Behoud van In Vivo Weefselcomplexiteit in een Olfactorisch Zenuwstelselmodel van Muizen met behulp van Whole-Mount Analyse voor het Bestuderen van Neurale Regeneratie

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een volledige workflow voor het behoud van de anatomische complexiteit van het olfactorische zenuwstelsel van de muis. Hier hebben we de volledige workflow gedetailleerd, inclusief dissectie, weefselpreparatie en beeldvorming. Dit protocol kan worden gebruikt om het olfactorische systeem te bestuderen onder normale of abnormale omstandigheden, inclusief natuurlijke herstelcondities.

Samenvatting

In het tijdperk van driedimensionale (3D) beeldvorming is gebleken dat standaard immunohistochemie zeer beperkt is bij studies naar pathologie en complexe menselijke anatomie. Door slechts smalle coupes te analyseren, kunnen grotere structuren en essentiële aspecten van de weefselarchitectuur cruciale contextuele details verliezen, wat leidt tot onvolledige of misleidende interpretaties. Hoewel tweedimensionale (2D) secties een basisbegrip van de histoarchitectuur hebben ondersteund, zijn ze onvoldoende om de werkelijke driedimensionale realiteit van biologische weefsels vast te leggen.

Een toenemend aantal studies in diverse anatomische regio's maakt nu gebruik van technieken waarbij intacte anatomische eenheden worden geïsoleerd - flat mount-, whole-mount- of en face-preparaten - gecombineerd met fluorescentiemicroscopie met een hoge resolutie. Deze benaderingen bieden een meer volledige visualisatie en interpretatie van de structurele organisatie. Dit is bijzonder belangrijk in het olfactorische zenuwstelsel, waar het definiëren van complexe cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan het opmerkelijke regeneratieve vermogen een context over de volledige dikte vereist. Bij dunne coupes bestaat het risico dat cruciale pathofysiologische kenmerken, die nog onvoldoende zijn gedefinieerd, over het hoofd worden gezien.

Gezien deze beperkingen en de kennislacune met betrekking tot de cellulaire interacties die de olfactorische regeneratie aansturen, was de ontwikkeling van een verfijnde whole-mounttechniek die in staat is om de complexiteit van het volledige weefseldikte te behouden essentieel. Volledige olfactorische slijmvliezen werden geïsoleerd als monsters van de volledige weefseldikte, vergezeld van een geoptimaliseerd protocol voor antilichaampenetratie. Hoge-resolutie imaging (EVIDENT SpinSR) en 3D-reconstructie maakten een nauwkeurige visualisatie van cellulaire interacties in vivo mogelijk.

Inleiding

Het olfactorische zenuwstelsel (ONS) vormt een uniek en goed onderbouwd model voor het bestuderen van mechanismen van neurale regeneratie, aangezien het gedurende het hele leven het unieke vermogen tot neuronale omloop behoudt¹. De potentie voor klinische vertaling van dit neuro-reparatieve vermogen blijft echter beperkt door aanzienlijke hiaten in ons begrip van het gedrag van de cellen in het olfactorische systeem^2,3,4. De cellulaire responsen en anatomische organisatie van het ONS, waaronder primaire olfactorische neuronen, olfactorische omhullingscellen (OECs) en perineurale fibroblasten, zijn beschreven in verschillende dierstudies, waarbij gebruik werd gemaakt van ultradunne (<2 µm) weefselcoupes in combinatie met ernstige fysieke letselmodellen toegepast op het ONS van knaagdieren^1,2. De dieren in deze studies werden gewoonlijk 10 dagen na het letsel geëuthanaseerd, wat slechts een klein venster biedt op één specifiek moment van de uitgebreide en complexere remodellering van dergelijk weefsel tijdens neuraal letsel². Deze studies rapporteerden dat OECs en fibroblasten na axonale dood als continue kanalen zouden blijven bestaan na het letsel.

Hoewel informatief, zorgde de gehanteerde aanpak vanwege de vele hierboven toegelichte beperkingen voor een conceptueel overzicht met een lage resolutie op een oppervlakkig niveau van de ONS, waardoor een uitgebreide beoordeling van de werkelijke cellulaire organisatie binnen de intacte ONS uiteindelijk werd uitgesloten³. Als gevolg hiervan zijn kritieke ruimtelijke relaties mogelijk over het hoofd gezien.

Het behoud van de driedimensionale weefselstructuur is essentieel voor een nauwkeurige anatomische en cellulaire analyse en is met succes toegepast op meerdere organen en pathologieën^{4,5,6,7,8,9,10,11,12}. Whole-mount benaderingen zijn gebruikt om de neurale organisatie binnen het reukslijmvlies in kaart te brengen^13,14, maar de visualisatie van de cellulaire interacties met een volledige ONS-structuur, inclusief een behouden lamina propria, is nog niet uitgevoerd.

