Protocollen voor efficiënte opvoeding en functionele analyse van de endoparasitoïde wesp Asobara japonica en haar gastheer Drosophila melanogaster

Summary

Het doel van dit protocol is het faciliteren van functionele analyse van parasitoïde-gastheerinteracties in Asobara japonica en Drosophila melanogaster. Door geoptimaliseerde kweekmethoden, een infectietest met één eicel en RNAi-gemedieerde gen-knockdown.

Abstract

Parasitisme is een biologische interactie waarbij het ene organisme het lichaam of de hulpbronnen van een ander (de gastheer) uitbuit, wat leidt tot aanzienlijke schade of de dood van de gastheer. Onder parasitaire dieren zijn parasitoïde wespen een van de meest soortrijke lijnen en vormen ze bijna 20% van alle insectensoorten. In het bijzonder leggen endoparasitoïde wespen direct in de gastlichaam en zetten ze een diverse reeks giffactoren in om de ontwikkeling, immuniteit en fysiologie van de gastheer te manipuleren. Als reactie op een wespenaanval proberen gastheren parasitoïde eieren te elimineren via aangeboren immuunmechanismen. De moleculaire en cellulaire mechanismen waarmee individuele gifcomponenten de gastheerbiologie moduleren en succesvolle parasitisme bevorderen, blijven echter slecht begrepen. Hier beschrijven we een gestandaardiseerd laboratoriumprotocol voor het grootbrengen van de endoparasitoïde wesp Asobara japonica en zijn gastheer Drosophila melanogaster. Zowel parthenogenetische als seksuele stammen van A. japonica zijn beschikbaar, en de parthenogenetische stam vertoont een hoog succespercentage voor parasitisme, wat stabiel onderhoud van laboratoriumvoorraden mogelijk maakt voor genoomanalyse en parasitismetests. Een enkelvoudige ovipositie infectietest en een dubbelstrengs RNA-gebaseerde gen-knockdownmethode werden geoptimaliseerd voor functionele analyse van gifgenen. Samen bieden deze protocollen een praktisch experimenteel kader voor het ontleden van de moleculaire mechanismen achter parasitoïde-gastheerinteracties en zullen ze toekomstig onderzoek in ontwikkelingsbiologie, immunologie en fysiologie faciliteren.

Introduction

Parasitisme is een levensstijl waarbij het ene organisme de voedingsbronnen van een ander benut en wijdverspreid is binnen taxa. Er wordt geschat dat tot de helft van alle bekende organismen parasitisme vertont in hun levenscyclus¹. Onder de parasieten vormen parasitoïde wespen een bijzonder diverse groep, die ongeveer 20% van alle insecten uitmaken^. Ze maken gebruik van een breed scala aan geleedpotige gastheren, zoals insecten, spinnen en mijten, en vertonen opmerkelijke diversiteit in hun levensgeschiedenis en parasitaire strategieën³. Deze kenmerken maken parasitoïde wespen tot een van de meest evolutionair en ecologisch succesvolle insectengroepen.

Interacties tussen parasitoïden en hun gastheren zijn uitgebreid bestudeerd als modelsystemen van evolutionaire "wapenwedloop". In het bijzonder gebruiken endoparasitoïde wespen een breed scala aan factoren, waaronder gif, symbiotische virussen en teratocyten ^4,5. Deze factoren manipuleren de fysiologie en ontwikkeling van de gastheer en zorgen zo voor een succesvolle ontwikkeling binnen de gastheer. Ondanks deze vooruitgang blijven de moleculaire mechanismen achter parasitisme slecht begrepen bij de meeste parasitoïde soorten. Een grote beperking is hun kleine lichaamsgrootte, wat de biochemische identificatie van gifcomponenten heeft belemmerd. Daarnaast is het technisch uitdagend om parasitoïden en hun gastheren te onderhouden met gesynchroniseerde ontwikkelingsstadia onder laboratoriumomstandigheden.

Recente ontwikkelingen in next-generation sequencing en andere omics-technologieën maken nu genoombrede analyses mogelijk, zelfs bij zeer kleine parasitoïde soorten. Deze benaderingen hebben nieuwe wegen geopend om voorheen ontoegankelijke moleculaire mechanismen te onderzoeken, waardoor parasitoïde-gastheerinteracties met ongekende resolutie kunnen worden bestudeerd. In deze context richt ons laboratorium zich op Asobara japonica Belokobylskij  (Hymenoptera: Braconidae), een soort die oorspronkelijk in Japan ^6,7,8 werd geïdentificeerd. A. japonica omvat een thelytokous parthenogenetische stam, waarbij vrouwtjes nakomelingen krijgen zonder te paren. Deze functie stelt ons in staat aanzienlijke hoeveelheden genetisch uniform genomisch DNA te verzamelen voor whole-genome sequencing⁹. Daarnaast parasiteert deze soort een breed scala aan Drosophila-soorten, waaronder het modelorganisme D. melanogaster,  dat grote experimentele voordelen biedt vanwege de goed gevestigde opvoedingsomstandigheden en nauwkeurig gedefinieerde ontwikkelingsstadia, waardoor reproduceerbare infectietests en nauwkeurige controle van parasitoïde ontwikkeling^{mogelijk zijn}.

