Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Menselijk geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardioïden als model om de levering van oligonucleotiden te beoordelen

219 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/72013

⸱

11 augustus 2026

 ,  ,  ,  , 
1Gulbenkian Institute for Molecular Medicine, 2Novo Nordisk Center for Optimized Oligo Escape, University of Copenhagen, 3Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol maakt de generatie van zelforganiserende cardiomyocyten-gebaseerde cardioïden mogelijk uit menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen voor microscopische beoordeling van fluorescentie-gelabelde oligonucleotide-opname.

Samenvatting

Oligonucleotide gebaseerde therapieën vormen een snel ontwikkelende klasse geneesmiddelen met aanzienlijk potentieel voor de behandeling van hart- en vaatziekten; Het efficiënt afleveren van het hartweefsel blijft echter een cruciale en onopgeloste uitdaging. Een belangrijk obstakel is de beperkte beschikbaarheid van robuuste, fysiologisch relevante menselijke in vitro modellen die in staat zijn om kwantitatieve beoordeling van oligonucleotide-opname en intracellulaire distributie te ondersteunen. Er wordt een gedetailleerd, stapsgewijs protocol gepresenteerd voor het genereren van zelforganiserende, 3D-cardioïden uit menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) en deze toepassen als platform om de opname van fluorescentief-gelabelde oligonucleotiden te evalueren. Het protocol begeleidt gebruikers door gerichte hartdifferentiatie in suspensiekweek door Wnt/β-catenine-signalering temporeel te moduleren, waardoor sequentiële specificatie van iPSC's mogelijk is via de mesoderm-, cardiale mesoderm en cardiomyocyt-voorloperfasen. Onder deze omstandigheden assembleren cellen zich spontaan tot kloppende, holte-bevattende driedimensionale structuren die canonieke cardiomyocytenmarkers tot expressie brengen. De resulterende cardioïden bieden een schaalbaar, experimenteel hanteerbaar platform voor beeldvormingsgebaseerde beoordeling van de efficiëntie van de opname van oligonucleotides, ter ondersteuning van de ontwikkeling en optimalisatie van toedieningsstrategieën voor harttoepassingen.

Inleiding

Oligonucleotide gebaseerde therapieën, voornamelijk antisense-oligonucleotiden (ASO's) en kleine interfererende RNA's (siRNA's), komen snel op als een transformerende en zeer specifieke benadering voor de behandeling van een breed scala aan ziekten, waaronder zowel erfelijke als verworven aandoeningen 1,2,3. Deze modaliteiten maken directe modulatie van genexpressie op mRNA-niveau mogelijk door sequentie-specifieke binding aan doeltranscripten, waardoor gen-silencing of splicingcorrectie mogelijk is van ziekte-geassocieerde genen die vaak ontoegankelijk zijn voor conventionele kleine-molecuultherapieën 4,5. Als zodanig bieden oligonucleotide gebaseerde gentherapieën een veelzijdig platform om diverse pathogene mechanismen over meerdere ziektegebieden aan te pakken, waaronder cardiovasculaire aandoeningen6. Tot nu toe zijn verschillende oligonucleotide-gebaseerde therapieën, waaronder ASO's, siRNA's en verbindings-switchingsmiddelen, goedgekeurd voor klinisch gebruik7. Ondanks deze vooruitgang blijft hun therapeutische werkzaamheid in zowel preklinische als klinische omgevingen beperkt door inefficiënte intracellulaire levering8. Huidige schattingen geven aan dat minder dan 1% van de geïnternaliseerde oligonucleotiden de endosomale compartimenten verlaat om het cytosol te bereiken en hun doel-RNA te betrekken, waardoor functionele activiteitbeperkt wordt 9,10. Deze beperking is vooral uitgesproken bij hartweefsel, waar opname en intracellulaire transport slecht worden begrepen.

