Menselijk geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardioïden als model om de levering van oligonucleotiden te beoordelen

Samenvatting

Dit protocol maakt de generatie van zelforganiserende cardiomyocyten-gebaseerde cardioïden mogelijk uit menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen voor microscopische beoordeling van fluorescentie-gelabelde oligonucleotide-opname.

Samenvatting

Oligonucleotide gebaseerde therapieën vormen een snel ontwikkelende klasse geneesmiddelen met aanzienlijk potentieel voor de behandeling van hart- en vaatziekten; Het efficiënt afleveren van het hartweefsel blijft echter een cruciale en onopgeloste uitdaging. Een belangrijk obstakel is de beperkte beschikbaarheid van robuuste, fysiologisch relevante menselijke in vitro modellen die in staat zijn om kwantitatieve beoordeling van oligonucleotide-opname en intracellulaire distributie te ondersteunen. Er wordt een gedetailleerd, stapsgewijs protocol gepresenteerd voor het genereren van zelforganiserende, 3D-cardioïden uit menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) en deze toepassen als platform om de opname van fluorescentief-gelabelde oligonucleotiden te evalueren. Het protocol begeleidt gebruikers door gerichte hartdifferentiatie in suspensiekweek door Wnt/β-catenine-signalering temporeel te moduleren, waardoor sequentiële specificatie van iPSC's mogelijk is via de mesoderm-, cardiale mesoderm en cardiomyocyt-voorloperfasen. Onder deze omstandigheden assembleren cellen zich spontaan tot kloppende, holte-bevattende driedimensionale structuren die canonieke cardiomyocytenmarkers tot expressie brengen. De resulterende cardioïden bieden een schaalbaar, experimenteel hanteerbaar platform voor beeldvormingsgebaseerde beoordeling van de efficiëntie van de opname van oligonucleotides, ter ondersteuning van de ontwikkeling en optimalisatie van toedieningsstrategieën voor harttoepassingen.

Inleiding

Oligonucleotide gebaseerde therapieën, voornamelijk antisense-oligonucleotiden (ASO's) en kleine interfererende RNA's (siRNA's), komen snel op als een transformerende en zeer specifieke benadering voor de behandeling van een breed scala aan ziekten, waaronder zowel erfelijke als verworven aandoeningen ^1,2,3. Deze modaliteiten maken directe modulatie van genexpressie op mRNA-niveau mogelijk door sequentie-specifieke binding aan doeltranscripten, waardoor gen-silencing of splicingcorrectie mogelijk is van ziekte-geassocieerde genen die vaak ontoegankelijk zijn voor conventionele kleine-molecuultherapieën ^4,5. Als zodanig bieden oligonucleotide gebaseerde gentherapieën een veelzijdig platform om diverse pathogene mechanismen over meerdere ziektegebieden aan te pakken, waaronder cardiovasculaire aandoeningen⁶. Tot nu toe zijn verschillende oligonucleotide-gebaseerde therapieën, waaronder ASO's, siRNA's en verbindings-switchingsmiddelen, goedgekeurd voor klinisch gebruik⁷. Ondanks deze vooruitgang blijft hun therapeutische werkzaamheid in zowel preklinische als klinische omgevingen beperkt door inefficiënte intracellulaire levering⁸. Huidige schattingen geven aan dat minder dan 1% van de geïnternaliseerde oligonucleotiden de endosomale compartimenten verlaat om het cytosol te bereiken en hun doel-RNA te betrekken, waardoor functionele activiteit^{beperkt wordt 9,10}. Deze beperking is vooral uitgesproken bij hartweefsel, waar opname en intracellulaire transport slecht worden begrepen.

Historisch gezien is preklinische evaluatie van cardiovaculaire therapieën sterk gebaseerd geweest op diermodellen, die onmisbaar blijven voor het beoordelen van farmacokinetica, biodistributie, effectiviteit en veiligheid in vivo. Belangrijke verschillen tussen soorten in hartfysiologie, genregulatie en cellulaire responsen beperken echter vaak hun vermogen om therapeutische werkzaamheid en toxiciteit bij mensen nauwkeurig te voorspellen. Deze beperkingen hebben de ontwikkeling van mensgebaseerde in vitro-modellen met verbeterde fysiologische relevantie gestimuleerd. Onder deze heeft de door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) technologie de modellering van hart- en vaatziekten gerevolutioneerd door een vrijwel onbeperkte bron van cellen te bieden die kunnen worden gedifferentieerd in cardiovasculaire lijnen. Humane iPSC-afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CM's) recapituleren veel van de moleculaire, structurele en functionele eigenschappen van het menselijk myocarde en zijn een breed geadopteerd platform geworden voor het onderzoeken van ziektemechanismen, medicijnresponsen en opkomende therapeutische modaliteiten¹¹. Conventionele tweedimensionale culturen van menselijke iPSC-CM's hebben echter belangrijke beperkingen. De meeste differentiatieprotocollen genereren cardiomyocyten die lijken op foetale in plaats van volwassen cellen, en vertonen onrijpe structurele, elektrofysiologische, metabole en contractiele eigenschappen¹².

Bovendien missen monolaagculturen de driedimensionale (3D) weefselarchitectuur, meercellige interacties en de samenstelling van extracellulaire matrix die de functie van cardiomyocyten in vivo beïnvloeden. Om deze uitdagingen aan te pakken, zijn steeds geavanceerdere 3D-cardiale^{modellen ontwikkeld}. Onder deze bevorderen gemanipuleerde hartweefsels (EHT's), gegenereerd door het inbedden van iPSC-CM's in biomateriaalsteigers en het toepassen van mechanische en elektrische stimulatie, structurele en functionele rijping, terwijl het de biomechanische omgeving van het native myocardium¹³ nauwer reproduceert. Hoewel EHT's fysiologisch zeer relevante platforms bieden voor ziektemodellering en geneesmiddelentesten, vereist hun ontwikkeling doorgaans gespecialiseerde bio-engineering expertise en speciale apparatuur. Aan de andere kant van het spectrum behouden ex vivo cardiale weefselsneetjes het meest trouw de oorspronkelijke weefselarchitectuur en cellulaire samenstelling, maar zijn ze afhankelijk van toegang tot primair hartweefsel, hebben ze beperkte levensvatbaarheid in cultuur en zijn ze niet gemakkelijk schaalbaar.

