Elastische vezelprofilering in longweefsel met behulp van kwantitatieve beeldvormingsanalyses

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol dat weefselvoorbereiding voor de visualisatie van elastische vezels en kwantitatieve profilering in muislongweefsel beschrijft. Deze methode maakt robuuste beoordeling mogelijk van weefselarchitectuur, ruimtelijke vezelorganisatie en extracellulaire matrixremodellering onder fysiologische en pathologische omstandigheden.

Samenvatting

Remodellering van de pulmonale extracellulaire matrix (ECM) is een belangrijk kenmerk van longschade en -ziekte. Elastische vezels zijn een centraal onderdeel van de long-ECM, bieden veerkracht en terugslag die nodig zijn voor een normale ademhalingsfunctie, en hun verstoring draagt bij aan een verstoorde weefselmechanica. Dit protocol beschrijft een robuuste, reproduceerbare workflow voor de voorbereiding en analyse van muislongweefsel, met een focus op de visualisatie en kwantitatieve profilering van elastische vezels. Het beschrijft geoptimaliseerde weefselverwerking en histologische kleuringsmethoden om elastinestructuren te behouden en te detecteren. Daarnaast beschrijft het protocol een beeldanalysepijplijn die kwantitatieve beoordeling van elastische vezeloverheid, organisatie en ruimtelijke verdeling binnen de long mogelijk maakt. De workflow bevat verder kleurvectorschatting in QuPath, kleurdeconvolutie in Fiji/ImageJ en op TWOMBLI gebaseerde beeldanalyse om kwantitatieve beoordeling van elastische vezelabundantie, vertakking en netwerkcomplexiteit mogelijk te maken. Strategieën voor beeldverwerving, het selecteren van interessegebieden, parameteroptimalisatie en kwaliteitscontrole zijn opgenomen om reproduceerbaarheid te waarborgen en gebruikersafhankelijke bias te minimaliseren. Met deze workflow hebben we met succes veranderingen in elastische vezelorganisatie en netwerkarchitectuur in de longen van obese muizen geïdentificeerd, waarmee we de toepasbaarheid voor het detecteren van ziektegerelateerde ECM-remodellering aantoonden. Samen bieden deze benaderingen een uitgebreid kader om elastische vezelremodellering en haar bijdrage aan weefselarchitectuur bij fysiologische en pathologische omstandigheden te onderzoeken. Deze methode vergemakkelijkt het bestuderen van door fibroblasten veroorzaakte structurele veranderingen en ondersteunt mechanistische inzichten in ECM-veranderingen die ten grondslag liggen aan longziekten.

Inleiding

Elastische vezels zijn essentiële componenten van de pulmonale extracellulaire matrix (ECM), voornamelijk bestaande uit elastine en bijbehorende microfibrillaire eiwitten die zich samenvoegen tot sterk georganiseerde, veerkrachtige netwerken¹. In de long zijn elastische vezels gerangschikt langs alveolaire septa en peribronchiale structuren, waar ze de elasticiteit en terugslag bieden die nodig zijn voor normale ademhalingsmechanica ^1,2. Als een van de meest voorkomende structurele ECM-componenten in weefsels zoals de long, aorta en baarmoeder, is de integriteit ervan cruciaal voor het behouden van weefselcompliantie ^1,2. Verstoring van de organisatie van elastische vezels is waargenomen bij een reeks longziekten, waaronder fibrose, emfyseem en chronische ontstekingsaandoeningen, waarbij veranderde vezelarchitectuur bijdraagt aan een verminderde longfunctie en mechanische eigenschappen ^2,3.

Het longmatrisoom is recentelijk gekarakteriseerd, waarbij kern-ECM-eiwitten zoals collageen en lamininen zijn onthuld, samen met matrisoom-geassocieerde componenten zoals cytokinen, ECM-regulatoren en ECM-geassocieerde eiwitten (bijv. integrineliganden, galectinen)^4,5. Naast het bieden van structurele ondersteuning reguleren deze componenten actief de weefselfunctie en vormen ze gespecialiseerde nissen die residente en migrerende cellen^{ondersteunen 6,7}. Recente studies hebben opvallend aangetoond dat metabole aandoeningen zoals obesitas geassocieerd zijn met significante veranderingen in de organisatie van elastische vezels, wat systemische metabole disregulatie koppelt aan veranderingen in de longarchitectuur van ECM en de functie van fibroblasten³. Deze bevindingen onderstrepen het belang van het begrijpen van elastische vezelremodellering als een dynamisch en ziekte-relevant proces.