Tijdens parasitisme van A. japonica injecteert een vrouwelijke wesp samen met een enkel ei gif in een vlieglarve, waarin een wespenslarve naast zijn gastheer groeit. Opmerkelijk is dat A. japonica een hoog parasitisme-succespercentage vertoont op de gastheer D. melanogaster, waardoor dit parasitoïde-gastheer-paar een krachtig experimenteel model is. Hier beschrijven we protocollen voor stabiel opvoeden, een infectietest met één ovipositie en een dubbelstrengs RNA (dsRNA)-gebaseerde genknockdownmethode in A. japonica. Deze protocollen bieden een betrouwbaar kader voor het ontleden van moleculaire mechanismen achter parasitoïde-gastheerinteracties.

Protocol

Een schematisch overzicht van de gesynchroniseerde kweekmethode voor D. melanogaster en A. japonica wordt weergegeven in Figuur 1.

1. Het grootbrengen van de gastfruitvlieg Drosophila melanogaster in het laboratorium

1. Houd alle proefdieren op 25 °C en 50-60% relatieve luchtvochtigheid tijdens een licht/donker cyclus van 12:12 uur. Gebruik de wildtype-stam Oregon-R (OR) als gastheer voor A. japonica (Figuur 2A).
2. Overbreng volwassen vliegen naar een nieuw voerflesje met standaard maïsmeel-gist-agar medium (0,55% agar, Tabel 1). Label het flesje met de overdrachtsdatum en de stamnaam "OR".
3. Maak deze volwassen vliegen één dag na de overdracht weg om te voorkomen dat er een te veel eieren in het voedsel zitten. Zorg ervoor dat de larven van het nageslacht op het oppervlak van het voedsel eten.
   OPMERKING: Als richtlijn moet je ongeveer 200-250 eieren per flesje (φ30×100 mm) bewaren. Hogere eidichtheden kunnen het succes van parasitisme verminderen en de variatie in de ontwikkeling van gastheer en wesp vergroten.
4. Vier dagen na stap 1.2 doe je een lepel vlieglarven (4 dagen na het leggen van het ei, dAEL) over in een nieuw voerflesje. Houd deze larven de volgende generatie lang niet blootgesteld aan parasitoïden. Deze procedure helpt ook om de larvale dichtheid van de gastheer in een flesje te reguleren.

2. Het grootbrengen van de endoparasitoïde wesp Asobara japonica in het laboratorium

1. Gebruik een parthenogenetische stam Tokyo (TK) en een seksuele stam Iriomote-jima (IR) (Figuur 2B). De eerste bestaat uit vrouwtjes, terwijl de tweede uit vrouwtjes en mannetjes bestaat. Mannetjes worden twee à vier dagen eerder gedicht dan vrouwtjes. Controleer daarom de aanwezigheid van vrouwtjes via hun legleggers vóór de overdracht.
2. Breng 10-20 volwassen wespen direct uit het voorraadflesje over in het flesje met vliegenlarven bij 4 dAEL. Label het flesje met de overdrachtsdatum en de stamnaam "TK" of "IR". Houd de wespen onder dezelfde omstandigheden als in Stap 1.1.
3. Laat volwassen wespen eieren in vlieglarven. Verwijder deze wespen één tot twee dagen later om superparasitisme te voorkomen, wat tot de dood van de gastheer kan leiden. Verwijder gesloten volwassen vliegen die 10 dagen of langer na Stap 2.2 uit parasitisme zijn ontsnapt.
4. Twee weken na stap 2.2 beginnen volwassen wespen te ontwijken uit het gastvliegenpophuis. Breng deze pas ingesloten volwassen wespen over in een nieuw voerflesje met filterpapier dat 25% glucose en 50 mM vitamine C-oplossing bevat. De stukken filterpapier moeten 2 uur gesteriliseerd worden bij 130 °C. Het leveren van de oplossing op filterpapier bevordert het gedrag van eierlegging en verlengt de levensduur van volwassen wespen. Onze benadering van het gebruik van vitamine C om de eicel te verbeteren is geïnspireerd door observaties in Drosophila-studies ¹¹.