Historisch gezien is preklinische evaluatie van cardiovaculaire therapieën sterk gebaseerd geweest op diermodellen, die onmisbaar blijven voor het beoordelen van farmacokinetica, biodistributie, effectiviteit en veiligheid in vivo. Belangrijke verschillen tussen soorten in hartfysiologie, genregulatie en cellulaire responsen beperken echter vaak hun vermogen om therapeutische werkzaamheid en toxiciteit bij mensen nauwkeurig te voorspellen. Deze beperkingen hebben de ontwikkeling van mensgebaseerde in vitro-modellen met verbeterde fysiologische relevantie gestimuleerd. Onder deze heeft de door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) technologie de modellering van hart- en vaatziekten gerevolutioneerd door een vrijwel onbeperkte bron van cellen te bieden die kunnen worden gedifferentieerd in cardiovasculaire lijnen. Humane iPSC-afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CM's) recapituleren veel van de moleculaire, structurele en functionele eigenschappen van het menselijk myocarde en zijn een breed geadopteerd platform geworden voor het onderzoeken van ziektemechanismen, medicijnresponsen en opkomende therapeutische modaliteiten11. Conventionele tweedimensionale culturen van menselijke iPSC-CM's hebben echter belangrijke beperkingen. De meeste differentiatieprotocollen genereren cardiomyocyten die lijken op foetale in plaats van volwassen cellen, en vertonen onrijpe structurele, elektrofysiologische, metabole en contractiele eigenschappen12.

Bovendien missen monolaagculturen de driedimensionale (3D) weefselarchitectuur, meercellige interacties en de samenstelling van extracellulaire matrix die de functie van cardiomyocyten in vivo beïnvloeden. Om deze uitdagingen aan te pakken, zijn steeds geavanceerdere 3D-cardialemodellen ontwikkeld. Onder deze bevorderen gemanipuleerde hartweefsels (EHT's), gegenereerd door het inbedden van iPSC-CM's in biomateriaalsteigers en het toepassen van mechanische en elektrische stimulatie, structurele en functionele rijping, terwijl het de biomechanische omgeving van het native myocardium13 nauwer reproduceert. Hoewel EHT's fysiologisch zeer relevante platforms bieden voor ziektemodellering en geneesmiddelentesten, vereist hun ontwikkeling doorgaans gespecialiseerde bio-engineering expertise en speciale apparatuur. Aan de andere kant van het spectrum behouden ex vivo cardiale weefselsneetjes het meest trouw de oorspronkelijke weefselarchitectuur en cellulaire samenstelling, maar zijn ze afhankelijk van toegang tot primair hartweefsel, hebben ze beperkte levensvatbaarheid in cultuur en zijn ze niet gemakkelijk schaalbaar.

Meer recentelijk zijn cardiale organoïden opgedoken als toegankelijke 3D-modelsystemen die belangrijke aspecten van de organisatieen functie van hartweefsel weergeven. Cardioïden zijn zelfassemblerende cardiale organoïden die voornamelijk bestaan uit cardiomyocyten en intrinsieke specificatie, ruimtelijke patroonvorming en morfogenese ondergaan om kamerachtige, holtebevattende structurente vormen 15,16. Methoden om cardioïden te vormen zijn doorgaans afhankelijk van een initiële activatie van Wnt-signalering om mesodermspecificatie te induceren, gevolgd door daaropvolgende remming om de betrokkenheid van de hartlijn te bevorderen. Cardioïden kunnen worden gegenereerd in statische of geroerde suspensieculturen, die schaalbare productie ondersteunen en de zelforganisatie van het weefsel bevorderen 15,16,17,18,19. Meer complexe multi-lijnige cardiale organoïden die endotheel-, epicardiale of andere celtypen bevatten, vergroten de fysiologische relevantie verder, maar vereisen meer uitgebreide differentiatieprotocollen, langere kweekperiodes en uitgebreide optimalisatie13,14.

Er wordt een eenvoudig, reproduceerbaar en efficiënt protocol gepresenteerd voor het genereren van zelforganiserende cardiomyocyten-gebaseerde cardioïden uit menselijke iPSC's en het toepassen ervan om de opname van fluorescentief-gelabelde oligonucleotiden te evalueren. Het protocol zal waardevol blijken voor onderzoekers die oligonucleotidechemie en afgiftestrategieën willen optimaliseren voor cardiovasculaire toepassingen. Alle materialen die in deze studie zijn gebruikt, staan vermeld in de Materiaaloverzicht.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Kweek en voorbereiding van iPSC's voor differentiatie

VOORZICHTIG: Voer alle open omgang met cellen en media uit in een gecertificeerde Klasse II bioveiligheidskast. Draag een labjas en handschoenen. Decontaminateer werkoppervlakken en vloeibaar afval met een geschikt desinfectiemiddel.

