Eenvoudige en toegankelijke ei-uitkomstassays in Caenorhabditis elegans: Aanpasbare formaten voor drugsscreening

Samenvatting

Deze studie presenteert een flexibel en gestandaardiseerd ei-uitkomstassayplatform in Caenorhabditis elegans dat meerdere experimentele formaten integreert. De aanpak verbetert reproduceerbaarheid, schaalbaarheid en toegankelijkheid, waardoor robuuste evaluatie van geneesmiddeleffecten en ontwikkelingsprocessen mogelijk is, terwijl het kosteneffectief en gemakkelijk aanpasbaar blijft voor zowel onderzoekstoepassingen als onderwijsomgevingen.

Samenvatting

Ei-uitkomstassays (EHA) worden veel gebruikt om de effecten van chemische verbindingen op vroege ontwikkelingsstadia van nematoden te evalueren, met name in anthelmintic-onderzoek. Bestaande methodologieën verschillen echter aanzienlijk in formaat, complexiteit en reproduceerbaarheid, en worden vaak gepresenteerd als vaste protocollen in plaats van aanpasbare experimentele kaders. In deze studie stellen we een eenvoudig, toegankelijk en flexibel platform voor ei-uitkomstassays in Caenorhabditis elegans op door drie experimentele configuraties te integreren en direct te vergelijken: (i) gecontroleerde incubatie in microcentrifugebuizen gevolgd door zaaien op agarplaten, (ii) directe blootstelling aan medicijnhoudende agarplaten, en (iii) meerlaag-gebaseerde vloeistofassays. Twee representatieve verbindingen werden gebruikt om de test te illustreren: één die het uitkomen van eieren remt en één die geen detecteerbaar effect heeft. Elke configuratie biedt duidelijke voordelen op het gebied van experimentele besturing, doorvoer en toegankelijkheid. De op microcentrifuge gebaseerde buisbenadering maakt nauwkeurige controle van geneesmiddelblootstelling mogelijk en ondersteunt kwantitatieve farmacologische analyses. Agar-gebaseerde assays bieden een vereenvoudigd en goedkope alternatief dat geschikt is voor continue blootstelling en onderwijsomgevingen. Multiwell-formaten maken schaalbare, gestandaardiseerde screening mogelijk, in overeenstemming met moderne geneesmiddelenontdekkingspijplijnen. Door deze formaten direct te vergelijken, laten we zien hoe methodologische keuzes de reproduceerbaarheid van de assay, de dynamiek van geneesmiddelblootstelling en biologische interpretatie beïnvloeden, met name in relatie tot stadia-specifieke factoren zoals de beschermende rol van de eierschaal en ontwikkelingsvariatie in moleculaire doelexpressie. Al met al vestigt dit werk ei-uitkomstassays in C. elegans als een veelzijdig en schaalbaar platform dat zich kan aanpassen aan diverse toepassingen, waaronder anthelmintische screening, toxicologische beoordeling, ontwikkelingsstudies en onderwijslaboratoria, waardoor een breder en rationeler gebruik van deze methodologie mogelijk wordt.

Inleiding

Ei-uitkomstassays (EHA) zijn al lange tijd gevestigd als een hoeksteenmethode in de nematologie voor het evalueren van ovicidale activiteit en vroege ontwikkelingseffecten van chemische verbindingen. Oorspronkelijk ontwikkeld voor parasitaire nematoden, kwantificeren deze assays de remming van embryonatie of larvale opkomst onder gecontroleerde in vitro omstandigheden, en leveren robuuste en biologisch relevante eindpunten zoals uitkomstpercentage- of concentratie-responsanalyse (bijv. EC₅₀ of IC₅₀)1,2,3,4,5,6,7.

Klassieke ei-gebaseerde benaderingen bij parasitaire nematoden zoals Haemonchus contortus en Trichostrongylus colubriformis zijn veel gebruikt om de effectiviteit van synthetische geneesmiddelen en natuurlijke producten te evalueren, evenals om anthelmintische resistentie te monitoren 1,2,6,8,9,10 . Deze methodologieën omvatten een reeks metingen, van directe beoordeling van eilevensvatbaarheid en uitkomst tot de evaluatie van larvale ontwikkeling na fecale kweek. Gezamenlijk hebben ze een centrale rol gespeeld in het koppelen van blootstelling aan geneesmiddelen aan de voortplantingsproductie van parasiet en het overdrachtspotentieel. Deze benaderingen vereisen echter vaak complexe monstervoorbereiding van geïnfecteerde gastheren, verlengde incubatietijden en gespecialiseerde infrastructuur, wat hun toegankelijkheid, schaalbaarheid en reproduceerbaarheid tussen laboratoriums kan beperken.

Het gebruik van Caenorhabditis elegans als modelorganisme is uitgegroeid tot een krachtige strategie om verschillende beperkingen die samenhangen met parasitaire nematoden te overwinnen. De korte levenscyclus, genetische tractie, eenvoudige kweek en het behoud van belangrijke moleculaire doelen die gedeeld worden met parasitaire soorten maken het bijzonder geschikt voor farmacologische, toxicologische en ontwikkelingsstudies. Belangrijk is dat embryogenese in C. elegans snel en zeer reproduceerbaar is, waardoor eilevensvatbaarheids- en uitkomstassays kunnen worden gebruikt als kwantitatieve en betrouwbare uitlezingen van vroege ontwikkelingsprocessen en hun verstoring door xenobiotica 11,12,13,14,15,16,17.

