Methodenartikel

Een muismodel van endometriose met ex vivo Cy5.5 kleurstof-gedopeerde silica-nanodeeltjeslabeling voor laesievisualisatie

123 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/72070

⸱

4 augustus 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics, Gynecology and Women’s Health, University of Missouri, 2Department of Biomedical Engineering, Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Michigan State University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie toont de inductie van endometriose aan met ex vivo labeling met Cy5.5-gedoopeerde silica-nanodeeltjes, waardoor fluorescerende visualisatie van endometriotische laesies mogelijk is zonder genetische manipulatie.

Samenvatting

Endometriose is een veelvoorkomende gynaecologische aandoening die wordt gekenmerkt door de groei van endometrium-achtig weefsel buiten de baarmoederholte, wat leidt tot chronische ontstekingen, bekkenpijn en onvruchtbaarheid. Betrouwbare muismodellen zijn essentieel voor het onderzoeken van de moleculaire, hormonale, immuun- en omgevingsmechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling en progressie van de ziekte. Conventionele methoden om endometriotische laesies te identificeren vertrouwen vaak op genetisch gemodificeerde fluorescerende reportermuizen, die tijdrovend en kostbaar zijn om te genereren. Hier presenteren we een eenvoudige, niet-genetische benadering om endometriose bij muizen op te wekken en te visualiseren door ex vivo donor-baarmoederweefselfragmenten te labelen met Cy5.5-gedopeerde silica-nanodeeltjes vóór transplantatie. De nanodeeltjes vertonen gunstige fysisch-chemische eigenschappen, hoge fluorescentiestabiliteit en minimale cytotoxiciteit, waardoor het effectief labelen van baarmoederweefsel mogelijk is zonder experimentele procedures te compromitteren. Na intraperitoneale implantatie in ontvangende muizen kunnen Cy5.5-gelabelde endometriotische laesies gemakkelijk worden onderscheiden van omringende gastheerweefsels met behulp van fluorescentiebeeldvorming. Dit protocol biedt een reproduceerbare en veelzijdige methode voor visualisatie en tracking van laesies, waardoor studies naar endometriose-pathogenese en de preklinische evaluatie van diagnostische en therapeutische strategieën mogelijk worden gemaakt zonder genetische manipulatie.

Inleiding

Endometriose is een veelvoorkomende gynaecologische aandoening waarbij cellen die het endometrium bekleden buiten de baarmoeder groeien. De resulterende endometriotische laesies leiden tot een chronische ontstekingsaandoening1, en getroffen vrouwen ervaren vaak bekkenpijn en onvruchtbaarheid2. Dysfunctie in endometriale stromale en epitheliale cellen verbetert de overleving en ontwikkeling van endometriotische laesies 3,4,5,6. Deze veelvoorkomende aandoening treft ongeveer 11% van de vrouwen alleen al in de VS. Het is een belangrijke oorzaak van onvruchtbaarheid en bekkenpijn7, en de prevalentie stijgt tot 50%–60% bij vrouwen met chronische bekkenpijn en onvruchtbaarheid 8,9,10,11,12,13. De geschatte jaarlijkse kosten voor het diagnosticeren en behandelen van endometriose bedragen in de Verenigde Statenmeer dan 22 miljard dollar. Huidige behandelingen omvatten chirurgische verwijdering van de laesies of het inleiden van een hypooestrogene toestand. Echter, recidief na een operatie komt vaak voor en bestaande therapieën zijn vaak niet effectief 9,16. De diagnose wordt doorgaans alleen vastgesteld door chirurgische visualisatie en histologische verificatie17,18. Bovendien wordt endometriose vaak niet gediagnosticeerd of verkeerd gediagnosticeerd, met een diagnostische vertraging van 9–11 jaaren 19,20 jaar. Deze vertraging legt een aanzienlijke emotionele en financiële last op zowel patiënten als het zorgsysteem20,21. Daarom is er dringend behoefte aan het ontwikkelen van niet-invasieve methoden voor zowel de diagnose als de behandeling van endometriose.

In vitro modellen hebben geavanceerd endometrioseonderzoek. Toch blijven ze beperkt in hun vermogen om de complexiteit van ziekten volledig te repliceren. Een grote uitdaging ligt in de multifactoriele aard van endometriose, die ingewikkelde interacties omvat tussen hormonen, ontstekingen, immuuncellen, zenuwen en diverse celtypen binnen een dynamische driedimensionale omgeving. Bovendien vangen in vitro-systemen de natuurlijke fluctuaties van ovariumsteroïden hormonen niet op, waardoor het vermogen om ziekte-effecten op het voortplantingskanaal te bestuderen beperktwordt 21,22,23. Een model van geïnduceerde endometriose met intacte muizen biedt dus een veelzijdig platform om de individuele en interactieve rollen van het immuunsysteem24, hormonen25,26 en omgevingsfactoren27,28 in de ontwikkeling van endometriose en de impact daarvan op het voortplantingskanaalte onderzoeken. Daarnaast stelt het gebruik van transgene muismodellen, waarin specifieke genen selectief worden verwijderd of overexpressief in het endometrium, onderzoekers in staat om de rollen van verschillende moleculaire routes in de ontwikkeling en progressie van endometriose te verduidelijken. Het nauwkeurig onderscheiden van endometriotische laesies van omliggende gastheerweefsels blijft echter een aanzienlijke technische uitdaging.

