Netwerkfarmacologie en experimenteel onderzoek van β-sitosterol bij de behandeling van chronische obstructieve longziekte via de glucocorticoïde receptor

Samenvatting

β-sitosterol verlichtte COPD en versterkte de effectiviteit van dexamethason, waarbij de glucocorticoidreceptor dit effect bemiddelde. Daarnaast verminderde β-sitosterol ontsteking, oxidatieve stress en cellulaire senescentie in zowel CSE-gestimuleerde bronchiale epitheelcellen als door sigarettenrook geïnduceerde COPD-muizen.

Samenvatting

Chronische obstructieve longziekte (COPD) is een veelvoorkomende ademhalingsaandoening die wordt gekenmerkt door aanhoudende ontsteking, oxidatieve stress en een progressieve achteruitgang van de longfunctie. Het therapeutische potentieel van β-sitosterol bij COPD blijft onduidelijk. Deze studie had als doel de beschermende effecten van β-sitosterol tegen COPD te onderzoeken en het onderliggende mechanisme ervan te verduidelijken. Databasescreening identificeerde de glucocorticoïdereceptor (GR) als een potentieel doelwit van β-sitosterol. Er werden een door sigarettenrook geïnduceerd COPD-muismodel en een door sigarettenrookextract (CSE)-gestimuleerd BEAS-2B-celmodel opgesteld. Longfunctie, longletselgerelateerde markers, ontsteking, oxidatieve stress en cellulaire senescentie werden beoordeeld met behulp van (RT-qPCR), DCFH-DA fluorescerende probe-assays en senescencedetectiekits. De effecten van β-sitosterol alleen of in combinatie met dexamethason (DEX) werden ook geëvalueerd. β-sitosterol verbeterde de longfunctie significant, normaliseerde longschade-gerelateerde markers en verminderde ontsteking, oxidatieve stress en cellulaire veroudering in zowel CSE-gestimuleerde BEAS-2B-cellen als door sigarettenrook blootgestelde muizen. Deze beschermende effecten gingen gepaard met een verhoogde expressie van de algemene relativiteitsbeperking. Bovendien verbeterde β-sitosterol de respons op DEX, en combineerde behandeling met β-sitosterol en DEX zorgde voor grotere verbeteringen in de longfunctie, longschademarkers, ontsteking, reactieve zuurstofniveaus en cellulaire senescentie dan alleen DEX-behandeling. Gezamenlijk suggereren deze bevindingen dat β-sitosterol COPD-gerelateerde pathologische veranderingen verlicht, ten minste gedeeltelijk, door GR-expressie op te waarderen en de therapeutische effectiviteit van DEX te verbeteren, wat het potentieel als aanvullende strategie voor COPD-behandeling benadrukt.

Inleiding

Chronische obstructieve longziekte (COPD) is een progressieve luchtwegaandoening die wordt gekenmerkt door aanhoudende ontsteking van de luchtwegen, alveolaire schade en onomkeerbare luchtstroomobstructie die de ademhalingsfunctie aantast en de kwaliteit van leven vermindert¹. De prevalentie ervan neemt aanzienlijk toe met de leeftijd, en het risico voor mensen van vijfenzestig jaar en ouder is ongeveer vijf keer zo groot als dat van mensen onder de^{tweeënveertig}. Deze demografische trend wordt geassocieerd met een toename van ziekteincidentie, sterfte en invaliditeit³. Epidemiologische prognoses geven aan dat COPD tegen 2030 de vierde belangrijkste doodsoorzaak wereldwijd kan worden, goed voor ongeveer 5% van alle sterfgevallen ^4,5,6. Op dit moment omvatten de geïdentificeerde risicofactoren genetische vatbaarheid, longdysplasie, blootstelling aan fijnstof, chronische bronchitis en luchtweginfectie⁷.

Onder de risicofactoren is sigarettenrook de belangrijkste pathogene factor van COPD⁸. Het bevat duizenden chemicaliën die bronchiale epitheelschade kunnen veroorzaken, de infiltratie van ontstekingscellen kunnen bevorderen en kunnen leiden tot remodellering van longweefsel⁹. Langdurige blootstelling kan aanhoudende en onomkeerbare epitheelschade veroorzaken, de afgifte van een groot aantal pro-inflammatoire chemokines bevorderen, de productie (ROS) aanzienlijk verhogen en celapoptose¹⁰ induceren. Veel studies hebben aangetoond dat de verhoogde niveaus van pro-inflammatoire chemokines zoals interleukine-8 (IL-8) en tumornecrosefactor-α (TNF-α), samen met overmatige ROS-productie en cellulaire senescencetie, nauw samenhangen met de ernst van COPD ^11,12. Dit benadrukt de noodzaak van middelen die deze belangrijke pathogene factoren effectief en veilig kunnen moduleren om beschermende en therapeutische effecten te hebben bij COPD.

Fytosterolen zijn natuurlijke bioactieve verbindingen die overal aanwezig zijn in plantcellenmembranen. Hiervan is β-sitosterol het meest voorkomend en wordt het wijdverspreid in lipidenrijke plantaardige voedingsmiddelen zoals groenten, noten, zaden en olijfolie 13,14,15,16. Studies hebben bevestigd dat toediening van β-sitosterol in doses tot 1000 mg/kg bij ratten en muizen niet geassocieerd is met cytotoxiciteit of genotoxiciteit¹⁷. Bovendien heeft onderzoek aangetoond dat β-sitosterol antioxidante eigenschappen vertoont door zijn effecten op antioxidante enzymen en humane oestrogeenreceptoren¹⁸.

β-sitosterol vertoont een breed spectrum aan farmacologische activiteiten, waaronder ontstekingsremmend¹⁹, koortsdempend²⁰, analgeticum²¹ en antidiabetische effecten¹³. Het heeft ook therapeutisch potentieel aangetoond in verschillende ziektemodellen, zoals colitis en darmontsteking²², en bezit anti-atherosclerotische²³ en immunomodulerende eigenschappen²⁴. Daarnaast heeft het een gunstig veiligheidsprofiel. Gezien deze eigenschappen heeft β-sitosterol aanzienlijke belangstelling getrokken als potentiële kandidaat voor geneesmiddelen. De precieze rol en onderliggende mechanismen bij COPD blijven echter grotendeels onduidelijk.