  1. Onderhoud iPSC's.
    1. Bedek kweekplaten met een geschikte basaalmembraanmatrix volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Voer iPSC's met een gedefinieerd, feeder-vrij pluripotent stamcelmedium en vervang het medium elke 24 uur.
    3. Houd culturen onder overconfluentie en passagecellen wanneer ze 70–80% confluentie bereiken.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat iPSC's een hoogwaardige, ongedifferentieerde morfologie behouden en bevestigd zijn als mycoplasmavrij voordat differentiatie wordt gestart.
  2. Voor-differentiatie passaging.
    1. Ontdooi iPSC's en zet cellen uit voor minstens twee passages voordat de hartdifferentiatie wordt gestart.
    2. Doorgangscellen met een enzymvrije dissociatiemethode, PBS-EDTA, compatibel met iPSC-onderhoud.
      PAUZEPUNT: Houd iPSC's in cultuur totdat ze 70–80% confluentie bereiken en behoud de typische morfologie zonder tekenen van spontane differentiatie.

2. Voorbereiding van iPSC-aggregaten in microwellplaten

  1. Dissocieer iPSC's naar een single-cell suspensie.
    1. Aspireer medium en was cellen één keer met 1 ml 1× PBS.
    2. Voeg celloskoppelingsoplossing (Accutase) toe bij 500 μL per put van een 6-put plaat en incubeer bij 37 °C gedurende 5–7 minuten.
    3. Voeg 1,5 ml wasmedium per put toe en suspensie voorzichtig opnieuw om een single-cell suspension te creëren.
    4. Breng de suspensie over in een 15 mL conische buis en centrifugeer op 200 × g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
    5. Aspireer de supernatant en suspendeer de celpellet opnieuw in feeder-vrije iPSC-medium aangevuld met ROCK-remmer (laatste 10 μM).
      OPMERKING: Pas de dissociatie-incubatietijd voor elke iPSC-lijn aan door de loskoppeling na 5 minuten te controleren en indien nodig in korte stappen uit te strekken.
  2. Tel cellen en bereid de platingdichtheid voor.
    1. Tel levensvatbare cellen met een standaard celtelmethode.
    2. Bereid een single-cell suspension voor van 0,9 × 106 cellen /mL voor elke put van een 800 μm microwell aggregatieplaat (24-wellformaat, ~300 microwells/well).
      OPMERKING: Optimaliseer het celnummer per put, aangezien de aggregatiegrootte of differentiatie-efficiëntie varieert tussen iPSC-lijnen.
  3. Prim de microwell-plaat en verwijder de bubbels.
    1. Voeg 500 μL feeder-vrije iPSC-medium met ROCK-remmer (laatste 10 μM) toe aan elke put.
    2. Centrifugeer de microwellplaat op 300 × g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur om luchtbellen uit de microwells te verwijderen.
      CRUCIAAL: Verwijder alle bellen volledig om een gelijkmatige celdepositie aan de bodem van elke microput mogelijk te maken en efficiënte aggregatevorming te ondersteunen.
  4. Plant iPSC's in microwells.
    1. Voeg 1,0 mL van de voorbereide single-cell suspension (0,9 × 106 cellen/mL) toe aan elke put, wat overeenkomt met 0,9 × 106 cellen per put.
    2. Voorzichtig opnieuw in de put 3–5 keer ophangen met een P1000 en voorkom het inbrengen van luchtbellen.
    3. Centrifugeer de plaat op 200 × g gedurende 3 minuten op kamertemperatuur om pelletcellen in de microwells te plaatsen.
    4. Controleer onder een microscoop of de cellen in de microwells zijn neergezet voordat je de plaat plaatst op 37 °C met 5% CO₂ gedurende 24 uur.
      KRITISCH: Behandel de plaat voorzichtig na centrifugatie. Beweeg of schud de plaat niet, want dit kan ervoor zorgen dat cellen uit de microwells komen.

3. Uitbreiding van iPSC-aggregaten in microwells

  1. Aspirateer voorzichtig en vervang het medium zonder de aggregaten te verstoren of los te maken.
    1. Kantel de plaat en aspireer langzaam ongeveer 1,0 mL medium uit elke put met een P1000-pipet, zodat de aggregaten in de microwells blijven zitten.
    2. Aspireer langzaam de resterende ~500 μL medium met een P1000 pipet.
    3. Voeg 1,5 mL feeder-vrije iPSC-medium toe aan elke put door het langzaam langs de rand van de put te doseren met een serologische pipet.
    4. Incubeer bij 37 °C, 5% CO₂ en herhaal dagelijks de mediumwissel.
      CRUCIAAL: Doseer medium op de wand van de put en vermijd directe stroom op aggregaten.

