Aantonen van fluorescerende peptidylremmer-targeting van mitochondriale ClpXP door fluorescentiemicroscopie in zoogdiercellen

Samenvatting

Dit protocol stelt een kwantitatieve beeldvormingsworkflow vast, waarbij confocale microscopie wordt toegepast om de selectieve lokalisatie van de fluorescerende peptidyl ClpP-remmer FAM-FAPAL-CMK (Carboxyfluorescein-FAPAL-chloromethylketon) in de mitochondriën te monitoren om ClpP te targeten, en de daaropvolgende morfologische veranderingen in mitochondriën in intacte cellen veroorzaakt door ClpP-remming.

Samenvatting

Mitochondriale ATP-afhankelijke proteasen zijn essentieel voor het behouden van de eiwithomeostase door afbraak van beschadigde of verkeerd gevouwen eiwitten. Hiervan bevindt het ClpXP-proteasecomplex zich in de mitochondriale matrix en draagt het bij aan de kwaliteitscontrole van mitochondriale omstandigheden onder fysiologische en stressomstandigheden. Dit werk demonstreert een kwantitatieve fluorescentiemicroscopieworkflow om mitochondriale targeting van de fluorescerende peptidylremmer FAM-FAPAL-CMK te beoordelen en mitochondriale morfologische veranderingen te evalueren die geassocieerd zijn met ClpXP-remming in zoogdiercellen. HeLa-cellen werden behandeld met FAM-FAPAL-CMK en geanalyseerd met confocale microscopie gecombineerd met immunofluorescentiekleuring van mitochondriale markers en kwantitatieve beeldanalyse. Colocalisatieanalyse met behulp van Costes-drempelwaarden en Manders' overlappingscoëfficiënten toonde mitochondriale verrijking van het inhibitorsignaal aan. Als gevolg hiervan veranderde remming van ClpP de mitochondriale morfologie. Immunoblotanalyse toonde geen significante verandering in ClpP-eiwitabundantie na remmerbehandeling. Gezamenlijk beschrijft dit werk een reproduceerbare, op beeldvorming gebaseerde workflow die het mogelijk maakt om mitochondriale ClpXP-functies in intacte cellen te onderzoeken als reactie op verstoringen van homeostase, zoals oxidatieve stress.

Inleiding

Mitochondriale ATP-afhankelijke proteasen zijn centraal voor eiwithomeostase en degraderen verkeerd gevouwen of beschadigde eiwitten 1,2,3,4,5,6. Hiervan is ClpXP een hetero-oligomeer AAA+ proteasecomplex dat zich bevindt in de mitochondriale matrix. De ClpX ATPase herkent en ontvouwt eiwitten, waarna ze transloceert naar de ClpP-proteolytische kamer ^7,8,9. Samen met andere mitochondriale proteasen handhaaft ClpXP de kwaliteitscontrole van eiwitten onder zowel normale als stressomstandigheden, waaronder oxidatieve stress en metabole verstoringen ^1,2,4. Verstoring van de homeostase van mitochondriale eiwitten is in verband gebracht met ziekten zoals neurodegeneratie en kanker, wat het belang onderstreept van het begrijpen van deze protease-activiteiten in intacte cellulaire systemen ^3,6,10.

Een grote uitdaging in het veld is het gebrek aan methoden om mitochondriale proteaseactiviteit direct met ruimtelijke resolutie in intacte cellen te monitoren. Bestaande benaderingen zijn voornamelijk gebaseerd op biochemische assays met gezuiverde eiwitten of cellysaten, die gedetailleerde kinetische informatie leveren maar de subcellulaire context niet behouden 11,12,13,14. Chemische biologische strategieën hebben deze beperking deels aangepakt door fluorogene peptidesubstraten en actief-plaatsgerichte remmers te ontwikkelen. Fluorescerende peptidylsubstraten maken kwantitatieve meting van ATP-afhankelijke peptidaseactiviteit mogelijk, terwijl peptidylremmers reversibele covalente interacties vormen met de proteolytische site om selectieve inhibitie te bereiken 13,15,16,17,18,19. Eerder is aangetoond dat de in het laboratorium gesynthetiseerde ClpXP-remmer FAPAL-CMK een covalente binding vormt met ClpP²⁰. In deze studie werd FAM-FAPAL-CMK, een fluoresceïne-gelabelde afgeleide van FAPAL-CMK, ontwikkeld als een mechanisme-gebaseerde remmer van ClpP, waardoor de intracellulaire lokalisatie mogelijk kon worden weergegeven.

