Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Ultrasone sturing van de opening van de bloed-hersenbarrière (BBB) in een microfluidische BBB-glioblastoomchip voor studies naar geneesmiddelentoediening

184 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/72041

⸱

18 augustus 2026

 ,  , 
1Ningbo No.2 Hospital, 2Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Neurological Diseases, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences, 3Lab of Nanopharmacology Research for Neurodegeneration, Department of Research and Development of Science and Technology, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences, 4Lab of Dementia and Neurorehabilitation Research, Department of Research and Development of Science and Technology, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de constructie van een microfluïdisch BBB‑glioblastoom (BBB‑GBM) chipmodel. Het model is gevalideerd voor de integriteit van de BBB en maakt onderzoek mogelijk naar transiënte en grotendeels reversibele BBB-opening geïnduceerd door laag-intens ultrageluid, waardoor een kwantitatieve evaluatie van ultrageluid-gemedieerd nanomiceltransport over de BBB en de efficiëntie van tumor-targeting mogelijk wordt.

Samenvatting

De bloed-hersenbarrière (BBB) vormt een groot obstakel bij de behandeling van glioblastoom (GBM) door de toegang van de meeste therapeutische moleculen tot de hersenen te beperken. Interspecifieke verschillen in de structuur en functie van de BBB bemoeilijken de klinische vertaling van diermodellen, wat de noodzaak benadrukt van mens-relevante in vitro BBB-platforms voor het beoordelen van de drugpermeabiliteit bij GBM-therapie. Hier wordt een protocol beschreven voor de constructie van een microfluidisch BBB-GBM-chipmodel. Dit model vestigt een tri-cultuursysteem bestaande uit humane cerebrale microvasculaire endotheelcellen (HCMECs), primaire astrocyten (ACs) en U87-MG-cellen binnen een in Matrigel ingebed microfluidisch platform. De integriteit van de BBB wordt geverifieerd via continue zonula occludens-1 (ZO-1) immunokleuring en een FITC-dextran permeabiliteitsassay. Laagintens ultrasound (US) (1 MHz, 1 W/cm2, 30 s) wordt vervolgens ingezet om een transiënte en grotendeels reversibele opening van de BBB te induceren, waardoor tumor-targetende nanomicellen (SFN@RB@SPMs) de barrière efficiënt kunnen passeren en kunnen accumuleren in GBM-cellen. Een belangrijk kenmerk van dit protocol is de integratie van real-time BBB-permeabiliteits- en drugdelivery-metingen binnen één ultrasound-responsieve chip, wat een krachtig platform biedt om de mechanismen van ultrasound-versterkte drugdelivery bij GBM te ontleden.

Inleiding

De behandeling van glioblastoom (GBM) wordt sterk beperkt door de BBB, die de toegang van vrijwel alle therapeutische middelen tot de hersenen ernstig belemmert1,2. De BBB wordt gevormd door niet-fenestrerende endotheelcellen die met elkaar zijn verbonden via tight junction-eiwitten (bijv. occludine, ZO-1), met aanvullende ondersteuning van pericyten en astrocytaire eindvoetjes3. Hoewel diermodellen waardevolle inzichten hebben verschaft in de functie van de BBB, beperken soortspecifieke variaties in fysiologie en metabolisme het vermogen om menselijke medicijnresponsen nauwkeurig te voorspellen4,5. Bijgevolg zijn fysiologisch relevante menselijke BBB-modellen onmisbaar voor het evalueren van de drugpermeabiliteit bij GBM-therapie.

Traditionele in vitro BBB-modellen, zoals het Transwell-cultuursysteem, slagen er niet in om de complexiteit van de BBB te reproduceren, waaronder cel-celinteracties, dynamische vloeistofveranderingen en door stroming geïnduceerde schuifspanning6. In contrast hiermee zijn microfluïdische BBB-modellen ontstaan als superieure platforms die deze in vivo-achtige kenmerken nauwgezet nabootsen7. Dergelijke BBB-on-a-chip-systemen zijn op grote schaal gebruikt om hersentumormetastasen te bestuderen8, BBB-dysfunctie bij neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer te onderzoeken9 en het transport van geneesmiddelen over de BBB te evalueren10,11. De meeste bestaande BBB-chipmodellen worden echter hoofdzakelijk gebruikt voor het testen van de permeabiliteit van geneesmiddelen en missen de mogelijkheid om externe fysieke stimuli te integreren die de BBB-permeabiliteit moduleren. Momenteel is gefocust ultrageluid (FUS) naar voren gekomen als een veelbelovende strategie om de BBB tijdelijk te openen met aanzienlijk herstel, wat een verbeterde toediening van therapeutische middelen aan de hersenen mogelijk maakt12,13. Eerdere mechanistische studies hebben aangetoond dat door ultrageluid geïnduceerde mechanische stimulatie de barrièrefunctie tijdelijk kan moduleren door cel-celverbindingen te remodelleren en de endotheliale permeabiliteit te verhogen. Zo toonden Silvani et al. aan dat door ultrageluid geïnduceerde mechanische krachten reversibele interendotheliale gapvorming veroorzaakten in in vitro vessel-on-a-chip14. In overeenstemming met deze bevindingen demonstreerden Beekers et al. dat door ultrageluid gemedieerde mechanische bio-effecten een tijdelijke opening van endotheliale cel-celcontacten induceerden, waardoor de endotheliale permeabiliteit toenam15. Onlangs rapporteerden Qiao et al. dat de endotheliale barrièrepermeabiliteit kritisch wordt gereguleerd door de parameters van de blootstelling aan ultrageluid, in het bijzonder de pulslengte, wat het belang benadrukt van het optimaliseren van akoestische parameters om een veilige en controleerbare BBB-modulatie te bereiken16. Ondanks deze vooruitgang blijven in vitro platforms die gelijktijdig een kwantitatieve analyse mogelijk maken van de door ultrageluid gemedieerde BBB-opening en de impact hiervan op de toediening van nanomedicijnen beperkt.