3. Enkelvoudige eicel infectietest

1. Synchroniseer de ontwikkelingsfase van vlieglarven die voor het infectie-experiment worden gebruikt.
   1. Plaats volwassen vliegen in een buis van 50 ml met een druivensap-agarplaat (3% agar) bestrooid met verse gistpasta en laat ze 24 uur eieren leggen.
   2. Verzamel pas uitgekomen larven van het eerste stadium op de druivensap-agarplaat en doe ze over in een klein flesje (12 ml) met 2-3 g vliegenvoer (vliegvoer gemengd met een geschikte hoeveelheid water). 20-30 larven worden in het flesje geplaatst. De vlieglarven mogen groeien tot 25 °C.
2. Bereid op het juiste moment een 4 cm petrischaal voor met een dunne, gelijkmatig verspreide laag vliegenvoedselpasta die een gebied van ongeveer 1,5-2,0 cm diameter bedekt (hierna infectietestarena genoemd). Naast de infectietestarena bereidt u een nieuw klein flesje (12 ml) voor met een geschikte hoeveelheid vliegenvoedselpasta. Dit flesje wordt gebruikt om de larven van de gastheer op te voeden na de infectietest.
3. Verzamel gefaseerde larven en breng ze over in een schaal met gedeïoniseerd water (weerstand = 15 MΩ·cm, 25 °C). Spoel de larven in het schaaltje met zachte beweging om restanten van hun lichaam te verwijderen.
4. Na het spoelen verwijder je voorzichtig overtollig vocht uit de larven met pluisvrije papieren doekjes, omdat overtollig water het gedrag van de wespen-eilegging in de infectietestarena verstoort. Vervolgens worden de larven overgebracht naar de arena. Deze stap verhoogt de larvale activiteit tijdens het infectie-experiment.
5. Verdoof volwassen wespen met_CO2-gas met een debiet van 5 L·^min-1 en een druk van 0,2 MPa. Plaats vervolgens voorzichtig ongeveer drie vrouwelijke wespen in de infectietestarena. Sluit het deksel van de schaal en laat ze herstellen op vliegenvoerpasta.
6. Observeer het eileggingsgedrag van deze wespen onder een stereomicroscoop (zoominstelling: 10× tot 15×).
   OPMERKING: Wanneer een wesp een bewegend larvale lichaam van een vlieg aanraakt, plaatst hij snel zijn legbuis in het vlieglichaam en injecteert hij gifcomponenten. Hoewel de vlieglarve kronkelt en zijn lichaam spartelt, raakt hij onmiddellijk verlamd. Vervolgens laat de wesp haar buik trillen en legt een ei in het larvale lichaam van de gasther, waarna de leger wordt verwijderd. Dit gedrag bij het leggen van eieren wordt infectie genoemd.
7. Na infectie open je het deksel en breng je de geïnfecteerde vlieglarve over in het nieuwe kleine flesje met vliegenvoedselpasta die in stap 3.2 is bereid. Om de infectietiming te standaardiseren, voer je het infectie-experiment binnen 15 minuten uit.
8. Label het kleine flesje met experimentele informatie, zoals de datum, monsternaam, infectietijd en aantal individuen. Deze flesjes worden dichtgestopt en vervolgens in een vochtige container geplaatst en op 25 °C gehouden.