Met kleurstof gedoteerde silica-nanodeeltjes zijn veelzijdige en robuuste probes voor cellulaire tracking en bioimaging. Ze zijn eenvoudig te synthetiseren, zeer dispersief, fotostabiel, biocompatibel en efficiënt in cellabeling30,31. De silica-ruggengraat stabiliseert hydrofobe fluoroforen binnen de matrix, waardoor ze efficiënte, hoog-quantumopbrengst (QY) fluorescerende moleculaire reporters worden. In de loop der jaren zijn dergelijke fluorescerende silica-nanodeeltjes op grote schaal gebruikt als heldere, duurzame ex vivo labels voor cellen en weefselstructuren voorafgaand aan transplantatie en daaropvolgende beeldvorming in vivo 32,33,34,35. Hier beschrijven we een gedetailleerde procedure voor de inductie van endometriose bij muizen met ex vivo labeling met behulp van Cy5.5 met kleurstof gedoteerde silica-nanodeeltjes, zoals gebruikt in een eerdere publicatie35, waardoor hun toepassing als stabiele beeldvormingsmarkers voor het volgen van laesies mogelijk is.

Protocol

Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de University of Missouri (Protocol nr. 65323) en werden uitgevoerd in overeenstemming met institutionele richtlijnen en toepasselijke nationale regelgeving voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.

1. Voorbereiding van Cy5.5-APTES conjugatie

  1. Los 1 mg cyanine 5,5-NHS ester op in 100 μL dimethylsulfoxide (DMSO) in een helder 11,1 mL glazen buisje met schroefdraad. Bedek het flesje onmiddellijk met aluminiumfolie om de oplossing tegen licht te beschermen.
    OPMERKING: Cy 5.5-APTES conjugaat kan een week lang worden opgeslagen bij 4 °C bij kamertemperatuur.
  2. Voeg 1 μL (3-aminopropyl)triethoxysilaan (APTES) toe aan de kleurstofoplossing.
  3. Voeg 0,5 μL triethylamine (TEA) toe en meng direct om de reactie te vergemakkelijken.
  4. Roer het reactiemengsel 24 uur op 300 rpm bij 30 °C in het donker om covalente koppeling tussen Cy5.5 en APTES mogelijk te maken.
  5. Sluit het flesje af met de dop en blijf het beschermen tegen licht door het in aluminiumfolie te wikkelen.

2. Synthese van Cy5.5 met kleurstof gedoteerde silica-nanodeeltjes

  1. Voeg 1 μL geconcentreerde ammoniakoplossing (28%) toe aan een nieuw helder glazen buisje met schroefdraad.
  2. Voeg 8,5 mL absolute ethanol toe (moleculaire biologiekwaliteit).
  3. Voeg 350 μL tetraethylorthosilicaat (TEOS) toe.
  4. Voeg 15 μL van de bereide Cy5.5-APTES-oplossing toe aan het silica-synthesereactiemengsel.
  5. Roer het reactiemengsel 24 uur op 500 rpm bij kamertemperatuur in het donker om covalente opname van de kleurstof in de silicamatrix mogelijk te maken.

3. Zuivering en verspreiding

  1. Breng het volledige reactiemengsel over in een 15 mL centrifugebuis.
  2. Bereid een balansbuis voor met een gelijke hoeveelheid gedestilleerd water voor centrifugatie.
  3. Centrifugeer beide buizen op 12.074 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Controleer of er een zichtbare pellet is gevormd aan de onderkant van de buis na centrifugatie.
  4. Was de pellet met 10 mL 95% ethanol door te centrifugeren op 12.074 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Herhaal deze wash 3 keer, waarbij de pellet door sonicatie ongeveer 3–5 minuten tussen de wasbeurten wordt opgehangen, of totdat het volledig is verspreid.
  5. Was de pellet met 5 ml gedestilleerd water en centrifugeer op 12.074 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Herhaal deze wash 2x, waarbij je de pellet ongeveer 3–5 minuten tussen de wasbeurten opnieuw ophangt door sonicatie, of totdat het volledig is verspreid.
  6. Suspendeer de pellet opnieuw in 5 mL gedestilleerd water door sonicatie totdat deze volledig is verspreid (geen vaste fragmenten waargenomen om dispersie te bevestigen). Bevestig dat de deeltjessuspensie zichtbaar blauw lijkt na volledige dispersie.
  7. Breng de suspense over in een glazen flesje, wikkel het flesje in aluminiumfolie om het te beschermen tegen licht, en bewaar het op kamertemperatuur.
  8. Beoordeel de deeltjesverspreiding en fluorescentie met behulp van een in vivo beeldvormingssysteem (IVIS). Gebruik een excitatiegolflengte van 680 nm en een emissiegolflengte van 710 nm voor Cy5.5.