Daarnaast heeft de beschikbaarheid van goed gekarakteriseerde mutante stammen mechanistische inzichten mogelijk gemaakt in de werking en resistentie van geneesmiddelen. Eerdere studies hebben aangetoond dat resistentie tegen bioactieve verbindingen op een stadium-afhankelijke manier kan ontstaan, waarbij embryonale en larvale stadia een differentiële gevoeligheid vertonen. Zo zijn veranderingen in glutamaterge signalering geassocieerd met resistente fenotypen bij larven, terwijl het uitkomen van eieren onaangetast^bleef 14,18,19,20. Dit benadrukt de stadia-specifieke aard van medicijngevoeligheid en suggereert dat embryonale stadia verschillende doelwitten of een verschil in toegankelijkheid kunnen hebben in vergelijking met latere ontwikkelingsstadia.

Naast parasitologie zijn eilevensvatbaarheidstests in C. elegans steeds relevanter geworden in de toxicologie en vroege geneesmiddelenontwikkeling. Deze assays zijn niet alleen toegepast om anthelmintische activiteit te beoordelen, maar ook om ontwikkelingstoxiciteit en door medicijnen veroorzaakte embryonale defecten te evalueren, met uitkomsten die kunnen correleren met toxiciteitsprofielen^met hogere organismen ^15,16. Tegelijkertijd introduceert de aanwezigheid van de eierschaal belangrijke biologische beperkingen, omdat het fungeert als een beschermende en selectieve permeabiliteitsbarrière rondom het embryo^21,22. Als gevolg hiervan kunnen sommige bioactieve moleculen het embryo niet bereiken, ondanks dat ze activiteit tonen in latere ontwikkelingsstadia 14,19,23,24. De toegang tot het embryo hangt daarom waarschijnlijk af van de fysisch-chemische eigenschappen van elke verbinding, waaronder moleculaire grootte en polariteit. Dit kan bijdragen aan verschillen tussen de activiteit die wordt waargenomen bij ei-uitkomstassays en die in latere ontwikkelingsstadia. Dit onderscheid onderstreept het belang van het duidelijk definiëren van zowel de experimentele context als het biologische eindpunt dat wordt gemeten.

Methodologisch zijn ei-uitkomstassays in Caenorhabditis elegans uitgevoerd met een breed scala aan experimentele formaten, waaronder vloeibare broeding van gesynchroniseerde eieren, directe blootstelling aan agarplaten met medicijnen, en multiwell-gebaseerde assays aangepast voor screening^met medium tot hoge doorvoer.

Vloeistofgebaseerde en microplaatformaten zijn breed toegepast in farmacologische screeningsstudies, omdat ze homogene blootstellingsomstandigheden bieden, nauwkeurige controle van geneesmiddelconcentraties vergemakkelijken en kwantitatieve analyse van concentratie-responsrelaties mogelijk maken. Parallel zijn vergelijkbare multiwell-gebaseerde strategieën uitgebreid ontwikkeld voor parasitaire nematoden, variërend van conventionele 96-well plaatassays tot ultra-high-throughput platforms met 384-well formaten ^4,5. Samen benadrukken deze benaderingen de veelzijdigheid en schaalbaarheid van ei-uitkomstassays bij verschillende nematodensoorten en hun aanpassingsvermogen aan diverse experimentele omgevingen, van kleinschalige mechanistische studies tot grootschalige combinatiescreening.

Elk formaat heeft unieke voordelen en beperkingen op het gebied van experimentele controle, reproduceerbaarheid, doorvoer en toegankelijkheid. Vloeistofgebaseerde assays bieden homogene blootstellingsomstandigheden en zijn goed geschikt voor kwantitatieve farmacologische analyses, terwijl agar-gebaseerde assays continue blootstelling gedurende de ontwikkeling mogelijk maken maar variabiliteit introduceren die verband houdt met geneesmiddeldiffusie en biobeschikbaarheid. Multiwell-formaten maken op hun beurt parallelisatie en verminderen het reagentiaverbruik mogelijk, in lijn met moderne screeningsstrategieën.

Ondanks het wijdverbreide gebruik worden ei-uitkomstassays vaak gepresenteerd als vaste protocollen in plaats van als een flexibel methodologisch kader. Directe vergelijkingen tussen formaten zijn schaars, en richtlijnen voor het kiezen van de meest geschikte configuratie voor specifieke toepassingen, variërend van mechanistische studies tot high-throughput screening of onderwijsomgevingen, blijven beperkt.

In deze studie stellen we een eenvoudig, toegankelijk en aanpasbaar platform voor ei-uitkomstassays in C. elegans, waarbij we drie experimentele configuraties integreren en vergelijken: (i) gecontroleerde incubatie in microcentrifugebuizen gevolgd door zaaien op agarplaten, (ii) directe blootstelling op agarplaten met medicijnen, en (iii) meervoudige vloeistofassays.

Door deze configuraties systematisch te evalueren, streven we ernaar een praktisch kader te creëren dat de afwegingen tussen experimentele controle, eenvoud en schaalbaarheid benadrukt. Dit geïntegreerde perspectief verbindt klassieke parasitologische methodologieën met moderne modelgebaseerde screeningsbenaderingen, waarbij ei-uitkomstassays niet als één gestandaardiseerde techniek worden gepositioneerd, maar als een veelzijdig platform dat zich kan aanpassen aan diverse onderzoekscontexten, waaronder anthelmintische ontdekking, toxicologische beoordeling, ontwikkelingsbiologie en onderwijstoepassingen.