Meer recentelijk zijn cardiale organoïden opgedoken als toegankelijke 3D-modelsystemen die belangrijke aspecten van de organisatie^{en functie van} hartweefsel weergeven. Cardioïden zijn zelfassemblerende cardiale organoïden die voornamelijk bestaan uit cardiomyocyten en intrinsieke specificatie, ruimtelijke patroonvorming en morfogenese ondergaan om kamerachtige, holtebevattende structuren^{te vormen 15,16}. Methoden om cardioïden te vormen zijn doorgaans afhankelijk van een initiële activatie van Wnt-signalering om mesodermspecificatie te induceren, gevolgd door daaropvolgende remming om de betrokkenheid van de hartlijn te bevorderen. Cardioïden kunnen worden gegenereerd in statische of geroerde suspensieculturen, die schaalbare productie ondersteunen en de zelforganisatie van het weefsel bevorderen 15,16,17,18,19. Meer complexe multi-lijnige cardiale organoïden die endotheel-, epicardiale of andere celtypen bevatten, vergroten de fysiologische relevantie verder, maar vereisen meer uitgebreide differentiatieprotocollen, langere kweekperiodes en uitgebreide optimalisatie^13,14.

Er wordt een eenvoudig, reproduceerbaar en efficiënt protocol gepresenteerd voor het genereren van zelforganiserende cardiomyocyten-gebaseerde cardioïden uit menselijke iPSC's en het toepassen ervan om de opname van fluorescentief-gelabelde oligonucleotiden te evalueren. Het protocol zal waardevol blijken voor onderzoekers die oligonucleotidechemie en afgiftestrategieën willen optimaliseren voor cardiovasculaire toepassingen. Alle materialen die in deze studie zijn gebruikt, staan vermeld in de Materiaaloverzicht.

Protocol

1. Kweek en voorbereiding van iPSC's voor differentiatie

VOORZICHTIG: Voer alle open omgang met cellen en media uit in een gecertificeerde Klasse II bioveiligheidskast. Draag een labjas en handschoenen. Decontaminateer werkoppervlakken en vloeibaar afval met een geschikt desinfectiemiddel.

1. Onderhoud iPSC's.
   1. Bedek kweekplaten met een geschikte basaalmembraanmatrix volgens de instructies van de fabrikant.
   2. Voer iPSC's met een gedefinieerd, feeder-vrij pluripotent stamcelmedium en vervang het medium elke 24 uur.
   3. Houd culturen onder overconfluentie en passagecellen wanneer ze 70–80% confluentie bereiken.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat iPSC's een hoogwaardige, ongedifferentieerde morfologie behouden en bevestigd zijn als mycoplasmavrij voordat differentiatie wordt gestart.
2. Voor-differentiatie passaging.
   1. Ontdooi iPSC's en zet cellen uit voor minstens twee passages voordat de hartdifferentiatie wordt gestart.
   2. Doorgangscellen met een enzymvrije dissociatiemethode, PBS-EDTA, compatibel met iPSC-onderhoud.
      PAUZEPUNT: Houd iPSC's in cultuur totdat ze 70–80% confluentie bereiken en behoud de typische morfologie zonder tekenen van spontane differentiatie.

2. Voorbereiding van iPSC-aggregaten in microwellplaten

1. Dissocieer iPSC's naar een single-cell suspensie.
   1. Aspireer medium en was cellen één keer met 1 ml 1× PBS.
   2. Voeg celloskoppelingsoplossing (Accutase) toe bij 500 μL per put van een 6-put plaat en incubeer bij 37 °C gedurende 5–7 minuten.
   3. Voeg 1,5 ml wasmedium per put toe en suspensie voorzichtig opnieuw om een single-cell suspension te creëren.
   4. Breng de suspensie over in een 15 mL conische buis en centrifugeer op 200 × g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
   5. Aspireer de supernatant en suspendeer de celpellet opnieuw in feeder-vrije iPSC-medium aangevuld met ROCK-remmer (laatste 10 μM).
      OPMERKING: Pas de dissociatie-incubatietijd voor elke iPSC-lijn aan door de loskoppeling na 5 minuten te controleren en indien nodig in korte stappen uit te strekken.
2. Tel cellen en bereid de platingdichtheid voor.
   1. Tel levensvatbare cellen met een standaard celtelmethode.
   2. Bereid een single-cell suspension voor van 0,9 × 10^{6 cellen} /mL voor elke put van een 800 μm microwell aggregatieplaat (24-wellformaat, ~300 microwells/well).
      OPMERKING: Optimaliseer het celnummer per put, aangezien de aggregatiegrootte of differentiatie-efficiëntie varieert tussen iPSC-lijnen.
3. Prim de microwell-plaat en verwijder de bubbels.
   1. Voeg 500 μL feeder-vrije iPSC-medium met ROCK-remmer (laatste 10 μM) toe aan elke put.
   2. Centrifugeer de microwellplaat op 300 × g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur om luchtbellen uit de microwells te verwijderen.
      CRUCIAAL: Verwijder alle bellen volledig om een gelijkmatige celdepositie aan de bodem van elke microput mogelijk te maken en efficiënte aggregatevorming te ondersteunen.
4. Plant iPSC's in microwells.
   1. Voeg 1,0 mL van de voorbereide single-cell suspension (0,9 × 10⁶ cellen/mL) toe aan elke put, wat overeenkomt met 0,9 × 10^{6 cellen} per put.
   2. Voorzichtig opnieuw in de put 3–5 keer ophangen met een P1000 en voorkom het inbrengen van luchtbellen.
   3. Centrifugeer de plaat op 200 × g gedurende 3 minuten op kamertemperatuur om pelletcellen in de microwells te plaatsen.
   4. Controleer onder een microscoop of de cellen in de microwells zijn neergezet voordat je de plaat plaatst op 37 °C met 5% CO₂ gedurende 24 uur.
      KRITISCH: Behandel de plaat voorzichtig na centrifugatie. Beweeg of schud de plaat niet, want dit kan ervoor zorgen dat cellen uit de microwells komen.