4. Endometriose-inductie met ex vivo labeling met Cy5.5 kleurstof-gedopeerde silica-nanodeeltjes

  1. Injecteer een 8 weken oude vrouwelijke donormuis (stam: C57Bl6J X129Sv) subcutaan met E2 (100 μL van 1 μg/mL in sesamolie) één keer dagelijks in de ochtend gedurende drie opeenvolgende dagen voor hormonale synchronisatie.
  2. Euthanaseer de donormuis door cervicale dislocatie 6 uur na de laatste E2-injectie en verwijder de baarmoeder.
  3. Snijd het baarmoederweefsel in ongeveer 1 mm3 fragmenten in een petrischaal met een scalpel30,36.
  4. Incubeer de baarmoederweefselfragmenten (45 mg) met 20% (v/v) Cy5.5 kleurstof-gedopeerde silica-nanodeeltjes in een 24-wells plaat met volledige RPMI-1640 medium (10% FBS) gedurende 3 uur bij 37 °C in 5%CO2.
  5. Verdoof de ontvangende muis (stam: C57Bl6J X129Sv) met 3% isofluraan in zuurstof en maak een incisie in de buik van 0,5 cm in het midden.
    OPMERKING: Plaats de muis in een inductiekamer met 3% isofluraan totdat er narcose is bereikt. Scheer de buik en breng de muis naar het operatieplatform. Plaats de neuskegel van het narcose voordat je met de operatie begint.
  6. Was de ex vivo-gelabelde baarmoederweefselfragmenten met een kweekmedium op kamertemperatuur door centrifugatie op 380 × g gedurende 2 minuten. Herhaal de wash 3 keer op.
  7. Onder narcose maakt u een 1 cm lange buikincisie in de ontvangende muizen. Suspendeer 45 mg Cy5.5-gelabelde weefselfragmenten in 500 μL PBS en injecteer de suspensie in de peritoneale holte met een naald van 20 gauge.
  8. Sluit het buikvlies met opneembare hechtingen en sluit de huid met wondclips. Plaats de muis in een warme omgeving en houd hem in de gaten tot hij herstelt is van de narcose.
  9. Euthanaser de muis door cervicale dislocatie op het geselecteerde experimentele eindpunt en verzamel de endometriotische laesies.

Resultaten

Met kleurstof gedoteerde silica-nanodeeltjes kunnen worden gebruikt als beeldvormingsprobes voor cellabelingtoepassingen. Cy5.5-gekleurde silica-nanodeeltjes (Cy5.5-SiNP's) werden in twee stappen gesynthetiseerd met behulp van een silica sol-gel-proces en gefunctionaliseerd met de fluorescerende cyaninekleurstof Cy5.5 met behulp van silaanchemie (Figuur 1). Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) onthulde uniforme bolvormige nanodeeltjes met diameters van 156,67 ± 15,23 nm (Figuur 1A). Dynamische lichtverstrooiing (DLS) toonde aan dat de gesynthetiseerde nanodeeltjes (SiNP's en Cy5,5-SiNP's) colloïdaal stabiel waren, met hydrodynamische diameters (Hd) van 130,67 ± 3,20 nm (PDI = 0,152 ± 0,009) en 185,9 ± 5,44 nm (PDI = 0,14 ± 0,009) respectievelijk (Figuur 1B). De zeta-potentiaal van kale SiNP's en Cy5,5-SiNP's waren respectievelijk −32,39 ± 3,55 mV en −50,53 ± 2,47 mV (Figuur 1C). Fotoluminescentiespectroscopie (excitatiegolflengte = 680 nm; emissiegolflengte = 710 nm) bevestigde de succesvolle opname van Cy5.5 in de silica-nanodeeltjes, en de Cy5.5-SiNP's vertoonden karakteristieke fluorescentie (Figuur 1D). Succesvolle kleurstofconjugatie werd verder bevestigd door het fotoluminescentiespectrum. Daarnaast was de kwantumopbrengst (QY) van de Cy5.5-SiNP's (φ = 0.31) vergelijkbaar met die van vrije Cy5.5-kleurstof (φ = 0.23)36.