Protocol

1. Caenorhabditis elegans , stromingen en cultuur

1. Gebruik de wildtype N2 (Bristol) stam en/of de transgene stam PD4251 (ccIs4251; dpy-20(e1282)) om de methodologie^25,26 te ontwikkelen en te valideren. PD4251 drukt GFP uit, wat visualisatie en potentiële beeldvormingstoepassingen faciliteert wanneer nodig, terwijl het uitkomst- en ontwikkelingsreacties van ei vertoont die niet te onderscheiden zijn van die waargenomen in de wildtype N2-stam onder de experimentele omstandigheden die in deze studie werden gebruikt²⁷.
2. Verkrijg stammen (bijv. wildtype N2-stam) van het Caenorhabditis Genetic Center (CGC), ondersteund door het National Institutes of Health Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
3. Wormen onder standaard laboratoriumomstandigheden houden op 18–25 °C op vers bereide Nematode Growth Medium (NGM) agarplaten met Escherichia coli OP50 als voedselbron. Bereid NGM voor door 16 g agar, 3 g NaCl en 2,5 g bactopepton op te lossen in 975 mL gedistilleerd of ultrazuiver water. Steriliseer door autoclaven. Na het afkoelen van het medium tot 55 °C, voeg je steriele oplossingen toe van kaliumfosfaatbuffer (25 mL, 1 M, pH 6,0), CaCl₂ (1 mL, 1 M), MgSO₄ (1 mL, 1 M) en cholesterol (1 mL, 5 mg/mL in absolute ethanol). Meng grondig en giet platen onder steriele omstandigheden.
4. Voer routinematig omgaan, propagatie en onderhoud uit volgens vastgestelde procedures zoals beschreven in WormBook en gerelateerde studies 24,26,28,29. Houd wormen onder niet-uithongeromstandigheden door continue beschikbaarheid van bacteriën en overvolle borden te vermijden. Houd de kweek binnen het aanbevolen temperatuurbereik (18–25 °C) en vermijd extreem droge omstandigheden, omdat deze de agaruitdroging kunnen versnellen.
5. Algemene overwegingen voordat je met de test start
   1. Definieer alle experimentele parameters van tevoren, waaronder temperatuur (18–25 °C), incubatietijd (4–8 uur), luchtvochtigheid (50–70%) en behandelingsprocedures.
   2. Bereid alle materialen voor voordat de assay start om de juiste timing en workflowcoördinatie te waarborgen.
   3. Houd consistente experimentele omstandigheden in stand bij alle replicaten om variabiliteit te minimaliseren.

2. Bereiding van testverbindingen en controles

1. Bereid alle verbindingen op de dag van het experiment vers voor. Los voorraden op in M9-buffer (22 mM KH₂PO₄, 42 mM Na₂HPO₄, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO₄) of steriel gedestilleerd water, afhankelijk van de compatibiliteit van de verbinding en de assayomstandigheden^30,31.
   OPMERKING: De keuze van waterig medium kan de samengestelde activiteit in C. elegans-assays beïnvloeden. Zo kunnen verbindingen zoals serotonine verschillende effectieve concentraties vertonen wanneer ze worden bereid in steriel gedestilleerd water in plaats van in een M9-buffer. Daarom moeten zowel voertuigcompatibiliteit als biologische respons empirisch worden geëvalueerd tijdens assay-optimalisatie. Ook kunnen voor verbindingen met een lage waterige oplosbaarheid geschikte voertuigen zoals dimethylsulfoxide (DMSO) of ethanol worden gebruikt. De uiteindelijke oplosmiddelconcentraties moeten laag blijven (meestal onder 0,2% v/v) om toxiciteit te voorkomen. Eerdere studies in C. elegans rapporteerden dat DMSO-concentraties tot 0,5% minimale effecten veroorzaken onder standaard laboratoriumomstandigheden¹⁷.
2. Bereid minstens vijf concentraties per verbinding voor om concentratie-responscurves te kunnen construeren en IC₅₀ - of IC_90-waarden te schatten. Gebruik een seriële verdunning met 2- tot 3-voudige concentratiestappen als uitgangspunt en pas het uiteindelijke concentratiebereik aan volgens de verwachte potentie, oplosbaarheid en experimentele respons van elke verbinding.
   OPMERKING: Als de teststoffen gevoelig zijn voor licht, moeten alle voorbereidingsstappen onder zwak licht worden uitgevoerd om degradatie te voorkomen. Dit omvat het voorbereiden van stockoplossingen, verdunningen en agarplaten met medicijnen. Waar mogelijk moeten borden worden bedekt met aluminiumfolie en in het donker worden bewaard. Evenzo moeten multiwell-platen tijdens de incubatie bedekt blijven (bijvoorbeeld met folie of ondoorzichtige deksels). Het gebruik van gesloten containers of vochtige kamers die de lichtblootstelling beperken, wordt aanbevolen om de stabiliteit van de verbinding gedurende het hele experiment te behouden.
3. Neem in elk experiment de volgende controles op: buffer-only controle (M9 of water) en voertuigcontrole (bijv. DMSO of ethanol bij dezelfde concentratie als gebruikt bij behandelingen).
   OPMERKING: De keuze van oplosmiddel is cruciaal. DMSO en ethanol worden vaak gebruikt omdat ze hydrofobe verbindingen oplossen terwijl ze bij lage concentraties biocompatibel blijven. Alternatieve benaderingen, zoals Tween 20 of cyclodextrines, kunnen worden overwogen om de löselijkheid te verbeteren. Geneesmiddeloplossingen moeten direct na de bereiding worden gebruikt, omdat stabiliteit in de loop van de tijd kan variëren en de reproduceerbaarheid kan beïnvloeden.

3. Het verkrijgen van gesynchroniseerde C. elegans-eieren

OPMERKING: De isolatie van C. elegans-eieren is uitgebreid beschreven in eerdere studies^29,32. Hier worden de belangrijkste stappen samengevat, met kleine aanpassingen om de terugwinning van schone, puinvrije eieren die geschikt zijn voor uitkomstassays te optimaliseren.