4. Generatie van RNA-interferentie (RNAi) wespen door dsRNA-injectie

1. Synthetiseer dsRNA's van 400 bp of langer voor dsRNA-gemedieerde gen-knockdown (RNA-interferentie, RNAi) met behulp van een in vitro transcriptie-gebaseerd dsRNA-synthesesysteem. De dsRNA-monsters moeten worden gehouden op -20 tot -80 °C tot gebruik. Gedetailleerde protocollen zijn zoals eerder beschreven⁹.
2. Bereid een 5,5 cm petrischaal met 2% agar voor het plaatsen van wespenlichamen. Vul tweederde van elk gerecht met agar om een dikke laag agarplaat te creëren voor injectie.
3. Leg een pluisvrij papieren doekje, bevochtigd met water, op het deksel van een plastic schaaltje.
4. Verzamel gastvliegenpoppen 7 dagen na infectie (dpi) uit het flesje en plaats ze op de pluisvrije papieren doekjes die in Stap 4.3 zijn voorbereid. Het toevoegen van een druppel water aan de buiswand helpt om gastvliegenpopkluizen van het flesje los te maken.
5. Onder de stereomicroscoop (zoominstelling: 20×) verwijder je het gastvliegenpop-omhulsel en maak je een wesplichaam bloot met een tang. Bij 7 dpi bevinden de meeste wespen zich in het popstadium, waarin de kop, borststuk en buik te onderscheiden zijn. Een wespenlichaam is onbeweeglijk.
6. Plaats de teruggehaalde wesplichamen op de agarplaat die in Stap 4.2 is voorbereid, waarbij hun lichaamassen in dezelfde oriëntatie worden uitgelijnd. Plaats 20-30 wespenlichamen met de rugzijde omhoog in één tot twee lijnen. Verwijder overtollig vocht op de agarplaat met een pluisvrij papieren doekje om te voorkomen dat wespen wegglijden.
7. Volgens de instructies van de fabrikant zet je het injectieapparaat en de stereomicroscoop op (Figuur 3A). Gebruik een micro-injectiesysteem uitgerust met een glazen capillairnaald die nauwkeurige controle van het injectievolume en de injectiesnelheid mogelijk maakt. Plaats de agarplaat waarin de wespkoppen zijn georiënteerd naar de punt van de injectienaald. Het injectievolume is 50 nL·^wasp-1 en de injectiesnelheid is 50 nL·^sec-1 op de injector.
8. Bereid glazen capillairnaalden voor met een naaldtreker. De vorm van de glascapillair is inpasbaar met de temperatuur van de verwarming.
9. Plaats de glazen capillairnaald op de naaldslijper onder een hoek van 30-35°. Schuurwerk de naald totdat de puntlengte 0,04 mm bereikt (vier delen op het oculair-richtkruis, Figuur 3B).
10. Ontdooi dsRNA vlak voor injectie. De concentratie van dsRNA is 0,25-1 μg·^μL-1. Voor visualisatie is de dsRNA-oplossing gekleurd met een blauwe kleurstof (Erioglaucine dinatriumzout, 2% gewicht·^volume-1). Met een microloader-pipettip vul je de glazen capillaire met dsRNA-oplossing met blauwe kleurstof. 4 μL is voldoende voor het injecteren van 30 wespenlichamen. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de oplossing aanwezig zijn.
    OPMERKING: Na het laden van de dsRNA-oplossing tik je voorzichtig met een nagel op de zijkant van de naald om eventuele vastzittende luchtbellen te verwijderen. Restluchtbellen kunnen de stroom van de oplossing belemmeren en de succesvolle injectie belemmeren.
11. Met een 1 ml spuit en een naald vul je het ongebruikte deel van de glascapillaire met minerale olie, zodat er geen luchtbellen in de capillaire achterblijven.
12. Bevestig de glazen capillairnaald met dsRNA-oplossing en minerale olie aan de naaldhouder en bevestig deze vervolgens op het injectieapparaat.
13. Pas de positie van de agarplaat en de glazen capillairnaald op de injector aan, zodat de glazen naald onder een hoek van 30-45° ten opzichte van de wesplichamen staat (Figuur 3A).
14. Steek de glazen capillairnaald in de dorsale zijde van het wesplichaam, met de iets laterale zijde naar de dorsale middenlijn. Microinjecteer de dsRNA-oplossing in het lichaam. De geïnjecteerde dsRNA-oplossing is zichtbaar met blauwe  kleurstof (Figuur 3C).
15. Na de injectie plaats je de agarplaten in een vochtige container (70-80% relatieve luchtvochtigheid) en bewaar je ze een week in een incubator van 25 °C, totdat volwassen wespen dichtkomen. Gewonde wespenlichamen moeten van de agarplaat worden verwijderd om bacteriële besmetting te voorkomen.
    PAUZEPUNT: In stap 4.6 mogen de wesppoppen enkele uren op de agarplaat worden gehouden voordat ze injecteren. Naalden kunnen van tevoren worden voorbereid (Stap 4.8 en 4.9); Ze zijn echter gevoelig voor verstopping na verloop van tijd. Vers voorbereide naalden bieden over het algemeen betrouwbaardere injectieprestaties.

Results

De aseksuele en seksuele stammen van Asobara japonica
A. japonica is wijdverspreid in heel Japan. Thelytokous parthenogenetische stammen domineren op de hoofdeilanden, terwijl arrhenotokous seksuele stammen voorkomen op de subtropische eilanden, waaronder Amami-Oshima en Iriomote-jima eilanden ^8,12. Bij seksuele stammen komen mannetjes enkele dagen eerder uit dan vrouwtjes, zodat het tijdstip van volwassen overdracht tussen deze stammen verschillend is. De deelwoeze parthenogenese in A. japonica wordt veroorzaakt door infectie met Wolbachia, een maternaal overgedragen endosymbiotische bacterie¹³. Eliminatie van Wolbachia door antibioticabehandeling resulteert in de productie van mannetjes ^9,14, en transplantatie van Wolbachia in seksuele stammen induceert parthenogenese¹⁵. Zowel aseksuele als seksuele stammen van A. japonica vertonen een hoog parasitisme-succes bij meerdere Drosophila-soorten. Zo kunnen ze bijvoorbeeld D. suzukii parasiteren, een economisch belangrijke fruitplaag, en worden ze beschouwd als potentiële biologische bestrijders in de landbouw¹⁶. Van de beschikbare stammen gebruikten we voornamelijk de door Wolbachia geïnfecteerde TK-stam voor onze experimenten. De TK-stam vertoont een hogere parasitisme-activiteit richting gastheerlarven vergeleken met IR-stam¹⁴, waardoor hij geschikt is voor analyses.

Het succes van parasitisme hangt af van de grootmaakomstandigheden
Het slagingspercentage van parasitisme bij A. japonica is over het algemeen hoog, maar wordt sterk beïnvloed door de grootmaakconditie van gastheervliegen. Onder voedingsarme omstandigheden wordt de groeiperiode van vliegenlarven verlengd en wordt de timing van de popariatie¹⁷ jaar vertraagd. Onder deze omstandigheden kunnen wespen er niet in slagen om de middelen van de gastheer goed te benutten en hun ontwikkeling niet te synchroniseren met die van de gastheren. Om deze mogelijkheid te onderzoeken, hebben we vliegen en wespen grootgebracht onder normale (1×) en gistarme (0,1×) omstandigheden. Vervolgens evalueerden we het succes van parasitisme en het tijdstip van de ontwikkeling (Figuren 2C, 2D). Het succes van parasitisme werd berekend als de verhouding tussen de uitgekomen volwassen wespen en de larven van de gasther.