Daarom was de huidige studie bedoeld om de potentiële therapeutische effecten en onderliggende mechanismen van β-sitosterol bij COPD te onderzoeken. Specifiek werd een door sigarettenrookextract (CSE)-geïnduceerd BEAS-2B-celletselmodel gebruikt om te evalueren of β-sitosterol CSE-gemedieerde cellulaire schade effectief kon verlichten, waarmee een nieuw kandidaatmolecuul voor COPD-therapeutische strategieën werd geïdentificeerd.

Protocol

De studie werd uitgevoerd volgens de richtlijnen voor Basis- en Klinische Farmacologie en Toxicologie voor experimentele en klinische studies²⁵. Alle dierproevenprotocollen werden goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van The Second Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine (Goedkeuring nr. 20230102), en alle experimenten werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Animal Ethics Committee. De studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de ARRIVE-richtlijnen.

Screening van belangrijke componenten en doelen via netwerkfarmacologie

Actieve componenten van Fritillaria cirrhosa D. Don, Lonicera japonica Thunb., Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq., en Adenophora stricta Miq. zijn opgehaald uit de Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database (TCMSP; geraadpleegd op 12 maart 2024). Kandidaatverbindingen werden gescreend volgens de volgende ADME-criteria: orale biobeschikbaarheid (OB) ≥ 30%, geneesmiddelgelijkheid (DL) ≥ 0,18 en Caco-2 permeabiliteit ≥ −0,4²⁵. Verbindingen die aan alle drie de criteria voldeden, werden behouden als kandidaat-actieve ingrediënten voor latere analyses.

De canonieke Simplified Molecular Input Line Entry System (SMILES)-structuur van β-sitosterol is verkregen van PubChem (geraadpleegd op 18 maart 2024) en geïmporteerd in SwissTargetPrediction (geraadpleegd op 21 maart 2024) voor doelvoorspelling. Homo sapiens werd geselecteerd als doelsoort. Potentiële doelen werden voorspeld op basis van 2D- en 3D-structurele gelijkenis tussen β-sitosterol en bekende liganden in de database. Voorspelde doelen met een kans groter dan 0 werden behouden en dubbele vermeldingen werden verwijderd.

COPD-geassocieerde genen zijn opgehaald uit de Therapeutic Target Database (TTD; geraadpleegd op 25 maart 2024) en de Comparative Toxicogenomics Database (CTD; geraadpleegd op 28 maart 2024) met het trefwoord "chronische obstructieve longziekte". Na verwijdering van duplicatengenen werden de COPD-geassocieerde genen gekruist met de voorspelde β-sitosteroldoelen om kandidaatdoelwitten te identificeren die mogelijk betrokken zijn bij de therapeutische effecten van β-sitosterol tegen COPD.

Moleculaire koppeling van β-sitosterol en GR

De driedimensionale structuur van β-sitosterol in SDF-formaat werd opgehaald uit de PubChem-database (geraadpleegd op 2 juni 2026), terwijl de kristalstructuur van de glucocorticoïde receptor (GR) werd verkregen uit de Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank (RCSB PDB; geraadpleegd op 3 juni 2026). Na standaardvoorbereiding van de ligand- en receptorstructuren werd moleculaire koppeling uitgevoerd via het CB-Dock2 online platform (geraadpleegd op 3 juni 2026). De voorbereide ligand- en receptorbestanden werden naar het platform geüpload, en dockingberekeningen werden uitgevoerd met behulp van de standaardparameters.

Functionele verrijkingsanalyse van Genontologie (GO) en Kyoto Encyclopedie van Genen en Genomen (KEGG)

Alle voorspelde doelgenen van β-sitosterol werden onderworpen aan GO functionele verrijking en KEGG padverrijkingsanalyses. Verrijkingsresultaten, waaronder significant verrijkte biologische processen, cellulaire componenten, moleculaire functies en signaalroutes, werden gesorteerd en opgeslagen in Aanvullend Dossier 1 voor latere bio-informatische analyse.

Diermodellering en groepering

De steekproefgrootte werd vastgesteld op zes dieren per groep op basis van een eerdere studie die een a priori power-analyse uitvoerde met G*Power-software (α = 0,05, power = 0,80) en aantoonde dat n = 6 voldoende was om biologisch relevante verschillen te detecteren onder vergelijkbare experimentele omstandigheden²⁶. Mannelijke C57BL/6 muizen van 6–8 weken (20 ± 2 g) werden willekeurig toegewezen aan vijf groepen: controlegroep, COPD-modelgroep, COPD + dexamethason (DEX)-groep, COPD + β-sitosterolgroep groep en COPD + DEX + β-sitosterolgroep. Muizen werden gehuisvest onder standaard laboratoriumomstandigheden (25 °C, 12 uur licht/donker cyclus) met vrije toegang tot standaard voedsel en water en mochten zich een week laten acclimatiseren voordat ze experimenteerden.

Voor het COPD-model werden muizen geplaatst in een hele lichaamskamer voor sigarettenrook (63 cm × 55 cm × 45 cm) en 12 weken blootgesteld aan gangbare sigarettenrook. Elke sigaret bevatte 10 mg teer, 0,9 mg nicotine en 10 mg koolmonoxide. Rookblootstelling vond twee keer daags plaats (5 dagen per week) om 9:30 uur en 15:00 uur, waarbij rook werd geproduceerd door 18 sigaretten die 90 minuten per sessie²⁷ in de kamer werden gebracht.