In deze studie stellen we een workflow vast met gebruik van een muismodel met whole-mount weefselverwerking, immunokleuring, hoge-resolutie beeldvorming en driedimensionale reconstructie, wat een gedetailleerde analyse van de architectuur van het ONS mogelijk maakt. Dit protocol is ontwikkeld om het gat in bestaande gepubliceerde methoden op te vullen, waarbij het protocol een volledige dikte van het olfactorische slijmvlies conserveert en preserveert, inclusief de lamina propria, waardoor de studie van intercellulaire interacties mogelijk wordt. Opmerkelijk is dat deze verfijnde methode voor weefselverzameling en -verwerking kan worden toegepast en gecombineerd met diverse modellen van het olfactorische systeem.

Protocol

Alle experimenten met dieren en transgeen gemodificeerde cellen werden uitgevoerd met goedkeuring van de Biosafety Committee van de Griffith University (NLRD/003/2020_var3) en de Animal Ethics Committee van de Griffith University (MHIQ/04/23/AEC), in overeenstemming met de richtlijnen van de Australian Commonwealth Office of Gene Technology regulator (OGTR).

OPMERKING: In totaal werden 15 volwassen laboratoriummuizen (8–9 weken) van beide geslachten gebruikt in de studie. Specifiek ging het om S100β-DsRed transgene muizen, waarbij alle OEC's het helderrood eiwit DsRed tot expressie brengen onder controle van de S100β-promotor. S100β maakt deel uit van een bredere familie van calciumbindende eiwitten en komt gewoonlijk tot expressie in gliacellen in het centrale zenuwstelsel, zoals OEC's. Dit model was optimaal voor de doeleinden van deze experimenten, omdat het een eenvoudige lokalisatie van de doelcelpopulaties mogelijk maakte met behulp van endogene fluorescentiesignalen. De S100β-DsRed transgene muizen waren eerder gegenereerd, en het is aangetoond dat het gebruik van deze transgene muizen een verbeterde detectie van OEC's biedt in vergelijking met immunohistochemie voor analyses van gefixeerd weefsel^15,16,17,18.

1. Verzamelen van koppen en fixatie van weefsel

1. Euthanaseer de dieren op de experimentele tijdstippen door inhalatie van toenemende CO₂.
2. Bevestig de dood door de afwezigheid van corneale reflexen en pedale terugtrekkingsreflexen, gevolgd door cervicale dislocatie, of in overeenstemming met de goedgekeurde SOP.
3. Verwijder de gehele kop en de kaken met een schaar.
4. Verwijder de huid van de schedel en verwijder het kraakbeen aan de neuspunt om de neusholte bloot te leggen en een efficiënte penetratie van het fixatiemiddel te waarborgen.
   OPMERKING: Deze stap, waarbij het meest frontale deel van het neuskraakbeen van het dier wordt weggesneden, bleek cruciaal om de juiste fixatie van het weefsel in de neusholte mogelijk te maken.
5. Spoel de koppen snel met PBS 1× om overtollig bloed te verwijderen.
6. Fixeer het weefsel door overnight (12–18 h) onderdompeling in 4% paraformaldehyde, gedurende ten minste 6 h (voldoende tijd om het betreffende weefsel te fixeren) bij 4 °C op een roller.
   WAARSCHUWING: Paraformaldehyde is een gevaarlijke chemische stof die formaldehyde-dampen afgeeft. Het is toxisch bij inademing, huidcontact en inname; het veroorzaakt irritatie aan de ogen, huid en luchtwegen; en het is een vermoedelijk carcinogeen. Werk uitsluitend in een zuurkast met geschikte PBM, waaronder handschoenen, een laboratoriumjas en oogbescherming. De veilige afvoer van gevaarlijke chemicaliën en biologisch afval dat tijdens het protocol wordt gegenereerd, moet gebeuren in overeenstemming met institutionele en lokale regelgeving.
   ​OPMERKING: Tijdens optimalisaties observeerden we dat 6 h voldoende was om het betreffende weefsel te fixeren; echter leidde een periode van meer dan 12 h waarschijnlijk tot overfixatie en degradatie van de mucosale structuren.
7. Haal de koppen uit het fixatiemiddel en was ze gedurende 3 h in PBS 1× bij kamertemperatuur (20–25 °C) op een roller.
8. Bewaar de koppen in verse PBS bij 4 °C en verzamel het mucosal weefsel (whole-mount) binnen 48 h.