Onder normale gistomstandigheden was het parasitisme-succespercentage 81,7% in de infectietest met één eier (Figuur 2C, links; Tabel 2). Toen het gistgehalte werd teruggebracht tot 10% (gistarme conditie), daalde het succespercentage van parasitisme tot 35,0% (Figuur 2C, rechts; Tabel 2). Deze vermindering kan worden verklaard doordat ongeveer 50% van de larven van de gastheer stierf na infectie. Deze resultaten suggereren dat de toewijzing van middelen tussen gastheer en parasitoïde wordt verstoord onder voedingsarme omstandigheden.

Opmerkelijk is dat de timing van wespen-eclosie niet in dezelfde mate werd vertraagd onder gistarme omstandigheden als onder normale gistomstandigheden. Terwijl de tijd voor vlieg-eclosie tot 9 dagen werd uitgesteld, werd de tijd voor de eclosie van wespen slechts tot 4-5 dagen vertraagd. Dit resultaat suggereert dat de beschikbaarheid van voedingsstoffen vooral invloed heeft op de ontwikkeling van de gastheer. De timing van eclosie is consistent bij zowel vliegen als wespen onder normale gistomstandigheden, maar niet bij gistarme omstandigheden, wat suggereert dat de gesynchroniseerde ontwikkeling tussen parasitoïden en gastheren afhangt van de beschikbaarheid van voedingsstoffen.

RNAi-gebaseerde benadering voor functionele analyse van gifgenen
Hoewel transcriptomische en proteomische analyses van de gifklier talrijke kandidaatmoleculen identificeren, blijft het onduidelijk welke hiervan nodig zijn voor succesvol parasitisme. Om de fysiologische rollen van deze kandidaatmoleculen te bepalen, zijn in vivo functionele analyses nodig met gen-knockdown-methoden.

We meldden onlangs dat A. japonica-parasitisme apoptose, autophagie en mitotische arrestatie veroorzaakt in de imaginale schijven van D. melanogaster-larven , wat leidt tot ernstige weefseldegradatie, een fenomeen dat imaginal disc degradation (IDD)¹⁰ wordt genoemd. Om de moleculen te identificeren die verantwoordelijk zijn voor IDD, voerden we een RNAi-screen uit van kandidaatgenen die waren geïdentificeerd via transcriptomische, proteomische en vergelijkende genomische analyses. Als gevolg hiervan werden twee genen geïdentificeerd, imaginal disc degradation factor (IDDF)-1 en IDDF-2 . Zowel IDDF-1 als IDDF-2 bevatten het Domein van Onbekende Functie 4803 (DUF4803). Opmerkelijk is dat na ons eerste rapport een onafhankelijke studie meerdere A. japonica-gifeiwitten (Venom-Induced Degradation genoemd, VID) identificeerde die geassocieerd zijn met IDD, die allemaal ook het DUF4803 domein¹⁸ bezitten.

Op basis van deze resultaten hebben we het RNAi-protocol verder geoptimaliseerd om reproduceerbaarheid en efficiëntie te verbeteren. In het bijzonder maakte het gebruik van Nanoject III een nauwkeurige controle van injectievolume en snelheid mogelijk, wat resulteerde in consistentere knockdown-resultaten.

Om de efficiëntie van het geoptimaliseerde RNAi-protocol te evalueren, voerden we knockdown uit van IDDF-1. Bij gesloten volwassen wespen was het expressieniveau van IDDF-1 significant lager vergeleken met de controle (Figuur 3D). Voor functionele validatie voerden we infectieassays uit met enkele oviposities met deze RNAi-wespen en larven van de gastheervlieg, waarbij de apoptose-reporter GC3Ai in de vleugelzakregio¹⁹ tot expressie kwam. Een GC3AI-signaal werd gedetecteerd in de vleugelzak na infectie met controlewespen (GFP RNAi). Daarentegen was het GC3Ai-signaal significant verminderd na infectie met IDDF-1 RNAi-wespen (Figuur 3E, 3F). Deze resultaten komen overeen met eerdere bevindingen en bevestigen dat de functie van IDDF-1 effectief wordt onderdrukt door RNAi.