Om de biocompatibiliteit van nanodeeltjes te evalueren, werden 12Z endometrial epitheelcellen 's nachts geïncubeerd met Cy5.5-SiNP's in DMEM bij 37 °C onder 5% CO₂. De levensvatbaarheid van cellen werd beoordeeld met een MTT-assay na behandeling met nanodeeltjesconcentraties van 0, 0,5, 1, 2,5, 5 en 10 μg/mL (Figuur 1E). Er werd geen cytotoxiciteit waargenomen bij concentraties tot 10 μg/mL. Cellen geïncubeerd met 5 μg/mL Cy5.5-SiNP's vertoonden een efficiënte opname van nanodeeltjes, waarbij fluorescentiemicroscopie deeltjeslokalisatie in het perinucleaire gebied aantoonde (Figuur 1F). Daarentegen werd geen Cy5.5-fluorescentie vastgesteld in onbehandelde controlecellen. De voorbereide Cy5.5-SiNP's toonden ook waterige stabiliteit, met hydrodynamische diameters variërend van 170–190 nm in gedeïoniseerd water en het behouden van een stabiele fluorescentieintensiteit gedurende zeven dagen, zoals bepaald door respectievelijk DLS en fluorescentiebeeldvorming (Figuur 1G, H).

Om de geschiktheid van Cy5.5-gedopeerde silica-nanodeeltjes voor ex vivo weefsellabeling vast te stellen, werden hun fluorescentie-eigenschappen gevalideerd vóór endometriose-inductie. IVIS-beeldvorming toonde robuuste fluorescentie-emissie van de nanodeeltjessuspensies, terwijl er geen detecteerbaar fluorescentiesignaal werd waargenomen in de negatieve controle die alleen water bevatte, wat de specificiteit en gevoeligheid van Cy5.5-fluorescentiedetectie bevestigde (Figuur 2).

De concentratie en incubatietijd voor ex vivo labeling van baarmoederweefselfragmenten werden vervolgens geoptimaliseerd. Fluorescentie werd gedetecteerd in baarmoederweefselfragmenten die 3 uur lang werden geïncubeerd met 20% (v/v) Cy5.5 kleurstof-gedopeerde silica-nanodeeltjes bij 37 °C onder 5%CO235. IVIS-beeldvorming bevestigde sterke en consistente fluorescentiesignalen van de gelabelde weefselfragmenten. Deze resultaten tonen aan dat Cy5.5-gekleurde silica-nanodeeltjes efficiënt baarmoederweefselfragmenten labelen zonder genetische modificatie (Figuur 3).

Het vermogen van Cy5.5-gekleurde silica-nanodeeltjes-gelabelde baarmoederweefselfragmenten om endometriose te induceren en de aanwijzing van laesie te vergemakkelijken werd vervolgens geëvalueerd35. Gelabelde weefselfragmenten werden in de peritoneale holte van ontvangende muizen geïnjecteerd en de ziekteprogressie werd een maand lang gevolgd. Aan het experimentele eindpunt werden endometriotische laesies gemakkelijk in de peritoneale holte geïdentificeerd. Cy5.5-positieve laesies werden duidelijk onderscheiden van het omliggende gastheerweefsel door IVIS-beeldvorming en fluorescentiemicroscopie, waardoor snelle en ondubbelzinnige laesieidentificatie mogelijk werd. Cy5.5-fluorescentie binnen de laesies werd verder bevestigd door fluorescentiemicroscopie.

Deze resultaten tonen aan dat ex vivo labeling met Cy5.5-kleurstof-gedopeerde silica-nanodeeltjes de succesvolle inductie van endometriose ondersteunt en de betrouwbare visualisatie van endometriotische laesies in vivo mogelijk maakt (Figuur 4).