Om bovenstaande hiaat te vullen, wordt een protocol gepresenteerd voor de constructie van een microfluïdische BBB-GBM-chip. Het microfluïdische apparaat ondersteunt een tri-cultuur van HCMEC's, primaire AC's en U87-MG GBM-cellen ingebed in Matrigel. De gereconstrueerde BBB vertoonde zowel structurele als functionele kenmerken van een intacte barrière, aangetoond door een continue ZO-1 lokalisatie langs de intercellulaire juncties en een beperkte diffusie van 40 kDa FITC-dextran over de vasculaire interface. Belangrijk is dat deze chip gekoppeld kan worden aan gecontroleerde ultrasone stimulatie om een transiënte opening van de BBB te induceren, waardoor het daaropvolgende transport en de tumor-targetefficiency van nanomicellen worden verbeterd. Met behulp van dit systeem kan het transport en de tumor-targetefficiency van nanomicellen SFN@RB@SPM kwantitatief worden beoordeeld. Over het algemeen biedt dit platform een nuttig instrument voor het bestuderen van de relatie tussen ultrasone parameters, BBB-modulatie met reversibele kenmerken en verbeterde afgifte van nanomicellen bij GBM-therapie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierprocedures waren in overeenstemming met de Richtlijnen (GB/T35892-2018) voor Ethische Beoordeling van het Welzijn van Experimentele Dieren en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Ningbo Institute of Life and Health Industry, UCAS (Goedkeuringsnr. GK-2023-XM-0073). De gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de Tabel met materialen.

1. Fabricage en preparatie van het BBB-GBM organ-on-a-chip-apparaat

  1. Chipontwerp en fotomaskerlay-out
    1. Ontwerp de chip met Auto CAD-software.
      OPMERKING: De chip bestaat uit drie parallelle microfluïdische kanalen, waaronder een bloedkanaal, een hersenkanaal en een tumorkanaal. De breedtes van het bloedkanaal en het tumorkanaal zijn beide 1000 µm, terwijl de breedte van het hersenkanaal 1300 µm is. De hoogte van de drie kanalen is 150 µm, en aangrenzende kanalen worden gescheiden door trapeziumvormige micropilaararrays met een breedte van 200 µm, die intercompartimentele moleculaire diffusie en cellulaire communicatie mogelijk maken. De gedetailleerde lay-out van het fotomaskerontwerp is weergegeven in Supplementary Figure 1 en Supplementary Figure 2. De SU-8 fotoresist die in deze studie is gebruikt, is 3050.
  2. Fabricage van een silicium mastermold met standaard fotolithografie met SU-8 fotoresist.
    1. Plaats een blanco siliciumwafer op het vacuümspan-chuck van de spincoater en activeer het vacuüm om de wafer stevig te immobiliseren.
    2. Dispenseer langzaam 10 mL SU-8 fotoresist op het centrum van de wafer.
    3. Voer een spincoatingproces in twee stappen uit om een uniforme fotoresistlaag te verkrijgen: eerst bij 500 rpm gedurende 10 s, daarna bij 2500 rpm gedurende 90 s.
    4. Breng de gecoate wafer over naar een warmteplaat en voer een soft bake uit bij 95 °C gedurende 30 min om het oplosmiddel te laten verdampen.
    5. Laat de wafer afkoelen tot kamertemperatuur en meet de dikte van de SU-8 laag met een diktemeter.
      OPMERKING: Voor een optimale BBB-vorming wordt een kanaalhoogte van 110–150 µm aanbevolen. Een enkele spin-coat (stap 1.2.3) levert doorgaans een filmdikte op van 40–50 µm; daarom zijn twee tot drie spincoatingprocessen nodig om de gewenste totale dikte te bereiken.
  3. Fotolithografische patroonvorming
    1. Stel de intensiteit van het ultraviolette (UV) licht van de mask aligner in op 14–15 mW/cm2.
    2. Lijn het chroom fotomasker uit met de SU-8-gecoate siliciumwafer en voer UV-blootstelling uit gedurende 10 s.
    3. Breng de siliciumwafer onmiddellijk over naar een warmteplaat voor post-exposure baking onder de volgende condities: 65 °C gedurende 10 s, gevolgd door 95 °C gedurende 300 s.
    4. Nadat de siliciumwafer is afgekoeld tot kamertemperatuur, wordt deze ondergedompeld in ontwikkelingsoplossing (propylenglycolmonomethyletheracetaat, PGMEA) en 4–6 min ontwikkeld.
    5. Spoel de wafer met isopropanol om de ontwikkeling te beëindigen, gevolgd door wassen met gedeïoniseerd water.
    6. Droog de wafer met stikstofgas en inspecteer de gepatroneerde microkanaalstructuren onder een optische microscoop.
      OPMERKING: Als er niet-ontwikkelde fotoresistresidu achterblijft, herhaal dan de ontwikkelingsstap totdat de microstructuren duidelijk gedefinieerd zijn.
    7. Bak de voltooide silicium master in een oven bij 200 °C gedurende 1 h om de adhesie tussen de SU-8 fotoresist en het siliciumwaferoppervlak te verbeteren.
  4. PDMS-chipfabricage
    1. Bereid polydimethylsiloxaan (PDMS) voor door het basisprepolymeer en het uithardingsmiddel grondig te mengen in een gewichtsverhouding van 10:1 (w/w) gedurende 30 min om een homogeen PDMS-prepolymeer te verkrijgen.
    2. Giet het PDMS-mengsel op de gefabriceerde silicium mastermold, waarbij wordt gegarandeerd dat de microstructuren volledig bedekt zijn.
    3. Plaats de mastermold in een vacuümdesiccator voor ontgassing om luchtbellen te verwijderen.
    4. Breng de mastermold over naar een oven en hard deze uit bij 65 °C gedurende 1,5–2 h.
    5. Snijd na het uitharden de PDMS-laag voorzichtig langs de chipgrenzen met een hobbymes en pel deze voorzichtig van de silicium mastermold.
    6. Dompel de PDMS-chip 30 min onder in 70%–75% ethanol voor voorlopige sterilisatie, spoel daarna met gedeïoniseerd water en laat aan de lucht drogen.
    7. Pons inlaat- en uitlaatpoorten met een biopsietpons van 2 mm.
  5. Plasmabinding en assemblage van het device
    1. Plaats de PDMS-chip en een schoon glasplaatje in de kamer van een plasmareiniger, waarbij de microkanaalzijde van de PDMS naar boven is gericht.
    2. Evacueer de kamer totdat de druk onder de 30 Pa zakt en voer vervolgens zuurstofgas in.
    3. Handhaaf de zuurstofstroom gedurende 90 s terwijl de kamerdruk onder de 40 Pa blijft.
    4. Stel het Radio Frequency (RF) vermogen in op 55% en voer een plasmabehandeling uit gedurende 90 s om de PDMS- en glasoppervlakken te activeren.
    5. Breng de geactiveerde PDMS-chip onmiddellijk in contact met het glasplaatje en druk zachtjes aan om een onomkeerbare binding te bewerkstelligen.
    6. Plaats het geassembleerde device in een oven bij 65 °C gedurende 24 h om de binding te stabiliseren en de hydrofobiciteit te herstellen.
    7. Steriliseer het gebonden device voor het zaaien van cellen door ultraviolette bestraling gedurende 30 min.
      OPMERKING: Handhaaf steriele omstandigheden door de gesteriliseerde chips tot aan gebruik in gesloten Petrischalen in een veiligheidskabinet te bewaren.