2. Collectie van weefsel in whole-mount

1. Voer weefselisolatie uit onder een microscoop.
2. Snijd de koppen doormidden met een scalpel, langs de midsagittale lijn.
3. Leg het interieur van de neusholte bloot (Figuur 1). Identificeer de anatomische regio's en verzamel het slijpvliesweefsel dat de gehele anatomische sectie bekleedt (Figuur 1B).
4. Breek en verwijder met een botcutter voorzichtig het septale bot dat een deel van de mucosa-holte bedekt.
   OPMERKING: Zie Figuur 2ADeze stap is cruciaal om de concave holte onder het bot bloot te leggen, waar de axonbundels door de dorsale wand lopen (Figuur 1B).
5. Zodra dit gebied is blootgelegd, gebruikt u gebogen pincetten om het weefsel voorzichtig los te maken en uit de concave dorsale wand te scheppen. Til het weefsel van het onderliggende bot op en pel voorzichtig het resterende reukepitheel af om het intacte whole-mount preparaat te verzamelen.
   OPMERKING: In deze fase was extreme voorzichtigheid vereist om scheuring van het weefsel te voorkomen.
6. Verzamel het betreffende weefsel uit zowel het rechter- als het linkerneusgat: het slijmvlies bedekt het septum, de dorsale linker- en rechterwand en de zeefplaat (lamina cribrosa) van de neusholte (Figuur 1A, B)Verzamel weefsel uit beide neusgaten, inclusief het septum, de dorsale wanden en de cribriforme plaat, om de anatomische regio te isoleren die de primaire olfactorische structuren bevat (Figuur 2C).
7. Was de verzamelde weefsels in 1× PBS en verwijder alle ongewenste weefsels, inclusief botfragmenten. Bewaar de weefsels bij 4 °C in 1× PBS voor toekomstige immunohistochemische analyse.
   OPMERKING: Indien het weefsel langdurig bewaard moet worden, wordt geadviseerd dit op te slaan in een oplossing van 1× PBS en 0,001% (w/v) natriumazide, bij 4 °C.

3. Geoptimaliseerd kleuringsprotocol

OPMERKING: Veelgebruikte kleuringsprotocollen zijn doorgaans geoptimaliseerd voor secties met een dunne tot gemiddelde dikte (bijv. tot 50 µm). Daarom moest het protocol worden aangepast aan het veel dikkere weefsel.
​Er werd vastgesteld dat een cruciale stap bestond uit het laten drijven van het weefsel in Eppendorf-buisjes gedurende het gehele kleuringsproces en het plaatsen van de buisjes op een roller terwijl de reagentia penetreren. Daarom werden de kleuringsstappen niet uitgevoerd met het weefsel op een objectglas. Het weefsel werd eerst gekleurd terwijl het dreef en vervolgens gemonteerd op objectglazen. Deze details zorgden ervoor dat het weefsel niet zou vouwen en dat de reagentia en antilichamen het gehele gebied konden penetreren.

1. Haal de weefsels uit de opslag en plaats ze in een Eppendorf-buis met blokkeringsoplossing (de te gebruiken oplossing is specifiek voor de kleuring).
   ​OPMERKING: Blokkeringsoplossing: 3% BSA, 0,3% Triton X-100 in PBS. Een andere belangrijke aanpassing was de tijd dat het weefsel aan elk reagens en antibody-cocktail werd blootgesteld.
2. Houd het weefsel 3 u bij kamertemperatuur in blokkeringsoplossing op een roller.
   OPMERKING: Er werd waargenomen dat het niet nodig was om de concentratie van de geselecteerde antilichamen en kleuringsreagentia (Tabel 1) te verhogen als de blootstellingstijd daaraan werd verlengd in vergelijking met de standaard immunohistochemische kleuring van dunne coupes. Dit minimaliseerde ook het gebruik van dure antilichaam-reagentia. Incubaties worden uitgevoerd in een 1,5 mL Eppendorf-buis waarbij de dophouder is afgesneden, zodat deze kan rollen op een roller. Het reagensvolume was 500 µL.
3. Incubeer gedurende 72 u bij 4°C met primaire antilichamen op een roller.
4. Was het weefsel tweemaal (elk 1,5 u) met PBS 1× bij kamertemperatuur op een roller.
5. Incubeer het weefsel met het secundaire antilichaam (ingepakt in aluminiumfolie) en kernkleuring gedurende minimaal 4 u bij kamertemperatuur op een roller en vervolgens een nacht (12–18 u) bij 4 °C op een roller.
6. Was het weefsel tweemaal (elk 1,5 u) met PBS 1× bij kamertemperatuur op een roller.