1. Verzameling zwangere wormen
   1. Begin met 3–5 NGM-platen met confluente culturen van zwangere volwassenen^25,26. Geef de voorkeur aan platen met grote aantallen zwangere wormen en zichtbare eieren, wat wijst op actieve voortplanting, terwijl overvolle of uitgehongerde culturen worden vermeden. Exacte wormtellingen worden meestal niet bepaald in dit stadium, omdat eicelisolatieprotocollen bij C. elegans vaak vertrouwen op confluente voortplantingsculturen in plaats van precieze diertellingen. Als algemene referentie: elke 60 mm plaat zou enkele honderden zwangere volwassen dieren moeten bevatten.
   2. Voeg gedestilleerd water toe aan elk bord en was de wormen voorzichtig in een 15 mL conische buis. Vermijd het schrapen van het agaroppervlak om vuil te minimaliseren.
   3. Centrifugeer op 266 × g tot 3 minuten (18–25 °C) om de wormen te pelletten. Verwijder de supernatant met bacteriën.
   4. Verwijder het supernatant en herhaal de wasstap drie keer. Suspendeer de pellet elke keer voorzichtig opnieuw om de verwijdering van resterende bacteriën te verbeteren.
2. Eiisolatie door bleken
   1. Susseer de wormpellet opnieuw in een vers bereide bleekoplossing (1,2% NaOCl en 0,5 M NaOH; eindvolume 5 mL). Bereid de oplossing direct voor gebruik voor om activiteit te garanderen.
      OPMERKING: Correct gebleekte monsters werden gedefinieerd als preparaten waarbij volwassen karkassen werden verstoord/verteerd terwijl intacte eieren morfologisch normaal en levensvatbaar bleven. Overgebleekte monsters werden geïdentificeerd door beschadigde of gelyseerde eieren, abnormale eimorfologie, verminderde uitkomstsnelheden of het ontbreken van levensvatbare larven na incubatie²⁵.
   2. Beweeg de buis krachtig om de oplossing van volwassen lichamen en het vrijkomen van eieren te bevorderen. Meng continu tijdens de incubatie om een uniforme blootstelling te garanderen.
   3. Houd de reactie nauwlettend in de gaten en neem niet langer dan 5 minuten. Controleer visueel: volwassen lichamen moeten grotendeels opgelost zijn terwijl eieren intact blijven.
   4. Houd de reactie nauwlettend in de gaten en stop deze na 5 minuten door koud steriel gedestilleerd water (bij voorkeur 10 °C) toe te voegen tot een eindvolume van 14 mL. Laat de broedtijd deze tijd niet overschrijden om schade aan de eieren te voorkomen.
   5. Sluit de buis af en keer voorzichtig meerdere keren om om de bleekoplossing snel te verdunnen. Voer deze stap zonder vertraging uit om de levensvatbaarheid van het ei te behouden.
   6. Centrifugeer op 266 × g gedurende 3 minuten (18–25 °C) en gooi het supernatant voorzichtig weg.
   7. Was de eierpellet drie keer met steriel gedestilleerd water om het resterende bleekmiddel volledig te verwijderen. Zorg voor een grondige herophanging tussen de wasbeurten. Susseer de eieren opnieuw in 5 mL M9-buffer of steriel water.
      OPMERKING: Het bleken van zwangere hermafrodieten levert een steriele eibereiding op die geschikt is voor gesynchroniseerde assays. Bij gebrek aan voedsel komen de uitgekomen larven in L1-ontwikkelingsstilstand en hervatten de ontwikkeling synchroon na het voeden.
3. Zuiveringsstap (sucroseflotatie)
   1. Voer deze stap uit als er na het bleken wormresten zichtbaar zijn.
   2. Bereid een oplossing van 30% sucrose door een 60% steriele sucrosebouillon te verdunnen (bijvoorbeeld gelijke volumes: 5 mL 60% sucrose met 5 mL gedestilleerd water).
   3. Voeg de sucroseoplossing toe aan de pellet en meng voorzichtig door te inverteren. Vermijd vortexen.
      OPMERKING: Omdat deze zuiveringsstap kort is en gevolgd wordt door directe wasstappen om resterende sucrose te verwijderen, werden onder de gebruikte omstandigheden geen detecteerbare effecten op de levensvatbaarheid van het eisel waargenomen. Daarentegen verbetert het verwijderen van wormresten de eicelvisualisatie, de telnauwkeurigheid en de uniformiteit van de blootstelling aan geneesmiddelen tussen monsters aanzienlijk.
   4. Centrifugeer op 266 × g gedurende 5 minuten (18–25 °C).
   5. Identificeer de eierlegger als een dunne witte ring bovenop de oplossing. Verzamel onmiddellijk 4 ml van het supernatant met eieren door de pipettip voorzichtig langs de ring te bewegen.
   6. Voer deze stap snel uit, want de eieren beginnen kort na centrifugatie door de zwaartekracht te zinken.
   7. Breng het verzamelde supernatant over in een schone buis met steriel gedestilleerd water. Was de eieren twee keer met koud steriel water om achtergebleven sucrose te verwijderen.
      OPMERKING: Deze stap is optioneel, maar sterk aanbevolen. Het verwijderen van vuil verbetert de visualisatie van eieren en de nauwkeurigheid van het tellen, en zorgt voor een meer uniforme blootstelling aan teststoffen door te voorkomen dat eieren vast komen te zitten in restanten van wormmateriaal.
4. Bereiding van eierbouillonoplossing
   1. Meng de ei-suspensie voorzichtig voordat je bemonstert, want de eieren bezinken snel.
   2. Plaats drie druppels van 20 μL op een preparaat en tel eieren onder een stereomicroscoop.
   3. Bereken het gemiddelde en pas de concentratie aan op 50–100 eieren per 100 μL met behulp van een M9-buffer. Meng opnieuw voordat je aliciteert om een gelijkmatige verdeling te behouden.
   4. Aliquot het vereiste volume ei-suspension voor elke experimentele conditie volgens het geselecteerde protocol.

