Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Behoud van In Vivo Weefselcomplexiteit in een Olfactorisch Zenuwstelselmodel van Muizen met behulp van Whole-Mount Analyse voor het Bestuderen van Neurale Regeneratie

140 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/72036

⸱

18 augustus 2026

 ,  ,  , 
1Griffith Institute for Biomedicine and Glycomics, Griffith University, 2Clem Jones Centre for Neurobiology and Stem Cell Research, Griffith University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een volledige workflow voor het behoud van de anatomische complexiteit van het olfactorische zenuwstelsel van de muis. Hier hebben we de volledige workflow gedetailleerd, inclusief dissectie, weefselpreparatie en beeldvorming. Dit protocol kan worden gebruikt om het olfactorische systeem te bestuderen onder normale of abnormale omstandigheden, inclusief natuurlijke herstelcondities.

Samenvatting

In het tijdperk van driedimensionale (3D) beeldvorming is gebleken dat standaard immunohistochemie zeer beperkt is bij studies naar pathologie en complexe menselijke anatomie. Door slechts smalle coupes te analyseren, kunnen grotere structuren en essentiële aspecten van de weefselarchitectuur cruciale contextuele details verliezen, wat leidt tot onvolledige of misleidende interpretaties. Hoewel tweedimensionale (2D) secties een basisbegrip van de histoarchitectuur hebben ondersteund, zijn ze onvoldoende om de werkelijke driedimensionale realiteit van biologische weefsels vast te leggen.

Een toenemend aantal studies in diverse anatomische regio's maakt nu gebruik van technieken waarbij intacte anatomische eenheden worden geïsoleerd - flat mount-, whole-mount- of en face-preparaten - gecombineerd met fluorescentiemicroscopie met een hoge resolutie. Deze benaderingen bieden een meer volledige visualisatie en interpretatie van de structurele organisatie. Dit is bijzonder belangrijk in het olfactorische zenuwstelsel, waar het definiëren van complexe cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan het opmerkelijke regeneratieve vermogen een context over de volledige dikte vereist. Bij dunne coupes bestaat het risico dat cruciale pathofysiologische kenmerken, die nog onvoldoende zijn gedefinieerd, over het hoofd worden gezien.

Gezien deze beperkingen en de kennislacune met betrekking tot de cellulaire interacties die de olfactorische regeneratie aansturen, was de ontwikkeling van een verfijnde whole-mounttechniek die in staat is om de complexiteit van het volledige weefseldikte te behouden essentieel. Volledige olfactorische slijmvliezen werden geïsoleerd als monsters van de volledige weefseldikte, vergezeld van een geoptimaliseerd protocol voor antilichaampenetratie. Hoge-resolutie imaging (EVIDENT SpinSR) en 3D-reconstructie maakten een nauwkeurige visualisatie van cellulaire interacties in vivo mogelijk.

Inleiding

Het olfactorische zenuwstelsel (ONS) vormt een uniek en goed onderbouwd model voor het bestuderen van mechanismen van neurale regeneratie, aangezien het gedurende het hele leven het unieke vermogen tot neuronale omloop behoudt1. De potentie voor klinische vertaling van dit neuro-reparatieve vermogen blijft echter beperkt door aanzienlijke hiaten in ons begrip van het gedrag van de cellen in het olfactorische systeem2,3,4. De cellulaire responsen en anatomische organisatie van het ONS, waaronder primaire olfactorische neuronen, olfactorische omhullingscellen (OECs) en perineurale fibroblasten, zijn beschreven in verschillende dierstudies, waarbij gebruik werd gemaakt van ultradunne (<2 µm) weefselcoupes in combinatie met ernstige fysieke letselmodellen toegepast op het ONS van knaagdieren1,2. De dieren in deze studies werden gewoonlijk 10 dagen na het letsel geëuthanaseerd, wat slechts een klein venster biedt op één specifiek moment van de uitgebreide en complexere remodellering van dergelijk weefsel tijdens neuraal letsel2. Deze studies rapporteerden dat OECs en fibroblasten na axonale dood als continue kanalen zouden blijven bestaan na het letsel.