4. Preparatie van de coupes

1. Verwijder het weefsel voorzichtig uit de Eppendorf-buis
2. Plaats het weefsel onder een microscoop op een objectglas en zorg dat er geen plooien in het weefsel zitten.
   OPMERKING: De oriëntatie van het weefsel kan onder de microscoop worden vastgesteld zonder fluorescentie. De lamina propria-zijde van het slijmvliesweefsel moet zodanig op het objectglas worden geplaatst dat het epitheel naar het glas van het objectglas is gericht en de lamina propria naar het dekglas. De lamina propria kan worden geïdentificeerd aan de aanwezigheid van dikke zenuwbundels, die zonder kleuring zichtbaar zijn. Door de oriëntatie zo te kiezen dat de lamina propria naar de zijde van het dekglas is gericht en de epitheelzijde op het objectglas ligt, worden zowel het kleuringsproces als het beeldvormingsproces vergemakkelijkt.
3. Dek de preparaten af met dekglas met behulp van een fluorescent monteermedium en verzegel de objectglazen.
4. Objectglazen kunnen worden bewaard bij 4 °C, nadat ze gedurende één nacht (12–18 h) in het donker bij kamertemperatuur zijn gedroogd

5. Beeldacquisitie en nabewerking

1. Acquisitie van immunofluorescente beelden bij lage vergroting
   1. Voer tijdens de beeldacquisitie automatische stitching uit met lineaire alpha-blending.
      ​OPMERKING: Het aantal z-stack frames moet worden aangepast aan de dikte van het specimen om volledige dekking van het weefselvolume te garanderen.
   2. Leg aangrenzende gezichtsvelden vast met een overlap van 15%. Acquireer getegelde beelden met een meander-acquisitiepatroon.
   3. Pas het totale aantal optische secties aan op basis van de weefseldikte.
   4. Stel de beeldkalibratie in op 215,594 nm/pixel in zowel de X- als Y-as. Acquireer beelden als z-stacks met een z-stapgrootte van 0,8 µm.
   5. Plaats het gemonteerde whole-mount weefsel op de tafel van de confocale microscoop. Acquireer overzichtsbeelden met een 30x objectief (NA 1,04).
2. Acquisitie van immunofluorescente beelden bij hoge vergroting.
   1. Acquireer gedetailleerde beelden met een 60× objectief (NA 1,5). Stel de beeldkalibratie in op 107,923 nm/pixel in zowel de X- als Y-as. Acquireer z-stack beelden met een z-stapgrootte van 0,41 µm.
   2. Pas het totale aantal optische secties aan op basis van de weefseldikte. Leg beelden vast vanuit een enkel gezichtsveld.
      ​OPMERKING: Voor 60× acquisities is geen image stitching vereist, omdat elke dataset uit een enkel gezichtsveld bestaat.
3. Acquisitie van histologische referentiebeelden
   1. Beeld HE-gekleurde mid-sagittale secties van muizenkoppen met een slide-scanning microscoop onder brightfield-verlichting.
   2. Acquireer beelden met een 40× objectief (NA 0,95) en een cameravergroting van 0,63x, wat resulteert in een effectieve vergroting van 25,2×.
   3. Bevestig een pixelkalibratie van 136,905 nm/pixel in zowel de X- als Y-as. Acquireer het beeld als een enkel focaal vlak.
   4. Stitch getegelde beelden automatisch met een meander-acquisitiepatroon en lineaire alpha-blending.
4. Acquisitie van immunofluorescente referentie-overzichtsbeelden
   1. Acquireer aanvullende immunofluorescente overzichtsbeelden met een 10x objectief.
   2. Leg het specimen vast als een enkele z-slice door tijdens de beeldacquisitie 0% tile-overlap te gebruiken.
   3. Stel de beeldkalibratie in op 647,249 nm/pixel in zowel de X- als Y-as. Genereer vervolgens een overzichtsbeeld dat de gehele anatomische regio van belang omvat.
5. Beeldverwerking en generatie van definitieve figuren.
   1. Exporteer de geacquireerde beelddatasets naar beeldanalyse-software. Genereer maximum intensity projections (MIPs) vanuit de z-stack datasets.
   2. Selecteer regions of interest (ROI's) voor nadere analyse en figuurvoorbereiding.
   3. Combineer immunofluorescente overzichtsbeelden met overeenkomstige HE-beelden om anatomische referentiefiguren te genereren. Verifieer vervolgens de uitlijning en anatomische correspondentie tussen de fluorescentie- en histologische datasets voorafgaand aan de figuurvoorbereiding.
      OPMERKING: Alle image stitching moet automatisch tijdens de beeldacquisitie worden uitgevoerd met vooraf ingestelde microscoopinstellingen en mag geen aanvullende post-processing vereisen. In ons geval werd de 3D-rendering gegenereerd met de Imaris-software: de surface rendering plugin, gebaseerd op drempelintensiteit voor elk geacquireerd kanaal, werd gebruikt om de 3D-reconstructie te produceren. Uiteindelijk werden de definitieve beelden samengesteld in Adobe Illustrator.

Resultaten

Onze hier gepresenteerde whole-mount-benadering maakte de isolatie en conservering van het volledige reukslijmvlies mogelijk. In ons geval was de focus gericht op het begrijpen van cellulaire en anatomische veranderingen op zowel macro- (volledig anatomisch overzicht) als microniveau (cellulair niveau).