4. Cardiale differentiatie van iPSC-aggregaten (Dag 0 tot Dag 12)

  1. Mesoderminductie (dag 0).
    1. Verwijder medium met de zachte aspiratiemethode beschreven in stappen 3.1.1–3.1.2.
    2. Voeg 1,5 mL per put toe van basaal medium, aangevuld met 2% B27 minus insuline en de Wnt/β-catenine-pathway activator (CHIR99021, eindconcentratie: 11 μM).
      OPMERKING: Bereid een 10 mM voorraadoplossing van CHIR99021, een klein-molecuul remmer van glycogeensyntase-kinase-3 (GSK-3). Om een uiteindelijke concentratie van 11 μM te bereiken, voeg je 1,65 μL van de standaardoplossing toe aan 1,5 mL medium.
  2. Middelmatige verandering na inleiding (dag 1).
    1. Na 24 uur na toevoeging van CHIR99021 aspireer je het medium voorzichtig uit elke put.
    2. Voeg 1,5 ml per put toe van vers basaal medium aangevuld met 2% B27 minus insuline, en incubeer dan 48 uur.
      KRITISCH: Houd je strikt aan de timing van de Wnt-modulatiestappen, omdat afwijkingen de differentiatie-efficiëntie kunnen aantasten.
      OPMERKING: Er wordt enige celdood verwacht na blootstelling aan de Wnt/β-catenine-pathway activator. Als er een groot aggregateverlies wordt waargenomen, overweeg dan om de concentratie van de activator in toekomstige experimenten te verlagen.
  3. Hartopname via WNT-remming (dag 3).
    1. Bereid het geconditioneerde medium voor door 760 μL verbruikt medium van elke put over te brengen naar een steriele 50 mL conische buis.
    2. Voeg voor elke put 760 μL vers basaal medium met 2% B27 zonder insuline toe aan de buis met het geconcentreerde medium, en meng voorzichtig.
    3. Voeg de Wnt-route-remmer, IWP4, toe aan het gemengde medium tot een uiteindelijke concentratie van 5 μM en draai de buis voorzichtig meerdere keren om te mengen om te mengen.
    4. Aspireer voorzichtig het resterende medium uit elke put en voeg vervolgens per put 1,5 mL van geconditioneerd medium toe, aangevuld met IWP4.
    5. Incubeer bij 37 °C met 5% CO₂ gedurende 48 uur.
      OPMERKING: Bereid een 1 mM stockoplossing van de Wnt-route-remmer IWP4 voor. Om een uiteindelijke concentratie van 5 μM te bereiken, voeg je 7,6 μL van de voorraadoplossing toe per 1,52 mL totaal medium (760 μL geconditioneerd medium + 760 μL vers basaal medium) voor elke put.
  4. Middelmatige verandering in microwells (dag 5).
    1. Vervang medium met de zachte aspiratiemethode zoals beschreven in stappen 3.1.1–3.1.2.
    2. Voeg 1,5 mL basaal medium toe, aangevuld met 2% B27 minus insuline, aan elke put en incubeer vervolgens bij 37 °C met 5% CO₂ gedurende 48 uur.
  5. Overbreng aggregaten van microwells naar 6-well platen (dag 7).
    1. Aspireer het medium zorgvuldig uit elke put met behulp van de zachte aspiratiemethode beschreven in stappen 3.1.1–3.1.2.
    2. Voeg 1,0 ml basaal medium toe, aangevuld met 2% B27 met insuline, aan elke put van de microwellplaat. Met een P1000-pipet pipeteert u het medium vijf keer op en neer terwijl de pipetpunt in een cirkelvormige beweging over het putoppervlak beweegt om de aggregaten in de microwells los te maken en in suspensie te brengen.
    3. Breng de aggregate suspensie over naar één put van een niet-behandelde 6-put kweekplaat.
    4. Spoel elke put van de microwellplaat twee tot drie keer met een extra 1,0 mL vers medium om eventuele resterende aggregaten terug te winnen, waarbij elke spoeling wordt overgebracht naar dezelfde put van de 6-well plaat.
    5. Incubeer bij 37 °C met 5% CO₂ gedurende 72 uur.
      OPMERKING: De aanwezigheid van dode cellen en cellulair afval na de aggregate overdracht wordt verwacht. Het meeste vuil wordt verwijderd tijdens de daaropvolgende mediumwissel.
  6. Middelmatige verandering tijdens de opsuspensiecultuur (dag 10).
    1. Beweeg de plaat voorzichtig om losjes vastzittende aggregaten los te maken.
    2. Kantel de plaat zodat de aggregaten door de zwaartekracht op de bodem van de put kunnen neerzetten.
    3. Aspireer het verbruikte medium zorgvuldig zonder de aggregaten te verstoren of te aspireren.
    4. Voeg 2,0 mL vers basaal medium toe, aangevuld met 2% B27 met insuline, aan elke put en incubeer bij 37 °C met 5% CO₂ gedurende 48–72 uur.
      OPMERKING: Spontane slagen worden meestal waargenomen vanaf ongeveer dag 10.
      PAUZEPUNT: Kloppende cardioïden kunnen in suspensiecultuur worden gehouden voor langdurige rijping door het medium elke 2–3 dagen te vervangen.