4. Eieruitkomst-assayformaten

1. Kortdurende blootstelling aan eicellen in microcentrifugebuizen (hoogcontroleformaat)
   OPMERKING: Deze experimentele configuratie is gebaseerd op eerder beschreven procedures²⁵, met aanpassingen om de controle over blootstellingsomstandigheden en reproduceerbaarheid te verbeteren.
   1. Voorbereiding van agarplaten voor ei-uitkomstassays
      1. Bereid medicijnvrije agarplaten voor met alleen agar en gedestilleerd water (1,7 g agar in 100 mL water). Voeg geen voedingsstoffen of bacteriën toe, want het doel is om het uitkomen van eieren te evalueren zonder belemmering door voedselbronnen. Giet ongeveer 3 mL agar per 35 mm petrischaal om de agardiepte consistent te behouden in de experimenten.
      2. Bereid borden 12–24 uur voor gebruik voor. Vermijd het overschrijden van dit tijdsvenster, omdat overmatig drogen de levensvatbaarheid van de eieren vermindert en de larvale beweging beïnvloedt.
      3. Verdeel elke plaat na het stollen in vier kwadranten om het tellen te vergemakkelijken.
      4. Bewaar borden bij 8–10 °C in afgesloten omstandigheden om uitdroging te voorkomen. Laat platen in evenwicht komen tot kamertemperatuur voordat je het gebruikt.
   2. Breng 500 μL ei-suspensie over in een 1,5 mL microcentrifugebuis voor elke conditie. Meng voorzichtig tussen de pipetstappen om ei-sedimentatie te voorkomen, want eieren zakken snel door de zwaartekracht. Het behouden van een homogene suspensie is cruciaal om vergelijkbare eieraantallen te garanderen onder verschillende omstandigheden.
   3. Voeg 500 μL behandelingsoplossing of bijbehorende controle toe aan de 500 μL ei-suspensie. Broeden 4–8 uur uit bij 22 °C. Bepaal de incubatietijd van tevoren en houd deze constant over experimenten (bijv. 6 uur), omdat variaties in deze tijd direct invloed hebben op de blootstelling aan medicijnen.
      OPMERKING: Bereid behandelingsoplossingen voor op 2x de gewenste eindconcentratie zodat verdunning na het mengen met de ei-suspension de beoogde eindwerkconcentratie oplevert.
   4. Houd een continue, zachte beweging tijdens de incubatie met behulp van een buisrotator (bijvoorbeeld 5–20 toeren per minuut verticale rotatie) of een schommelplatform. Zorg ervoor dat buizen voortdurend in beweging blijven om eisedimentatie te voorkomen en om gelijkmatige blootstelling te bevorderen. Deze stap is cruciaal, omdat statische omstandigheden leiden tot eicelophoping en heterogene blootstelling aan medicijnen.
   5. Centrifugeer de buizen op 3.420 × g gedurende 3 minuten (18–25 °C) na incubatie. Identificeer de pellet, die verschijnt als een kleine witte afzetting op de buiswand. Oriënteer buizen consequent (bijvoorbeeld markeren één zijde) vóór centrifugatie om snelle pelletlokalisatie te vergemakkelijken en per ongeluk verlies bij het verwijderen van supernatanten te voorkomen.
   6. Verwijder het supernatant voorzichtig zonder het pelletje te verstoren. Was de eieren drie keer met M9-buffer om de resterende stof te verwijderen. Suspendeer de laatste pellet opnieuw in 240 μL M9-buffer.
   7. Plat de vering op agarplaten door 20 μL per kwadrant te doseren. Gebruik drie borden per conditie. Laat de druppels volledig drogen voordat je platen verplaatst of omkeert om te voorkomen dat het eivlak wordt verplaatst.
      OPMERKING: Begin met een groter totaal volume ei-suspension dan strikt noodzakelijk is om het verlies van eieren tijdens het wassen te compenseren en zorg voor voldoende eindmonster voor het opmaken en tellen. Om de procedure te vereenvoudigen en het gebruik van agarplaten te verminderen, vooral in onderwijsomgevingen, breng je de opnieuw gesuspendeerde eieren direct over in een multiwellplaat in plaats van op agarplaten. Stel het uiteindelijke volume aan op 200 μL per put en vul ongebruikte putten met steriel water om verdamping te minimaliseren.
2. Directe blootstelling aan eicel op medicijnhoudende agarplaten
   1. Bereid een agaroplossing die uitsluitend agar en steriel gedestilleerd water bevat (1,7 g agar in 100 mL). Verhit tot het volledig is opgelost en houd de oplossing in vloeibare vorm. Laat de agar afkoelen tot 50–55 °C voordat je een verbinding toevoegt, en meet de temperatuur met een laboratoriumthermometer. Deze stap is cruciaal om de stabiliteit van de samenstelling te behouden en homogene incorporatie te waarborgen, zoals eerder beschreven²⁸. Bereid minstens vijf concentraties per verbinding voor om concentratie-responsanalyse en IC_50-schatting mogelijk te maken.