2. Celzaai en totstandkoming van het BBB-GBM-model

  1. Bereid de volgende reagentia voor:
    1. Kweekmedium voor AC's (voor het hersenkanaal): DMEM/F12 basismedium met 20% foetaal kalfsserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine (P/S).
    2. Kweekmedium voor HCMEC's (voor het vasculair kanaal): Endotheelcelmedium (ECM) aangevuld met 1% P/S.
    3. Kweekmedium voor GBM-cellen (voor het glioomkanaal): MEM-basaalmedium met 10% FBS en 1% P/S.
    4. Reagens voor celdissociatie: Gebruik een 0,25% trypsine-EDTA-oplossing voor het losmaken van adherente cellen.
      OPMERKING: Langdurige blootstelling aan trypsine kan de levensvatbaarheid van de cellen verminderen. Controleer de loslating van de cellen onder een microscoop en neutraliseer de trypsine direct met volledig medium.
    5. Houd alle cellen (AC's, HCMEC's en U87-MG) in 100 mm-kweekschalen voordat ze in het microfluïdische apparaat worden gezaaid.
  2. Isolatie van primaire AC's
    1. Isoleer primaire astrocyten uit de cerebrale cortex van pasgeboren ratten (postnatale dag 1–3). Verwijder voorzichtig de hersenvliezen en bloedvaten op ijs, snipper het corticale weefsel met steriele chirurgische scharen en onderwerp dit aan enzymatische digestie.
    2. Was de gedissocieerde celsuspensie met ijskoud PBS, behandel deze met trypsine om een dissociatie tot enkelcellen te bereiken en verzamel de pellets door middel van centrifugatie (400 x g, 5 min, kamertemperatuur).
    3. Resuspendeer de cellen en zaai deze uit in T25-kweekflessen met AC-kweekmedium.
    4. Identificeer de astrocyten (AC's) met GFAP via immunofluorescentiekleuring. De afbeelding is opgenomen in Aanvullend Figuur 3.
  3. Cellzaai
    OPMERKING: Dag 1 - Uitplaten van AC's in het hersenkanaal.
    1. Voeg 1 mL 0,25% trypsine-EDTA toe aan de kweekschaal met AC's. Draai de schaal voorzichtig rond om een gelijkmatige verdeling te waarborgen.
    2. Incubeer bij 37 °C gedurende 1–2 min totdat de cellen loslaten van de kweekschaal.
    3. Voeg 3 mL ACs-kweekmedium (uit stap 2.1.1) toe om trypsine te neutraliseren. Pipetteer voorzichtig om een suspensie van enkelvoudige cellen te verkrijgen.
    4. Verzamel de celsuspensie in een centrifugebuis en centrifugeer bij 300 × g gedurende 3 min bij 4 °C.
    5. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 200 µL van AC-medium.
    6. Bepaal de celconcentratie met een automatische celteller en pas de dichtheid aan naar 2,5 × 106 cellen/ml
    7. Meng de celsuspensie van de AC's met Matrigel in een verhouding van 3:5 (v/v) (AC-cellen: Matrigel).
    8. Breng met een micropipet ... over 10 µL van het Matrigel-AC-mengsel in het hersenkanaal.
      OPMERKING: Voer de laadprocedure uit terwijl de chip op ijs wordt gehouden om voortijdige polymerisatie van Matrigel te voorkomen.
    9. Incubeer de chip bij 37 °C in een 5% $\text{CO}_2$2 30 min in de incubator om polymerisatie van Matrigel en stabilisatie van de cellen mogelijk te maken.
      OPMERKING: Dag 1 - Uitzaaien van HCMEC's in het vasculaire kanaal.
    10. Voeg 1 mL 0,25% trypsine-EDTA toe en incubeer bij 37 °C gedurende ongeveer 30 s totdat de cellen loslaten.
    11. Voeg 3 mL HCMEC-medium (stap 2.1.2) toe om de enzymatische digestie te stoppen.
    12. Pipette voorzichtig om een uniforme enkelcel-suspensie te verkrijgen.
    13. Verzamel de suspensie en centrifugeer bij 300 × g gedurende 3 min bij 4 °C.
    14. Verwijder het supernatant en resuspendeer het celpellet in 200 µL van HCMEC-medium.
    15. Tel de cellen en pas de concentratie aan naar 2 × 106 cellen/ml
    16. Voorzichtig introduceren 10 µL van de HCMEC-suspensie in het vasculaire kanaal van de chip.
    17. Plaats de chip gedurende 30 min zijwaarts in de celincubator om de aanhechting van endotheelcellen langs de kanaalwand te bevorderen.
    18. Zaai een aanvullende 10 µL van de HCMEC-suspensie in het vasculaire kanaal om de endotheliale dichtheid in het vasculaire kanaal te verhogen.
    19. Incubeer de chip nog 30–60 min om de adhesie van HCMEC's mogelijk te maken.
    20. Voeg toe 100 µL gemengd kweekmedium bij de inlaat van de chip.
      OPMERKING: Het gemengde medium bestaat uit AC-medium en HCMEC-medium in een verhouding van 1:1 (v/v).
      Dag 3 - Uitplaten van U87-MG-cellen in het glioomkanaal.
    21. Voeg 1 mL 0,25% trypsine-EDTA toe aan de kweekschaal en incubeer bij 37 °C gedurende 1–2 min.
    22. Voeg 3 mL U87-MG-medium (uit stap 2.1.3) toe om de digestie te beëindigen.
    23. Pipette voorzichtig om een homogene suspensie van enkelcellen te verkrijgen.
    24. Overbreng de celsuspensie naar een centrifugebuis en centrifugeer bij 300 × g gedurende 3 min.
    25. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 200 µL van U87-MG-medium.
    26. Tel de celconcentratie en pas de dichtheid aan naar 2 × 106 cellen/mL.
    27. Introductie 10 µL van de U87-MG-celсусpensie in het glioomkanaal van de chip.
    28. Incubeer de chip in een 37 °C met 5% CO2 gedurende 30–60 min om celhechting mogelijk te maken.
    29. Voeg toe 100 µL van U87-MG-kweekmedium aan de inlaat van de chip.
    30. Houd het microfluïdische apparaat in een 37 °C omgeving met 5% CO22 nog eens 48 uur om de vorming van endotheliale tight junctions mogelijk te maken.