5. Microscopische karakterisering van cardioïden

OPMERKING: Deze methode biedt een workflow voor de histologische karakterisering van cardioïden met behulp van cryosecties. De resulterende secties kunnen worden gebruikt voor diverse histologische analyses, waaronder hematoxyline- en eosinekleuring (H&E) om de algehele weefselarchitectuur te beoordelen en immunofluorescentielabeling om de identiteit van cardiomyocyten te evalueren.

  1. Fixatie en cryosectie.
    1. Fix cardioïden in 4% paraformaldehyde 's nachts bij 4 °C.
      VOORZICHTIG: Paraformaldehyde is giftig en waarschijnlijk een kankerverwekkend stof; Behandel het in een chemische dampkap terwijl je passende persoonlijke beschermingsmiddelen draagt. Verzamel al het afval dat paraformaldehyde bevat (fixatief en wasmiddelen) in een duidelijk gelabelde container voor aldehyde/chemisch gevaarlijk afval, en voer dit af volgens de institutionele procedures voor gevaarlijk afval.
      VEILIGHEID: Voer alle fixatie en hantering van paraformaldehyde uit in een chemische dampkap terwijl je passende persoonlijke beschermingsmiddelen draagt.
    2. Was drie keer met PBS en cryoprotecteer de vaste cardioïden in 30% (met v/v) sucrose in PBS 's nachts bij 4 °C.
    3. Leg de cardioïden in gelatine, vries en snijd cryosecties van 10 μm dik op microscoopglaas. Bewaar de secties op −20 °C tot gebruik.
  2. Immunolabeling.
    1. Ontdooi de secties 15 minuten op kamertemperatuur.
    2. Was de secties in PBS op 37 °C gedurende 10 minuten, twee keer.
    3. Omcirkel het interessegebied op elke dia's met een hydrofobe pen om een put te creëren die de blokkering en antistofoplossingen behoudt.
    4. Rehydrateer de secties gedurende 2–3 minuten in een permeabilisatiebuffer (PB; PBS met 0,1% Tween-20) in een Coplin-pot.
    5. Haal de glaasjes uit PB, laat de overtollige oplossing aflopen en plaats de glaasjes in een vochtige kamer.
      KRITISCH: Vanaf nu is het cruciaal om de secties niet te laten drogen.
    6. Blokkeer de secties met 200–300 μL PB met 5% fotaal rundserum (FBS) gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur in een vochtige kamer.
    7. Verwijder de blokkerende oplossing en incubeer de secties een nacht bij 4 °C met 100 μL primaire antistof (anti-cMYBP-C; 1:50) verdund in blokkerende oplossing (PB met 1% FBS).
    8. Was de glaasjes drie keer met PB en incubeer ze 2 uur op kamertemperatuur met een groene fluorescerende anti-muis secundair antilichaam (1:200), rood fluorescerend falloïde (1:400) en DAPI (1 μg/mL).
    9. Was drie keer in PB en monteer met een antifade montagemedium.
      VOORZICHTIG: Verzamel alle fluorescentiekleurstofhoudende oplossingen (secundaire antistoffen, falloïde en DAPI-kleuringsoplossingen en de bijbehorende wasbeurten) in een container en voer ze af als chemisch afval volgens de institutionele richtlijnen.
  3. Beeldverwerving.
    1. Maakt confocale beelden met een laser-scannende confocale microscoop uitgerust met een arraydetector voor superresolutiebeeldvorming met een 10× en een 63×/1,40 olie-immersieobjectief.
    2. Exciteer de ver-rode fluorofoor, groene fluorofoor en nucleaire kleuring met laserlijnen van respectievelijk 639 nm, 488 nm en 405 nm lasertransmissies bij 4,0%, 4,0% en 1,0%.
    3. Enkele optische secties verkrijgen met een pixelgrootte van 0,0353 × 0,0353 μm2, unidirectioneel scannen, scansnelheid 6, zoom 1,7, lijngemiddelde 1, en een pixelverblijftijd van 0,935 μs per pixel.
    4. Pas arraydetector superresolutie beeldverwerking toe met automatische Wiener-filtering.