Conventionele beoordeling van elastische vezels is vaak gebaseerd op kwalitatieve histologische evaluatie, semi-kwantitatieve scoresystemen of metingen van elastineabundantie, die beperkte informatie geven over fiberorganisatie, connectiviteit en netwerkcomplexiteit ^8,9. Hoewel deze benaderingen nuttig zijn om grove veranderingen in elastinegehalte te detecteren, kunnen ze subtiele architecturale veranderingen die samenhangen met weefselremodellering mogelijk niet vastleggen. Kwantitatieve beeldgebaseerde analyses hebben het potentieel om deze beperkingen te overwinnen door objectieve en reproduceerbare karakterisering van elastische vezelnetwerken mogelijk te maken en vergelijkingen tussen experimentele omstandigheden en studies te vergemakkelijken. Om dit aan te pakken, maakt het hier beschreven protocol een geïntegreerde analyse van de pulmonale ECM-organisatie mogelijk, met een specifieke focus op elastische vezelarchitectuur. Naast gevestigde benaderingen voor ^{ECM-karakterisering 4,5,} omvat deze workflow Elastica-kleuring en een TWOMBLI-gebaseerde^{10-beeldanalysepijplijn} geoptimaliseerd voor longweefselarchitectuur. Door Elastica-kleuring te combineren met kwantitatieve netwerkanalyse, gaat deze workflow verder dan conventionele histologische beoordeling en maakt het gedetailleerde karakterisering van vezelabundantie, fragmentatie, ruimtelijke organisatie en structurele complexiteit mogelijk. Het protocol is bijzonder geschikt voor studies naar fibrose, emfyseem, obesitas-geassocieerde longremodeling, ontstekingsziekten van de long, veroudering en andere aandoeningen die worden gekenmerkt door extracellulaire matrixremodellering in de long.

Protocol

Alle hier beschreven muizenexperimenten zijn uitgevoerd in overeenstemming met goedkeuring van de Animal Ethics Committee van de deelstaat Noordrijn-Westfalen, Duitsland (AZ: 81-04.04.2021.A221).

OPMERKING: Draag gedurende de procedure passende persoonlijke beschermingsmiddelen (labjas, handschoenen, oogbescherming).

1. Bemonstering en voorbereiding van muislongweefsel

OPMERKING: Muizen werden geëuthanaseerd door een isoflurane-overdosis volgens institutionele en overheidsrichtlijnen voorafgaand aan weefselverzameling.

1. Open voorzichtig de thoracale holte met een middenlijnincisie, snijd vervolgens het middenrif langs de aanhechting en leg voorzichtig de longen bloot.
2. Verwijder de hele long door de rechter- en linkerlobben samen te verwijderen, waarbij je erop let dat alle lobben intact blijven.
3. Plaats de longlobben afzonderlijk in een buis van 5 mL met 2 mL 10% neutrale gebuffreerde formaline en incubeer 15–20 uur bij 4 °C.
   OPMERKING: De fixatie bewaart de weefselarchitectuur voor latere histologische en elastische vezelanalyses. Omdat het primaire doel van deze workflow de visualisatie en kwantitatieve beoordeling van de organisatie van elastische vezels was in plaats van alveolaire morfometrische analyses, waren longen niet inflatiegefixeerd vóór weefselverwerking.
   VOORZICHTIG: Neutraal gebufferde formaline bevat formaldehyde, dat giftig en kankerverwekkend is en irritatie kan veroorzaken voor huid, ogen en ademhalings. Hanteer formaline in een gecertificeerde chemische dampkap terwijl je passende persoonlijke beschermingsmiddelen dragt, waaronder handschoenen, een labjas en veiligheidsbril.
4. Inbed het gefixeerde longweefsel in paraffine met behulp van een standaard histologisch inbeddingprotocol¹¹.
   OPMERKING: Zorg voor volledige uitdroging en paraffine-infiltratie om de weefselmorfologie te behouden voor latere kleuring. Om variabiliteit tussen monsters te minimaliseren en compatibiliteit te waarborgen tussen experimentele omstandigheden, wordt voor elke analyse altijd dezelfde longkwabben gebruikt. Het wordt aanbevolen om de linker kwab te gebruiken voor histologie.
5. Snijd FFPE-longweefsel in secties van 5–7 μm dik met behulp van een microtoom en monteer deze op standaard glazen glaasjes. Bak de dia's 1 uur op 60 °C voordat je doorgaat met downstream toepassingen. Dia's kunnen enkele weken bij RT in een stofvrije omgeving worden opgeslagen of bij 4 °C voor langdurige opslag.
   OPMERKING: Vermijd vochtblootstelling tijdens opslag, omdat vochtigheid parafineoxidatie kan veroorzaken en de kleurkwaliteit kan aantasten. Bewaar glaasjes in een afgesloten plastic glasdoos met droogmiddel als langdurige opslag nodig is.
   Pauzepunt: Bewaar de glaasjes op RT of 4 °C tot ze worden gekleurd.