De whole-mount benadering stelt ons in staat om zowel de epitheliale compartimenten als die van de lamina propria te verzamelen en de ruimtelijke relaties tussen axonbundels, olfactorische omhullende cellen (OEC's) en fibroblasten – onze cellen van belang – te behouden. Deze aanpak maakte de acquisitie mogelijk van grote, continue datasets die de volledige dikte en het brede oppervlak van het slijmvliesweefsel vastlegden (Figuur 3) en stelde ons in staat om details van de complexe cellulaire structuur en interactie vast te leggen (Figuur 3), en hoe deze zouden veranderen tussen intacte condities (n = 3) (Figuur 3A, B) en beschadigde condities (n = 12) (Figuur 3C, D).

Door deze geoptimaliseerde procedure voor weefselverwerking en kleuring te combineren met confocale microscopie met een hoge resolutie, waren we in staat om beelden van bredere mucosale regio's te verkrijgen met een groot en nauwkeurig detail op cellulair niveau over de gehele diepte van het weefsel. Z-stack acquisitie over meerdere aangrenzende regio's maakte de reconstructie van uitgebreide anatomische domeinen mogelijk zonder de resolutie of signaalintegriteit in gevaar te brengen (Figuur 4A–F). Dankzij de cellulaire details met een hoge resolutie konden we de verkregen Z-stacks van de volledige weefseldikte (Figuur 4G) ook gebruiken om gerenderde beelden te realiseren (Figuur 4H) om de microarchitectuur van het weefsel verder te begrijpen.

Een betrouwbare bepaling van de weefseloriëntatie voorafgaand aan het monteren en imageren werd consistent bereikt zonder dat fluorescerende markering nodig was. De zijde van de lamina propria was gemakkelijk identificeerbaar onder lichtveldmicroscopie door de aanwezigheid van dikke zenuwbundels, die duidelijk te onderscheiden waren van de epitheellaag. Het standaardiseren van de monsteroriëntatie door de lamina propria direct naast het dekglas en het epitheeloppervlak tegen het objectglas te plaatsen, verbeterde de consistentie van de beeldvorming tussen de monsters en vergemakkelijkte de daaropvolgende driedimensionale reconstructie. De penetratie van antilichamen kan worden bepaald door het bijbehorende signaal te analyseren dat gedurende de gehele dikte van het weefsel wordt waargenomen. Dit is gewoonlijk duidelijk door ofwel de afwezigheid van een signaal, ofwel door een signaal dat progressief afneemt naarmate men dieper in het weefsel doordringt.

Driedimensionale rendering uitgevoerd in Imaris maakte een heldere visualisatie mogelijk van complexe cellulaire netwerken en axonale organisatie binnen het intacte slijmvlies. Oppervlaktegebaseerde rendering, toegepast via kanaalspecifieke intensiteitsdrempelwaarden, genereerde nauwkeurige 3D-representaties van de weefselarchitectuur terwijl fijne structurele details behouden bleven.

Voor kleuring en visualisatie omvatten de verwachte resultaten een duidelijke visualisatie van het doelsignaal van de kleuring, zonder abnormaal verlies of verslechtering van het signaal door de gehele dikte van de weefsels. Wanneer een bekend gekleurd doelwit niet via microscopie kan worden gevisualiseerd, moet dit worden beschouwd als een onsuccesvol resultaat.