3. Uitbreiding van iPSC-aggregaten in microwells

1. Aspirateer voorzichtig en vervang het medium zonder de aggregaten te verstoren of los te maken.
   1. Kantel de plaat en aspireer langzaam ongeveer 1,0 mL medium uit elke put met een P1000-pipet, zodat de aggregaten in de microwells blijven zitten.
   2. Aspireer langzaam de resterende ~500 μL medium met een P1000 pipet.
   3. Voeg 1,5 mL feeder-vrije iPSC-medium toe aan elke put door het langzaam langs de rand van de put te doseren met een serologische pipet.
   4. Incubeer bij 37 °C, 5% CO₂ en herhaal dagelijks de mediumwissel.
      CRUCIAAL: Doseer medium op de wand van de put en vermijd directe stroom op aggregaten.

4. Cardiale differentiatie van iPSC-aggregaten (Dag 0 tot Dag 12)

1. Mesoderminductie (dag 0).
   1. Verwijder medium met de zachte aspiratiemethode beschreven in stappen 3.1.1–3.1.2.
   2. Voeg 1,5 mL per put toe van basaal medium, aangevuld met 2% B27 minus insuline en de Wnt/β-catenine-pathway activator (CHIR99021, eindconcentratie: 11 μM).
      OPMERKING: Bereid een 10 mM voorraadoplossing van CHIR99021, een klein-molecuul remmer van glycogeensyntase-kinase-3 (GSK-3). Om een uiteindelijke concentratie van 11 μM te bereiken, voeg je 1,65 μL van de standaardoplossing toe aan 1,5 mL medium.
2. Middelmatige verandering na inleiding (dag 1).
   1. Na 24 uur na toevoeging van CHIR99021 aspireer je het medium voorzichtig uit elke put.
   2. Voeg 1,5 ml per put toe van vers basaal medium aangevuld met 2% B27 minus insuline, en incubeer dan 48 uur.
      KRITISCH: Houd je strikt aan de timing van de Wnt-modulatiestappen, omdat afwijkingen de differentiatie-efficiëntie kunnen aantasten.
      OPMERKING: Er wordt enige celdood verwacht na blootstelling aan de Wnt/β-catenine-pathway activator. Als er een groot aggregateverlies wordt waargenomen, overweeg dan om de concentratie van de activator in toekomstige experimenten te verlagen.
3. Hartopname via WNT-remming (dag 3).
   1. Bereid het geconditioneerde medium voor door 760 μL verbruikt medium van elke put over te brengen naar een steriele 50 mL conische buis.
   2. Voeg voor elke put 760 μL vers basaal medium met 2% B27 zonder insuline toe aan de buis met het geconcentreerde medium, en meng voorzichtig.
   3. Voeg de Wnt-route-remmer, IWP4, toe aan het gemengde medium tot een uiteindelijke concentratie van 5 μM en draai de buis voorzichtig meerdere keren om te mengen om te mengen.
   4. Aspireer voorzichtig het resterende medium uit elke put en voeg vervolgens per put 1,5 mL van geconditioneerd medium toe, aangevuld met IWP4.
   5. Incubeer bij 37 °C met 5% CO₂ gedurende 48 uur.
      OPMERKING: Bereid een 1 mM stockoplossing van de Wnt-route-remmer IWP4 voor. Om een uiteindelijke concentratie van 5 μM te bereiken, voeg je 7,6 μL van de voorraadoplossing toe per 1,52 mL totaal medium (760 μL geconditioneerd medium + 760 μL vers basaal medium) voor elke put.
4. Middelmatige verandering in microwells (dag 5).
   1. Vervang medium met de zachte aspiratiemethode zoals beschreven in stappen 3.1.1–3.1.2.
   2. Voeg 1,5 mL basaal medium toe, aangevuld met 2% B27 minus insuline, aan elke put en incubeer vervolgens bij 37 °C met 5% CO₂ gedurende 48 uur.
5. Overbreng aggregaten van microwells naar 6-well platen (dag 7).
   1. Aspireer het medium zorgvuldig uit elke put met behulp van de zachte aspiratiemethode beschreven in stappen 3.1.1–3.1.2.
   2. Voeg 1,0 ml basaal medium toe, aangevuld met 2% B27 met insuline, aan elke put van de microwellplaat. Met een P1000-pipet pipeteert u het medium vijf keer op en neer terwijl de pipetpunt in een cirkelvormige beweging over het putoppervlak beweegt om de aggregaten in de microwells los te maken en in suspensie te brengen.
   3. Breng de aggregate suspensie over naar één put van een niet-behandelde 6-put kweekplaat.
   4. Spoel elke put van de microwellplaat twee tot drie keer met een extra 1,0 mL vers medium om eventuele resterende aggregaten terug te winnen, waarbij elke spoeling wordt overgebracht naar dezelfde put van de 6-well plaat.
   5. Incubeer bij 37 °C met 5% CO₂ gedurende 72 uur.
      OPMERKING: De aanwezigheid van dode cellen en cellulair afval na de aggregate overdracht wordt verwacht. Het meeste vuil wordt verwijderd tijdens de daaropvolgende mediumwissel.
6. Middelmatige verandering tijdens de opsuspensiecultuur (dag 10).
   1. Beweeg de plaat voorzichtig om losjes vastzittende aggregaten los te maken.
   2. Kantel de plaat zodat de aggregaten door de zwaartekracht op de bodem van de put kunnen neerzetten.
   3. Aspireer het verbruikte medium zorgvuldig zonder de aggregaten te verstoren of te aspireren.
   4. Voeg 2,0 mL vers basaal medium toe, aangevuld met 2% B27 met insuline, aan elke put en incubeer bij 37 °C met 5% CO₂ gedurende 48–72 uur.
      OPMERKING: Spontane slagen worden meestal waargenomen vanaf ongeveer dag 10.
      PAUZEPUNT: Kloppende cardioïden kunnen in suspensiecultuur worden gehouden voor langdurige rijping door het medium elke 2–3 dagen te vervangen.