3. Evaluatie van de integriteit van de BBB

  1. Permeabiliteitsassay
    1. Bereid fluoresceïne-isothiocyanaat-dextran (FITC-dextran) met een molecuulgewicht van 40 kDa voor in gemengd kweekmedium (ACs-medium: HCMEC-medium = 1:1, v/v) tot een eindconcentratie van 10 µg/mL.
    2. Breng 10 µL van de FITC-dextran-oplossing aan in het vasculaire kanaal.
    3. Plaats de microfluïdische chip op de tafel van een geïnverteerde fluorescentiemicroscoop om fluorescentiebeelden van zowel het vasculaire kanaal als het aangrenzende hersenkanaal te verkrijgen met intervallen van 20 min om de diffusie van dextran over de endotheliale barrière te monitoren.
    4. Kwantificeer de permeabiliteitscoëfficiënt (Papp, cm/s) met de volgende formule:
      Papp (cm/s)= Vergelijking voor procesefficiëntie, met Fs, Fc, Δt; wiskundige formule voor wetenschappelijk onderzoek.
      Waarbij Papp de schijnbare permeabiliteitscoëfficiënt is (cm/s), FS de fluorescentie-intensiteit is op het beginmoment in het bloedkanaal, FC de fluorescentie-intensiteit is in het hersenkanaal aan het einde van het diffusie-interval, Δt de diffusietijd is (s), VT het diffusievolume van FITC-dextran in het hersenkanaal is (cm3) en A het endotheliale oppervlak is (cm2).
      OPMERKING: Een lagere permeabiliteitscoëfficiënt duidt op een hogere integriteit van de BBB en een dichtere vorming van de endotheliale barrière.
    5. Voer de data-analyse en parameterdefinities uit.
      OPMERKING: Fluorescentie-intensiteitswaarden van zowel de bloed- als hersenkanalen werden gecorrigeerd voor de achtergrond met behulp van metingen verkregen uit celvrije regio's van de chip. ROI's werden gedefinieerd aan beide zijden van de bloed-herseninterface op basis van de fluorescentiediffusielengte. Het endotheliale oppervlak (A) werd berekend op basis van het interface-oppervlak tussen de vasculaire en hersenkanalen (met een opening tussen twee micropilaren als referentie): 200 µm × 150 µm = 30.000 µm2 = 3 × 10-6 cm2. Het FITC-dextran diffusievolume (VT) werd afgeleid uit de diffusie-penetratiediepte in het hersenkanaal vermenigvuldigd met A. Fluorescentiebeelden werden elke 20 min (1200 s) verkregen over een periode van 60 min; de permeabiliteitscoëfficiënt werd berekend met de gegevens van het 20-min interval. Permeabiliteitswaarden werden berekend op basis van drie onafhankelijke chips voor elke experimentele groep. Alle eenheidsomzettingen werden uitgevoerd voordat de permeabiliteit werd uitgedrukt in cm/s.
  2. Immunofluorescentieanalyse van ZO-1
    1. Was de microfluïdische kanalen drie keer met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om resterend kweekmedium te verwijderen.
    2. Fixeer de cellen door 4% paraformaldehyde (PFA) in de kanalen aan te brengen en 10 min te incuberen bij kamertemperatuur.
    3. Permeabiliseer de cellen met 0,1% Triton X-100 in PBS gedurende 15 min bij kamertemperatuur.
    4. Blokkeer aspecifieke antilichaambinding door de kanalen 45 min te incuberen met 2% runderserumalbumine (BSA) in PBS bij kamertemperatuur.
    5. Breng het primaire anti-ZO-1 antilichaam (verdunning 1:200) aan in de kanalen en incubeer dit overnight bij 4 °C.
    6. Was het kanaal grondig met PBS om ongebonden primair antilichaam te verwijderen.
    7. Incubeer de chips met een Alexa Fluor 555-geconjugeerd anti-konijn secundair antilichaam (verdunning 1:1000) gedurende 45 min bij kamertemperatuur in het donker.
    8. Tegenkleur de kernen met 1 µg/mL 4’6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) gedurende 1 min bij kamertemperatuur in het donker.
      OPMERKING: DAPI is lichtgevoelig en moet tijdens het kleuren tegen licht worden beschermd.
    9. Was de kanalen drie keer met PBS.
    10. Beeld de microfluïdische component af met een geïnverteerde fluorescentiemicroscoop en een confocale laserscanmicroscoop om de lokalisatie van ZO-1 langs de endotheliale celverbindingen te visualiseren.