In vergelijking met biochemische assays maakt confocale fluorescentiemicroscopie ruimtelijk opgeloste beoordeling van probe-distributie en mitochondriale morfologie in intacte cellen mogelijk, waarbij informatie wordt verkregen die niet alleen uit lysaten kan worden verkregen. In tegenstelling tot enzymatische assays meet fluorescentielokalisatie echter niet direct de katalytische activiteit of moleculaire bindingsgebeurtenissen en kan het worden beïnvloed door de opname-efficiëntie van de probe, mitochondriale dynamiek en beeldvormingsomstandigheden. Daarnaast is succesvolle implementatie afhankelijk van voldoende probeaccumulatie en voldoende opgeloste mitochondriale netwerken, waardoor deze workflow het meest geschikt is voor hechtende gekweekte cellen met duidelijk herkenbare mitochondriale morfologie.

Het doel van deze studie is het opzetten van een kwantitatieve workflow die mechanisme-gebaseerde fluorescentieprobes integreert met confococale microscopie om mitochondriale protease-lokalisatie en functie in intacte cellen te monitoren. Door selectieve chemische probes te combineren met hoogresolutie confocale beeldvorming, maakt deze workflow beoordeling mogelijk van mitochondriale lokalisatie, probeverdeling en morfologische responsen op verstoringen van mitochondriale homeostase in intacte cellen. Het kan de bestaande biochemische assays aanvullen die direct de proteaseactiviteit meten maar ruimtelijke resolutie missen.

Protocol

Experimenten werden uitgevoerd met commercieel verkrijgbare HeLa-cellen. Er werden geen menselijke deelnemers, gewervelde dieren of primaire biologische materialen gebruikt die afkomstig zijn van mensen of gewervelden. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Celkweek en behandeling

1. Kweek HeLa-cellen in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal rundereserum (FBS) bij 37 °C in een bevochtigde broedmachine met 5%_CO2.
2. Plaatcellen op steriele glazen dekfolies en 24 uur incuberen om celhechting mogelijk te maken.
3. Los de inhibitor FAM-FAPAL-CMK op in DMSO om een 50 μM-voorraad te bereiden en vries in bij -20 °C voor opslag.
4. Voeg 50 nM FAM-FAPAL-CMK toe aan het celgroeimedium in de behandelde celmonsters.
5. Voeg een gelijk volume DMSO toe aan controlemonsters die overeenkomen met de uiteindelijke oplosmiddelconcentratie van met de inhibitor behandelde monsters, zodat eventuele effecten niet door DMSO worden veroorzaakt.
6. Incubeer de cellen nog eens 18 uur onder dezelfde kweekomstandigheden voordat ze later worden verwerkt.
   Opmerking: DE FAM-FAPAL-CMK-remmer is in het laboratorium ontworpen en gesynthetiseerd, en de synthesemethode is eerder gerapporteerd²⁰.

2. Fixatie en permeabilisatie

1. Was de cellen 5 minuten met vooropgewarmde D-PBS en herhaal één keer.
2. Fixeer de cellen 15 minuten bij kamertemperatuur met behulp van een PHEM-buffer (68 mM PIJPEN, 25 mM HEPES, 15 mM EGTA, 3 mM MgCl₂, pH 6,9) die 2,4% (v/v) formaldehyde, 0,05% (v/v) glutaraldehyde en 0,5% (w/v) saponine bevat.
3. Maak verse natriumborhydrideoplossing (5 mg/mL in D-PBS).
4. Incubeer de cellen 15 minuten in de natriumborhydrideoplossing op kamertemperatuur om restglutaraldehyde te neutraliseren.
5. Spoel de cellen drie keer af met D-PBS gedurende 5 minuten elk voordat je begint te kleuren.
   OPMERKING: Formaldehyde en glutaraldehyde zijn giftige fixatieven. Voer fixatiestappen uit in de capuchon en draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (handschoenen, labjas en oogbescherming). Natriumborhydride is een reactief reducerend middel, en moet voorzichtig worden behandeld. De PHEM-gebaseerde fixatiebuffer met formaldehyde, glutaraldehyde en saponine werd geselecteerd om mitochondriale morfologie te behouden terwijl antigeentoegankelijkheid tijdens immunokleuring behouden blijft. Formaldehyde en glutaraldehyde zorgen voor eiwitkruisbinding voor structureel behoud, terwijl de buffersamenstelling en pH van PHEM helpen de mitochondriale ultrastructuur²¹ te stabiliseren. Saponin bevordert membraanpermeabilisatie om de fixatiesnelheid te verbeteren. Deze fixatiestrategie minimaliseert vervorming van mitochondriale netwerken en is bijzonder geschikt voor kwantitatieve analyse van mitochondriale morfologie.