5. Microscopische karakterisering van cardioïden

OPMERKING: Deze methode biedt een workflow voor de histologische karakterisering van cardioïden met behulp van cryosecties. De resulterende secties kunnen worden gebruikt voor diverse histologische analyses, waaronder hematoxyline- en eosinekleuring (H&E) om de algehele weefselarchitectuur te beoordelen en immunofluorescentielabeling om de identiteit van cardiomyocyten te evalueren.

1. Fixatie en cryosectie.
   1. Fix cardioïden in 4% paraformaldehyde 's nachts bij 4 °C.
      VOORZICHTIG: Paraformaldehyde is giftig en waarschijnlijk een kankerverwekkend stof; Behandel het in een chemische dampkap terwijl je passende persoonlijke beschermingsmiddelen draagt. Verzamel al het afval dat paraformaldehyde bevat (fixatief en wasmiddelen) in een duidelijk gelabelde container voor aldehyde/chemisch gevaarlijk afval, en voer dit af volgens de institutionele procedures voor gevaarlijk afval.
      VEILIGHEID: Voer alle fixatie en hantering van paraformaldehyde uit in een chemische dampkap terwijl je passende persoonlijke beschermingsmiddelen draagt.
   2. Was drie keer met PBS en cryoprotecteer de vaste cardioïden in 30% (met v/v) sucrose in PBS 's nachts bij 4 °C.
   3. Leg de cardioïden in gelatine, vries en snijd cryosecties van 10 μm dik op microscoopglaas. Bewaar de secties op −20 °C tot gebruik.
2. Immunolabeling.
   1. Ontdooi de secties 15 minuten op kamertemperatuur.
   2. Was de secties in PBS op 37 °C gedurende 10 minuten, twee keer.
   3. Omcirkel het interessegebied op elke dia's met een hydrofobe pen om een put te creëren die de blokkering en antistofoplossingen behoudt.
   4. Rehydrateer de secties gedurende 2–3 minuten in een permeabilisatiebuffer (PB; PBS met 0,1% Tween-20) in een Coplin-pot.
   5. Haal de glaasjes uit PB, laat de overtollige oplossing aflopen en plaats de glaasjes in een vochtige kamer.
      KRITISCH: Vanaf nu is het cruciaal om de secties niet te laten drogen.
   6. Blokkeer de secties met 200–300 μL PB met 5% fotaal rundserum (FBS) gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur in een vochtige kamer.
   7. Verwijder de blokkerende oplossing en incubeer de secties een nacht bij 4 °C met 100 μL primaire antistof (anti-cMYBP-C; 1:50) verdund in blokkerende oplossing (PB met 1% FBS).
   8. Was de glaasjes drie keer met PB en incubeer ze 2 uur op kamertemperatuur met een groene fluorescerende anti-muis secundair antilichaam (1:200), rood fluorescerend falloïde (1:400) en DAPI (1 μg/mL).
   9. Was drie keer in PB en monteer met een antifade montagemedium.
      VOORZICHTIG: Verzamel alle fluorescentiekleurstofhoudende oplossingen (secundaire antistoffen, falloïde en DAPI-kleuringsoplossingen en de bijbehorende wasbeurten) in een container en voer ze af als chemisch afval volgens de institutionele richtlijnen.
3. Beeldverwerving.
   1. Maakt confocale beelden met een laser-scannende confocale microscoop uitgerust met een arraydetector voor superresolutiebeeldvorming met een 10× en een 63×/1,40 olie-immersieobjectief.
   2. Exciteer de ver-rode fluorofoor, groene fluorofoor en nucleaire kleuring met laserlijnen van respectievelijk 639 nm, 488 nm en 405 nm lasertransmissies bij 4,0%, 4,0% en 1,0%.
   3. Enkele optische secties verkrijgen met een pixelgrootte van 0,0353 × 0,0353 μm², unidirectioneel scannen, scansnelheid 6, zoom 1,7, lijngemiddelde 1, en een pixelverblijftijd van 0,935 μs per pixel.
   4. Pas arraydetector superresolutie beeldverwerking toe met automatische Wiener-filtering.