figure-results-1
Figuur 1: Fysische karakterisering van Cy5.5 met kleurstof gedoteerde silica-nanodeeltjes (Cy5.5-SiNP's). (A) Representatieve transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) afbeelding van Cy5.5-SiNP's. Deeltjesdiameter = 156,67 ± 15,23 nm. Schaalbalk = 100 nm. (B) Dynamische lichtverstrooiing (DLS) metingen van de hydrodynamische diameters van SiNP's (130,67 ± 3,20 nm, PDI = 0,152 ± 0,009) en Cy5,5-SiNP's (185,9 ± 5,44 nm, PDI = 0,14 ± 0,009). (C) Zetapotentiaalmetingen van SiNP's (−32,39 ± 3,55 mV) en Cy5,5-SiNP's (−50,53 ± 2,47 mV), wat de afname van zetapotentiaal na Cy5.5-conjugatie aantoont. (D) Fluorescentieprofiel van Cy5,5-SiNP's (excitatiegolflengte = 680 nm; emissiegolflengte = 710 nm). Inset: Brightfield- en fluorescentiebeelden van Cy5.5-SiNP's verspreid in water. (E) MTT-cellevensvatbaarheidstest van 12Z-cellen behandeld met Cy5,5-SiNP's bij concentraties van 0, 0,5, 1, 2,5, 5 en 10 μg/mL. (F) Cellulaire opname van Cy5.5-SiNP's door 12Z-cellen. Cellen werden behandeld met PBS (controle) of Cy5.5-SiNP's. Blauw = DAPI; rood = Cy5.5-SiNP's. Schaalbalk = 200 μm. (G) Groottestabiliteit van Cy5.5-SiNP's die 7 dagen in water zijn opgeslagen, zonder significante verandering in hydrodynamische diameter. (H) Fluorescentiestabiliteit van Cy5.5-SiNP's die 7 dagen in water zijn opgeslagen, zonder significante verandering in fluorescentieintensiteit. Inset: Representatieve fluorescentiebeelden gemaakt op dag 1, 3 en 6. NS = niet significant. Waarden worden weergegeven als gemiddelde ± SD. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Bevestiging van Cy5.5 kleurstof-gedopeerde silica-nanodeeltjes. (A) Representatieve afbeelding van Cy5.5-kleurstof-gedopeerde silica-nanodeeltjes. (B) Detectie van Cy5.5-fluorescentie uit Cy5.5-gekleurde silica-nanodeeltjes met behulp van IVIS-beeldvorming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Ex vivo labeling van baarmoederweefselfragmenten met Cy5.5 met kleurstof gedoteerde silica-nanodeeltjes. Het linkerpaneel toont onbehandelde controle-baarmoederweefselfragmenten, en het rechterpaneel toont baarmoederweefselfragmenten gelabeld met Cy5.5-kleurstof-gedopeerde silica-nanodeeltjes. Cy5.5-fluorescentie werd gedetecteerd met behulp van IVIS-beeldvorming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Detectie van endometriotische laesies gelabeld met Cy5.5 kleurstof-gedopeerde silica-nanodeeltjes. (A) IVIS-afbeelding van de peritoneale holte. (B) Fluorescentiemicroscopie van Cy5.5-gelabelde endometriotische laesies maakt duidelijke identificatie binnen de peritoneale holte mogelijk. (C) Representatieve fluorescentiemicroscopiebeelden van endometriotische laesies. Gele fluorescentie duidt op het Cy5.5-signaal, en kernen werden tegengekleurd met DAPI. (D) Representatief beeld van een endometriotische laesion. De pijl geeft Cy5.5-gedoopeerde silica-nanodeeltjes aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

De huidige studie introduceert een Cy5.5-kleurstof-gedopeerde silica-nanodeeltjes-gebaseerde benadering als een praktische en efficiënte methode om endometriotische laesies in muismodellen te visualiseren35. Deze strategie biedt verschillende voordelen, waaronder eenvoud, flexibiliteit en niet-genetische aard, waardoor het niet nodig is om transgene verslaggeverdieren te genereren. In vergelijking met conventionele visualisatiemethoden, zoals fluorescerende reportermuismodellen, vermindert deze methode de technische complexiteit terwijl de efficiëntie van de etikettering robuust blijft, waardoor de toegankelijkheid voor endometrioseonderzoek wordt verbreed. Daarnaast bieden silica-nanodeeltjes een stabiel platform voor het opnemen van fluorescerende kleurstoffen en voor hun efficiënte retentie in het weefsel, waardoor reproduceerbare laesieidentificatie wordt ondersteund.

Het onderscheiden van endometriotische laesies van omringend gastheerweefsel is essentieel voor het bestuderen van ziekte-initiatief en progressie in muismodellen. Rosa26mTmG-meldermuizen expresseren alomtegenwoordig een membraangericht tandem-dimeer Tomatenfluorescerende eiwit (mT), dat wordt omgezet in membraangericht groen fluorescerende eiwit (mG) na Cre-gemedieerde excisie in specifieke doelweefsels37. Hoewel er talrijke transgene muismodellen beschikbaar zijn om genfunctie bij endometriose te onderzoeken, is het genereren van fluorescerende reporterdieren arbeidsintensief en tijdrovend. Daarentegen biedt ex vivo labeling met Cy5.5 met kleurstof gedoteerde silica-nanodeeltjes een snel, flexibel en niet-genetisch alternatief voor laesievisualisatie, terwijl het compatibel blijft met een breed scala aan bestaande muismodellen.

Succesvolle implementatie van dit protocol hangt af van zorgvuldige controle van verschillende kritieke experimentele parameters. Tijdens de synthese van nanodeeltjes beïnvloeden de concentratie van katalysatoren, de samenstelling van het oplosmiddel, de toevoegingssnelheid van TEOS, mengomstandigheden en wasefficiëntie direct de deeltjesgrootte, de intensiteit van de fluorescentie en de reproduceerbaarheid van labeling. De Stöber-methode biedt een eenvoudige, schaalbare en reproduceerbare methode voor het synthetiseren van fluorescerende silica-nanodeeltjes met precieze controle over de deeltjesgrootte en stabiele kleurstofopname 38,39,40,41. In vergelijking met reverse microemulsiemethoden minimaliseert de Stöber-benadering de zuiveringsuitdagingen geassocieerd met tensideer, terwijl Cy5.5-fluorescentie behouden blijft onder milde reactieomstandigheden 39,40,41,42. Het verhogen van de katalysatorconcentratie verhoogt doorgaans de deeltjesgrootte40, terwijl een snellere TEOS-toevoegingssnelheid nucleatie bevordert, wat resulteert in kleinere deeltjes41. Grondige wasbeurt is essentieel om niet-gereageerde reagentia te verwijderen en de stabiliteit van nanodeeltjes tijdens opslag te verbeteren.