Figuur 1. Schematisch overzicht van de opvoedingsprocedures voor D. melanogaster en A. japonica. 
Stapsgewijze procedures worden weergegeven volgens de ontwikkelingsstadia van D. melanogaster. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Parasitisme door Asobara japonica. (A) Schematisch van de ontwikkelingsrelatie tussen D. melanogaster en zijn parasitoïde A. japonica. Een vrouwtje wesp zet gif en één ei af in een vlieglarve. Na het uitkomen ontwikkelt de wespenlarve zich parallel aan de gastlarve, die vervolgens pupariaten vormt. Na de verpopping eet de wesp het hele vlieglichaam op en sluit uiteindelijk uit de popbehuizing van de vlieg. (B) Volwassen wespen van de aseksuele stam (links) en seksuele stam (rechts) van A. japonica. Schubbalk, 1 mm. (C) Uitkomstsnelheid van vliegen of wespen onder normale (1×) en gistarme (0,1×) omstandigheden. Infectieassays met één eicel werden uitgevoerd met larven van de gastheervlieg vier dagen na het leggen van het ei (dAEL). n = 267 (1×, vliegen), 120 (0,1×, vliegen), respectievelijk 85 (1×, wespen) en 80 (0,1×, wespen). (D) Eclosietiming van vliegen en wespen onder de twee voedingsomstandigheden zoals weergegeven in (C). De verhouding volwassen dieren tot poppen is aangegeven. n = respectievelijk 250, 107, 61 en 41. De zwarte pijl geeft het tijdstip van wespeninfectie aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Geoptimaliseerde RNAi-procedure met Nanoject III. (A) Opstelling van het microinjectieapparaat onder een stereomicroscoop. De glazen capillairnaald was geplaatst onder een hoek van 30-45° ten opzichte van de agarplaat. (B) De punt van de glazen capillairnaald is geslepen met een naaldslijpmachine. (C) Een blauwgeverfde oplossing werd met een glazen capillairnaald in een wesplichaam gemicronjecteerd. De voorzijde van de wesp wordt op de afbeelding aangegeven door A. P, achterste. Schubbalk, 1 mm. (D) Expressieniveaus van IDDF-1 in GFP RNAi en IDDF-1 RNAi wespen werden gekwantificeerd met de delta-delta C_t methode. De expressieniveaus werden genormaliseerd naar RpL32-Aj. De gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde ± SD met individuele datapunten (n = 5). P < 0,005 ( T-test van de leerling). (E en F) GC3AI-signalen in vleugelschijven van niet-geïnfecteerde larven en gastlarven 6 uur na infectie (hpi) na infectie met controlewespen (GFP RNAi)  of IDDF-1 RNAi. Vleugelschijven zijn omlijnd met witte stippellijnen gebaseerd op DAPI-kleuring van kernen (1:10000, 62247; Thermo Fisher Scientific). De verhouding van GC3Ai-positieve oppervlakkigheid tot vleugelzakoppervlakte werd gekwantificeerd. P < 0,005 (Eenrichtings-ANOVA gevolgd door Tukey's meervoudige vergelijkingstest). n = 11 biologische replicaties per groep. Schaalbalk, 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Componenten	Bedrag
Water	1 L
Agar	5,5 g
Gist	40 g
Maïsmeel	90 g
Glucose	100 g
Propionzuur	3 mL
10% butyl p-Hydroxybenzoaat in 70% EtOH	3,5 mL

Tabel 1: Componenten van standaard maïsmeel-gist-agar medium (vliegenvoer).

Voedseltype	Staat	# van totaal aantal individuen	# van gesloten of dode individuen				Opkomstsnelheid van vliegen of wespen (%)
			Vlieg	Wesp	Dodelijk op de pop	Larvale dodelijk
1×	Ongeïnfecteerd	267	248	0	2	17	92.88389513
	A. japonica is geïnfecteerd	120	0	98	9	13	81.66666667
0,1×	Ongeïnfecteerd	85	38	0	23	24	44.70588235
	A. japonica is geïnfecteerd	80	0	28	13	39	35

Tabel 2: Aantal individuen en opkomstpercentages onder normale (1x) en gistarme (0,1x) omstandigheden.

Naam van de primer	Sequentie (1,60>90 m)	Doel
AjRpL32_qPCR_Fwd	CCCGTCACATGCTTCCTACT	qRT-PCR
AjRpL32_qPCR_Rev	GAATTTGCGATTCTGCATCA	qRT-PCR
qPCR_gene007424_Fwd	TGGGCAATGATTGTGTGAGT	qRT-PCR
qPCR_gene007424_Rev	GCGTCCCTGTATCGAAGGTA	qRT-PCR
Aj_gene007424_ex1_Fwd	ATGAGCATCAAGCAAGCAGTGCTAG	CDS-klonen
Aj_gene007424_ex10_Rev	TCAGCACCTTCTACCCGGCAAATT	CDS-klonen, dsRNA-sjabloon
Aj_gene007424_RNAi_Fwd	GAGGAGAGTGGAAGCCAGGTGTAG	dsRNA-sjabloon
T7_Aj_gene007424_ex10_Rev	GGATCCTAATACGACTCACTATAGGT CAGCACCTTCTACCCGGCAAATT	dsRNA-sjabloon
T7_Aj_gene007424_ RNAi_Fwd	GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAG GAGAGTGGAAGCCAGTTGTAG	dsRNA-sjabloon
※ Deze primers en dsRNA-templates worden gerapporteerd in Kamiyama et al. 2022.
※ gene007424 staat voor IDDF-1.

Tabel 3: Sequenties van primers en dsRNA-templates die in deze studie zijn gebruikt.