4. Ultrasone verbetering van de afgifte van nanomicellen over de BBB naar GBM-cellen

  1. Ultrasoundstimulatie
    1. Haal de chip voorzichtig uit de kweekschaal en plaats deze in een biosafety cabinet.
    2. Pas ultrasoundstimulatie toe met behulp van een therapeutisch ultrasoonsysteem uitgerust met een 1 MHz transducer (effectief stralend oppervlak: 5 cm2).
    3. Plaats een 3 mm dik akoestisch koppelingskussen van medische kwaliteit tussen de ultrasoundprobe en het oppervlak van de microfluïdische chip om een efficiënte akoestische transmissie te waarborgen.
    4. Positioneer de ultrasoundprobe direct boven het vasculaire kanaalgebied van het microfluïdische apparaat.
      OPMERKING: Luchtbellen tussen de transducer en de chip verminderen de transmissie van akoestische energie aanzienlijk en dienen te worden vermeden.
    5. Stel de ultrasoundparameters als volgt in: duty cycle: 60%; frequentie: 1 MHz; intensiteit: 1 W/cm2; blootstellingsduur: 30 s; pulsherhalingsfrequentie (PRF): 100 Hz. De gedetailleerde ultrasoundparameters worden vermeld in Supplementary Table 1.
    6. Plaats voor de onbehandelde controlegroep de ultrasoundtransducer in dezelfde positie, maar houd deze inactief als sham-controle, zodat identieke handelingen worden uitgevoerd zonder akoestische blootstelling.
    7. Verwijder na de ultrasoundblootstelling het koppelingskussen en plaats de chip onmiddellijk terug in een steriele kweekschaal.
    8. Voeg vers kweekmedium toe aan de inlaatpoorten van de chip.
    9. Incubeer het apparaat bij 37 °C met 5% CO2 tot aan verdere analyse.
  2. Evaluatie van ultrasound-geïnduceerde BBB-modulatie
    1. Voer ZO-1 immunofluorescentiekleuring uit onmiddellijk na de ultrasoundbehandeling (0 u) en 24 u na de behandeling om veranderingen in de integriteit van de tight junctions te beoordelen.
    2. Volg de procedure voor immunofluorescentiekleuring zoals beschreven in stap 3.2.
    3. Vergelijk de verdeling van de ZO-1 kleuring langs de z-as om het effect van ultrasoundstimulatie op de integriteit van de BBB tight junctions te evalueren.
  3. Preparatie en karakterisering van SFN@RB@SPM nanomicellen
    1. Bereid de SFN@RB@SPM nanomicellen voor volgens het eerder vastgestelde protocol17. Kort gezegd werden stokoplossingen van het amfifiele peptide (aangeduid als SPM, 6 mg/mL), RB (0,6 mg/mL) en SFN (6 mM) gemengd in een volumeverhouding van 1:1:1.
    2. Plaats het mengsel in een sonicator en soniceer bij 28 kHz, 25 °C gedurende 30 min.
    3. Dialyseer het mengsel (molecular weight cut-off: 1000 Da) gedurende 48 u om vrij RB en SFN te verwijderen.
    4. Meet de grootte en het zetapotentieel van de nanomicellen via dynamic light scattering (DLS). De karakteriseringsgegevens worden vermeld in Supplementary Figure 4.
  4. Evaluatie van ultrasound-gestimuleerde afgifte van nanomicellen en accumulatie in glioomcellen
    1. Introduceer onmiddellijk na de ultrasoundblootstelling het kweekmedium met nanomicellen in het vasculaire kanaal van het microfluïdische apparaat.
    2. Om het transport van nanomicellen over de BBB te evalueren, wordt de microfluïdische chip op de tafel van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop geplaatst en worden fluorescentiebeelden van zowel het vasculaire kanaal als het aangrenzende hersenkanaal genomen met intervallen van 20 min over een periode van 60 min.
    3. Kwantificeer de fluorescentiebeelden in het hersenkanaal om de door ultrasound verbeterde permeabiliteit van nanomicellen te evalueren.
    4. Om de accumulatie van nanomicellen in glioomcellen te beoordelen, wordt het apparaat na de ultrasoundblootstelling gedurende 3 u geïncubeerd onder standaard kweekcondities (37 °C, 5% CO2), waarna het glioomkanaal met een fluorescentiemicroscoop wordt afgebeeld om de intracellulaire opname van nanomicellen te evalueren.
  5. Statistische analyse
    1. Druk alle kwantitatieve gegevens uit als gemiddelde±standaardfout van het gemiddelde (SEM).
    2. Voer elk experiment uit met drie onafhankelijke biologische replica's (n = 3 chips per experimentele conditie). Voor elke biologische replica werden ten minste drie technische replica's (ROI per kanaal) gemeten om de betrouwbaarheid van de gegevens te waarborgen.
    3. Bereken de permeabiliteitscoëfficiënt (Papp, cm/s) uit elke onafhankelijke chip, welke diende als de primaire analyse-eenheid voor alle statistische vergelijkingen.
      OPMERKING: Vergelijkingen tussen twee groepen werden uitgevoerd met een ongepaarde tweezijdige Student's t-test. Vergelijkingen tussen drie of meer groepen werden geanalyseerd met een eenwegvariantieanalyse (ANOVA), gevolgd door de Tukey post hoc test voor meervoudige vergelijkingen. Voor experimenten met twee onafhankelijke variabelen werd een tweeweg-ANOVA gevolgd door de Tukey-test voor meervoudige vergelijkingen uitgevoerd. Statistische analyses werden uitgevoerd met statistische en grafische software. Een p-waarde van <0,05 werd beschouwd als statistisch significant.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om de in vivo structuur van de bloed-hersenbarrière (BBB) na te bootsen, is een tri-cultuur microfluïdische chip ontwikkeld door HCMEC's, primaire AC's en U87-MG-cellen te integreren (het "chipmodel" genoemd). Zoals weergegeven in Figuur 1A,B, zijn er drie parallelle kanalen in het apparaat aangebracht: het vasculaire kanaal (links, blauw), het met Matrigel gevulde hersenkanaal (centraal, roze) en het tumorkanaal (rechts, groen), die respectievelijk zijn gezaaid met...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol beschrijft de totstandkoming van een microfluïdische BBB-GBM-chip voor het evalueren van ultrasone modulatie van de BBB en de aflevering van nanomicellen. In vergelijking met conventionele in vitro BBB-modellen (bijv. Transwell), maakt dit microfluïdische platform ruimtelijk gedefinieerde co-cultuur van endotheelcellen, AC's en glioomcellen mogelijk, waardoor onderzoek naar drugstransport over een fysiologisch relevante BBB mogelijk wordt. Verschillende kritische stappen in het protocol vereisen zor...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Tijdens de voorbereiding van dit manuscript hebben de auteurs ChatGPT (OpenAI) uitsluitend gebruikt voor taalbewerking en verbetering. De auteurs hebben alle door AI ondersteunde inhoud beoordeeld en bewerkt en dragen de volledige verantwoordelijkheid voor de nauwkeurigheid en integriteit van het manuscript. Er zijn geen AI-tools gebruikt voor datageneratie, analyse of de voorbereiding van figuren.