Verschillende aanvullende factoren zijn belangrijk voor het bereiken van reproduceerbare ex vivo weefsellabeling en het vestigen van laesies. Uniforme grootte van het baarmoederweefselfragment, homogene nanodeeltjesverspreiding en consistente incubatiecondities verbeteren de labelingsefficiëntie en verminderen de experimentele variabiliteit. Het parallel verwerken van ongelabelde controleweefsels is ook essentieel om echte Cy5.5-fluorescentie te onderscheiden van weefselautofluorescentie en niet-specifieke achtergrondsignalen. Tijdens de inductie van de laesie minimaliseren consistente hormonale priming van donormuizen, zachte implantatie van gelabelde weefselfragmenten en passende postoperatieve zorg weefseltrauma en niet-specifieke ontstekingen, waardoor de reproduceerbaarheid van de vorming van de laesie verbetert.

Ondanks deze voordelen moeten er verschillende beperkingen worden overwogen. De persistentie en stabiliteit van het fluorescentiesignaal in vivo kunnen variëren na implantatie door weefselremodelering, cellulaire proliferatie en immuungemedieerde clearance. Als exogeen fluorescerend label wordt verwacht dat het Cy5.5-signaal geleidelijk afneemt naarmate gelabelde cellen zich delen, wat mogelijk de haalbaarheid van langetermijnstudies beperkt. Daarnaast kan variabiliteit in weefselvoorbereiding en opname van nanodeeltjes de labelingsefficiëntie tussen experimenten beïnvloeden, wat het belang van gestandaardiseerde experimentele procedures benadrukt.

Hoewel de huidige studie zich richt op ex vivo laesiedetectie, is Cy5.5 een ver-rood/nabij-infrarood (NIR) fluorescerende kleurstof die de autofluorescentie van weefsels minimaliseert en diepere penetratie van fotonen mogelijk maakt. Deze optische eigenschappen maken Cy5.5 zeer geschikt voor in vivo beeldvormingstoepassingen. Dienovereenkomstig biedt de high-quantum-yield Cy5.5 kleurstof-gedopeerde silica-nanodeeltjeslabelstrategie een robuust platform voor niet-invasieve longitudinale laesie tracking met behulp van NIR-fluorescentie en fotoakoestische beeldvorming43,44.

Toekomstige studies moeten zich richten op het verbeteren van de duurzaamheid van fluorescentie en het verder optimaliseren van labelconsistentie onder experimentele omstandigheden. Systematische evaluatie van signaalretentie zal helpen het optimale beeldvormingsvenster voor longitudinale studies te definiëren, terwijl voortdurende verfijning van nanodeeltjesontwerp- en labelcondities de gevoeligheid kan vergroten en de toepasbaarheid van deze aanpak op andere ziektemodellen kan vergroten. Al met al biedt deze op nanodeeltjes gebaseerde strategie een snel, reproduceerbaar en veelzijdig alternatief voor genetische labelingbenaderingen voor het visualiseren van endometriotische laesies en zou het mechanistische studies en de preklinische evaluatie van diagnostische en therapeutische strategieën moeten vergemakkelijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) (R01HD108895 aan T.K. en J.W.J.).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
(3-Aminopropyl)triethoxysilaan (APTES)Sigma-Aldrich440140Zuiverheid ≥99%
17β-EstradiolMilliporeSigmaE8875Zuiverheid ≥98%
AmmoniumhydroxideFisher ScientificA669S-50028% ammoniumhydroxide-oplossing
BD Autoclip WondsluitingssysteemBD427631Chirurgische wondclips
Duidelijk glazen schroefdraadviaalFisherbrandFS60910A-311,1 mL duidelijk glazen viaal
Cyanine 5.5 NHS-esterSigma-AldrichGEPA15502Nabij-infrarood fluorescerende kleurstof
Ethanol, absoluutFisher ScientificBP2818Molecuulbiologiekwaliteit
Foetaal bovien serum (FBS)Gibco16000044Celkweeksupplement
HogesnelheidscentrifugeBeckman Coulter Life SciencesAvanti J-EHogesnelheidscentrifuge
In vivo beeldvormingssysteemPerkinElmerIVIS SpectrumFluorescentiebeeldvormingssysteem
IsofluraanBaxterNDC1001-9-360-60Inhalatieanestheticum
MagneetroerbeurtjeFisherbrand14-513-648 mm
MagneetroerplakaatChelmsfordSP88854200Magneetroerplakaat met variabele snelheid
Gekoelde centrifugeEppendorf5427 RUitgerust met FA-45-48-11 rotor
RPMI-1640-mediumGibco11835-030Celkweekmedium
SesamzaadolieMilliporeSigmaS3547Drager voor estradiolbereiding
Tetraethylorthosilicaat (TEOS)Sigma-Aldrich86578Zuiverheid ≥99%
Triethylamine (TEA)Sigma-AldrichT0886Zuiverheid ≥99%
UltrasoonbadFisherbrandCPX1800HVoor dispersie van nanodeeltjes door sonicatie