3. Immunofluorescentiekleuring

1. Blokcellen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een blokkeringsbuffer die 3% (w/v) rundereserumalbumine (BSA) bevat in PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, pH 7,4) met 0,1% (v/v) Triton X-100.
2. Incubeer cellen met primaire antilichamen verdund in een blokkerende buffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Gebruik muis anti-TOMM20 (1:500) en konijn anti-ClpP (1:500).
3. Was cellen drie keer met PBS gedurende 5 minuten om ongebonden primaire antilichamen te verwijderen.
4. Incubeer cellen met secundaire antilichamen die verdund zijn in een blokkerende buffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Gebruik het secundaire antilichaam van CF405S (geconjugeerde muis) (1:500) en Alexa Fluor 647-geconjugeerd konijn secundair antilichaam (1:500).
5. Bescherm monsters tegen licht tijdens en na secundaire antistoffenincubatie.
6. Herhaal stap 3.3.
7. Bevestig coverslips op glazen slides met behulp van montagemedium.
   OPMERKING: ClpP en TOMM20 werden gevisualiseerd onder 405 nm en 647 nm om spectrale overlap met FAM-signalen te vermijden.

4. Beeldverwerving

1. Neem beelden met een confocale laserscanningmicroscoop uitgerust met een olie-immersie-objectief met een hoge numerieke opening.
2. Exciteer fluoroforen met 405 nm en 633 nm laserlijnen. Gebruik geschikte dichroïsche bundelsplitters om excitatielicht te reflecteren en uitgezonden fluorescentie naar de detectoren te geven.
3. Stel de pixelgrootte in op 35,3 nm (X, Y) en de Z-stap op 0,1 μm om voldoende axiale bemonstering van mitochondriale structuren te garanderen.
4. Neem beelden met een framegrootte van 1900 x 1900 pixels (X, Y) en verzamel 5 optische secties per Z-stack, beginnend bij het bovenste mitochondriale signaal en eindigend onder het mitochondriale signaal, om ervoor te zorgen dat het overheersende mitochondriale signaal wordt verzameld.
   OPMERKING: Vertegenwoordigende microscoop-verwervingsinstellingen zijn weergegeven in Aanvullende Figuur 1. Voor HeLa-cellen zijn mitochondriën typisch dunne buisvormige structuren, ongeveer 0,5-1 μm in diameter²². Dus een Z-volume van 0,5 μm is voldoende om een aanzienlijk deel van de individuele mitochondriale matrix te vangen, maar niet noodzakelijk de hele cel. Een Z-stack van 5 secties werd geselecteerd om voldoende bemonstering van mitochondriale structuren in balans te brengen met snelle beeldacquisitie, om bewegingsgerelateerde artefacten tijdens celbeeldvorming te minimaliseren.