Om de therapeutische effecten van de interventies te evalueren, werd na 8 weken blootstelling aan sigarettenrook gestart met de toediening van het medicijn en deze werd de resterende 4 weken voortgezet. Vanaf week 9 kregen muizen in de respectievelijke behandelgroepen dagelijks intragastrische toediening van DEX (1 mg/kg)²⁸ of β-sitosterol (50 mg/kg)^29,30 1 uur voor blootstelling aan sigarettenrook. Eerdere farmacokinetische studies rapporteerden een orale biobeschikbaarheid van ongeveer 4% voor β-sitosterol bij knaagdieren³¹. Daarnaast hebben verschillende muisstudies doseringen gebruikt variërend van 20 tot 50 mg/kg³². Daarom werd een dosis van 50 mg/kg gekozen om voldoende systemische blootstelling te garanderen, terwijl binnen het bereik bleef dat vaak wordt gebruikt in preklinische studies.

Muizen in de controlegroep werden blootgesteld aan gefilterde kamerlucht, terwijl muizen in de model- en behandelingsgroepen een gelijkwaardig volume normale zoutoplossing als voertuig kregen. Aan het einde van de experimentele periode werden muizen diep verdoofd met isofluraan totdat de pedaalreflex verloren gingen en geëuthanaseerd door bloedverlies via bloedafname via de abdominale aorta. De thoracale holte werd onmiddellijk geopend en intacte bilaterale longweefsels werden zorgvuldig verwijderd, afgespoeld met ijskoude fosfaatgebakken zoutoplossing (PBS) en op ijs gelegd. Voor bronchoalveolaire lavagevloeistof (BALF) werd de luchtpijp gecannuleerd en afgespoeld met koude, steriele PBS, die voorzichtig werd ingebracht en herhaaldelijk werd teruggetrokken om lavagevocht op te vangen. Longweefsels en BALF-monsters werden op ijs gehouden en vervolgens verwerkt voor analyses stroomafwaarts.

BEAS-2B celkweek

BEAS-2B menselijke bronchiale epitheelcellen werden behouden in Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12 (DMEM/F12), dat 10% foetaal rundserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine bevatte onder 5% CO₂ bij 37 °C.

CSE-voorbereiding en blootstelling aan BEAS-2B-cellen

BEAS-2B-cellen werden gewassen met fosfaatgeboterde zoutoplossing en in driedubbele dichtheid in 24-wellplaten geplaatst met een dichtheid van 5 × 10^4-cellen per put. Na 12 uur kweek bereikten de cellen ongeveer 60% confluentie en werden ze vervolgens blootgesteld aan CSE. CSE werd vers voorbereid zoals eerder beschreven, met kleine aanpassingen³³. Kort gezegd werd één ongefilterde commerciële sigaret continu verbrand, en de gangbare rook werd met een vacuümpomp met een constante stroom van 1,05 L/min (ongeveer −11 kPa negatieve druk) in 10 mL serumvrij medium geborreld gedurende ongeveer 5 minuten totdat de sigaret volledig verbrand was. De verkregen oplossing werd eerst onderworpen aan pre-filtratie om grote deeltjesonzuiverheden te verwijderen, waarna ze gesteriliseerd werden via een 0,22 μm steriel microporeus filter om restdeeltjes te elimineren; de resulterende voorraadoplossing werd gedefinieerd als 100% CSE. Alle vers bereide CSE werd direct na filtratie gebruikt voor celbehandeling zonder opslag. Cellen werden gestimuleerd met een medium dat 2,5% CSE bevatte. Na 24 uur CSE-behandeling werden de kweeksupernatanten verzameld en opgeslagen bij -40 °C voor latere analyse³⁴.

Kwantitatieve real-time polymerase kettingreactie (RT-qPCR)

Totaal RNA werd geëxtraheerd uit BEAS-2B-cellen met behulp van een totale RNA-extractiekit en reverse-getranscribeerd in cDNA met een reverse transcription kit volgens de instructies van de fabrikant. RT-qPCR werd vervolgens uitgevoerd met een realtime PCR-detectiesysteem en een op SYBR Green gebaseerde qPCR-mastermix. Alle RT-qPCR-experimenten werden uitgevoerd met drie biologische replicaten en drie technische replicaten per monster om de betrouwbaarheid van de data te waarborgen.

Elke qPCR-reactie werd uitgevoerd in een totaal volume van 20 μL, met 10 μL SYBR Green qPCR master mix, 0,4 μL forward primer, 0,4 μL reverse primer, 2 μL verdunde cDNA-template en 7,2 μL RNase-vrij water. De versterkingsvoorwaarden waren als volgt: initiële denaturatie bij 95 °C gedurende 3 minuten, gevolgd door 40 cycli denaturatie bij 95 °C gedurende 10 seconden en annealing/extensie bij 60 °C gedurende 30 s. Relatieve genexpressieniveaus werden berekend met de 2^{−ΔΔCt-methode}, waarbij GAPDH als interne referentiegen fungeerde. De primersequenties die in deze studie zijn gebruikt, worden genoemd in Aanvullende Tabel 1.

Analyse van intracellulaire reactieve zuurstofsoorten (ROS)

De intracellulaire ROS-productie in BEAS-2B-cellen werd beoordeeld met behulp van de fluorogene probe 2′,7′-dichloordifluoresceïne-diacetaat (DCFH-DA) en geanalyseerd met flowcytometrie. Tijdens de flowcytometrische verwerving werd een standaard forward scatter (FSC) en side scatter (SSC) gatingstrategie toegepast om cellulair afval uit te sluiten en intacte enkele cellen te selecteren. In totaal werden 10.000 geldige cellulaire gebeurtenissen per monster verkregen. De excitatie- en emissiegolflengtes waren respectievelijk ingesteld op 488 nm en 525 nm. Vervolgens werden flowcytometrische gegevens geanalyseerd om de intracellulaire ROS-fluorescentieintensiteit te kwantificeren.

Malondialdehyde (MDA) niveau bepaling

Het intracellulaire MDA-gehalte werd gemeten met een lipideperoxidatie-assaykit volgens de instructies van de fabrikant. Kort daarna werden behandelde BEAS-2B-cellen geoogst en gelyseerd, waarna ze bij lage temperatuur werden gecentrifugeerd om het supernatant op te vangen. De thiobarbiturzuur (TBA) colorimetrische reactie werd vervolgens uitgevoerd en de absorptie werd gemeten op 532 nm met een microplaatlezer. Relatieve MDA-niveaus werden berekend volgens de standaardcurve.