Discussion

In deze studie hebben we een veelzijdig experimenteel platform opgezet voor het onderzoeken van parasitoïde-gastheerinteracties op moleculair niveau. Door de opvoedingscondities te optimaliseren, een infectietest met één eier en het RNAi-protocol bieden we een robuust systeem voor functionele studies van parasitoïde-afgeleide factoren. Dit platform zal toekomstige studies faciliteren die gericht zijn op het onthullen van de mechanismen waarmee parasitoïde wespen de ontwikkeling van de gastheer manipuleren en kan ook bijdragen aan de ontwikkeling van biologische plaagbestrijdingsstrategieën.

De door Wolbachia geïnfecteerde TK-stam van A. japonica biedt een zeer reproduceerbaar experimenteel systeem voor het analyseren van parasitisme. In veel parasitoïde-gastheerstudies zijn experimentele uitkomsten vaak variabel, waarbij de overleving en het succes van de parasitoïde van de gastheer gevoelig afhangen van omgevings- en fysiologische omstandigheden. Daarentegen vertoont de TK-stam consequent veel parasitisme-succes, waardoor er effectief een "parasitoïde-dominante" aandoening ontstaat waarbij de uitkomst van de infectie grotendeels uniform is. Bovendien vermindert het als parthenogenetische stam de experimentele variatie tussen individuen vanwege zijn uniforme genetische achtergrond. Deze reproduceerbaarheid maakt betrouwbare tracking van het parasitismeproces mogelijk en faciliteert kwantitatieve analyses van gastheerresponsen en parasitoïde-afgeleide factoren.

Daarnaast vergemakkelijkt de voortplanting van thelytokous genomische analyses aanzienlijk door de generatie van zeer homogeen genomisch DNA mogelijk te maken, wat cruciaal is voor hoogwaardige genoomassemblage. Hoewel dergelijke parthenogenetische stammen niet in alle parasitoïde soorten voorkomen, benadrukken onze resultaten het potentieel van door Wolbachia geïnduceerde thelytoky als strategie om de genomische hulpbronnen te verbeteren. Het vestigen van Wolbachia-geïnfecteerde lijnen in andere parasitoïde soorten kan daarom een krachtige benadering zijn om genomische hulpbronnen uit te breiden en vergelijkende moleculaire studies over parasitoïden te versnellen.

Parasitisme-uitkomsten worden sterk beïnvloed door de voedingsomstandigheden van de gastheer, wat aangeeft dat grootvoedingsomstandigheden een cruciale factor zijn voor het succes van parasitoïden. Omdat succesvol parasitisme afhankelijk is van precieze temporele coördinatie met de ontwikkeling van gastheer en wesp, zullen ongecontroleerde voedingsomstandigheden dit proces waarschijnlijk verstoren en de reproduceerbaarheid verminderen. Daarom is zorgvuldige standaardisatie van de opvoedingscondities van gastheer essentieel om een betrouwbaar experimenteel systeem op te zetten om de interacties tussen parasiet en gastheer te bestuderen. Bovendien moeten de vliegenflesjes apart worden bewaard van de flesjes van wespenbestand, omdat de aanwezigheid van wespen het gedrag van de vliegen-eieren-afzetting^{vermindert met 20,21}.

Om kwantitatieve evaluatie van parasitoïde-gastheerinteracties mogelijk te maken, hebben we een infectietest met één eier ontwikkeld waarbij een enkele eicel in elke gastheer wordt afgezet. Deze test staat in contrast met conventionele bulkinfectie-assays, die vaak meerdere ovipositie-evenementen omvatten die leiden tot overmatige gastheerschade en sterfte. Om efficiënte eierlegging binnen een beperkt tijdsbestek (~15 min.) te bevorderen, werden pas gesloten wespen volwassen mensen voorgeconditioneerd met een glucose- en vitamine C-oplossing, waardoor de efficiëntie van de eicel en de algehele reproduceerbaarheid verbeterden.

Daarnaast optimaliseerden we het RNAi-protocol voor genfunctieanalyse bij parasitoïde wespen. Door gebruik te maken van het microinjectiesysteem bereikten we nauwkeurige controle van het injectievolume en verbeterden we de consistentie van knockdown-efficiëntie. Functionele validatie met IDDF-1 bevestigde dat deze methode genexpressie effectief onderdrukt en reproduceerbare fenotypische uitkomsten oplevert. Aangezien transcriptomische en proteomische studies blijven aantreffen met het identificeren van grote aanstellingen van kandidatengiffactoren, zal de beschikbaarheid van een functioneel screeningsplatform essentieel zijn om hun biologische rol te bepalen.