Dankbetuigingen

Wij danken voor de financiering door het Zhejiang Provincial Natural Science Foundation (LQ24H160003), de Medical Scientific Research Foundation of Zhejiang Province (2024KY351), het Ningbo Natural Science Foundation (2023J365), het Yongjiang Talent Introduction Programme (Young Innovative Talent Project, 2021A-012-G) en het Bei’An Talent Programme van het district Jiangbei, Ningbo (2023RC004).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Alexa Fluor 555-geconjugeerd anti-konijn secundair antilichaamCell Signaling Technology, Inc.4413
anti-ZO-1 antilichaamThermo Fisher Scientific Co., Ltd.40-2200
BiopsietponsZhejiang YoungChip Technology Co., Ltd.10305130004
Bovien serumalbumineAbsin Bioscience Inc.9048-46-8
CeltellerThermo Fisher Scientific Co., Ltd.Countess TM3
Celkweekschaal (100 mm)Corning Inc.430167
CentrifugeBeckman Coulter, Inc.Avanti J-15R
ChroommaskerSuzhou Chip Scientific Instrument Co.,Ltd.ZX-GBYM
Confocale laser-scanning microscoopCarl Zeiss AGZeiss LSM900
DAPIBeyotime Biotech Inc.C1002
OntwikkelaarSuzhou Chip Scientific Instrument Co., Ltd.RCD-400
DMEM/F12ScienCell Research LaboratoriesC3130-0500
ECMScienCell Research Laboratories1001
EthanolNingbo Zhenhai Yongfeng Chemical Plant6923193900015
Foetaal bovien serumScienCell Research LaboratoriesC04001-500
Fiji (Fiji Is Just ImageJ)Open-source projectN/A
FITC-Dextran (40 kDa)Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.GC19938
GlasplaatjesCitotest Scientific Co., Ltd.188105W
Graphpad prism 9.5GraphPad Software, Inc.N/A
Humane cerebrale microvasculaire endotheelcellen (HCMECs)BeNa Culture CollectionBNCC337717
IncubatorEsco Lifesciences Co., LtdCLM-170B-8-CN
Omgekeerde fluorescentiemicroscoopNikon Instruments Inc.TS2-FL
IsopropanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.80109218
MatrigelCorning Inc.354234
MEMPricella Life Science & Technology Co., Ltd.PM150410
StikstofNingbo Baifang Gas CO., Ltd.N/A
ZuurstofNingbo Baifang Gas CO., Ltd.N/A
Paraformaldehyde (PFA, 4%)Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1101-500mL
PBSScienCell Research LaboratoriesC3580-0500
PDMSCorning Inc.220777
Penicilline/streptomycinePricella Life Science & Technology Co., Ltd.PB180120
FotolithografieInstitute of Optics and Electronics,Chinese Academy of SciencesURE-2000\AL
Fotolithografie warmteplaatSuzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.WH-HP-02
Plasma-asherTIANKECHUANGDA Co., Ltd.PT-05-LF
Primaire astrocytenN/AN/AGeïsoleerd uit hersenen van neonatale rat (dag 1-3)
SiliciumwaferZhejiang YoungChip Technology Co., Ltd.10204040001
SpincoaterSuzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.WH-SC-01
SU-8Kayaku Advanced Materials Inc.1030403002
Triton X-100Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.9002-93-1
TrypsineScienCell Research LaboratoriesC3530-0100
U87-MG cellenPricella Life Science & Technology Co., Ltd.CL-0238
Ultrasound-apparaat Shenzhen Dongdixin Technology Co., Ltd.Sonic-Stimu Pro UT1041
Zen3.4(blue edition)Carl Zeiss AGN/A