Celverouderingsbeoordeling

Cellulaire senescentie werd geëvalueerd met behulp van een senescence-detectietest gebaseerd op senescence-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-gal) activiteit. SA-β-gal-positieve cellen werden gekwantificeerd door flowcytometrie. Parallel werden de mRNA-expressieniveaus van de senescentie-geassocieerde markers p53 en p21 bepaald door RT-qPCR.

Celproliferatie-assay

Celproliferatie werd beoordeeld met behulp van een colorimetrische cellevensvatbaarheidsassaykit. De absorptie werd gemeten op 450 nm met een microplaatlezer.

GR knockdown-assay

Celtransfectie werd uitgevoerd met behulp van een lipiden-gebaseerde transfectiereaktia. De volgende oligonucleotiden werden getransfecteerd: glucocorticoidereceptor-gericht klein interfererend RNA (si-GR) en negatieve controle klein interfererend RNA (si-NC). Kandidaat-siRNA-sequenties gericht op GR zijn ontworpen met behulp van het online bio-informaticaplatform siDirect 2.0. Na transfectie werden cellen 48 uur gekweekt en werden alle siRNA's gebruikt bij een uiteindelijke concentratie van 50 nM. De knockdown-efficiëntie werd geverifieerd door het meten van de expressie van GR mRNA met behulp van RT-qPCR.

Voertuigcontrolegroepen werden opgenomen in zowel β-sitosterolbehandelings- als transfectieexperimenten. Voor β-sitosterolinterventie dienden cellen behandeld met alleen het voertuigoplossing als de voertuigcontrolegroep (aangeduid als CSE+0). Statistische analyse bevestigde dat er geen significante verschillen werden waargenomen tussen de voertuigcontrole- en blanke controlegroepen.

Statistische analyse

Alle kwantitatieve resultaten werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardafwijking van drie biologisch onafhankelijke in vitro-experimenten . Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van statistische analysesoftware. De Shapiro–Wilk-test werd gebruikt om de normaliteit van de datasetverdeling te onderzoeken voorafgaand aan statistisch testen; Bonferroni post-hoc correctie werd ingevoerd om P-waarden aan te passen voor meervoudige vergelijkingen na variantieanalyse (ANOVA). Vergelijkingen tussen twee groepen werden beoordeeld met een ongepaarde Student's t-test, terwijl eenrichtings- of tweerichtings-ANOVA werd toegepast voor multigroepsvergelijkingen. Een p-waarde ≤ 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

β-sitosterol was een potentieel natuurlijk product voor de behandeling van COPD

Vanwege de gerapporteerde genezende effecten van Fritillaria cirrhosa D. Don, gedroogde bloem van Lonicera japonica Thunb., gedroogde wortel van Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq., en Adenophora stricta Miq. bij de behandeling van longziekten 35,36,37,38 gebruikte deze studie de TCMSP-database om systematisch de actieve componenten van deze Traditionele Chinese Geneeskunde (TCM) kruiden te identificeren β-sitosterol werd geïdentificeerd als een belangrijk werkzame bestanddeel dat gedeeld werd door deze TCM-kruiden (Figuur 1A). Om systematisch het onderliggende moleculaire mechanisme van β-sitosterol te onderzoeken, werd de structurele informatie van SMILES opgehaald uit de PubChem-database en geïmporteerd in de SwissTargetPrediction-database voor doelvoorspelling; Alle voorspelde doelen met een voorspellende kans boven 0 werden behouden voor latere analyse. Het resulterende ingrediënt-doelwitinteractienetwerk tussen β-sitosterol en zijn kandidaatdoelen werd gevisualiseerd en gepresenteerd in Figuur 1B. In totaal werden 43 veronderstelde doelgenen van β-sitosterol voorspeld met behulp van de SwissTargetPrediction-database. Vervolgens werden GO functionele verrijkings- en KEGG-routeverrijkingsanalyses uitgevoerd op de doelgenen van β-sitosterol, en alle volledige verrijkingsdatasets werden gearchiveerd in Supplementair Bestand 1. Opmerkelijk is dat steroïdemetabole processen werden geïdentificeerd als een van de meest significant verrijkte routes. Verzamelde literatuur heeft de nauwe correlatie aangetoond tussen abnormale steroïdenmetabolisme en glucocorticoïderesistentie bij COPD³⁹. Bovendien was GR duidelijk verrijkt binnen functionele clusters gerelateerd aan steroïdemetabolisme. Deze bevinding biedt cruciale bio-informatische ondersteuning voor onze latere cellulaire experimenten die het mechanisme onderzoeken waarmee β-sitosterol de gevoeligheid van DEX-effecten verbetert en het GR-expressieniveau verandert.

De genen die gerelateerd zijn aan COPD zijn gehaald uit de TTD- en CTD-databases. Latere Venn-intersectieanalyse (Figuur 1C) toonde twee overlappende genen aan tussen β-sitosteroldoelen en TTD-afgeleide COPD-gerelateerde genen, nog eens twee overlappende genen tussen β-sitosteroldoelen en CTD-afgeleide COPD-gerelateerde genen, en vijf gedeelde COPD-genen tussen de TTD- en CTD-datasets. Uiteindelijk was GR het enige gen dat gemeenschappelijk was in alle drie de datasets en werd het gedefinieerd als het kerndoel van β-sitosterol tegen COPD. Gedetailleerde numerieke gegevens van de Venn-analyse zijn opgenomen in Aanvullend Dossier 2. Voor verdere verificatie van bindingsaffiniteit werd moleculaire koppeling van β-sitosterol met GR uitgevoerd (Figuur 1D). Bindingspockets met Vina-scores lager dan −7,0 kcal/mol werden beschouwd als gunstig bindend affin. De Vina-scores van pockets C1 en C5 waren respectievelijk −8,8 en −7,2 kcal/mol, wat wijst op een sterke voorspelde interactie tussen β-sitosterol en GR.