Figuur 1. Weergave van de anatomische regio met overlay van het mucosa whole-mount weefsel. (A–C). Sagittaal aanzicht van de binnenzijde van het linker neusgat (Hematoxyline en Eosine, HE-kleuring) van de muis (A) met overlay van de mucosa whole-mount kleuring uit dezelfde regio (voor anatomische oriëntatie) (B), waarop de oriëntatie en positie van axonbundels in het groen met celkernen in het blauw worden weergegeven. Deze techniek maakte het mogelijk om de volledige anatomische structuur te behouden: het is mogelijk om de primaire reukzenuw (ON) en accessoire (vomeronasale zenuwen, VNN) axonbundels duidelijk te onderscheiden, evenals hun pad van het septum naar de bulbus olfactorius (OB), door de lamina cribrosa (B, C), te volgen. Het hier weergegeven weefsel is gekleurd met Hoechst voor de kernen (blauw) en β-III-Tubulin voor de axonbundels (groen). Representatieve beelden van n = 15 onafhankelijke preparaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Macro- en schematische weergaven van het olfactorische systeem. (A) Met behulp van een botknipper wordt het neustussenschot (geel gebied) verwijderd langs de rode stippellijn. (B) Zodra de onderliggende concave neusholte (bruin) is blootgelegd, kan het volledige slijmvliesweefsel dat zich vanuit dit gebied uitstrekt tot aan het respiratoire en olfactorische slijmvlies worden verzameld. (C) Grafische weergave ter illustratie van de continuïteit van deze structuren, die zich uitstrekken van het olfactorische epitheel tot aan de bulbus olfactorius. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Uitgebreid overzicht van het anatomische gebied verkregen met een whole-mount collectie- en kleuringsprotocol. (A–D). Representatieve beelden van gezonde en beschadigde mucosae worden getoond. Van boven naar beneden: intacte mucosa van gezond weefsel (n = 3) en beschadigde mucosa (n = 12). In het gezonde weefsel (A>) omsluiten OEC's met hun verlengde bipolaire morfologie (A>, links) de axonbundels (A>, midden), en fibroblasten vormen de buitenste laag van deze tunnelachtige structuren (A>, rechts, witte pijl). De drie geselecteerde ROI's weerspiegelen deze details (B>). In de beschadigde mucosa vertonen OEC's zowel bipolaire als ronde morfologieën (C, D>, links, witte pijlen). Axonbundels lijken minder uniform en solide (C>, D>, midden, witte pijlen). Fibroblasten lijken wijdverspreid over de gehele regio (C>, D>, rechts, witte pijlen). Schaalbalk = 100 µm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. Driedimensionale fluorescentiebeeldvorming van mucosale whole mounts. (A–H). Beelden met lage vergroting van de cellen (A–F) en een beeld met hoge vergroting (G) zijn verkregen uit beeldstacks van meerdere opeenvolgende regio's met behulp van een SpinSR-microscoop. Olfactorische omhullende cellen (OEC's) zijn in het rood weergegeven, fibroblasten in magenta, axonen in het groen en kernen in het blauw. Pijlen geven verschillende OEC-morfologieën aan (A) en een buitenlaag van fibroblasten rond axonbundels (B en C). D–F bevatten pijlen die overeenkomsten in de gezonde structuren van de fibroblasten markeren. Deze beelden benadrukten de ruimtelijke organisatie van de cellulaire componenten, die vervolgens werden gerenderd met Imaris-software (H). Schaalbalk = 50 µm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Reagens	Doelwit	Verdunning	Incubatieomstandigheden	Rationale
Primair antilichaam
β-III-Tubulin (Rabbit)	Axonen	1:300	Gedurende 72 h bij 4 °C, op een roller	om volledige penetratie door de dikte mogelijk te maken
PDGFR-β (Rat)	Fibroblasten	1:100
Secundair antilichaam
Alexa 488	Primaire konijn-antilichamen	1:250	In aluminiumfolie gewikkeld, minimaal 4 h bij kamertemperatuur op een roller, daarna overnight bij 4 °C op een roller.	Aluminiumfolie voorkomt fotobleken; de duur, temperatuur en agitatie door de roller maken een goede penetratie mogelijk
Alexa 647	Primaire rat-antilichamen	1:500
Kernen
Hoechst	Celkernen	1:2500

Tabel 1: Lijst van antilichamen met verdunningen geoptimaliseerd voor dit protocol. Deze tabel bevat de kleuringsreagentia met hun targets, verdunningen en de rationale voor de incubatiecondities.

Discussie

De afgelopen decennia hebben langzaam het begin van het driedimensionale tijdperk gezien, waarbij vele innovatieve benaderingen in het wetenschappelijke veld zijn ontwikkeld. Zo hebben driedimensionale reconstructiemethoden, mogelijk gemaakt door de ontwikkeling van complexe whole-mount imaging-methoden in combinatie met fluorescentiemicroscopen met een hoge resolutie, gezorgd voor een beter begrip van verschillende volledige weefselhistoarchitecturen. Deze driedimensionale rendering-benaderingen zijn gebruikt om verschillende structuren in het menselijk lichaam te definiëren, zoals vaten, klieren en veelvoorkomende tumoren^4,5,6,7,8,9. Bovendien is er informatie verzameld over de verschillen tussen pathologische en normale structuren, bijvoorbeeld in volledige muizenhersenen^10,11,12. Deze benadering is geïdentificeerd als een cruciale stap naar een beter begrip van de verschillende biologische systemen, wat een dieper inzicht faciliteert in cellulaire circuits, hun structurele en functionele ruimtelijke organisatie en hun potentiële bijdrage aan menselijke pathologieën.

Een nadeel van de verschillende combinaties van driedimensionale weefselreconstructie en beeldvorming is dat de meeste benaderingen weefsel-clearingstappen vereisen. Hoewel deze methode nuttig is voor veel weefsels, is deze niet geschikt voor alle weefseltypen^8,9,19. In feite omvatten clearing-procedures verschillende wasstappen, die potentieel doelepiepopeen epitopes kunnen beschadigen en endogene signalen kunnen beïnvloeden²⁰.

De hierboven beschreven benaderingen zijn gebruikt om vele belangrijke cellulaire structuren binnen verschillende systemen te definiëren. Echter, het olfactoire systeem en de structuren van belang hebben een minimale aanwezigheid van botcomponenten waarmee ze gemakkelijk geïsoleerd zouden kunnen worden; daarom zijn er in recente jaren whole‑mount benaderingen uitgeprobeerd die geen clearing-stappen bevatten^13,14.