Hoewel informatief, zorgde de gehanteerde aanpak vanwege de vele hierboven toegelichte beperkingen voor een conceptueel overzicht met een lage resolutie op een oppervlakkig niveau van de ONS, waardoor een uitgebreide beoordeling van de werkelijke cellulaire organisatie binnen de intacte ONS uiteindelijk werd uitgesloten3. Als gevolg hiervan zijn kritieke ruimtelijke relaties mogelijk over het hoofd gezien.

Het behoud van de driedimensionale weefselstructuur is essentieel voor een nauwkeurige anatomische en cellulaire analyse en is met succes toegepast op meerdere organen en pathologieën4,5,6,7,8,9,10,11,12. Whole-mount benaderingen zijn gebruikt om de neurale organisatie binnen het reukslijmvlies in kaart te brengen13,14, maar de visualisatie van de cellulaire interacties met een volledige ONS-structuur, inclusief een behouden lamina propria, is nog niet uitgevoerd.

In deze studie stellen we een workflow vast met gebruik van een muismodel met whole-mount weefselverwerking, immunokleuring, hoge-resolutie beeldvorming en driedimensionale reconstructie, wat een gedetailleerde analyse van de architectuur van het ONS mogelijk maakt. Dit protocol is ontwikkeld om het gat in bestaande gepubliceerde methoden op te vullen, waarbij het protocol een volledige dikte van het olfactorische slijmvlies conserveert en preserveert, inclusief de lamina propria, waardoor de studie van intercellulaire interacties mogelijk wordt. Opmerkelijk is dat deze verfijnde methode voor weefselverzameling en -verwerking kan worden toegepast en gecombineerd met diverse modellen van het olfactorische systeem.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten met dieren en transgeen gemodificeerde cellen werden uitgevoerd met goedkeuring van de Biosafety Committee van de Griffith University (NLRD/003/2020_var3) en de Animal Ethics Committee van de Griffith University (MHIQ/04/23/AEC), in overeenstemming met de richtlijnen van de Australian Commonwealth Office of Gene Technology regulator (OGTR).

OPMERKING: In totaal werden 15 volwassen laboratoriummuizen (8–9 weken) van beide geslachten gebruikt in de studie. Specifiek ging het om S100β-DsRed transgene muizen, waarbij alle OEC's het helderrood eiwit DsRed tot expressie brengen onder controle van de S100β-promotor. S100β maakt deel uit van een bredere familie van calciumbindende eiwitten en komt gewoonlijk tot expressie in gliacellen in het centrale zenuwstelsel, zoals OEC's. Dit model was optimaal voor de doeleinden van deze experimenten, omdat het een eenvoudige lokalisatie van de doelcelpopulaties mogelijk maakte met behulp van endogene fluorescentiesignalen. De S100β-DsRed transgene muizen waren eerder gegenereerd, en het is aangetoond dat het gebruik van deze transgene muizen een verbeterde detectie van OEC's biedt in vergelijking met immunohistochemie voor analyses van gefixeerd weefsel15,16,17,18.

1. Verzamelen van koppen en fixatie van weefsel

  1. Euthanaseer de dieren op de experimentele tijdstippen door inhalatie van toenemende CO2.
  2. Bevestig de dood door de afwezigheid van corneale reflexen en pedale terugtrekkingsreflexen, gevolgd door cervicale dislocatie, of in overeenstemming met de goedgekeurde SOP.
  3. Verwijder de gehele kop en de kaken met een schaar.
  4. Verwijder de huid van de schedel en verwijder het kraakbeen aan de neuspunt om de neusholte bloot te leggen en een efficiënte penetratie van het fixatiemiddel te waarborgen.
    OPMERKING: Deze stap, waarbij het meest frontale deel van het neuskraakbeen van het dier wordt weggesneden, bleek cruciaal om de juiste fixatie van het weefsel in de neusholte mogelijk te maken.
  5. Spoel de koppen snel met PBS 1× om overtollig bloed te verwijderen.
  6. Fixeer het weefsel door overnight (12–18 h) onderdompeling in 4% paraformaldehyde, gedurende ten minste 6 h (voldoende tijd om het betreffende weefsel te fixeren) bij 4 °C op een roller.
    WAARSCHUWING: Paraformaldehyde is een gevaarlijke chemische stof die formaldehyde-dampen afgeeft. Het is toxisch bij inademing, huidcontact en inname; het veroorzaakt irritatie aan de ogen, huid en luchtwegen; en het is een vermoedelijk carcinogeen. Werk uitsluitend in een zuurkast met geschikte PBM, waaronder handschoenen, een laboratoriumjas en oogbescherming. De veilige afvoer van gevaarlijke chemicaliën en biologisch afval dat tijdens het protocol wordt gegenereerd, moet gebeuren in overeenstemming met institutionele en lokale regelgeving.
    ​OPMERKING: Tijdens optimalisaties observeerden we dat 6 h voldoende was om het betreffende weefsel te fixeren; echter leidde een periode van meer dan 12 h waarschijnlijk tot overfixatie en degradatie van de mucosale structuren.
  7. Haal de koppen uit het fixatiemiddel en was ze gedurende 3 h in PBS 1× bij kamertemperatuur (20–25 °C) op een roller.
  8. Bewaar de koppen in verse PBS bij 4 °C en verzamel het mucosal weefsel (whole-mount) binnen 48 h.