β-sitosterol beschermde BEAS-2B-cellen tegen CSE-schade, wat mogelijk geassocieerd is met verhoogde GR-expressie

β-sitosterol toonde een significant beschermend effect in het model van BEAS-2B-celbeschadiging geïnduceerd door CSE. De CSE + 0-groep was ontworpen als een voertuigcontrolegroep die CSE ontvangt plus een gelijk volume geneesmiddeloplosmiddel zonder β-sitosterol. Zoals verwacht werd er geen significant verschil gevonden tussen de CSE- en CSE+0-groepen. De verbinding remde de door CSE geïnduceerde productie van TNF-α en IL-6 op een concentratieafhankelijke manier (Figuur 2A). Het verlaagde ook de intracellulaire ROS-niveaus (Figuur 2B). β-sitosterol verlaagde ook het MDA-gehalte significant (Figuur 2C), onderdrukte door CSE geïnduceerde cellulaire senescentie (Figuur 2D) en verlaagde de senescentie-gerelateerde markers p53 en p21 (Figuur 2E). Deze effecten gingen gepaard met upregulatieve GR mRNA-expressie (Figuur 2F), wat suggereert dat de beschermende functie nauw verbonden kan zijn met transcriptionele upregulatie van GR. Binnen het geteste concentratiebereik oefende β-sitosterol geen duidelijke cytotoxiciteit uit op de levensvatbaarheid van BEAS-2B-cellen (Figuur 2G), wat wijst op een gunstige cellulaire tolerantie voor deze verbinding. Aangezien 20 μg/mL (ongeveer 48,2 μM) de krachtigste remmende effecten vertoonde, werd deze dosis geselecteerd voor latere experimenten. Hoewel er geen statistisch significant verschil werd waargenomen tussen de groepen 10 μg/mL en 20 μg/mL met betrekking tot de onderdrukking van pro-inflammatoire cytokines, liet 20 μg/mL β-sitosterol een lichte neerwaartse trend in het niveau van inflammatoire factoren zien. Bovendien behaalde 20 μg/mL een superieure effectiviteit in het remmen van door CSE geïnduceerde ROS- en MDA-accumulatie, het verminderen van cellulaire senescentie en het opreguleren van de expressie van GR mRNA. Dit ondersteunde het selecteren van 20 μg/mL als optimale werkconcentratie voor vervolg-reddingsassays.

RT-qPCR-resultaten (Figuur 2H) bevestigden geslaagde GR-knockdown. De GR mRNA-niveaus in de si-GR-groep werden met ongeveer 78% verlaagd vergeleken met de si-NC-controle, wat de efficiëntie van GR-silencing voor latere reddingsassays bevestigde. Na de GR-knockdown werden de remmende effecten van β-sitosterol op ontstekingsfactoren en ROS significant omgekeerd (Figuur 2I, J). Evenzo werd de verzwakking van cellulaire senescentie door β-sitosterol ook opgeheven (Figuur 2K). Gezamenlijk toonden deze resultaten aan dat β-sitosterol een beschermende rol speelde tegen door CSE veroorzaakte schade aan bronchiale epitheelcellen via GR-gemedieerde ontstekingsremmende, antioxidatieve en anti-verouderingsmechanismen.

β-sitosterol versterkte de therapeutische effecten van DEX op longfunctie en ontsteking in een muismodel van COPD

In een muismodel van COPD, vastgesteld door blootstelling aan sigarettenrook, had behandeling met β-sitosterol, DEX of hun combinatie allemaal duidelijke beschermende effecten. Statistische vergelijkingen tussen meerdere groepen werden geanalyseerd met eenrichtings-ANOVA, gevolgd door Tukey's post-hoc test. Vijf verschillende symboolstijlen werden toegepast om experimentele cohorten te onderscheiden: cirkels voor de controlegroep, driehoeken voor de modelgroep, asterisken voor de Model + DEX-groep, vierkanten voor de Model + β-sitosterolgroep, en diamanten voor de Model + DEX + β-sitosterolgroep. Elke horizontale haak vertegenwoordigt een statistische vergelijking tussen twee gekoppelde experimentele groepen.

In vergelijking met de controlegroep vertoonden muizen in de COPD-modelgroep duidelijke verminderingen in geforceerd uitademingsvolume in 0,1 s (FEV₀.₁), geforceerde vitale capaciteit (FVC), piekuitademingsstroom (PEF) en de FEV₀.₁/FVC-verhouding. Zoals weergegeven in Figuur 3A–D, bevestigde een FEV₀.₁/FVC-verhouding onder 70% de succesvolle vestiging van het COPD-model. Toediening van DEX of alleen β-sitosterol keerde deze longfunctiestoornissen significant om ten opzichte van modelmuizen, en gecombineerde behandeling leidde tot verdere verbeteringen ten opzichte van de toediening van een enkel middel. Daarnaast is een veranderde MMP-9/TIMP-1-verhouding een kenmerkende moleculaire marker voor luchtwegremodeling, en een verhoogde MUC5AC-expressie staat voor een overmatige slijmhypersecretie^40,41. We detecteerden verder de mRNA-niveaus van MMP-9, TIMP-1 en de slijmmarker MUC5AC, en berekenden de MMP-9/TIMP-1 verhouding (Figuur 3E, F). De modelgroep toonde een duidelijk verhoogde MMP-9/TIMP-1 verhouding en verhoogde expressie van MUC5AC. DEX of alleen β-sitosterol verlaagde effectief beide parameters, en combinatiebehandeling leverde een superieure remmende effectiviteit op vergeleken met monotherapie.

COPD-modelmuizen vertoonden uitgesproken verhogingen in BALF-niveaus van TNF-α en IL-6, evenals een verhoogd long-ROS-gehalte ten opzichte van controlemuizen. DEX of β-sitosterol alleen verminderde zowel de ontstekingscytokineniveaus als de oxidatieve stress aanzienlijk, en gecombineerde behandeling leverde sterkere remmende effecten op (Figuur 3G, H). Bovendien werd de expressie van de pulmonale GR mRNA aanzienlijk verlaagd in de COPD-modelmuizen. DEX of alleen β-sitosterol verhoogde de GR-expressie significant, en gecombineerde behandeling verhoogde de GR-niveaus verder (Figuur 3I).