5. Behandeling en beeldvorming van levende cellen

1. Kweek HeLa-cellen op 35 mm glazen bodemschalen in DMEM met 10% FBS bij 37 °C in een bevochtigde broedmachine met 5%_CO2.
2. Voeg een inhibitor (eindconcentratie: 50 nM) of een gelijk volume DMSO toe aan cellen 24 uur na het zaaien. Incubeer cellen nog eens 18 uur onder standaard kweekomstandigheden.
3. Verwijder kweekmedium met de remmer of DMSO en spoel de cellen één keer af met voorverwarmde D-PBS gedurende 5 minuten.
4. Voeg een live-cell imagingoplossing toe met 20 nM MitoTracker DeepRed.
5. Voer live-cell beeldvorming uit bij kamertemperatuur met dezelfde hierboven beschreven microscoopinstellingen. Maakt beelden in per-frame scanmodus met een geschatte 4,72 s per optisch gedeelte (ongeveer 24 s in totaal per 5-sectie Z-stack).
   OPMERKING: Vijf optische secties per Z-stack zijn ingesteld om voldoende bemonstering van mitochondriale structuren in balans te brengen met beheersbare verwervingstijden. Daarnaast wordt een live-cell imagingoplossing bij kamertemperatuur gebruikt om de mitochondriale motiliteit te verminderen in vergelijking met beeldvorming bij 37 °C. Hoewel mitochondriale beweging tijdens live-celbeeldvorming nog steeds kan bijdragen aan variabiliteit in colocalisatiemetingen, helpen consistente acquisitie-instellingen over alle monsters om systematische bias te verminderen. Representatieve software-instellingen zijn weergegeven in Aanvullende Figuur 2.

6. Mitochondriale morfologieanalyse

1. Open afbeeldingsbestanden in Fiji²³ en genereer maximale intensiteitsprojecties uit Z-stacks door Image → Stacks → Z-project te selecteren en Max Intensity te kiezen.
2. Pas de Otsu-drempelmethode toe door te navigeren naar Image → Adjust → Threshold en selecteer Otsu uit de drempelopties. Pas de drempel toe op segmentmitochondriën.
3. Voer de Mitochondria Analyzer-plugin²⁴ uit en selecteer per mito de 2D-analysemodus.
4. Meet de grootte (oppervlakte) en omtrek van de mitochondriale mitochondriale analyse met de output van de Mitochondria Analyzer.
5. Verkrijg de mitochondriale vormfactorwaarden rechtstreeks uit de mitochondriale analyzer-output, waarbij de vormfactor wordt berekend als P²/(4πA), waarbij P de omtrek en A het gebied vertegenwoordigt.
6. Meet de totale taklengte per mitochondrion met behulp van de netwerkanalysefunctie binnen de plugin om mitochondriale connectiviteit te beoordelen.
7. Presenteer de gegevens als verdelingen van individuele mitochondriale metingen, samen met gemiddelde waarden afkomstig van 30 cellen per conditie verspreid over drie onafhankelijke biologische replicata.
8. Evalueer de statistische significantie met behulp van Welch's t-test in een statistische analysesoftware.

7. Colocalisatieanalyse

1. Open afbeeldingsbestanden in Fiji en genereer maximale intensiteit 2D-projecties uit 3D-beeldstacks. Voor consistentie analyseer je alle monsters met dezelfde projectie- en acquisitiestrategie.
2. Splits fluorescentiekanalen door Beeld → Kleur → Split Channels te selecteren.
3. Start de Coloc 2-plugin door Plugins → Colocalization → Coloc 2 te selecteren.
4. Wijs de juiste kanalen toe voor analyse en schakel Costes-drempelregressie in in de plugin-instellingen. Voer de analyse per cel uit.
5. Noteer de overlappingscoëfficiënten van Manders (M1 en M2) om het signaalaandeel in elk kanaal te beoordelen dat ruimtelijk samenvalt met het andere.
6. Schakel Costes-randomisatie in in de Coloc 2-instellingen in en stel het aantal randomisaties in op 50 om de statistische significantie te beoordelen.