2. Collectie van weefsel in whole-mount

  1. Voer weefselisolatie uit onder een microscoop.
  2. Snijd de koppen doormidden met een scalpel, langs de midsagittale lijn.
  3. Leg het interieur van de neusholte bloot (Figuur 1). Identificeer de anatomische regio's en verzamel het slijpvliesweefsel dat de gehele anatomische sectie bekleedt (Figuur 1B).
  4. Breek en verwijder met een botcutter voorzichtig het septale bot dat een deel van de mucosa-holte bedekt.
    OPMERKING: Zie Figuur 2ADeze stap is cruciaal om de concave holte onder het bot bloot te leggen, waar de axonbundels door de dorsale wand lopen (Figuur 1B).
  5. Zodra dit gebied is blootgelegd, gebruikt u gebogen pincetten om het weefsel voorzichtig los te maken en uit de concave dorsale wand te scheppen. Til het weefsel van het onderliggende bot op en pel voorzichtig het resterende reukepitheel af om het intacte whole-mount preparaat te verzamelen.
    OPMERKING: In deze fase was extreme voorzichtigheid vereist om scheuring van het weefsel te voorkomen.
  6. Verzamel het betreffende weefsel uit zowel het rechter- als het linkerneusgat: het slijmvlies bedekt het septum, de dorsale linker- en rechterwand en de zeefplaat (lamina cribrosa) van de neusholte (Figuur 1A, B)Verzamel weefsel uit beide neusgaten, inclusief het septum, de dorsale wanden en de cribriforme plaat, om de anatomische regio te isoleren die de primaire olfactorische structuren bevat (Figuur 2C).
  7. Was de verzamelde weefsels in 1× PBS en verwijder alle ongewenste weefsels, inclusief botfragmenten. Bewaar de weefsels bij 4 °C in 1× PBS voor toekomstige immunohistochemische analyse.
    OPMERKING: Indien het weefsel langdurig bewaard moet worden, wordt geadviseerd dit op te slaan in een oplossing van 1× PBS en 0,001% (w/v) natriumazide, bij 4 °C.

3. Geoptimaliseerd kleuringsprotocol

OPMERKING: Veelgebruikte kleuringsprotocollen zijn doorgaans geoptimaliseerd voor secties met een dunne tot gemiddelde dikte (bijv. tot 50 µm). Daarom moest het protocol worden aangepast aan het veel dikkere weefsel.
​Er werd vastgesteld dat een cruciale stap bestond uit het laten drijven van het weefsel in Eppendorf-buisjes gedurende het gehele kleuringsproces en het plaatsen van de buisjes op een roller terwijl de reagentia penetreren. Daarom werden de kleuringsstappen niet uitgevoerd met het weefsel op een objectglas. Het weefsel werd eerst gekleurd terwijl het dreef en vervolgens gemonteerd op objectglazen. Deze details zorgden ervoor dat het weefsel niet zou vouwen en dat de reagentia en antilichamen het gehele gebied konden penetreren.