      OPMERKING: Voeg geen bacteriële voedselbronnen toe. Bij gebrek aan voedsel gaan de uitgekomen larven in een gesynchroniseerde L1-ontwikkelingsstilstand, waardoor de voortgang naar latere larvale stadia tijdens de assayperiode^26,33 wordt voorkomen.
   2. Voeg het juiste volume medicijnoplossing of voertuigcontrole toe aan de gekoelde agar. Meng voorzichtig door langzame inversie om een homogene verdeling te garanderen. Vermijd vortexvorming of hevig schudden om de vorming van een bel te voorkomen.
   3. Giet onmiddellijk ongeveer 3 ml agar in 35 mm Petrischalen. Werk gestaag om een constante temperatuur en plaatdikte te behouden. Bereid minstens 3–5 borden per conditie voor.
   4. Opslag en hantering van platen als volgt: Laat platen bij kamertemperatuur op een vlak oppervlak stollen. Bewaar platen omgekeerd om te voorkomen dat condensatie het agaroppervlak bereikt.
   5. Zet het experiment op: Zaai 50–100 eieren direct op de agarplaten. Houd constante experimentele parameters aan, waaronder temperatuur, incubatietijd, luchtvochtigheid en het tijdstip van de voorbereiding van de platen. Gebruik ten minste vijf concentraties voor concentratie-responsanalyse.
      OPMERKING: Bereid borden 12–24 uur voor gebruik voor. Vermijd overmatig drogen, omdat dit de levensvatbaarheid van de eieren en de larvale beweging kan beïnvloeden. Wikkel platen om uitdroging te verminderen en te beschermen tegen licht bij het werken met lichtgevoelige stoffen. Bewaar borden in een schone, bij voorkeur bevochtigde omgeving (bijvoorbeeld een afgesloten container met vochtig papier) om variaties te minimaliseren.
3. Ei-uitkomstassay in multiwell-platen (medium tot hoogdoorvoerformaat)
   OPMERKING: Dit formaat wordt veel gebruikt in zowel C. elegans - als parasitaire nematodenstudies voor screening met medium tot hoge doorvoer, waardoor parallelle evaluatie van meerdere verbindingen en concentraties onder gestandaardiseerde omstandigheden mogelijk is.
   1. Voorbereiding van putplaten en experimenteel ontwerp: Gebruik 96-putplaten (of een alternatief formaat afhankelijk van de doorvoerbehoefte). Bereid de plaatindeling van tevoren voor en definieer geneesmiddelconcentraties (gerangschikt over kolommen), replicaties (over rijen) en controles, waaronder buffer-only (M9 of water) en voertuigcontroles (bijv. DMSO of ethanol bij dezelfde uiteindelijke concentratie als gebruikt bij behandelingen).
      OPMERKING: Gebruik transparante, platbodem multiwellplaten om directe visualisatie en telling in elke put mogelijk te maken onder doorgegeven LED-verlichting met een stereomicroscoop. Eieren en uitgekomen L1-larven worden direct gekwantificeerd in de putten zonder overdrachtstappen, waardoor monsterverlies en het verwerken van artefacten worden geminimaliseerd.
   2. Voorlaad elke put met de juiste hoeveelheid medicijnoplossing of controle. Gebruik gelijke volumes over alle putten.
   3. Toevoeging van ei-suspension
      1. Bereid een goed gehomogeniseerde ei-suspensatie met een bepaalde concentratie (zie Sectie 2).
      2. Voeg een gelijke hoeveelheid ei-suspensie toe aan elke put waarin de medicijnoplossing zit. Gebruik een eindvolume van 200 μL per put.
      3. Pas de eidichtheid aan op minstens 30 eieren per put (idealiter 30–100). Niet meer dan 100 eieren per put, want overbevolking bemoeilijkt de handmatige kwantificering aanzienlijk. Individuele eieren worden moeilijk te onderscheiden, terwijl beweeglijke L1-larven actief door de put zwemmen, wat de telnauwkeurigheid vermindert en de experimentele variabiliteit verhoogt.
      4. Meng de ei-suspensie voorzichtig voordat je doseert om een gelijkmatige verdeling te garanderen.
   4. Laad het bord voorzichtig. Vermijd het introduceren van luchtbellen. Pipetteer consequent en wissel tips tussen de omstandigheden om kruisbesmetting te voorkomen. Tik voorzichtig op de plaat om ervoor te zorgen dat alle inhoud op de bodem van de putten neerkomt.
   5. Incubatieomstandigheden: Incubeer de plaat bij 20–22 °C onder gecontroleerde en vochtige omstandigheden gedurende in totaal 24 uur vanaf eicelisolatie.
      OPMERKING: Minimaliseer variabiliteit door het gebruik van buitenputten te vermijden of deze te vullen met buffer om verdamping te verminderen. Incubeer platen in een bevochtigde kamer (bijvoorbeeld een afgesloten container met vochtig papier) en bescherm tegen licht bij het werken met lichtgevoelige verbindingen. Vermijd onnodige beweging tijdens de incubatie. Houd een consistente timing van eierbereiding en blootstelling aan geneesmiddelen bij alle replicata, aangezien variaties de ontwikkelingsfase en de interpretatie van de gegevens kunnen beïnvloeden.