8. Cellysaatgeneratie

1. Zaai HeLa-cellen in DMEM met 10% FBS en incubeer bij 37 °C in een bevochtigde broedmachine met 5%_CO2.
2. Voeg 24 uur na het zaaien 50 nM-remmer of een gelijkwaardig volume DMSO toe aan de cellen en incubeer nog eens 18 uur onder standaard kweekomstandigheden.
3. Verwijder het kweekmedium en spoel de cellen 5 minuten af met voorverwarmde D-PBS, en try psiniseer om los te maken.
4. Knip trypsinisatie met vers celgroeimedium en centrifugeer op 300 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg.
5. Suspendeer de celpellet opnieuw in D-PBS en centrifugeer op 300 x g gedurende 3 minuten om cellen te wassen. Gooi het supernatant weg.
6. Sussief de celpellet opnieuw in een pre-gekoelde lysisbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM natriumchloride, 0,1% SDS, 0,5% natriumdeoxycholaat, 2% CHAPS, 10 mM TCEP, 1 mM PMSF, 1x proteaseremmer-cocktail).
7. Incubeer 20 minuten lysaten op ijs en sonicaat 2 minuten in een ijswaterbad om volledige lysis te garanderen.
8. Centrifugelysaten op 13.000 x g, 4 °C gedurende 20 minuten.
9. Breng het vrijgemaakte supernatant over naar een verse voorgekoelde buis voor analyse stroomafwaarts.
   OPMERKING: PMSF is giftig en moet worden behandeld in een dampkap met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. SDS is een irriterend middel en sonicatie genereert warmte en aerosolen. Voer lysis- en sonicatiestappen uit op ijs en volg de veiligheidsrichtlijnen van de instelling.

9. Bradford-assay

1. Bereid een set standaardoplossingen met BSA in 0,15 M natriumchloride. De concentraties zijn: 0, 0,02 mg/mL, 0,04 mg/mL, 0,06 mg/mL, 0,08 mg/mL, 0,10 mg/mL.
2. Verdun het onbekende cellysaat 50 en 100 keer in 0,15 M natriumchloride.
3. Pipet repliceert van elke standaardkromme-oplossing en onbekende monsters in een 96-wellplaat.
4. Voeg Bradford-reagens toe aan elke put. Voor elke put gebruik je een 160 μL eiwitoplossing met 40 μL 5x Bradford-reagens (commercieel verkrijgbaar). Meng voorzichtig door te pipetteren.
5. Incubeer de plaat op kamertemperatuur gedurende 10 minuten en meet de absorptie bij 595 nm met een plaatlezer.
6. Genereer een standaardcurve door BSA-concentraties op de x-as en de gemiddelde absorptie bij 595 nm uit replicate metingen op de y-as uit te zetten.
7. Bepaal de eiwitconcentraties van monsters met behulp van de standaardcurve. Vermenigvuldig berekende waarden met de verdunningsfactor om de oorspronkelijke concentratie te krijgen.

10. Immunoblotting

1. Laad gelijke hoeveelheden cellysaat op een 12% polyacrylamide gel en scheid eiwitten met SDS-PAGE.
2. Activeer het PVDF-membraan door het kort in ethanol te dompelen. Evenwicht zowel het membraan- als het detperpapier in de transferbuffer.
3. Eiwitten worden van de gel naar een PVDF-membraan overgebracht met behulp van een halfdroog transfersysteem.
4. Blokkeer het membraan in 5% (w/v) magere droge melk in TBS (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,6) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur met zachte roering.
5. Incubeer het membraan met het primaire antilichaam verdund in de blokkerende buffer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur met zachte roering. Gebruik konijn anti-ClpP (1:2000) en muis anti-beta-actine (ACTB, 1:10.000).
6. Was het membraan drie keer met TBST (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1% (v/v) Tween 20, pH 7,6) gedurende 5 minuten per was om het niet-gebonden antilichaam te verwijderen.
7. Incubeer het membraan met HRP-geconjugeerd secundair antilichaam, verdund in blokkerende buffer (1:3000) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur met zachte roering.
8. Herhaal de wasstap.
9. Detecteer eiwitbanden met behulp van chemiluminescente detectiereagentia.

11. Densitometrische analyse

1. Open de afbeelding van de Western blot in Fiji.
2. Verander het afbeeldingstype naar 8-bit door Image → type → 8-bit.
3. Trek de achtergrond van het beeld af met Proces → trek de achtergrond af. Controleer de lichtachtergrond en stel de rollende balstraal in op 50,0 pixels.
4. Omcirkel de band op de eerste baan met de rechthoektool, selecteer vervolgens 'analyseer → gel → selecteer de eerste baan.
5. Verplaats het rechthoekgereedschap naar de tweede baan en selecteer 'analyseer → gel → selecteer de volgende baan. Herhaal deze stap totdat alle rijstroken zijn geselecteerd.
6. Plot de banddichtheid door → gel te analyseren → lanes te plotten.
7. Gebruik het rechte lijngereedschap om een lijn te tekenen aan de onderkant van de banddichtheidspiek en gebruik het wandgereedschap om de banddichtheid af te lezen.
8. Herhaal dezelfde procedure uit stappen 11.1–11.8 op het loading control blot-beeld.
9. Rapporteer de relatieve banddichtheid door dichtheid (ClpP) te delen door dichtheid (ACTB).