  1. Haal de weefsels uit de opslag en plaats ze in een Eppendorf-buis met blokkeringsoplossing (de te gebruiken oplossing is specifiek voor de kleuring).
    ​OPMERKING: Blokkeringsoplossing: 3% BSA, 0,3% Triton X-100 in PBS. Een andere belangrijke aanpassing was de tijd dat het weefsel aan elk reagens en antibody-cocktail werd blootgesteld.
  2. Houd het weefsel 3 u bij kamertemperatuur in blokkeringsoplossing op een roller.
    OPMERKING: Er werd waargenomen dat het niet nodig was om de concentratie van de geselecteerde antilichamen en kleuringsreagentia (Tabel 1) te verhogen als de blootstellingstijd daaraan werd verlengd in vergelijking met de standaard immunohistochemische kleuring van dunne coupes. Dit minimaliseerde ook het gebruik van dure antilichaam-reagentia. Incubaties worden uitgevoerd in een 1,5 mL Eppendorf-buis waarbij de dophouder is afgesneden, zodat deze kan rollen op een roller. Het reagensvolume was 500 µL.
  3. Incubeer gedurende 72 u bij 4°C met primaire antilichamen op een roller.
  4. Was het weefsel tweemaal (elk 1,5 u) met PBS 1× bij kamertemperatuur op een roller.
  5. Incubeer het weefsel met het secundaire antilichaam (ingepakt in aluminiumfolie) en kernkleuring gedurende minimaal 4 u bij kamertemperatuur op een roller en vervolgens een nacht (12–18 u) bij 4 °C op een roller.
  6. Was het weefsel tweemaal (elk 1,5 u) met PBS 1× bij kamertemperatuur op een roller.

4. Preparatie van de coupes

  1. Verwijder het weefsel voorzichtig uit de Eppendorf-buis
  2. Plaats het weefsel onder een microscoop op een objectglas en zorg dat er geen plooien in het weefsel zitten.
    OPMERKING: De oriëntatie van het weefsel kan onder de microscoop worden vastgesteld zonder fluorescentie. De lamina propria-zijde van het slijmvliesweefsel moet zodanig op het objectglas worden geplaatst dat het epitheel naar het glas van het objectglas is gericht en de lamina propria naar het dekglas. De lamina propria kan worden geïdentificeerd aan de aanwezigheid van dikke zenuwbundels, die zonder kleuring zichtbaar zijn. Door de oriëntatie zo te kiezen dat de lamina propria naar de zijde van het dekglas is gericht en de epitheelzijde op het objectglas ligt, worden zowel het kleuringsproces als het beeldvormingsproces vergemakkelijkt.
  3. Dek de preparaten af met dekglas met behulp van een fluorescent monteermedium en verzegel de objectglazen.
  4. Objectglazen kunnen worden bewaard bij 4 °C, nadat ze gedurende één nacht (12–18 h) in het donker bij kamertemperatuur zijn gedroogd