Een beperking van dit RNAi-protocol is dat het niet geschikt is voor het analyseren van genen die functioneren tijdens de vroege stadia van wespontwikkeling, omdat het technisch uitdagend is om dsRNA in wespen-eieren te injecteren die zich in de gastheerlichamen bevinden. Om dit te overwinnen kan het opzetten van een ex vivo foksysteem een nuttige aanpak bieden²². Alternatief kunnen gen-knockoutbenaderingen met Direct Parental (DIPA)-CRISPR een aanvullende strategie bieden, waarbij reagentia in volwassen vrouwtjes worden geïnjecteerd om genoombewerkte nakomelingen^{te genereren 23}. Deze methode heeft inderdaad met succes gen-knockout-individuen gegenereerd in de pop-ectoparasitoïde Nasonia vitripennis door reagentia te injecteren in volwassen vrouwtjes of individuen in het late popstadium²⁴. Samen met onze RNAi-gebaseerde genknockdownmethode zullen deze benaderingen een meer uitgebreide analyse van genfuncties die betrokken zijn bij het parasitismeproces mogelijk maken.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL tube	Greiner Bio-One	210261	Infectie assay
1 mL syringe	TERUMO	SS-01T	dsRNA injectie
Agar	Daisin, Ltd.	P-700	Kweek
Asnol Petri Dish φ40×13.5mm	As One Corporation	1-8549-01	Infectie assay
Asnol Petri Dish φ55×17mm	As One Corporation	1-8549-02	dsRNA injectie
Blauwe kleurstof (Erioglaucine dinatriumzout)	Sigma-Aldrich Co. Llc.	861146-25G	dsRNA injectie
Butyl p-Hydroxybenzoaat	Nacalai Tesque, Inc.	06327-15	Kweek
CO2 drukregelaar	YAMATOSANGYO	YR-507F-2	Infectie assay
Confocale laserscanning microscoop	Zeiss	LSM700	Beeldanalyse
Maïsmeel	Sunny Maize Co., Ltd.	No.4M	Kweek
DAPI	Thermo Fisher Scientific Inc.	PI62247	Kernkleuring, 1:10000
Gedeïoniseerd water	Millipore Inc.	ZLXEV030WW	Infectie assay
Dual-Stage Glass Micropipette Puller	Narishige	PC-10	dsRNA injectie
Fiji	NA	https://fiji.sc	Beeldanalyse
Filterpapier	Advantec	ITEM 526	Kweek
Vliegvoer flesje	Chiyoda Science Co., Ltd.	KFB-3M	Kweek
Vliegvoer flesje plug	Chiyoda Science Co., Ltd.	AS-275	Kweek
Pincet	Dumont Biologie	11252-20	Dissectie
Vriezer, -20 °C	Nihon Freezer	GS-3120HC	Staalopslag
Vriezer, -80 °C	Nihon Freezer	CLN-52UD2	Staalopslag
Glijplaatjes	Matsunami Glass Ind., Ltd	S7213	Infectie assay
Glucose	Showa Sangyo Co., Ltd.	Niet beschikbaar	Kweek
KOD Plus Neo	Toyobo	KOD-401	dsRNA synthese
Incubator	Panasonic	MIR-254-PJ	Kweek
Ligation high Ver.2	Toyobo	LGK-201	dsRNA synthese
Micropipet aanmaakschuur	Narishige	EG-401	dsRNA injectie
Mineralolie	Nacalai Tesque, Inc.	23306-84	dsRNA injectie
Nanoject III	Drummond Scientific Company	3-000-207	dsRNA injectie
Nanoject Glass Capillaries	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	dsRNA injectie
pBluescript KS (+) plasmid	Niet beschikbaar	Niet beschikbaar	dsRNA synthese
pBluescript SK (-) plasmid	Niet beschikbaar	Niet beschikbaar	dsRNA synthese
PrimeScript reverse Transcriptase	Takara	2680A	dsRNA synthese
Propionzuur	Nacalai Tesque, Inc.	29018-55	Kweek
PROWIPE	Daio Paper Corporation	2-2624-02	Infectie assay, dsRNA injectie.
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix met gDNA Remover	Toyobo	FSQ-301	qRT-PCR
RNAiso Plus reagens	Takara	9108	qRT-PCR
Klein flesje (Testbuisje 12 mL)	Sarstedt	REF 58.487	Infectie assay
Klein flesje plug	Chiyoda Science Co., ltd.	QD-S4	Infectie assay
Spatel	As One Corporation	6-522-02	Kweek
Vierkante petrischaal	Eiken Chemical Co., Ltd.	64-2192-55, AW2000	dsRNA injectie
Stereomicroscoop	Leica Microsystems	lvesta3 (C-Mount)	Infectie assay
Stereomicroscoop	Nikon Solutions Co., Ltd.	SMZ1000	dsRNA injectie
T7 RiboMAX Express RNAi System	Promega	P1700	dsRNA synthese
Thermal Cycler Dice Real Time System	Takara	TP815	qRT-PCR
Thermal Cycler GeneAtlas	Astel	G02	dsRNA synthese, qRT-PCR
THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix	Toyobo	QPS-201	qRT-PCR
TissueLyser II	Qiagen	Niet beschikbaar	qRT-PCR
Vitamine C, L-Ascorbinezuur	Nacalai Tesque, Inc.	03420-65	Kweek
Welch's druivensap 100	Asahi Soft drinks Co., Ltd.	32390	Infectie assay
Gist	Asahi Group Foods, Ltd.	HB-P02	Kweek