5. Evaluatie en tellen

1. Evalueer het uitkomen van ei 24 uur na de isolatie van het ei, zodat de controleomstandigheden volledig uitkomen onder de gedefinieerde temperatuur. Bereken dit tijdstip vanaf het moment van eicelverzameling om voldoende embryonale ontwikkeling mogelijk te maken. Beschouw eieren die in dit stadium nog niet uitgekomen zijn als beïnvloed door de behandeling.
2. Onderzoek monsters onder een stereomicroscoop. Voor elke aandoening (agarplaten of multiwellplaten) kwantificeer je het aantal niet-uitgekomen eieren en het aantal uitgekomen L1-larven.
3. Scan het gehele observatiegebied, inclusief plaatranden en putgrenzen, aangezien beweeglijke L1-larven zich ongelijk kunnen verspreiden en zich in deze gebieden kunnen ophopen.
   OPMERKING: Voer direct tellen uit onder een stereomicroscoop voor snelle evaluatie zonder extra apparatuur. Houd een consistente eidichtheid onder alle omstandigheden, gebruik minstens 3–5 technische replicaten per conditie en voer minimaal drie onafhankelijke experimenten uit met verschillende eibereidingen om betrouwbare vergelijkingen te garanderen.

6. Beeldverwerving en documentatie

1. Neem beelden met een stereomicroscoop uitgerust met een digitale camera. Voor agarplaten registreert u elk kwadrant; Voor multiwellplaten registreer je elke individuele put. Zorg ervoor dat alle gebieden worden gevangen, inclusief plaatranden en putgrenzen, waar larven zich kunnen ophopen.
   OPMERKING: Standaard 10x oculairs en objectieven, die variëren van 0,6x tot 5x (totale vergroting van 6x tot 50x), worden veel gebruikt en maken een duidelijke visualisatie van zowel eieren als L1-larven binnen het telgebied mogelijk. Gebruik doorgestuurde LED-verlichting. Houd constante camera-acquisitie-instellingen (helderheid, belichting en contrast) aan gedurende alle experimentele omstandigheden om consistente beeldkwaliteit en betrouwbare vergelijking tussen monsters te garanderen.
2. Gebruik geschikte acquisitiesoftware om beelden vast te leggen. Verwerk en analyseer afbeeldingen met behulp van beeldanalysesoftware. Houd identieke analyseparameters aan over alle experimentele omstandigheden, waaronder helderheid, contrast, vergroting, hetzelfde verworven gebied/veld en telcriteria.
3. Kwantificeer het aantal niet-uitgekomen eieren en L1-larven uit de verkregen beelden. Beschouw larven als uitgekomen wanneer ze volledig uit de eierschaal zijn gekomen. Eieren met gedeeltelijk uitgekomen larven moeten als niet uitgekomen worden geclassificeerd. Pas identieke classificatiecriteria toe op alle experimentele omstandigheden.
4. Incubeer platen of multiwell-platen nog eens 12–24 uur bij 16–18 °C om te beoordelen of de waargenomen inhibitie van het uitkomen van het ei omkeerbaar is. Onder de gedefinieerde experimentele omstandigheden worden eieren die op dit stadium nog niet uitgekomen zijn, als aangetast door de behandeling beschouwd.

7. Data-analyse

1. Bereken de ei uitkomstremming als:
   Percentage niet-uitgekomen eieren = (Aantal niet-uitgekomen eieren) / (totaal aantal eieren + larven)
2. Voer minstens 3–5 onafhankelijke experimenten uit met verschillende eierbatches. Druk gegevens uit als gemiddelde ± standaarddeviatie (gemiddelde ± SD).
3. Genereer concentratie-responscurves met behulp van niet-lineaire regressie en bepaal IC_50-waarden .
4. Voer statistische vergelijkingen uit tussen aandoeningen met behulp van de t-test van de leerling en definieer statistische significantie op p < 0,05.
5. Analyseer gegevens met behulp van geschikte statistische software.

8. Toepassing van ei-uitkomstassays met behulp van trans-cinnamaladehyde en linalylacetaat

OPMERKING: Deze studie richt zich niet op een specifieke verbinding, maar gebruikt representatieve middelen om te illustreren hoe elk experimenteel formaat onder vergelijkbare omstandigheden kan worden uitgevoerd, gecontroleerd en geïnterpreteerd. Trans-cinnaldehyde (TCA) werd gekozen als illustratieve verbinding omdat het eerder is gekarakteriseerd en consequent robuuste, reproduceerbare inhibitie van het uitkomen van eieren produceert over de drie hier gepresenteerde assayconfiguraties. Belangrijk is dat het doel van het opnemen van TCA was om protocolimplementatie en representatief concentratie-responsgedrag aan te tonen, in plaats van relatieve kracht of vergelijkende prestaties tussen formaten vast te stellen.