Referenties

  1. Narsinh KH, Perez E, Haddad AF, Young JS, Savastano L, Villanueva-Meyer JE, et al. Strategies to improve drug delivery across the blood-brain barrier for glioblastoma. Curr Neurol Neurosci Rep. 2024;24(5):123-139.
  2. Xie Y, Yang F, He L, Huang H, Chao M, Cao H, et al. Single-cell dissection of the human blood-brain barrier and glioma blood-tumor barrier. Neuron. 2024;112(18):3089-105 e7.
  3. Scalise AA, Kakogiannos N, Zanardi F, Iannelli F, Giannotta M. The blood-brain and gut-vascular barriers: from the perspective of claudins. Tissue Barriers. 2021;9(3):1926190.
  4. Sivandzade F, Cucullo L. In-vitro blood-brain barrier modeling: A review of modern and fast-advancing technologies. J Cereb Blood Flow Metab. 2018;38(10):1667-1681.
  5. Shawahna R, Decleves X, Scherrmann JM. Hurdles with using in vitro models to predict human blood-brain barrier drug permeability: a special focus on transporters and metabolizing enzymes. Curr Drug Metab. 2013;14(1):120-136.
  6. Oddo A, Peng B, Tong Z, Wei Y, Tong WY, Thissen H, et al. Advances in Microfluidic Blood-Brain Barrier (BBB) Models. Trends Biotechnol. 2019;37(12):1295-1314.
  7. Hajal C, Offeddu GS, Shin Y, Zhang S, Morozova O, Hickman D, et al. Engineered human blood-brain barrier microfluidic model for vascular permeability analyses. Nat Protoc. 2022;17(1):95-128.
  8. Xu H, Li Z, Yu Y, Sizdahkhani S, Ho WS, Yin F, et al. A dynamic in vivo-like organotypic blood-brain barrier model to probe metastatic brain tumors. Sci Rep. 2016;6:36670.
  9. Park J, Wetzel I, Marriott I, Dreau D, D'Avanzo C, Kim DY, et al. A 3D human triculture system modeling neurodegeneration and neuroinflammation in Alzheimer's disease. Nat Neurosci. 2018;21(7):941-951.
  10. Park TE, Mustafaoglu N, Herland A, Hasselkus R, Mannix R, FitzGerald EA, et al. Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies. Nat Commun. 2019;10(1):2621.
  11. Peng B, Tong Z, Tong WY, Pasic PJ, Oddo A, Dai Y, et al. In situ surface modification of microfluidic blood-brain-barriers for improved screening of small molecules and nanoparticles. ACS Appl Mater Interfaces. 2020;12(51):56753-56766.
  12. Mainprize T, Lipsman N, Huang Y, Meng Y, Bethune A, Ironside S, et al. Blood-brain barrier opening in primary brain tumors with non-invasive MR-guided focused ultrasound: a clinical safety and feasibility study. Sci Rep. 2019;9(1):321.
  13. Adriani G, Ma D, Pavesi A, Kamm RD, Goh EL. A 3D neurovascular microfluidic model consisting of neurons, astrocytes and cerebral endothelial cells as a blood-brain barrier. Lab Chip. 2017;17(3):448-459.
  14. Silvani G, Scognamiglio C, Caprini D, Marino L, Chinappi M, Sinibaldi G, et al. Reversible cavitation-induced junctional opening in an artificial endothelial layer. Small. 2019;15(51):e1905375.
  15. Beekers I, Vegter M, Lattwein KR, Mastik F, Beurskens R, van der Steen AFW, et al. Opening of endothelial cell-cell contacts due to sonoporation. J Control Release. 2020;322:426-438.
  16. Qiao C, Luo S, Liu Z, Bu Y, Cai Y, Liu Z, et al. Tuning endothelial barrier permeability with ultrasound: a pulse-length-dependent interplay between bubble dynamics and cellular bioeffects. Ultrason Sonochem. 2026;129:107851.