Gezamenlijk gaven deze bevindingen aan dat β-sitosterol beschermde tegen COPD-gerelateerde pathologische veranderingen bij muizen door de longfunctie te behouden, ontstekingen te remmen, oxidatieve stress te verminderen en de expressie van de GR te verhogen. Bovendien versterkte de gecombineerde toediening van β-sitosterol de beschermende effectiviteit van DEX in dit model.

β-sitosterol verbeterde de therapeutische effectiviteit van DEX, mogelijk door regulatie van de GR-route in het door CSE geïnduceerde BEAS-2B-celmodel

In het door CSE geïnduceerde BEAS-2B-celmodel verlaagde DEX-monotherapie significant de mRNA-expressie van pro-inflammatoire cytokines, verlaagde intracellulaire ROS- en MDA-niveaus, en verlaagde het aandeel senescente cellen evenals de expressie van de senescentiemarkers p53 en p21. Deze resultaten bevestigen de ontstekingsremmende, antioxiderende en anti-senescentie werking van DEX. Opmerkelijk is dat het co-toedienen van β-sitosterol de beschermende effecten van DEX verder versterkte, wat resulteerde in een sterkere onderdrukking van ontsteking, oxidatieve stress en cellulaire veroudering in vergelijking met DEX-monotherapie. Bij GR-knockdown (si-GR) in de DEX + β-sitosterol co-behandelingsgroep was de cellulaire respons op de gecombineerde therapie duidelijk afgezwakt. Zoals weergegeven in Figuur 4A–E, werd de comediate remming van ontsteking, oxidatieve stress en senescentie door DEX en β-sitosterol significant omgekeerd, wat aangeeft dat een GR-tekort de gunstige effecten van β-sitosterol op de effectiviteit van DEX verzwakte.

Gezamenlijk toonden deze bevindingen aan dat β-sitosterol de effectiviteit van DEX verbeterde, mogelijk door het reguleren van GR-gerelateerde processen, waardoor de beschermende effecten van DEX tegen door CSE geïnduceerde bronchiale epitheelcelbeschadiging werden versterkt.

BESCHIKBAARHEID GEGEVENS:

Alle ruwe gegevens die de bevindingen van deze studie ondersteunen, zijn opgenomen in de aanvullende materialen (Aanvullend Bestand 1, Aanvullend Bestand 2).

Figuur 1: Sleutelrol van β-sitosterol in COPD-therapie. (A) Actieve componenten in Fritillaria cirrhosa D. Don, gedroogde bloem van Lonicera japonica Thunb., en gedroogde wortel van Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq. en Adenophora stricta Miq. werden gescreend via de TCMSP-database. (B) De potentiële doelwitten van β-sitosterol. (C) Intersectieanalyse van β-sitosterol downstream doelen en COPD-gerelateerde genen. (D) Moleculaire koppelingsanalyse tussen β-sitosterol en GR-eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Betrokkenheid van GR bij β-sitosterol-gerelateerde bescherming tegen door CSE geïnduceerde celbeschadiging. (A) Concentratieafhankelijke modulatie van door CSE geïnduceerde ontstekingsmediatoren (TNF-α, IL-6) door β-sitosterol. (B) β-sitosteroldosis effect op het ROS-niveau in CSE-blootgestelde cellen. (C) Effecten van β-sitosterol op door CSE opgereguleerde MDA-inhoud. (D) De invloed van β-sitosterol op door CSE gestimuleerde cellulaire senescentie. (E) Modulatie van senescentie-gerelateerde p53 en p21 door β-sitosterol onder CSE-stimulatie. (F) β-sitosterolconcentratie-afhankelijke regulatie van GR-expressie onder CSE-stimulatie. (G) Cellevensvatbaarheid van β-sitosterol over geteste concentraties in BEAS-2B-cellen. (H) RT-qPCR-detectie van GR mRNA-expressie om de knockdown-efficiëntie na GR-gerichte siRNA-transfectie te verifiëren. (I) Regulerende associatie tussen GR en β-sitosterol tegen door CSE geïnduceerde ontstekingsfactoren. (J) Regulerende associatie tussen GR en β-sitosterol tegenover CSE-geïnduceerde ROS-accumulatie. (K) Regulerende associatie tussen GR en β-sitosterol tegen CSE-geïnduceerde cellulaire senescence. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001; NS, niet significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Effecten van β-sitosterol gecombineerd met DEX op de longfunctie, ontsteking, oxidatieve stress en GR-expressie bij COPD-modelmuizen. (A) Veranderingen in geforceerd uitademingsvolume in 0,1 s (FEV₀.₁) bij COPD-muizen. (B) Veranderingen in de geforceerde vitale capaciteit (FVC) bij COPD-muizen. (C) Effecten op piek uitademingsstroom (PEF) bij COPD-muizen. (D) FEV₀.₁/FVC-verhouding bij COPD-modelmuizen. (E) Relatieve mRNA-verhouding van MMP-9/TIMP-1 weerspiegelt de herstructurering van de luchtwegen. (F) Relatieve mRNA-expressie van MUC5AC wijst op slijmhypersecretie in muizenlongweefsels. (G) Niveaus van TNF-α en IL-6 in bronchoalveolaire spoelvloeistof (BALF). (H) ROS-productie in het longweefsel van COPD-muizen. (I) Relatieve mRNA-expressie van GR in muizenlongweefsel. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Effect van β-sitosterol op GR-gemedieerde DEX-resistentie in door CSE geïnduceerde BEAS-2B-cellen. (A) Relatieve mRNA-expressie van ontstekingsfactoren (TNF-α, IL-6) in elke groep. (B) ROS-niveau in elke groep. (C) MDA-inhoud in elke experimentele groep. (D) Percentage verouderde BEAS-2B-cellen in elke groep. (E) Relatieve mRNA-niveaus van senescentie-geassocieerde markers p53 en p21. **p < 0,01; p < 0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende tabel 1: Primersequenties gebruikt voor RT-qPCR-analyse. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Volledige GO- en KEGG-verrijkingsanalysedatasets voor β-sitosterol doelgenen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 2: Gedetailleerde numerieke resultaten van de Venn-analyse waarin de overlappende doelen tussen β-sitosterol en COPD worden geïdentificeerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