6. Fluorescentie-oligonucleotide opnametest

1. Bereid een voorraadoplossing voor van het fluorescentie-gelabelde oligonucleotide geconjugeerd aan palmitinezuur om de lipofilie te verhogen.
   1. Reconstrueren van het gelyofilieerde, fluorescerend gelabelde oligonucleotide in nucleasevrij water tot een uiteindelijke concentratie van 1 mM. Vortex kort en centrifugeer op 3.000 × g gedurende 30 seconden om de oplossing onderin de buis op te vangen.
   2. Bereid eenmalige aliquots van de 1 mM voorraadoplossing voor en bewaar bij −20 °C beschermd tegen licht.
   3. Voeg op de dag van het experiment 1 μL van de 1 mM voorraad toe aan 1 mL cardioïde kweekmedium om een uiteindelijke oligonucleotideconcentratie van 1 μM te verkrijgen. Meng door zachte plaatroering.
2. Incubeer cardioïden met het fluorescentief-gelabelde oligonucleotide (1 μM eindconcentratie) in serumvrij medium bij 37 °C met 5% CO₂ gedurende 24 uur.
3. Was de cardioïden drie keer met fosfaatgeborrelde zoutoplossing (PBS) om extracellulaire oligonucleotide te verwijderen.
4. Fix de cardioïden in 4% paraformaldehyde gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur, was drie keer met PBS en ga door met fluorescerend labelen voordat je beelden maakt.
5. Incubeer intacte gefixeerde cardioïden 's nachts bij 4 °C, beschermd tegen licht, in PBS met 5 μg/mL tarwekiemagglutinine (WGA) geconjugeerd met een groene fluorofoor en 1 μg/mL DAPI. Was drie keer in PBS en monteer met een antifade montagemedium.
   VOORZICHTIG: Verzamel alle oligonucleotide- en fluorescerend kleurstofhoudende media en wasmiddelen, inclusief het gelabelde oligonucleotide incubatiemedium uit stap 6.2 en de WGA/DAPI-kleuringsoplossing, in een aparte container en voer ze af als chemisch/biologisch gevaarlijk afval volgens de richtlijnen van de instelling.
6. Maak confocale beelden van de opname en verspreiding van oligonucleotides.
   1. Maak confocale beelden met een laser-scannende confocale microscoop uitgerust met een arraydetector voor superresolutiebeeldvorming en een 40× wateronderdompelingsobjectief. Verslaat beelden als z-stacks van 8 secties met een z-stapgrootte van 2 μm, die een totale diepte van 16 μm beslaan.
   2. Exciteer de nucleaire kleuring, membraanmarker en het verrood fluorescerend gelabelde oligonucleotide met laserlijnen van respectievelijk 405 nm, 488 nm en 639 nm bij 0,9%, 0,2% en 3,0% lasertransmissie.
   3. Opnames van beelden met een voxelgrootte van 0,0449 × 0,0449 × 2 μm³, bidirectioneel scannen, scansnelheid 5, lijngemiddelde 1, en een pixel-verblijftijd van 1,51 μs per pixel. Pas Airyscan/superresolutie beeldverwerking toe met automatische Wiener-filtering.
   4. Houd alle acquisitie-instellingen (laservermogen, detectorversterking, z-stap en voxelgrootte) constant over alle z-posities en over alle monsters om een valide vergelijking van het oligonucleotidesignaal tussen omstandigheden mogelijk te maken.

Resultaten

Figuur 1 vat de differentiatieworkflow samen en illustreert de karakteristieke morfologische veranderingen die in elke fase van het protocol worden verwacht, van iPSC-aggregatie tot de vorming van zelforganiserende cardioïden. Suspensie-gebaseerde microwell-aggregatie biedt een eenvoudige en gestandaardiseerde aanpak voor de parallelle generatie van grote aantallen groottegecontroleerde cardioïden. Succesvolle differentiatie wordt gekenmerkt door het genereren van gelijkmatig grote aggregaten, gevolgd door de ontwikkeling van interne holtes en het begin van spontane slagen, meestal vanaf ongeveer dag 10. Samen bieden deze morfologische kenmerken praktische kwaliteitscontrolepunten voor het beoordelen van de efficiëntie en reproduceerbaarheid van cardioïde generatie.

De cardioïde architectuur en weefselorganisatie kunnen worden beoordeeld door histologische analyse van cryosecties. Zoals weergegeven in Figuur 2, onthult hematoxyline- en eosinekleuring (H&E) van succesvol gedifferentieerde cardioïden goed georganiseerde driedimensionale weefsels met één of meer interne holtes omgeven door compacte cellulaire lagen, wat consistent is met kamerachtige organisatie. Succesvolle cardioïden vertonen doorgaans geen necrotische gebieden en minimale structurele fragmentatie. Daarentegen veroorzaken suboptimale differentiaties vaak onregelmatige of ingestorte structuren zonder zichtbare holtes, wat wijst op een verstoorde zelforganisatie van het weefsel.

Cardiomyocytdifferentiatie kan verder worden geëvalueerd door immunofluorescentiekleuring van cryosecties. Zoals geïllustreerd in Figuur 3A–B, vertonen succesvolle cardioïden een brede expressie van de sarcomerische marker cMYBP-C, georganiseerd in sterk geordende, periodieke striaties die kenmerkend zijn voor sarcomeren. Deze gestreepte structuren zijn breed verspreid over het weefsel en zijn vaak uitgelijnd langs de longitudinale as van de cardiomyocyten, wat een efficiënte hartdifferentiatie weerspiegelt. Daarentegen vertonen suboptimale cardioïden zwakke, vlekkerige of regionaal beperkte sarcomerische kleuring, vaak beperkt tot perifere gebieden, met uitgestrekte gebieden zonder detecteerbaar signaal, wat wijst op inefficiënte cardiomyocytdifferentiatie.

De opname van fluorescentief-gelabelde oligonucleotiden kan worden beoordeeld door zowel live-celbeeldvorming als confocale microscopie van gefixeerde cardioïden. Zoals getoond in Figuur 4, wordt succesvolle opname gekenmerkt door gemakkelijk detecteerbare intracellulaire oligonucleotide geassocieerde fluorescentie die als discrete puncta wordt verspreid, wat consistent is met endosomale lokalisatie. WGA afbakent celmembranen en DAPI contrasteert kernen, waardoor bevestiging van intracellulaire oligonucleotide lokalisatie mogelijk wordt. Naast het bieden van kwalitatieve visualisatie van de opname van oligonucleotides, kunnen de verworven beeldstacks worden gebruikt voor kwantitatieve analyses, waaronder fluorescentieintensiteit per punctum, puncta-aantal per cel en het percentage oligonucleotide-positieve cellen. Zoals weergegeven in Figuur 5A–C, maakt Z-stack imaging het mogelijk om de oligonucleotideverdeling in het driedimensionale weefsel verder te beoordelen, waarbij fluorescentie wordt gedetecteerd over meerdere optische secties die zich uitstrekken van het oppervlak naar het binnenste van het cardioïde, wat wijst op effectieve weefselpenetratie.