6. Fluorescentie-oligonucleotide opnametest

  1. Bereid een voorraadoplossing voor van het fluorescentie-gelabelde oligonucleotide geconjugeerd aan palmitinezuur om de lipofilie te verhogen.
    1. Reconstrueren van het gelyofilieerde, fluorescerend gelabelde oligonucleotide in nucleasevrij water tot een uiteindelijke concentratie van 1 mM. Vortex kort en centrifugeer op 3.000 × g gedurende 30 seconden om de oplossing onderin de buis op te vangen.
    2. Bereid eenmalige aliquots van de 1 mM voorraadoplossing voor en bewaar bij −20 °C beschermd tegen licht.
    3. Voeg op de dag van het experiment 1 μL van de 1 mM voorraad toe aan 1 mL cardioïde kweekmedium om een uiteindelijke oligonucleotideconcentratie van 1 μM te verkrijgen. Meng door zachte plaatroering.
  2. Incubeer cardioïden met het fluorescentief-gelabelde oligonucleotide (1 μM eindconcentratie) in serumvrij medium bij 37 °C met 5% CO₂ gedurende 24 uur.
  3. Was de cardioïden drie keer met fosfaatgeborrelde zoutoplossing (PBS) om extracellulaire oligonucleotide te verwijderen.
  4. Fix de cardioïden in 4% paraformaldehyde gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur, was drie keer met PBS en ga door met fluorescerend labelen voordat je beelden maakt.
  5. Incubeer intacte gefixeerde cardioïden 's nachts bij 4 °C, beschermd tegen licht, in PBS met 5 μg/mL tarwekiemagglutinine (WGA) geconjugeerd met een groene fluorofoor en 1 μg/mL DAPI. Was drie keer in PBS en monteer met een antifade montagemedium.
    VOORZICHTIG: Verzamel alle oligonucleotide- en fluorescerend kleurstofhoudende media en wasmiddelen, inclusief het gelabelde oligonucleotide incubatiemedium uit stap 6.2 en de WGA/DAPI-kleuringsoplossing, in een aparte container en voer ze af als chemisch/biologisch gevaarlijk afval volgens de richtlijnen van de instelling.
  6. Maak confocale beelden van de opname en verspreiding van oligonucleotides.
    1. Maak confocale beelden met een laser-scannende confocale microscoop uitgerust met een arraydetector voor superresolutiebeeldvorming en een 40× wateronderdompelingsobjectief. Verslaat beelden als z-stacks van 8 secties met een z-stapgrootte van 2 μm, die een totale diepte van 16 μm beslaan.
    2. Exciteer de nucleaire kleuring, membraanmarker en het verrood fluorescerend gelabelde oligonucleotide met laserlijnen van respectievelijk 405 nm, 488 nm en 639 nm bij 0,9%, 0,2% en 3,0% lasertransmissie.
    3. Opnames van beelden met een voxelgrootte van 0,0449 × 0,0449 × 2 μm3, bidirectioneel scannen, scansnelheid 5, lijngemiddelde 1, en een pixel-verblijftijd van 1,51 μs per pixel. Pas Airyscan/superresolutie beeldverwerking toe met automatische Wiener-filtering.
    4. Houd alle acquisitie-instellingen (laservermogen, detectorversterking, z-stap en voxelgrootte) constant over alle z-posities en over alle monsters om een valide vergelijking van het oligonucleotidesignaal tussen omstandigheden mogelijk te maken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 1 vat de differentiatieworkflow samen en illustreert de karakteristieke morfologische veranderingen die in elke fase van het protocol worden verwacht, van iPSC-aggregatie tot de vorming van zelforganiserende cardioïden. Suspensie-gebaseerde microwell-aggregatie biedt een eenvoudige en gestandaardiseerde aanpak voor de parallelle generatie van grote aantallen groottegecontroleerde cardioïden. Succesvolle differentiatie wordt gekenmerkt door het generer...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Oligonucleotide gebaseerde therapieën zijn uitgegroeid tot een krachtige klasse van gengerichte modaliteiten, ondersteund door decennia van vooruitgang in de oligonucleotidchemie die de doelspecificiteit, metabole stabiliteit en immunogene tolerantie hebben verbeterd 7,8. Ondanks het toenemende aantal klinisch goedgekeurde RNA-therapieën, blijft hun bredere toepassing beperkt door inefficiënte intracellulaire levering