Deze studies erkenden het belang van een betere definitie van de organisatie van neuronale structuren in het olfactorische systeem. Bijgevolg lag de nadruk vooral op het verstrekken van een duidelijke topografische kaart van de distributie van de olfactorische sensorische neuronen op basis van de expressie van verschillende markers¹⁴, evenals het onthullen van nieuwe inzichten in hun bijzondere cilia¹³.

De hier ontwikkelde en gepresenteerde whole-mount techniek maakt het mogelijk om het slijmvliesweefsel in zijn geheel te verzamelen en te behouden, waardoor de mogelijkheid ontstaat om cruciale inzichten te verkrijgen in de anatomische en fysiologische structuur van deze omgeving, met in ons geval een specifieke focus op de relatie tussen OECs, fibroblasten en axonbundels. Door deze verfijnde isolatie- en kleurtechniek te combineren met confocal imaging met hoge resolutie, konden grote beelden worden verzameld die de structuur van het gehele doelgebied en de aanwezige cellen weerspiegelen. Specifiek biedt onze verfijnde techniek twee onderscheidende voordelen: het gehele slijmvlies wordt geoogst en verwerkt, inclusief de architectuur van de lamina propria¹³, en de mildere methode voor weefselpreparatie helpt de macroanatomie alsoals de intercellulaire interacties (zoals olfactorische omhullingscellen, axonen en fibroblasten) beter te behouden in vergelijking met andere flat-mount protocollen¹⁴. Dit is ook de reden waarom dit protocol geen validatie tegenover kleuring van dunne coupes bevat.

Zoals hierboven vermeld, houden whole-mount technieken gewoonlijk lange periodes van weefselbewerking en het gebruik van specifieke, dure reagentia in. Deze methode is ontwikkeld met een focus op minimale weefselbewerking om zowel het tijdsbestek als het risico op beschadiging van belangrijke cellulaire structuren te minimaliseren. De geoptimaliseerde methode vormt daarom een snel proces dat kan worden uitgevoerd met reagentia die algemeen worden gebruikt voor immunohistochemie op dunne coupes, wat een valide alternatief biedt voor benaderingen die langere bewerkingstijden vereisen en niet geschikt zijn voor botloze structuren zoals slijmvliesweefsel.

Beeldverwerving en nabewerking kunnen worden uitgevoerd met elk confocaal microscopieplatform dat in staat is om hoge-resolutie z-stacks te verkrijgen van dikke weefselmonsters, met voldoende laserpenetratie om beelden te maken door de mucosae van belang (raadpleeg de methodensectie voor meer details over onze instellingen voor acquisitie en beeldbewerking).

Met passende aanpassingen geloven wij dat dit protocol kan worden vertaald en toegepast op andere veelvoorkomende knaagdiermodellen. Met enkele weefselspecifieke aanpassingen kan deze methode worden toegepast in verschillende contexten, waaronder de bestudering van mucosale en submucosale weefsels uit de luchtwegen en het gastro-intestinale tractus (GIT); het onderzoek naar weefselorganisatie en multisysteeminteracties binnen het zenuwstelsel; de analyse van ontstekingsprocessen en mucosa-geassocieerde lymfoïde weefsels (MALTs); alsmede de exploratie van verschillende multisysteemassen, zoals de darm-hersen-as.

De belangrijkste kracht van dit protocol ligt in de methodologische verfijningen die hoogwaardige driedimensionale beeldvorming mogelijk maken terwijl de weefselintegriteit behouden blijft, en die tevens zorgen voor een relatief snelle aanpak in vergelijking met andere whole-mount methodieken die eerder in het vakgebied zijn uitgeprobeerd.

De succesvolle implementatie van deze aanpak was sterk afhankelijk van een diepgaand anatomisch begrip van het betreffende weefsel. In ons geval was kennis van de verwachte lokalisatie van de axonbundels in feite essentieel om de invasiviteit van de verzamelprocedure te minimaliseren zodra de binnenkant van de schedel was blootgelegd. Deze anatomische kennis was cruciaal om de regio en het weefsel van belang snel te kunnen lokaliseren en de algehele structuur van het slijmvlies te behouden, wat benadrukt dat een succesvolle weefselverwerking intrinsiek verbonden is met een gefundeerde verzamelstrategie en niet enkel met stappen tijdens de naverwerking.

Zoals in diverse opmerkingen in de sectie methoden is vermeld, waren meerdere technische aanpassingen cruciaal voor de ontwikkeling en optimalisatie van deze methode. Het vrij laten drijven van het weefsel in Eppendorf-buisjes gedurende het gehele kleuringsproces, in combinatie met continue rotatie tijdens de incubatie van reagentia en antilichamen, vormde een cruciale stap ten opzichte van meer statische whole‑mount- en dunne-sectieprotocollen. Deze verfijning voorkwam vouwen van het weefsel en zorgde tegelijkertijd voor een homogene penetratie van de reagentia door het gehele monster, waardoor de consistentie van de kleuring verbeterde zonder dat onnodige helderingsstappen vereist waren. Daarnaast bleek een zorgvuldige optimalisatie van de incubatieduur voor elk reagens en elke antilichamenmix essentieel. Deze laatste stap moet mogelijk verder worden aangepast op basis van het gekozen type antilichaam.