5. Beeldacquisitie en nabewerking

  1. Acquisitie van immunofluorescente beelden bij lage vergroting
    1. Voer tijdens de beeldacquisitie automatische stitching uit met lineaire alpha-blending.
      ​OPMERKING: Het aantal z-stack frames moet worden aangepast aan de dikte van het specimen om volledige dekking van het weefselvolume te garanderen.
    2. Leg aangrenzende gezichtsvelden vast met een overlap van 15%. Acquireer getegelde beelden met een meander-acquisitiepatroon.
    3. Pas het totale aantal optische secties aan op basis van de weefseldikte.
    4. Stel de beeldkalibratie in op 215,594 nm/pixel in zowel de X- als Y-as. Acquireer beelden als z-stacks met een z-stapgrootte van 0,8 µm.
    5. Plaats het gemonteerde whole-mount weefsel op de tafel van de confocale microscoop. Acquireer overzichtsbeelden met een 30x objectief (NA 1,04).
  2. Acquisitie van immunofluorescente beelden bij hoge vergroting.
    1. Acquireer gedetailleerde beelden met een 60× objectief (NA 1,5). Stel de beeldkalibratie in op 107,923 nm/pixel in zowel de X- als Y-as. Acquireer z-stack beelden met een z-stapgrootte van 0,41 µm.
    2. Pas het totale aantal optische secties aan op basis van de weefseldikte. Leg beelden vast vanuit een enkel gezichtsveld.
      ​OPMERKING: Voor 60× acquisities is geen image stitching vereist, omdat elke dataset uit een enkel gezichtsveld bestaat.
  3. Acquisitie van histologische referentiebeelden
    1. Beeld HE-gekleurde mid-sagittale secties van muizenkoppen met een slide-scanning microscoop onder brightfield-verlichting.
    2. Acquireer beelden met een 40× objectief (NA 0,95) en een cameravergroting van 0,63x, wat resulteert in een effectieve vergroting van 25,2×.
    3. Bevestig een pixelkalibratie van 136,905 nm/pixel in zowel de X- als Y-as. Acquireer het beeld als een enkel focaal vlak.
    4. Stitch getegelde beelden automatisch met een meander-acquisitiepatroon en lineaire alpha-blending.
  4. Acquisitie van immunofluorescente referentie-overzichtsbeelden
    1. Acquireer aanvullende immunofluorescente overzichtsbeelden met een 10x objectief.
    2. Leg het specimen vast als een enkele z-slice door tijdens de beeldacquisitie 0% tile-overlap te gebruiken.
    3. Stel de beeldkalibratie in op 647,249 nm/pixel in zowel de X- als Y-as. Genereer vervolgens een overzichtsbeeld dat de gehele anatomische regio van belang omvat.
  5. Beeldverwerking en generatie van definitieve figuren.
    1. Exporteer de geacquireerde beelddatasets naar beeldanalyse-software. Genereer maximum intensity projections (MIPs) vanuit de z-stack datasets.
    2. Selecteer regions of interest (ROI's) voor nadere analyse en figuurvoorbereiding.
    3. Combineer immunofluorescente overzichtsbeelden met overeenkomstige HE-beelden om anatomische referentiefiguren te genereren. Verifieer vervolgens de uitlijning en anatomische correspondentie tussen de fluorescentie- en histologische datasets voorafgaand aan de figuurvoorbereiding.
      OPMERKING: Alle image stitching moet automatisch tijdens de beeldacquisitie worden uitgevoerd met vooraf ingestelde microscoopinstellingen en mag geen aanvullende post-processing vereisen. In ons geval werd de 3D-rendering gegenereerd met de Imaris-software: de surface rendering plugin, gebaseerd op drempelintensiteit voor elk geacquireerd kanaal, werd gebruikt om de 3D-reconstructie te produceren. Uiteindelijk werden de definitieve beelden samengesteld in Adobe Illustrator.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De hier gepresenteerde whole-mount benadering maakte de isolatie en preservatie van het volledige reukepitheel mogelijk. In ons geval lag de focus op het begrijpen van cellulaire en anatomische veranderingen op zowel macro- (volledig anatomisch overzicht) als microniveau (cellulair niveau).

De whole-mount benadering stelt ons in staat om zowel de epitheliale compartimenten als die van de lamina propria te verzamelen en de ruimtelijke relaties tussen axonbundels, olfactorische omhullende cellen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De afgelopen decennia hebben langzaam het begin van het driedimensionale tijdperk gezien, waarbij vele innovatieve benaderingen in het wetenschappelijke veld zijn ontwikkeld. Zo hebben driedimensionale reconstructiemethoden, mogelijk gemaakt door de ontwikkeling van complexe whole-mount imaging-methoden in combinatie met fluorescentiemicroscopen met een hoge resolutie, gezorgd voor een beter begrip van verschillende volledige weefselhistoarchitecturen. Deze driedimensionale rendering-benaderingen zijn gebruikt om verschi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te melden.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door financiering van de Clem Jones Foundation, de Perry Cross Spinal Research Foundation en de Motor Accident Insurance Commission aan JSTJ en RR, een National Injury Insurance Scheme Queensland-beurs aan RR, en een Perry Cross Spinal Research Foundation-beurs aan FO. Een deel van dit project werd ondersteund door de “Griffith University Post-Graduate Research Scholarship (GUPRS)” en de “Griffith University International Postgraduate Research Scholarship (GUIPRS)” aan FO.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Bovien serumalbumine (BSA)Sigma-AldrichA3294-50GImmunohistochemie
Adobe Illustratorversie 28.5
Anti-beta III tubuline antilichaam - neuronale markerAbcamab18207
Anti-PDGFR bèta antilichaam [APB5]Abcamab91066
bisBenzimide H 33342 trihydrochlorideSigma Aldrich14533
DEKGLAASJE 24X50MM NR. 1.5 100STKBio-strategyEPBRCS245015GPImmunohistochemie
Donkey anti-konijn IgG (H+L) sterk kruisgeadsorbeerd secundair antilichaam, Alexa Fluo 488Thermo FisherA-21206
Dumont #15A botknipper - epoxy gecoatDaniels Health Laboratory Products P/L11215-02Weefseldissectie
Dumont #7 pincet - Biologie/DumostarDaniels Health Laboratory Products P/L11297-10Weefseldissectie
Geit anti-rat IgG (H+L) kruisgeadsorbeerd secundair antilichaam, Alexa Fluor™ 647Thermo FisherA-21247
Imaris softwareImarisversie 9.5.0Imaging
Mayo dissectieschaarProSciTech420SSWeefseldissectie
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148-500GWeefselbewerking
Fosfaatgebufferde zoutoplossing, steriele PBS-tabletten (PBS)Thermo Fisher Scientific18912014Weefselbewerking
ProLong Glass Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36980Immunohistochemie
Scalpelblad #23Scalpel Blades Swann MortonCOS240BWeefseldissectie
Scalpelhouder #4ProSciTechT134Weefseldissectie
NatriumazideSigma-AldrichS2002-25GWeefselbewerking
SucroseChem-Supply57-50-1Weefselbewerking
TOMO Adhesie microscopiglazenProSciTechGEMS63705-09Immunohistochemie
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100mLImmunohistochemie