Resultaten

ClpP-remming verandert mitochondriale morfologie en netwerkorganisatie
De mitochondriale morfologie werd beoordeeld om te bepalen of ClpP-remming de mitochondriale organisatie in HeLa-cellen verandert. Representatieve fluorescentiebeelden toonden duidelijke verschillen in mitochondriale organisatie tussen controlecellen en FAM-FAPAL-CMK-behandelde cellen (Figuur 1A). Kwantitatieve analyse toonde aan dat het mitochondriaal oppervlak afnam ...

Discussie

Het peptidylchloromethylketon FAPAL-CMK¹⁵ is eerder aangetoond een potentiële irreversibele remmer te zijn van de proteasesubunit (ClpP) van de mitochondriale ATP-afhankelijke protease ClpXP. Hoewel de kinetische experimenten de potentie en het werkingsmechanisme van de remmer aantoonden, kon de in vitro-benadering de effectiviteit van FAPAL-CMK als selectieve mitochondriale ClpP-remmer in intacte cellen niet evalueren. Fluorescentieconfocale microscopie ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Alexa Fluor 647-geconjugeerd konijn secundair antilichaam	Jackson Immuno Research	711-607-003
Beta Actin muis antilichaam	Proteintech	66009
runderserum albumine	Fisher bioreagents	BP1600
CHAPS	VWR	M127
ClpP konijn PolyAb	Proteintech	15698
cOmplete protease inhibitor cocktail	Roche	11697498001
D-PBS	Corning	21-031-CV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Corning	10-013-CV
Dylight405-geconjugeerd muis secundair antilichaam	Jackson Immuno Research	715-475-150
ECL Select Western Blotting Detection Reagent	Cytiva	RPN2235
EGTA	Calbiochem	4100
foetaal runderserum	R&D Systems	S11550
glutaaraldehyde, 70% oplossing	Polysciences, Inc	01201-2
GraphPad Prism	11.0.2 (100)
HEPES	Dot Scientific, Inc	DSH75030
HRP-geconjugeerd muis antilichaam	Cell Signaling Technology	7076S
HRP-geconjugeerd konijn antilichaam	Cell Signaling Technology	7074S
ImageJ/Fiji	2.16.0/1.54p
Live cell imaging oplossing	Gibco	A59688DJ
Magnesium Chloride Hexahydraat	Fisher	BP214
Mitochondria-Analyzer plugin voor Fiji	https://github.com/AhsenChaudhry/Mitochondria-Analyzer
MitoTracker DeepRed	Life Technologies	M22426
muis anti-TOMM20	Santa Cruz Biotechnology	SC17764
paraformaldehyde, 16% oplossing	Electron Microscopy Sciences	15710
PIPES	Dot Scientific, Inc	DSP40140
PMSF	RPI research products	P20270
Kaliumchloride	Alfa Aesar	11595
kaliumfosfaat monobasisch	VWR	BDH9268
ProLong montage medium	Invitrogen	P36930
Protein Assay Dye	Bio-Rad	5000006
saponine	Thermo Scientific	A18820.14
natriumboorhydride	Thermo Scientific	200050250
Natriumchloride	VWR	BDH9286
natriumdeoxycholaat	Sigma	D6750
Natriumdodecylsulfaat	VWR	0227
natriumfosfaat dibasisch	AMERSCO	0348
Softwarenaam	Versie-informatie
Tris	Dot Scientific, Inc	DST60040
Tris(2-carboxyethyl)fosfine hydrochloride (TCEP)	GOLD BIOTECHNOLOGY INC	TCEP-10
Triton X-100	Sigma	X100
Tween 20	VWR	0777
ZEISS Zen	2.3