COPD veroorzaakt een aanzienlijke wereldwijde ziektelast en blijft een grote uitdaging voor de wereldwijde gezondheid¹. De huidige behandeling van COPD omvat zowel farmacologische als niet-farmacologische interventies⁴². Onder de farmacologische behandelingen worden glucocorticosteroïden (GC's) veel gebruikt bij chronische ontstekingsziekten. Ze werken door te binden aan de GR en histondeacetylase 2 te rekruteren in transcriptiecomplexen om histonacetylatie⁴³ om te keren. Echter, meerdere studies hebben aangetoond dat de GC-gevoeligheid bij COPD-patiënten^{is verminderd 44,45}, en onderzoeken hebben bewijs geleverd van GC-resistentie bij deze ziekte⁴⁶. Deze bevindingen geven aan dat het overwinnen van GC-resistentie een aanzienlijke klinische uitdaging is, wat de noodzaak van nieuwe therapeutische middelen benadrukt. Daarom is het identificeren van effectievere therapeutische opties voor COPD van groot belang.

Eerdere studies hebben aangetoond dat γ-sitosterol een antiproliferatief effect uitoefent op bronchiale epitheelcellen bij COPD⁴⁷. Aangezien γ-sitosterol en β-sitosterol beide veelvoorkomende bioactieve componenten van fytosterolen zijn, breidt de huidige studie het huidige begrip van fytosterolwerking bij COPD uit en benadrukt het de potentiële beschermende waarde van β-sitosterol bij ziektepathogenese. Onze bevindingen toonden aan dat β-sitosterol significant de afgifte van ontstekingsfactoren remde, oxidatieve stress verminderde en cellulaire senescentie onderdrukte. Dit komt overeen met eerdere rapporten waaruit blijkt dat β-sitosterol effectief de upregulatie van door lipopolysaccharide geïnduceerde ontstekingsmediatoren zoals IL-6, induceerbare stikstofoxidesynthase en TNF-α⁴⁸ onderdrukt. Deze bevindingen bevestigen de ontstekingsremmende werking en ondersteunen de consistentie ervan over verschillende ontstekingsmodellen heen.

Geïnhaleerde GC's zijn effectieve ontstekingsremmende middelen om ontstekingen in de luchtwegen te beheersen. Ze handelen voornamelijk door te binden aan en de GR⁴⁹ te activeren. Een belangrijk pathologisch kenmerk van COPD is echter de verminderde gevoeligheid van cellen voor de ontstekingsremmende effecten van GCs⁴⁴. Downregulatie of functionele stoornis van GR wordt beschouwd als een belangrijk mechanisme dat ten grondslag ligt aan de ontwikkeling van GC-resistentie bij COPD-patiënten⁵⁰. Eerdere studies hebben aangetoond dat bepaalde geneesmiddelen de GC-gevoeligheid kunnen vergroten. Zo heeft de combinatie van azithromycine en budesonide een significant sterker remmend effect op de productie van IL-4 en CXCL8 dan elk middel op zichzelf⁵¹.

Opmerkelijk is dat de huidige studie aantoonde dat in zowel door sigarettenrook blootgestelde COPD-muismodellen als CSE-geïnduceerde BEAS-2B-celmodellen, de combinatie van β-sitosterol met DEX significant sterkere remmende effecten op ontstekingsfactoren, oxidatieve stress en cellulaire senescentie opleverde dan alleen DEX. Deze combinatie verbeterde ook aanzienlijk de beschermende effectiviteit van DEX tegen COPD-gerelateerde pathologische veranderingen en bronchiale epitheelcelbeschadiging bij muizen. Dit resultaat suggereert dat β-sitosterol de gevoeligheid van bronchiale epitheelcellen voor DEX kan verbeteren, wat een nieuwe benadering biedt om GC-insensitiviteit of -resistentie bij sommige COPD-patiënten aan te pakken. In overeenstemming met in vitro kwantitatieve PCR-resultaten verhoogt β-sitosterol de GR mRNA-niveaus op een concentratieafhankelijke manier, in plaats van direct als GR-agonist of antagonist te dienen. Bevestigde si-GR knockdown-efficiëntie en daaropvolgende functionele reddingsassays bevestigen verder dat β-sitosterol de cellulaire GC-responsiviteit verbetert door het totale intracellulaire GR-niveau te verhogen in plaats van direct GR te activeren, waardoor verbeterde therapeutische effecten worden gegenereerd in combinatie met DEX, een canonieke GR-agonist. Dienovereenkomstig kunnen veranderingen in GR-expressie worden gekoppeld aan de werking van β-sitosterol, wat consistent is met eerdere waarnemingen van significant verminderde GR en de actieve isoform GRα in de gladde spiercellen van de luchtwegen van COPD-patiënten⁵². Belangrijk is dat GR-knockdown-experimenten verder de centrale rol van deze receptor in β-sitosterol-gemedieerde cytoprotectie onthulden, wat aangeeft dat sommige biologische functies van β-sitosterol afhangen van de integriteit van de GR-route.

Gezamenlijk toont de huidige studie niet alleen aan dat GR mogelijk een belangrijke mediator is van β-sitosterol bij COPD-interventie, maar biedt ook een potentiële nieuwe benadering om de klinische uitdaging van DEX-resistentie te overwinnen, waarmee een experimentele basis wordt gelegd voor de ontwikkeling van natuurlijke aanvullende therapieën gericht op de GR-route.