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Dankbetuigingen

Wij danken leden van het Novo Nordisk Foundation Challenge Center for Optimized Oligo Escape, met name Knud Jensen voor het ontwerp en de synthese van oligonucleotides, en Nikos S. Hatzakis en Tomas Kirchhausen voor waardevolle begeleiding over kwantitatieve beeldvorming en intracellulaire traffickinganalyse. Dit werk werd gefinancierd door het Novo Nordisk Foundation Challenge Center for Optimized Oligo Escape (NNF23OC0081287). M.F. ontving een beurs van Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal (2020.04836.BD). Wij danken GIMM Bioimaging en de GIMM Histopathology Platforms (Lissabon, Portugal) voor de technische ondersteuning.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
4', 6-diamidino-2'-phenylindole, dihydrochlorideThermo Scientific62248DAPI
10× dry objectiveZeissEC Plan-Neofluar 10×/0.30
40× water objectiveZeissLD C-Apochromat 40×/1.10 Corr
63× oil-immersion objectiveZeissPlan-Apochromat 63×/1.40 Oil DIC M27 
800-µm microwell aggregation plateSTEMCELL Technologies34815AggreWell 800
Andor Neo 5.5 sCMOS camera AndorAndor Neo 5.5 
Antifade mounting mediumVector LaboratoriesH-1000-10VECTASHIELD Antifade Mounting Medium
B27 supplement minus insulin, 50×GibcoA18956-01B27 Minus Insulin 50×
B27 supplement with insulin, 50×Gibco17504-044B27 Supplement 50×
Basal MediumGibco21875-034RPMI 1640
Basement-membrane matrixGibco / CorningA14132-02 / 354230Geltrex LDEV-Free / Matrigel LDEV-Free
brightfield microscope EVOSEVOS XL Core Imaging Microscope
Cell detachment solutionSTEMCELL Technologies07922ACCUTASE
confocal microscopeZEISSZEISS LSM 980 with Airyscan 2 Microscope
Defined feeder-free iPSC maintenance mediumSTEMCELL Technologies100-0276mTeSR Plus
DMEM/F12Gibco31331-028DMEM/F12
Non-treated 6-well plateAvantor (VWR)734-2777Untreated 6-well Plate
PhalloidinThermo ScientificA22287Phalloidin Labeling Probes ALexa 647
Phosphate-buffered saline (1× PBS)Gibco14190-144DPBS 1×
primary antibody c-MYBPC3Santa Cruzsc-137181MYBPC3 Antibody (F-1)
ROCK inhibitorSTEMCELL Technologies72304ROCK Inhibitor (Y-27632)
Secondary antibody (green)Thermo ScientificA-11017F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Washing medium supplementGibco10828028KnockOut Serum Replacement
WGA, Alexa Fluor™ 488 conjugateInvitrogen W11261WGA
widefield microscopeNikonNikon Eclipse Ti 
WNT pathway inhibitorSTEMCELL Technologies72552IWP4
Wnt/β-catenin pathway activatorSigmaSML1046CHIR99021