Figuur 1: Werkwijze voor het genereren van menselijke iPSC-afgeleide cardioïden. Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) worden geaggregeerd in microwellplaten (Dag−2) en onderworpen aan gerichte cardiale differentiatie door temporele modulatie van Wnt-signalering. Mesoderm-inductie wordt gestart op dag 0 door behandeling met de Wnt-pathway-activator CHIR99021 in basaal medium aangevuld met B27 minus insuline, gevolgd door verwijdering van de activator op dag 1. Cardiale specificatie wordt op dag 3 geïnduceerd door behandeling met de Wnt-route-remmer IWP4, die op dag 5 wordt verwijderd. Op dag 7 worden de aggregaten overgebracht naar 6-wellplaten en gehouden in basaal medium aangevuld met insuline dat B27 bevat. Op dag 14 zijn zelforganiserende cardioïden gevestigd en geschikt voor downstream toepassingen, waaronder oligonucleotidopname-assays. Deze afbeelding is gemaakt door de auteurs met Biorender, en de vereiste auteursrechtlicentie is bijgevoegd. Representatieve brightfield-beelden die op de aangegeven tijdstippen zijn gemaakt, illustreren de verwachte morfologische progressie van uniform grote iPSC-aggregaten naar cavitatieve, zelforganiserende cardioïden. Schaalbalk = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Histologische karakterisering van menselijke iPSC-afgeleide cardioïden. Vertegenwoordigende hematoxyline- en eosine-(H&E)-gekleurde cryosecties van dag 14 cardioïden die interne holtes laten zien omgeven door compacte cellulaire lagen, wat overeenkomt met kamerachtige weefselorganisatie. Beelden werden gemaakt met een beeldmicroscoop. Kwantificering van differentiatie-uitkomsten toonde aan dat 94,0 ± 2,6% van de cardioïden spontane klopping vertoonden en 60,3 ± 20,6% één of meer zichtbare interne holtes bevatte. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD uit drie onafhankelijke differentiaties, met ongeveer 115 cardioïden geanalyseerd per differentiatie. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Immunofluorescentiekarakterisering van cardiomyocytdifferentiatie. Vertegenwoordigende cryosecties van cardioïden van dag 14. (A) DAPI-kleuring toont de verdeling van celkernen. (B) Immunofluorescentiebeeld toont kernen gelabeld met DAPI (blauw) en sarcomeren gelabeld met een antilichaam tegen cardiale myosine-bindend eiwit C (cMYBP-C, groen), wat georganiseerde sarcomerische structuren in gedifferentieerde cardiomyocyten aantoont. Beelden werden gemaakt met laser-scannende confocale fluorescentiemicroscopie met een 10×/0,30 droogobjectief (links) en een 63×/1,40 olie-immersieobjectief (rechts). Schaalbalken = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Beeldvorming van oligonucleotide-opname door cardioïden. Confocale beelden die de intracellulaire lokalisatie van fluorescentief-gelabelde antisense-oligonucleotiden (ASO's, geel) tonen bij cardioïden van dag 14. Celmembranen zijn gelabeld met fluorescerende tarwekiemen agglutinine (WGA, magenta), en kernen worden gekleurd met DAPI (blauw). ASO-geassocieerde fluorescentie wordt gedetecteerd als discrete intracellulaire puncta (pijlen). De onderste panelen tonen negatieve controle cardioïden die niet geïncubeerd zijn met fluorescerende ASO's. Beelden in de rechterpanelen komen overeen met hogere vergrotingsweergaven van de ingebakelde gebieden in de linker panelen. Representative beelden werden gemaakt met laser-scannende confocale microscopie met arraydetector superresolutie beeldvorming met een 40× wateronderdompelingsobjectief. Schaalbalken = 10 μm (links) en 5 μm (rechts). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Beoordeling van de penetratie van oligonucleotiden door de cardioïden. (A) Schema dat de verwerving van optische secties op toenemende dieptes binnen de cardioïde illustreert. Deze afbeelding is gemaakt door de auteurs met Biorender, en de vereiste auteursrechtlicentie is bijgevoegd. (B) Representatieve confocale beelden die de verdeling tonen van fluorescerend gelabelde ASO's op z-posities van 0 μm, 6 μm en 10 μm ten opzichte van het weefseloppervlak. De beeldinstellingen werden constant gehouden over alle z-posities. Schaalbalk = 10 μm. (C) Kwantificering van het percentage cellen met ten minste één ASO-geassocieerd punctatesignaal op elke beeldvormingsdiepte toonde een vergelijkbare oligonucleotide-opname door het hele weefsel, met 83,1 ± 2,5%, 84,9 ± 4,5% en 84,0 ± 4,5% ASO-positieve cellen bij respectievelijk 0 μm, 6 μm en 10 μm. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD van drie cardioïden, met drie optische secties geanalyseerd per cardioïde en in totaal 1.305 cellen gekwantificeerd. Representative beelden werden gemaakt met laser-scannende confocale microscopie met arraydetector superresolutie beeldvorming met een 40× wateronderdompelingsobjectief. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Video 1: Time-lapse sequentie. Een video die is opgenomen met 40 frames per seconde toont spontane contractiele activiteit bij cardioïden. De beeldvorming werd uitgevoerd met een breedveldmicroscoop uitgerust met een sCMOS-camera. Klik hier om deze video te downloaden.

Discussie

Oligonucleotide gebaseerde therapieën zijn uitgegroeid tot een krachtige klasse van gengerichte modaliteiten, ondersteund door decennia van vooruitgang in de oligonucleotidchemie die de doelspecificiteit, metabole stabiliteit en immunogene tolerantie hebben verbeterd ^7,8. Ondanks het toenemende aantal klinisch goedgekeurde RNA-therapieën, blijft hun bredere toepassing beperkt door inefficiënte intracellulaire levering ^7,8. Vanwege hun grootte, lading en hydrofilicititeit kunnen oligonucleotiden niet passief over het plasmamembraan diffunderen en worden ze in plaats daarvan geïnternaliseerd via endocytische routes ^9,10. Na opname blijft de overgrote meerderheid (~99%) van de geïnternaliseerde oligonucleotiden geconcentreerd in endosomale compartimenten ^9,10. Endosomale handel verloopt door een rijpingsproces van vroege tot late endosomen en uiteindelijk lysosomen; De precieze compartimenten waaruit oligonucleotiden naar het cytosol ontsnappen, zijn echter nog onvolledig begrepen en kunnen meerdere endosomale populaties omvatten⁹. Deze beperkte cytosolische afgifte vormt een kritieke snelheidsbeperkende barrière en onderstreept de noodzaak van fysiologisch relevante experimentele systemen die kwantitatieve beoordeling van oligonucleotide-opname, intracellulaire transport en endosomale^ontsnapping mogelijk maken.