De huidige studie kende echter verschillende beperkingen. Ten eerste werd de longfunctie alleen beoordeeld om het succesvolle vestigen van het COPD-muismodel te bevestigen, en werden hematoxyline-eosine (HE) en Masson-kleuringen niet uitgevoerd om typische pathologische kenmerken, waaronder emfyseem, luchtwegremodellering en slijmhypersecretie, verder te verifiëren. Omdat alle gefixeerde longmonsters tijdens eerdere experimenten werden verbruikt, was reconstructie van het 12-weken-sigarettenrook-geïnduceerde COPD-muismodel niet haalbaar binnen de beschikbare studieperiode. Om deze beperking gedeeltelijk aan te pakken, werden de MMP-9/TIMP-1-verhouding en de expressieniveaus van MUC5AC mRNA gekwantificeerd met behulp van bewaarde long-RNA-monsters. Ten tweede werd slechts één combinatiedosis van β-sitosterol en DEX in vivo geëvalueerd, en werden dosis-respons of synergetische effecten niet systematisch onderzocht. Verdere studies met meervoudige dosiscombinaties zijn gerechtvaardigd om potentiële synergetische interacties te karakteriseren. Ten derde, vanwege experimentele beperkingen en onderzoekskosten, werden slechts zes muizen in elke groep opgenomen. De relatief kleine steekproefgrootte kan de vatbaarheid voor variabiliteit tussen dieren hebben vergroot en de statistische robuustheid van de bevindingen hebben beperkt. Toekomstige studies met grotere steekproefgroottes zijn nodig om de huidige resultaten verder te valideren. Ten vierde werden stabiele DEX-resistente cellijnen niet vastgesteld; Daarom kon het vermogen van β-sitosterol om gevestigde glucocorticoïde resistentie om te keren niet direct worden geëvalueerd. Aanvullende studies met gevalideerde glucocorticoïderesistente modellen zijn nodig om dit potentiële mechanisme verder te onderzoeken.

Concluderend suggereren deze bevindingen dat GR-signalering betrokken kan zijn bij de beschermende effecten van β-sitosterol tegen door CSE veroorzaakte schade in BEAS-2B-cellen, inclusief het remmen van afgifte van inflammatoire factoren, oxidatieve stress en cellulaire veroudering, evenals verbeteringen in de longfunctie en longschade-biomarkers. Bovendien verbeterde β-sitosterol de therapeutische gevoeligheid van deze cellen voor DEX. Gezamenlijk identificeren deze bevindingen β-sitosterol als een potentiële natuurlijke kandidaatmolecuul die kan bijdragen aan de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën voor COPD.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
BEAS-2B menselijke bronchiale epitheelcellen	SunnCell, China	SC-0218	Menselijke bronchiale epitheelcellijn voor in vitro studie
C57BL/6 muizen	Vital River Laboratories, China	213	Diermodel voor COPD in vivo-experiment
CB-DOCK2	China	https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php	voor moleculaire docking simulatie tussen ligand en receptoreiwit
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)	Beyotime Biotechnology, China	C0038	Detectie van celviabiliteit en proliferatie
CellEvent™ Senescence Green Detection Kit	Thermo Fisher, USA	C10851	Detectie van cellulaire veroudering
Sigaretten	Hongta, China	Niet verstrekt	Sigaret gebruikt voor rookblootstelling en CSE-voorbereiding
CTD	USA	https://ctdbase.org/	voor het ophalen van COPD-gerelateerde genen
DCFH-DA fluorescente sonde	Sigma-Aldrich, USA	D6883-50MG	Detectie van intracellulair ROS-niveau
Dexamethason (DEX)	Yeasen, China	40323ES03	Glucocorticoïde voor gecombineerde interventie
DMEM/F12 medium	Gibco, USA	11330032	Basaal medium voor BEAS-2B celkweek
Fetaal bovien serum (FBS)	Gibco, USA	10270106	Aanvulling voor celkweekmedium
GraphPad Prism	GraphPad Software, USA	9.3.1	Data statistische analyse en grafiektekening
Isofluraan	RWD Life Science, China	R510-22-10	Inhalatieanestheticum voor diereusethanasie
Lipid Peroxidation MDA Assay Kit	Beyotime Biotechnology, China	S0131S	Detectie van intracellulair malondialdehyde (MDA) gehalte
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher, USA	11668030	Transfectie reagens voor siRNA levering
Multimode microplaatlezer	Thermo Fisher, USA	VL0000D0	Detectie van absorptie en fluorescentiewaarde
Navios EX Flow Cytometer	Beckman Coulter, USA	B80912	Analyse van ROS en verouderde cellen
Penicilline/streptomycine	HyClone, USA	SV30010	Antibiotica om bacteriële besmetting te voorkomen
Power SYBR™ Green Master Mix	Thermo Fisher, USA	4367659	Fluorescente kwantitatieve PCR-amplificatie
PrimeScript™ RT reagent Kit	Takara, Japan	RR037Q	Omgekeerde transcriptie voor cDNA-synthese
PubChem database	USA	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/	voor het verkrijgen van canonische SMILES-sequentie en het downloaden van 3D SDF-structurele informatie van beta-sitosterol
QuantStudio Dx PCR Instrument	Thermo Fisher, USA	4479889	Real-time RT-qPCR detectie
RCSB PDB	USA	https://www.rcsb.org/	om GR-kristal 3D-structuurbestand te verkrijgen
RNA/Protein Isolation Kit	Beyotime Biotechnology, China	R0018S	Totale RNA-extractie uit cel- en longweefsel
si-GR	Ontworpen in silico via siDirect 2.1	Aangepaste synthese	Gids: 5′-UUUUGAAUGGGUGUAGCAA-3′; Passagier: 5′-GCUUUCACCCAUUCAAAAGG-3′, knockdown voor GR
si-NC	Thermo Fisher, USA	4390843	gebruikt als negatieve transfectiecontrole voor cellulaire en in vivo-tests
SwissTargetPrediction database	Zwitserland	http://swisstargetprediction.ch/	voor in silico voorspelling van potentiële medicijngerelateerde eiwittoretsen
TCMSP database	China	https://www.tcmsp-e.com/	voor screening van kruideningrediënten en doelwitvoorspelling
TTD	Singapore	https://db.idrblab.net/ttd/	voor verzameling van gevalideerde COPD-geassocieerde ziektegenen
Whole-body rookblootstellingskamer	Teague Enterprise, USA	TE-2	Oprichting van een door sigarettenrook geïnduceerde COPD-model
β-sitosterol	ChemicalBook, China	83-46-5	Actieve fytosterol voor medicijnbehandeling