Referenties

  1. Marquardt RM, Kim TH, Shin JH, Jeong JW. Progesterone and estrogen signaling in the endometrium: What goes wrong in endometriosis? Int J Mol Sci. 2019;20(15).
  2. Yilmaz BD, Bulun SE. Endometriosis and nuclear receptors. Hum Reprod Update. 2019;25(4):473–485.
  3. Kanzaki H, Wang HS, Kariya M, Mori T. Suppression of natural killer cell activity by sera from patients with endometriosis. Am J Obstet Gynecol. 1992;167(1):257–261.
  4. Oosterlynck DJ, Meuleman C, Waer M, Vandeputte M, et al. The natural killer activity of peritoneal fluid lymphocytes is decreased in women with endometriosis. Fertil Steril. 1992;58(2):290–295.
  5. Tanaka E, Sendo F, Kawagoe S, Hiroi M. Decreased natural killer cell activity in women with endometriosis. Gynecol Obstet Invest. 1992;34(1):27–30.
  6. Vigano P, Vercellini P, Di Blasio AM, Colombo A, et al. Deficient antiendometrium lymphocyte-mediated cytotoxicity in patients with endometriosis. Fertil Steril. 1991;56(5):894–899.
  7. Bulun SE. Endometriosis. N Engl J Med. 2009;360(3):268–279.
  8. Eskenazi B, Warner ML. Epidemiology of endometriosis. Obstet Gynecol Clin North Am. 1997;24(2):235–258.
  9. Johnson NP, Hummelshoj L, World Endometriosis Society Montpellier Consortium. Consensus on current management of endometriosis. Hum Reprod. 2013;28(6):1552–1568.
  10. Kim JJ, Kurita T, Bulun SE. Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis, uterine fibroids, and breast cancer. Endocr Rev. 2013;34(1):130–162.
  11. Burney RO, Giudice LC. Pathogenesis and pathophysiology of endometriosis. Fertil Steril. 2012;98(3):511–519.
  12. Fadhlaoui A, Bouquet de la Joliniere J, Feki A. Endometriosis and infertility: How and when to treat? Front Surg. 2014;1:24.
  13. D'Hooghe TM, Debrock S, Hill JA, Meuleman C. Endometriosis and subfertility: Is the relationship resolved? Semin Reprod Med. 2003;21(2):243–254.
  14. Simoens S, Hummelshoj L, D'Hooghe T. Endometriosis: Cost estimates and methodological perspective. Hum Reprod Update. 2007;13(4):395–404.
  15. Gao X, Outley J, Botteman M, Spalding J, et al. Economic burden of endometriosis. Fertil Steril. 2006;86(6):1561–1572.
  16. Brown J, Farquhar C. An overview of treatments for endometriosis. JAMA. 2015;313(3):296–297.
  17. Martin DC, Hubert GD, Vander Zwaag R, el-Zeky FA. Laparoscopic appearances of peritoneal endometriosis. Fertil Steril. 1989;51(1):63–67.
  18. Quesada J, Harma K, Reid S, Rao T, et al. Endometriosis: A multimodal imaging review. Eur J Radiol. 2023;158:110610.
  19. Culley L, Law C, Hudson N, Denny E, et al. The social and psychological impact of endometriosis on women's lives: A critical narrative review. Hum Reprod Update. 2013;19(6):625–639.
  20. Nnoaham KE, Hummelshoj L, Webster P, et al. Reprint of: Impact of endometriosis on quality of life and work productivity: A multicenter study across ten countries. Fertil Steril. 2019;112(4 Suppl 1):e137–e152.
  21. Herington JL, Bruner-Tran KL, Lucas JA, Osteen KG. Immune interactions in endometriosis. Expert Rev Clin Immunol. 2011;7(5):611–626.
  22. Malvezzi H, Marengo EB, Podgaec S, Piccinato CA. Endometriosis: Current challenges in modeling a multifactorial disease of unknown etiology. J Transl Med. 2020;18(1):311.
  23. Esfandiari F, Mansouri N, Shahhoseini M, Heidari Khoei H, et al. Endometriosis organoids: Prospects and challenges. Reprod Biomed Online. 2022;45(1):5–9.
  24. Lin YJ, Lai MD, Lei HY, Wing LY. Neutrophils and macrophages promote angiogenesis in the early stage of endometriosis in a mouse model. Endocrinology. 2006;147(3):1278–1286.
  25. Fang Z, Yang S, Lydon JP, DeMayo F, et al. Intact progesterone receptors are essential to counteract the proliferative effect of estradiol in a genetically engineered mouse model of endometriosis. Fertil Steril. 2004;82(3):673–678.
