische mechanismen die ten grond liggen aan de dysregulatie van YTHDC2 te verduidelijken. Validatie op eiwitniveau via immunohistochemie (IHC) of Western blotting moet ook worden uitgevoerd om de concordantie tussen mRNA- en eiwitexpressie te beoordelen. Standaardisatie van monsterverwerking en validatietechnieken zal tevens cruciaal zijn om de reproduceerbaarheid en klinische toepasbaarheid te waarborgen.

Conclusie

Deze studie biedt een verkennende evaluatie van de YTHDC2-expressie in NSCLC door bio-informatische analyses te integreren met klinische qRT-PCR-validatie. Echter, de inconsistente detectie over verschillende analytische platforms en de beperkte diagnostische nauwkeurigheid (AUC ≈0,5) sluiten het gebruik ervan als op zichzelf staande klinische biomarker momenteel uit. Hoewel bio-informatische analyses wijzen op een potentiële prognostische significantie, ondersteunt onafhankelijke klinische validatie de betrouwbaarheid voor diagnostische of prognostische toepassing niet. Deze bevindingen moeten voorzichtig worden geïnterpreteerd en vereisen validatie in grotere multicentrische cohorten met studies op eiwitniveau en functionele studies voordat enige klinische toepassing in overweging kan worden genomen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Aangepaste Primers en Probes	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	Aangepaste synthese	Primer- en probesequenties vermeld in Tabel 6
DNase I	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China	DNase I (HiPure FFPE RNA Kit)	Verwijdering van genomisch DNA-contaminatie
ESTIMATE-algoritme	Yoshihara et al.	R-pakket (Versie 1.0.13)	Schatting van tumorzuiverheid
FFPE RNA Extractie Kit	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China	HiPure FFPE RNA Kit (R4130-02)	RNA-extractie uit FFPE-weefsel
GDC Data Portal	National Cancer Institute (NCI), NIH, USA	https://portal.gdc.cancer.gov	Downloaden van TCGA-datasets
GEPIA webserver	Peking University, China	http://gepia.cancer-pku.cn	Genexpressieanalyse
Kaplan–Meier Plotter	Semmelweis University, Hongarije	https://kmplot.com	Overlevingsanalyse
Microcentrifuge	Eppendorf AG, Hamburg, Duitsland	5424 R	RNA-zuiveringsprocedures
NanoDrop Spectrofotometer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	NanoDrop 2000/2000c	RNA-kwantificering
Probe-gebaseerde qPCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	TaqMan Universal PCR Master Mix II (4440040)	Kwantitatieve PCR-amplificatie
R Statistische Software	R Foundation for Statistical Computing, Wenen, Oostenrijk	Versie 4.4.1	Statistische analyses en ROC-analyse
Real-time PCR Systeem	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA	CFX Opus 96	Kwantitatieve real-time PCR
Reverse Transcriptie Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (K1622)	cDNA-synthese
RNA-zuiveringskolom	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China	HiPure Mini Column I	Silica-membraan RNA-zuiveringskolom
RNase-vrij Water	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China	RNase-vrij Water	RNA-elutie
SPSS Statistics	IBM Corp., Armonk, NY, USA	IBM SPSS Statistics Versie 27.0	Statistische analyses
survivalROC-pakket	CRAN (R Foundation for Statistical Computing)	Versie 1.0.3.1	Tijdsafhankelijke ROC-analyse
TCGA-database	National Cancer Institute (NCI), NIH, USA	https://portal.gdc.cancer.gov	Publieke database voor kankorgenomica
Wasbuffer RW1	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China	Buffer RW1	Wasbuffer voor RNA-zuivering
Wasbuffer RW2	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, China	Buffer RW2	Wasbuffer voor RNA-zuivering