Samen leidden deze specifieke factoren tot een verbeterde reproduceerbaarheid, terwijl de totale verwerkingstijd werd verkort en de monsterbehandeling minder intensief werd.

Een andere belangrijke methodologische stap was de mogelijkheid om de weefseloriëntatie betrouwbaar te bepalen vóór het inklissen en imageren, zonder dat fluorescente labeling nodig was. De kant van de lamina propria van het mucosaal weefsel kon gemakkelijk worden geïdentificeerd onder brightfield-microscopie aan de hand van dikke zenuwbundels, die duidelijk te onderscheiden waren van het omringende epitheelweefsel. Het standaardiseren van de monsteroriëntatie, door de lamina propria richting het dekglas te positioneren en de epitheellaag op het objectglas te laten rusten, bleek de kwaliteit van de beeldverwerving te verbeteren. Deze eenvoudige maar effectieve verfijning verbeterde de consistentie van de beeldvorming tussen de monsters en droeg bij aan de kwaliteit van de verkregen driedimensionale reconstructies.

Er zijn echter enkele beperkingen om rekening mee te houden. Dit protocol is niet getest op veel gangbare muisstammen of andere knaagdiersoorten. Evenzo zijn de optimalisaties uitgevoerd onder de specifieke experimentele omstandigheden zoals hierboven beschreven en uitsluitend met de vermelde antilichaampanels. Hoewel het protocol zou moeten werken voor de meeste muis- en ratstammen, diverse verschillende antilichamen en alle experimentele modellen waarbij slijmvliezen in volledige dikte kunnen worden geoogst, kan verdere zorgvuldige optimalisatie vereist zijn. Een andere opmerkelijke beperking is dat een enkele whole-mount sectie slechts met één antilichaampanel kan worden gekleurd, in tegenstelling tot dunne weefselcoupes, waarbij elke coupe met een individueel antilichaampanel kan worden gekleurd en er dus meerdere verschillende panels van antilichamen op dunne weefselcoupes kunnen worden getest.

Over het algemeen laten deze methodologische innovaties zien hoe relatief eenvoudige aanpassingen in de weefselbehandeling, kleuringscondities en monsteroriëntatie de resultaten van whole-mount imaging aanzienlijk kunnen verbeteren. Door uitgebreide weefselbewerking en transparantiestappen te vermijden, biedt deze benadering een praktisch en aanpasbaar alternatief voor de bestudering van delicate, botloze weefsels, terwijl het nog steeds mogelijk is om gedetailleerde, grootschalige driedimensionale gegevens te verkrijgen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Bovien serumalbumine (BSA)	Sigma-Aldrich	A3294-50G	Immunohistochemie
Adobe Illustrator		versie 28.5
Anti-beta III tubuline antilichaam - neuronale marker	Abcam	ab18207
Anti-PDGFR bèta antilichaam [APB5]	Abcam	ab91066
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride	Sigma Aldrich	14533
DEKGLAASJE 24X50MM NR. 1.5 100STK	Bio-strategy	EPBRCS245015GP	Immunohistochemie
Donkey anti-konijn IgG (H+L) sterk kruisgeadsorbeerd secundair antilichaam, Alexa Fluo 488	Thermo Fisher	A-21206
Dumont #15A botknipper - epoxy gecoat	Daniels Health Laboratory Products P/L	11215-02	Weefseldissectie
Dumont #7 pincet - Biologie/Dumostar	Daniels Health Laboratory Products P/L	11297-10	Weefseldissectie
Geit anti-rat IgG (H+L) kruisgeadsorbeerd secundair antilichaam, Alexa Fluor™ 647	Thermo Fisher	A-21247
Imaris software	Imaris	versie 9.5.0	Imaging
Mayo dissectieschaar	ProSciTech	420SS	Weefseldissectie
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Weefselbewerking
Fosfaatgebufferde zoutoplossing, steriele PBS-tabletten (PBS)	Thermo Fisher Scientific	18912014	Weefselbewerking
ProLong Glass Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36980	Immunohistochemie
Scalpelblad #23	Scalpel Blades Swann Morton	COS240B	Weefseldissectie
Scalpelhouder #4	ProSciTech	T134	Weefseldissectie
Natriumazide	Sigma-Aldrich	S2002-25G	Weefselbewerking
Sucrose	Chem-Supply	57-50-1	Weefselbewerking
TOMO Adhesie microscopiglazen	ProSciTech	GEMS63705-09	Immunohistochemie
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100mL	Immunohistochemie