Referenties

  1. Kulkarni JA, Witzigmann D, Thomson SB, Chen S, Leavitt BR, Cullis PR, et al. The current landscape of nucleic acid therapeutics. Nat Nanotechnol. 2021;16(6):630-43.
  2. Lauffer MC, van Roon-Mom W, Aartsma-Rus A, Collaborative N. Possibilities and limitations of antisense oligonucleotide therapies for the treatment of monogenic disorders. Commun Med (Lond). 2024;4(1):6.
  3. Lee HG, Kim J, Jang CY, Shin M. Antisense Oligonucleotide Therapeutics Targeting Age-Related Diseases. BioDrugs. 2026;40(2):237-61.
  4. Roberts TC, Langer R, Wood MJA. Advances in oligonucleotide drug delivery. Nat Rev Drug Discov. 2020;19(10):673-94.
  5. Corey DR, Damha MJ, Manoharan M. Challenges and Opportunities for Nucleic Acid Therapeutics. Nucleic Acid Ther. 2022;32(1):8-13.
  6. Gotthardt M, Badillo-Lisakowski V, Parikh VN, Ashley E, Furtado M, Carmo-Fonseca M, et al. Cardiac splicing as a diagnostic and therapeutic target. Nat Rev Cardiol. 2023;20(8):517-30.
  7. Liu M, Wang Y, Zhang Y, Hu D, Tang L, Zhou B, et al. Landscape of small nucleic acid therapeutics: moving from the bench to the clinic as next-generation medicines. Signal Transduct Target Ther. 2025;10(1):73.
  8. Sun X, Setrerrahmane S, Li C, Hu J, Xu H. Nucleic acid drugs: recent progress and future perspectives. Signal Transduct Target Ther. 2024;9(1):316.
  9. Dowdy SF, Setten RL, Cui XS, Jadhav SG. Delivery of RNA Therapeutics: The Great Endosomal Escape! Nucleic Acid Ther. 2022;32(5):361-8.
  10. Patra C, Hussein Z, Ace VD, Misnik EV, Rybalko DS, Salimova AA, et al. The efficacy of oligonucleotide-based gene therapeutics in gene silencing. Theranostics. 2026;16(2):599-616.
  11. Lyra-Leite DM, Gutierrez-Gutierrez O, Wang M, Zhou Y, Cyganek L, Burridge PW. A review of protocols for human iPSC culture, cardiac differentiation, subtype-specification, maturation, and direct reprogramming. STAR Protoc. 2022;3(3):101560.
  12. Karbassi E, Fenix A, Marchiano S, Muraoka N, Nakamura K, Yang X, et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nat Rev Cardiol. 2020;17(6):341-59.
  13. Kim YH, Son YH, Choi Y, Kim MS, Park SJ, Lee KY. Advanced in vitro cardiac models for drug evaluation: integration of organoids, engineered tissues, and microphysiological systems. Microsyst Nanoeng. 2026;12(1).
  14. Mendjan S, Deyett A, Yelon D. Coordination of cardiogenesis in vivo and in vitro. Nat Rev Mol Cell Biol. 2026;27(1):19-34.
  15. Lewis-Israeli YR, Wasserman AH, Gabalski MA, Volmert BD, Ming Y, Ball KA, et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nat Commun. 2021;12(1):5142.
  16. Hofbauer P, Jahnel SM, Papai N, Giesshammer M, Deyett A, Schmidt C, et al. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis. Cell. 2021;184(12):3299-317 e22.
  17. Silva AC, Matthys OB, Joy DA, Kauss MA, Natarajan V, Lai MH, et al. Co-emergence of cardiac and gut tissues promotes cardiomyocyte maturation within human iPSC-derived organoids. Cell Stem Cell. 2021;28(12):2137-52 e6.
  18. Drakhlis L, Biswanath S, Farr CM, Lupanow V, Teske J, Ritzenhoff K, et al. Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development. Nat Biotechnol. 2021;39(6):737-46.
  19. Prondzynski M, Berkson P, Trembley MA, Tharani Y, Shani K, Bortolin RH, et al. Efficient and reproducible generation of human iPSC-derived cardiomyocytes and cardiac organoids in stirred suspension systems. Nat Commun. 2024;15(1):5929.
  20. Buntz A, Killian T, Schmid D, Seul H, Brinkmann U, Ravn J, et al. Quantitative fluorescence imaging determines the absolute number of locked nucleic acid oligonucleotides needed for suppression of target gene expression. Nucleic Acids Res. 2019;47(2):953-69.
  21. Branco MA, Cotovio JP, Rodrigues CAV, Vaz SH, Fernandes TG, Moreira LM, et al. Transcriptomic analysis of 3D Cardiac Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reveals Faster Cardiomyocyte Maturation Compared to 2D Culture. Sci Rep. 2019;9(1):9229.
  22. Grimm JB, English BP, Chen J, Slaughter JP, Zhang Z, Revyakin A, et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nat Methods. 2015;12(3):244-50, 3 p following 50.
  23. Lavaee A, Jain A, Scanavachi G, Costa-Filho JI, Ingemansson A, Kirchhausen T. SpatialDINO: A Self-Supervised 3D Vision Transformer that enables Segmentation and Tracking in Crowded Cellular Environments. bioRxiv. 2026.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Geïnduceerde pluripotente stamcellencardioïde-modelcardiale differentiatieWnt-signaleringcardiaal mesodermcardiomyocytenprogenitorenfluorescente oligonucleotidencellulaire opnamedriedimensionale cardioïden

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.