1. Experimentele opstelling en compoundvoorbereiding
   1. Bereid agarplaten (3 mL per 35 mm schaal) 12–24 uur van tevoren voor met behulp van alleen agar-medium (1,7% in gedestilleerd water). Label de borden, verdeel ze in vier kwadranten om het tellen te vergemakkelijken, bewaar ze onder afgesloten omstandigheden om uitdroging te voorkomen, en breng ze in evenwicht tot kamertemperatuur voordat je ze gebruikt.
   2. Bereid verse trans-cinnamaldehyde (TCA) voorraadoplossingen voor in DMSO en verdun deze in steriel water of agar om acht uiteindelijke concentraties (0,05–0,7 mM) te verkrijgen. Houd de uiteindelijke DMSO-concentratie onder 0,2% onder alle omstandigheden. Gebruik respectievelijk water, agar en/of DMSO als negatieve en voertuigcontrole.
   3. Test linalylacetaat op 5 mM als een negatieve verbinding om het vermogen van de test te evalueren om onder identieke experimentele omstandigheden onderscheid te maken tussen actieve en inactieve verbindingen.
   4. Bereid gesynchroniseerde ei-suspensies voor zoals hierboven beschreven en pas de dichtheid aan op 50–100 eieren per 100 μL. Gebruik gelijke volumes en vergelijkbare eieraantallen in alle formaten om consistentie tussen omstandigheden te waarborgen.
2. Toepassing van experimentele formaten met behulp van een referentieverbinding
   1. Kortdurende blootstelling in microcentrifugebuizen (hoogcontrole-formaat)
      1. Meng 500 μL ei-suspension met 500 μL behandeloplossing met 0,05–0,7 mM TCA. Incubeer de buizen 6 uur bij 18–20 °C en houd de incubatietijd consistent aan in alle experimenten.
      2. Houd de buisjes tijdens de incubatie continu zacht bewegen met een rotator.
      3. Centrifugeer de buizen op 3.420 × g gedurende 3 minuten (18–25 °C) na blootstelling en verwijder voorzichtig het supernatant. Was de eieren drie keer met gedestilleerd water om reststoffen te verwijderen en de blootstelling tijdens de vastgestelde broedtijd te beperken.
      4. Susselt de uiteindelijke pellet opnieuw in 240 μL gedestilleerd water en plat de suspensie op agarplaten met 20 μL per kwadrant met drie platen per conditie. Broed de platen uit bij 16–18 °C gedurende 24 uur na de eiisolatie.
   2. Directe blootstelling aan geneesmiddelhoudende agarplaten
      1. Bereid agarplaten met medicijnen voor door TCA-oplossingen toe te voegen aan agar die is afgekoeld tot 50–55 °C en zachtjes te mengen om homogene verdeling te garanderen. Giet ongeveer 3 ml agar per plaat en bereid de platen 12–24 uur voor gebruik voor.
      2. Zaai eieren direct op het oppervlak van de platen met dichtheden vergelijkbaar met die in andere formaten (50–100 eieren per 100 μL). Voer geen wasstappen uit in deze configuratie.
      3. Broed de platen uit bij 16–18 °C tot 24 uur na de eiisolatie.
   3. Multiwell plaatassay (medium tot hoogdoorvoerformaat)
      1. Preload 96-well platen met medicijnoplossingen en controles. Voeg ei-suspensies toe om een eindvolume van 200 μL per put en een dichtheid van 50–100 eieren per put te verkrijgen.
      2. Zorg voor homogene verdeling tijdens de belasting door bellen te vermijden en consistente volumes over putten te behouden. Broed de platen 24 uur na de eiisolatie uit bij 20–22 °C onder vochtige omstandigheden.
3. Beeldverwerving en kwantificatie
   1. Evalueer het uitkomen van het ei 24 uur na de isolatie van het ei, zodra het uitkomen is voltooid onder controleomstandigheden. Tel het aantal niet-uitgekomen eieren en L1-larven onder een stereomicroscoop voor elke aandoening. Onderzoek de randen van de platen en de grenzen van de putjes zorgvuldig, omdat larven zich in deze gebieden kunnen ophopen.
   2. Maakt beelden met een stereomicroscoop uitgerust met een digitale camera voor documentatiedoeleinden. Registreer elk kwadrant voor agarplaten en beeld systematisch elke put af voor multiwellplaten. Gebruik beeldanalysesoftware wanneer nodig om kwantificatie te ondersteunen.
   3. Incubeer de platen nog eens 12–24 uur na beeldverwerving om te beoordelen of de waargenomen remming van het uitkomen omkeerbaar is.
   4. Voer alle experimenten uit met ten minste drie onafhankelijke biologische replicata.

Resultaten

TCA veroorzaakte duidelijke concentratieafhankelijke remming van het uitkomen van ei in alle experimentele formaten, zoals weergegeven in Figuur 1. Voor elke assayconfiguratie worden representatieve concentratie-responscurves weergegeven: microcentrifugebuizen (Figuur 1A), directe blootstelling op agarplaten (Figuur 1B) en multiwellplaten (Figuur 1C).

Discussie

Deze studie biedt een eenvoudig en aanpasbaar platform voor ei-uitkomstassays in Caenorhabditis elegans, gestructureerd rond drie complementaire experimentele formaten die verschillen in controle, blootstellingsdynamiek en schaalbaarheid. In plaats van één enkel optimaal protocol te definiëren, ondersteunen onze resultaten de opvatting dat ei-uitkomstassays moeten worden beschouwd als een flexibel methodologisch kader dat aanpasbaar is aan specifieke experimentele doelstellingen...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Bacteriologische Agar	Britania	B0101406	moet vers worden bereid (1,7 gr in 100 mL H2O)
Bleekvloeistof	N/A	N/A	1,2 % (v/v) NaOH en 0,5 M NaOH
Centrifuge	ThermoScientific.	Sorvall ST16R.
Centrifuge	BiofugePICO naar eppendorfbuisje	Heraeus 75003235
Digitale camera	ToupCam	TP605100A	Industriële digitale camera. Aanpasbare brandpuntsafstand USB 2.0
DMSO	BioBasic	RAS#7-68-5	MW: 78,13
Linalyl Acetaat	SIGMA	Nr.CAS: 115-95-7	moet vers worden bereid
Lysogeny bouillon (LB) medium	N/A	N/A	10 g Bacto-tryptone, 5 g gistextract, 10 g NaCl tot 1 L gedestilleerd water
M9 Buffer	N/A	N/A	3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g  NaCl, 0,25 g MgSO4 tot 1 L gedestilleerd water
Mini Rotator	BioSan	Bio RS-24
Nematode Groei Medium (NGM)	N/A	N/A	3 g NaCl, 17 g agar, 2,5 g  Bacto-Peptone tot 1 L gedestilleerd water. Steriliseer door autoclaving. Aangevuld met 1 mL cholesterol (5 mg/mL),  1 mL CaCl2 (1 M), 25 mL kaliumfosfaatbuffer (1 M, pH 6,0) en 1 mL  MgSO4 (1 M)
Petrischaal (3 - 5 mm)	ThermoScientific. Nunclon DeltaSurface	153066
Petrischaal (90 mm x 15 mm)	ExtraGene	1026160305	Alleen voor laboratoriumgebruik, Polystyreen.
Pipet	Fisherbrand	N/A
SigmaPlot 12.0	Systat Software	N/A	Versie 12.0
Stereomicroscoop	ARCANO	ZTX-T 1:4 LED	Trinoculair stereomicroscoop (10x–40x totale vergroting; LED incident en getransmitteerd licht)
Sucrose	Laboratorio Cicarelli	Art 841	60 % (v/v) sucrose
Weefselkweekplaat 96 well	Biofil	TCP 012096	Polystyreen, laag verdampingsdeksel.
ToupView	ToupTek Photonics	N/A
Transcinnamaldehyde (TCA)	Santa Cruz Biotechnology	J1712	Moet vers worden bereid