Referenties

  1. Li Y, Field P M, Raisman G. Repair of adult rat corticospinal tract by transplants of olfactory ensheathing cells. Science. 1997;277 (5334),2000–2002.
  2. Li Y, Field P M, Raisman G. Olfactory ensheathing cells and olfactory nerve fibroblasts maintain continuous open channels for regrowth of olfactory nerve fibres. Glia. 2005;52(3):245–251.
  3. Yamaguchi M, et al. The New Era of Three-Dimensional Histoarchitecture of the Human Endometrium. J Pers Med. 2021;11(8).
  4. Falk M, Ynnerman A, Treanor D, Lundström C. Interactive visualization of 3D histopathology in native resolution. IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 2018;25(1):1008–1017.
  5. Kiemen A, et al. In situ characterization of the 3D microanatomy of the pancreas and pancreatic cancer at single-cell resolution. BioRxiv. 2020.2012. 2008.416909, (2020).
  6. Tian J, et al. Three-dimensional reconstruction of laryngeal cancer with whole organ serial immunohistochemical sections. Sci Rep. 2020;10(1):18962.
  7. Lotz JM, et al. Integration of 3D multimodal imaging data of a head and neck cancer and advanced feature recognition. Biochim Biophys Acta Proteins Proteom. 2017;1865(7):946–956.
  8. Nojima S, et al. CUBIC pathology: three-dimensional imaging for pathological diagnosis. Sci Rep. 2017;7(1):9269.
  9. Tainaka K, et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell reports. 2018;24(8):2196–2210.e2199.
  10. Onozato ML, Klepeis VE, Yagi Y, Mino-Kenudson M. A role of three-dimensional (3D)-reconstruction in the classification of lung adenocarcinoma. Stud Health Technol Inform. 2012;35(2):79–84.
  11. Hama H, et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of the transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 2011;14(11):1481–1488.
  12. Tainaka K, et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 2014;159(4):911–924.
  13. Oberland S, Neuhaus EM. Whole mount labeling of cilia in the main olfactory system of mice. J Vis Exp. 2014;10.3791/52299(94).
  14. Gavid M, et al. Technique of flat-mount immunostaining for mapping the olfactory epithelium and counting the olfactory sensory neurons. PLoS One. 2023;18(1):e0280497.
  15. Windus LC, et al. Stimulation of olfactory ensheathing cell motility enhances olfactory axon growth. Cell Mol Life Sci. 2011;68(19):3233–3247.
  16. Windus LC, Claxton C, Allen CL, Key B, St John JA. Motile membrane protrusions regulate cell-cell adhesion and migration of olfactory ensheathing glia. Glia. 2007;55(16):1708–1719.
  17. Windus LC, et al. Lamellipodia mediate the heterogeneity of central olfactory ensheathing cell interactions. Cell Mol Life Sci. 2010;67(10):1735–1750.
  18. Chehrehasa F, et al. Olfactory glia enhance neonatal axon regeneration. Mol Cell Neurosci. 2010;45(3):277–288.
  19. Ueda HR, et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 2020;21(2):61–79.
  20. Jing D, et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Res. 2018;28(8):803–818.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Driedimensionale beeldvormingvolledige weefseldiktehoge-resolutie microscopieantilichaampenetratie3D-reconstructiereukslijmvlies

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.