  17. Li Y, Yang X, Wei Z, Niu H, Wu L, Chen C, et al. Sulforaphane wrapped in self-assembled nanomicelle enhances the effect of sonodynamic therapy on glioma. Pharmaceutics. 2024;17(1):34.
  18. Yuan W, Lv Y, Zeng M, Fu BM. Non-invasive measurement of solute permeability in cerebral microvessels of the rat. Microvasc Res. 2009;77(2):166-173.
  19. Lee SWL, Campisi M, Osaki T, Possenti L, Mattu C, Adriani G, et al. Modeling nanocarrier transport across a 3D in vitro human blood-brain-barrier microvasculature. Adv Healthc Mater. 2020;9(7):e1901486.
  20. Mehta RI, Carpenter JS, Mehta RI, Haut MW, Ranjan M, Najib U, et al. Blood-brain barrier opening with MRI-guided focused ultrasound elicits meningeal venous permeability in humans with early Alzheimer disease. Radiology. 2021;298(3):654-662.
  21. Cho H, Seo JH, Wong KH, Terasaki Y, Park J, Bong K, et al. Three-dimensional blood-brain barrier model for in vitro studies of neurovascular pathology. Sci Rep. 2015;5:15222.
  22. Campisi M, Shin Y, Osaki T, Hajal C, Chiono V, Kamm RD. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 2018;180:117-129.
  23. Wang YI, Abaci HE, Shuler ML. Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening. Biotechnol Bioeng. 2017;114(1):184-194.
  24. Jiang L, Li S, Zheng J, Li Y, Huang H. Recent progress in microfluidic models of the blood-brain barrier. Micromachines (Basel). 2019;10(6):375.
  25. Bonkowski D, Katyshev V, Balabanov RD, Borisov A, Dore-Duffy P. The CNS microvascular pericyte: pericyte-astrocyte crosstalk in the regulation of tissue survival. Fluids Barriers CNS. 2011;8(1):8.
  26. Hurtado-Alvarado G, Cabanas-Morales AM, Gomez-Gonzalez B. Pericytes: brain-immune interface modulators. Front Integr Neurosci. 2014;7:80.
  27. Santa-Maria AR, Walter FR, Figueiredo R, Kincses A, Vigh JP, Heymans M, et al. Flow induces barrier and glycocalyx-related genes and negative surface charge in a lab-on-a-chip human blood-brain barrier model. J Cereb Blood Flow Metab. 2021;41(9):2201-2215.
  28. van der Helm MW, van der Meer AD, Eijkel JC, van den Berg A, Segerink LI. Microfluidic organ-on-chip technology for blood-brain barrier research. Tissue Barriers. 2016;4(1):e1142493.
  29. Alluri H, Peddaboina CS, Tharakan B. Evaluation of tight junction integrity in brain endothelial cells using confocal microscopy. Methods Mol Biol. 2024;2711:257-262.
  30. Nitta T, Hata M, Gotoh S, Seo Y, Sasaki H, Hashimoto N, et al. Size-selective loosening of the blood-brain barrier in claudin-5-deficient mice. J Cell Biol. 2003;161(3):653-660.
  31. Ben-Zvi A, Lacoste B, Kur E, Andreone BJ, Mayshar Y, Yan H, et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 2014;509(7501):507-511.
  32. Andreone BJ, Chow BW, Tata A, Lacoste B, Ben-Zvi A, Bullock K, et al. Blood-brain barrier permeability is regulated by lipid transport-dependent suppression of caveolae-mediated transcytosis. Neuron. 2017;94(3):581-594 e5.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Glioblastoommodelultrasone openen van de bloed-hersenbarrièrepermeabiliteit van de bloed-hersenbarrièreendotheelcellenastrocytco-cultuurFITC-dextranassaynanomiceltransport

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.