Het hier beschreven protocol is ontwikkeld om aan deze behoefte te voldoen door menselijke iPSC-afgeleide cardioïden te combineren met beeldvormingsgebaseerde uitlezingen van oligonucleotide-opname. De robuustheid van dit systeem is afhankelijk van verschillende kritieke stappen die direct invloed hebben op reproduceerbaarheid en experimentele uitkomsten. Ten eerste is de kwaliteit van de startende iPSC-culturen een belangrijke factor voor succesvolle hartdifferentiatie. De auteurs bevelen periodieke karyotypeanalyse aan om langdurige genomische stabiliteit te waarborgen en routinematige beoordeling van koloniemorfologie, integriteit en groeidynamiek. Hoogwaardige culturen worden gekenmerkt door compacte, goed gedefinieerde kolonies met gladde grenzen, minimale spontane differentiatie en consistente proliferatie. Culturen met onregelmatige kolonieranden, heterogene celmorfologie of differentiatiegebieden moeten worden verworpen en vervangen door laagdoorgewinterde bevroren voorraden voordat differentiatie wordt gestart.

Een tweede cruciale stap is de gecontroleerde vorming van iPSC-aggregaten met behulp van microwellplaten, wat de generatie van uniforme, grootte-gedefinieerde driedimensionale structuren bevordert die essentieel zijn voor reproduceerbare cardiale differentiatie²¹. Microwell-gebaseerde aggregatie genereert embryoide lichamen met gedefinieerde diameters (optimaal 200–230 μm), waarmee cel-celinteracties en blootstelling aan morfogengradiënten tijdens de temporele modulatie van Wnt-signalering worden gestandaardiseerd. Uit onze ervaring wordt deze grootte consequent bereikt door ongeveer 3.000 cellen per individuele microwell te zaaien (stap 2.2), een aandoening die empirisch geoptimaliseerd en gevalideerd is over meerdere menselijke iPSC-lijnen, inclusief commercieel verkrijgbare lijnen en lijnen die intern zijn herprogrammeerd. Omdat de proliferatiesnelheden van iPSC kunnen variëren, kan de optimale zaaidichtheid aanpassing vereisen om de gewenste aggregategrootte te behouden. Het niet beheersen van deze parameters kan leiden tot heterogene structuren, verminderde levensvatbaarheid en verminderde differentiatie-efficiëntie.

Histologische analyse, zoals weergegeven in Figuur 2, biedt een handige kwaliteitscontrole van de vorming van cardioïden. In het bijzonder kan het ontbreken van interne holtes of de aanwezigheid van ingestorte of gefragmenteerde structuren wijzen op suboptimale aggregatevorming of onvoldoende temporele controle van Wnt-signalering tijdens de differentiatiestappen (stappen 4.1–4.3). Bij sommige mislukte differentiaties ontstaan niet-contractiele celpopulaties binnen of rond de cardioïden. Deze cellen lijken typisch gelig bij brightfield-microscopie en hechten zich meestal aan kweekplaten met lage hechting, terwijl cardiomyocytenrijke cardioïden over het algemeen grijs zijn, compacte driedimensionale structuren blijven en zich niet gemakkelijk hechten. Als een aanzienlijk deel van de aggregaten dit hechtende, niet-contractiele fenotype vertoont, moet de differentiatie als suboptimaal worden beschouwd. In dat geval moet de probleemoplossing beginnen met het herzien van de iPSC-koloniemorfologie voordat differentiatie wordt uitgevoerd, waarbij de totale grootte tussen Dag −1 en Dag 0 wordt bevestigd, en indien nodig de zaaidichtheid en de concentraties van CHIR99021 en IWP4 voor de specifieke iPSC-lijn opnieuw wordt geoptimaliseerd.

Lage of afwezige spontane klopping op dag 10–12 weerspiegelt meestal inefficiënte mesoderm-inductie of hartspecificatie, meestal door een ongeschikte Wnt-modulator concentratie of timing, of door overmatige celdood na CHIR99021 behandeling (Stap 4.2). Uit onze ervaring kan het titreeren van CHIR99021 binnen een bereik van 9–13 μM per iPSC-lijn en het verifiëren van de concentratie en activiteit van stockoplossingen de differentiatie-efficiëntie aanzienlijk verbeteren. Immunofluorescentieanalyse van de organisatie van sarcomerische eiwitten, zoals weergegeven in Figuur 3, biedt een handige kwaliteitscontrole van cardiomyocytdifferentiatie. Zwakke of vlekkerige kleuring van sarcomereiwit, vooral wanneer beperkt tot perifere gebieden van het cardioïde, wijst doorgaans op onvolledige of heterogene cardiomyocytdifferentiatie. In deze gevallen wordt het verlengen van de rijpingsperiode van de suspensiecultuur (stap 4.6 en pauzepunt) vóór fixatie en het verifiëren van fixatie- en antistofkleuringsvoorwaarden aanbevolen.

Hoewel dit cardioïde model een driedimensionale menselijke cardiale microomgeving biedt die aanzienlijk verbetert ten opzichte van conventionele tweedimensionale cardiomyocytenculturen, herhaalt het niet volledig de complexiteit van het volwassen menselijk hart. Cardioïden vormen een vroeg stadium van de menselijke hartontwikkeling, waarbij cardiomyocyten een onvolwassen, foetale-achtig fenotype¹⁴ behouden. Bovendien missen de weefsels vasculaire perfusie, innervatie, aanwezige immuuncellen en de volledige kamerspecifieke architectuur van het volwassen myocardium. Daarom is dit platform goed geschikt voor het onderzoeken van cellulaire opname en intracellulaire distributie van oligonucleotiden onder gecontroleerde experimentele omstandigheden, maar moet voorzichtigheid worden betracht bij het extrapoleren van opnamekinetiek en afgiftemechanismen direct naar de in vivo omgeving. De toekomstige integratie van extra hartceltypen, vaatnetwerken en weefselrijpingsstrategieën zou de fysiologische relevantie van dit platform verder moeten vergroten.