  26. Fang Z, Yang S, Gurates B, Tamura M, et al. Genetic or enzymatic disruption of aromatase inhibits the growth of ectopic uterine tissue. J Clin Endocrinol Metab. 2002;87(7):3460–3466.
  27. Foster WG, Ruka MP, Gareau P, Foster RA, et al. Morphologic characteristics of endometriosis in the mouse model: Application to toxicology. Can J Physiol Pharmacol. 1997;75(10–11):1188–1196.
  28. Cummings AM, Metcalf JL, Birnbaum L. Promotion of endometriosis by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in rats and mice: Time-dose dependence and species comparison. Toxicol Appl Pharmacol. 1996;138(1):131–139.
  29. Yoo JY, Kim TH, Shin JH, Marquardt RM, et al. Loss of MIG-6 results in endometrial progesterone resistance via ERBB2. Nat Commun. 2022;13(1):1101.
  30. Ow H, Larson DR, Srivastava M, Baird BA, et al. Bright and stable core-shell fluorescent silica nanoparticles. Nano Lett. 2005;5(1):113–117.
  31. Chung SJ, Hadrick K, Nafiujjaman M, Apu EH, et al. Targeted biodegradable near-infrared fluorescent nanoparticles for colorectal cancer imaging. ACS Appl Bio Mater. 2024;7(12):7861–7870.
  32. Pittet MJ, Swirski FK, Reynolds F, Josephson L, et al. Labeling of immune cells for in vivo imaging using magnetofluorescent nanoparticles. Nat Protoc. 2006;1(1):73–79.
  33. Nguyen TT, Nguyen HN, Nghiem THL, Do XH, et al. High biocompatible FITC-conjugated silica nanoparticles for cell labeling in both in vitro and in vivo models. Sci Rep. 2024;14(1):6969.
  34. Marquardt RM, Nafiujjaman M, Kim TH, Chung SJ, et al. A mouse model of endometriosis with nanoparticle labeling for in vivo photoacoustic imaging. Reprod Sci. 2022;29(10):2947–2959.
  35. Kim TH, Bae N, Kim T, Hsu AL, et al. Leptin stimulates endometriosis development in mouse models. Biomedicines. 2022;10(9).
  36. Bouteiller C, Clave G, Bernardin A, Chipon B, et al. Novel water-soluble near-infrared cyanine dyes: Synthesis, spectral properties, and use in the preparation of internally quenched fluorescent probes. Bioconjug Chem. 2007;18(4):1303–1317.
  37. Muzumdar MD, Tasic B, Miyamichi K, Li L, et al. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 2007;45(9):593–605.
  38. Stӧber W, Fink A, Bohn E. Controlled growth of monodisperse silica spheres in the micron size range. J Colloid Interface Sci. 1968;26(1):62–69.
  39. Thorat AV, Ghoshal T, Chen L, Holmes JD, et al. Synthesis and stability of IR-820 and FITC-doped silica nanoparticles. J Colloid Interface Sci. 2017;490:294–302.
  40. Silva AS, Santos JHZ. Silica particle size and polydispersity control from fundamental practical aspects of the Stöber method. Colloids Surf A Physicochem Eng Asp. 2024;702:135190.
  41. Saha A, et al. Greening the pathways: A comprehensive review of sustainable synthesis strategies for silica nanoparticles and their diverse applications. RSC Adv. 2024;14(16):11197-11216.
  42. Lian Y, Ding LJ, Zhang W, Zhang XA, et al. Synthesis of highly stable cyanine-dye-doped silica nanoparticles for biological applications. Methods Appl Fluoresc. 2018;6(3):034002.
  43. Kumar PPP, Chung SJ, Hadrick K, Hill ML, et al. Noninvasive detection and thermal ablation therapy of endometriosis using silica-coated gold nanorods. Adv Nanobiomed Res. 2025;5(12):2500101.
  44. Rahman MS, et al. Nanoceria as a non-steroidal anti-inflammatory drug for endometriosis theranostics. J Control Release. 2025;378:1015-1029.

Herprints en machtigingen

Tags

GeneeskundeEditie 234Editie 234Lege waardeEditieFITC-kleurstof-gedoteerde silica-nanodeeltjes

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.