Betrouwbare beoordeling van de opname van oligonucleotiden door de cardioïden die in dit protocol worden beschreven, vereist optimalisatie en standaardisatie van ASO-concentratie, incubatietijd en beeldvormingsinstellingen, zoals weergegeven in Figuur 4 en Figuur 5. De keuze van fluorofoor is bijzonder belangrijk, omdat kleurstoffen verschillen in helderheid, fotostabiliteit en gevoeligheid voor omgevingseffecten. In deze studie gebruikten we Janelia Fluor 646 (JF646)²², een verrood silicium-rhodamine fluorofoor met hoge helderheid en fotostabiliteit die robuuste signaaldetectie biedt en tegelijkertijd autofluorescentie in driedimensionale monsters minimaliseert. Deze eigenschappen maken het zeer geschikt voor het beelden van de opname van oligonucleotidepatiënten in levende of gefixeerde cardioïden. Opmerkelijk is dat fluoroforconjugatie het gedrag van oligonucleotiden kan beïnvloeden, inclusief opname en transport, en daarom voor elk experimenteel systeem gevalideerd moet worden.

In zijn huidige vorm biedt dit protocol zowel kwalitatieve als kwantitatieve beoordeling van de opname van oligonucleotides. Confocale beeldvorming van intracellulaire ASO-geassocieerde puncta maakt visualisatie van oligonucleotidelokalisatie binnen cardioïden mogelijk, terwijl de opname-efficiëntie wordt gekwantificeerd door handmatig het percentage ASO-positieve cellen te bepalen met behulp van de Cell Counter-plugin in Fiji/ImageJ. Hoewel deze aanpak goed geschikt is voor de hier gepresenteerde moderate-throughput analyses, is handmatige beeldanalyse arbeidsintensief en kan het gevoelig zijn voor waarnemersbias, vooral wanneer het wordt toegepast op grote datasets. Recente ontwikkelingen in zelf-supervised deep learning voor driedimensionale microscopie bieden veelbelovende kansen om deze beperkingen te overwinnen. AI-gebaseerde beeldanalyse kan heterogene subcellulaire structuren in complexe driedimensionale omgevingen nauwkeurig segmenteren, identificeren en volgen, waardoor geautomatiseerde kwantificering van oligonucleotide-opname en intracellulaire transport, inclusief endosomale dynamica²³. De opname van deze benaderingen in toekomstige implementaties van het protocol zou de doorvoersnelheid, reproduceerbaarheid en analytische precisie moeten verbeteren.

Vooruitkijkend biedt de integratie van humane iPSC-afgeleide cardioïden met kwantitatieve beeldvorming, machine learning-gebaseerde beeldanalyse en enkeldeeltjesmethodologieën een krachtig kader voor het onderzoeken van de mechanismen die de levering van oligonucleotiden in menselijk hartweefsel regelen. Het combineren van fysiologisch relevante driedimensionale cardiale modellen met geavanceerde analytische tools die in staat zijn subcellulaire organisatie en dynamiek op te lossen, zal een uitgebreide kwantitatieve karakterisering van oligonucleotide-opname, intracellulaire transport en, met passende complementaire assays, endosomale ontsnapping mogelijk maken. Dergelijke geïntegreerde benaderingen worden verwacht de systematische identificatie van factoren die de afgifte-efficiëntie bepalen te faciliteren, de rationele optimalisatie van oligonucleotidechemieën en toedieningsvoertuigen ondersteunen, en een schaalbaar platform bieden voor het evalueren van opkomende oligonucleotidetherapieën in de context van hart- en vaatziekten.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
4', 6-diamidino-2'-phenylindole, dihydrochloride	Thermo Scientific	62248	DAPI
10× dry objective	Zeiss		EC Plan-Neofluar 10×/0.30
40× water objective	Zeiss		LD C-Apochromat 40×/1.10 Corr
63× oil-immersion objective	Zeiss		Plan-Apochromat 63×/1.40 Oil DIC M27
800-µm microwell aggregation plate	STEMCELL Technologies	34815	AggreWell 800
Andor Neo 5.5 sCMOS camera	Andor		Andor Neo 5.5
Antifade mounting medium	Vector Laboratories	H-1000-10	VECTASHIELD Antifade Mounting Medium
B27 supplement minus insulin, 50×	Gibco	A18956-01	B27 Minus Insulin 50×
B27 supplement with insulin, 50×	Gibco	17504-044	B27 Supplement 50×
Basal Medium	Gibco	21875-034	RPMI 1640
Basement-membrane matrix	Gibco / Corning	A14132-02 / 354230	Geltrex LDEV-Free / Matrigel LDEV-Free
brightfield microscope	EVOS		EVOS XL Core Imaging Microscope
Cell detachment solution	STEMCELL Technologies	07922	ACCUTASE
confocal microscope	ZEISS		ZEISS LSM 980 with Airyscan 2 Microscope
Defined feeder-free iPSC maintenance medium	STEMCELL Technologies	100-0276	mTeSR Plus
DMEM/F12	Gibco	31331-028	DMEM/F12
Non-treated 6-well plate	Avantor (VWR)	734-2777	Untreated 6-well Plate
Phalloidin	Thermo Scientific	A22287	Phalloidin Labeling Probes ALexa 647
Phosphate-buffered saline (1× PBS)	Gibco	14190-144	DPBS 1×
primary antibody c-MYBPC3	Santa Cruz	sc-137181	MYBPC3 Antibody (F-1)
ROCK inhibitor	STEMCELL Technologies	72304	ROCK Inhibitor (Y-27632)
Secondary antibody (green)	Thermo Scientific	A-11017	F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Washing medium supplement	Gibco	10828028	KnockOut Serum Replacement
WGA, Alexa Fluor™ 488 conjugate	Invitrogen	W11261	WGA
widefield microscope	Nikon		Nikon Eclipse Ti
WNT pathway inhibitor	STEMCELL Technologies	72552	IWP4
Wnt/β-catenin pathway activator	Sigma	SML1046	CHIR99021