2. Elastische vezelkleuring

1. Voer Elastica (resorcine-fuchsine) kleuring uit op 5–7 μm paraffine-ingebedde longweefselsecties om elastische vezels binnen de alveolaire en vaatstructuren te visualiseren.
   OPMERKING: Beits alleen zoveel glaasglaasjes als tegelijkertijd kunnen worden verwerkt om een consistente kleurintensiteit en reproduceerbaarheid over monsters te garanderen.
   1. Deparaffineer de glaasjes door ze twee keer gedurende 5 minuten in xyleen (gemengde isomeren) te dompelen.
      VOORZICHTIG: Xyleen is giftig en brandbaar. Hanteer het met een chemische dampkap en draag passende beschermingsmiddelen.
   2. Rehydrateer de slides in dalende ethanolseries tot 80% ethanol.
      1. Incubeer het glaasglaasje 3 minuten bij RT in een kleuringskamer gevuld met 100% ethanol.
      2. Zet de glaasglaap over in verse 100% ethanol en incubeer 3 minuten bij RT.
      3. Zet de glaasglaasje over naar 95% ethanol en incubeer 3 minuten bij de rest.
      4. Breng de glaasje over naar 80% ethanol en incubeer het 3 minuten bij RT.
   3. Breng het glaasje over in een nieuwe kleuringskamer met Resorcine-Fuchsine-oplossing en incubeer 20–30 minuten bij RT.
      OPMERKING: Resorcine-Fuchsin kleuringsoplossing kan meerdere keren worden gebruikt en is stabiel bij RT.
      WAARSCHUWING: Resorcine-fuchsine kleuroplossing bevat mogelijk gevaarlijke chemicaliën, waaronder geconcentreerde zuren en kleurstoffen, die huid- en oogirritatie kunnen veroorzaken. Behandel de oplossing in een goed geventileerde ruimte of met de dampkap en draag passende persoonlijke beschermingsmiddelen volgens de veiligheidsrichtlijnen van de instelling.
   4. Plaats de glaasglaap in een kleurkamer onder stromend gedestilleerd water en was het 1 minuut lang.
   5. Differentieer in 95–96% ethanol: 15–60 s, monitor onder de microscoop.
      OPMERKING: Stop wanneer elastische vezels diep paars-violet blijven en de achtergrond voldoende is verwijderd. Gekleurde elastische vezels lijken donkerpaars. Collageenvezels blijven ongekleurd en zien er meestal bleek uit. Overkleuring kan de achtergrond vergroten; Pas de incubatietijd aan afhankelijk van de weefseldikte en fixatie.
   6. Stop de differentiatie door de glaasglaasje direct over te brengen naar bidistilleerd water en 30 seconden te spoelen. Optioneel: Tegenkleuring kan worden uitgevoerd indien nodig voor extra longonderzoek, maar dit kan de efficiëntie van vezelsegmentatie verminderen. We raden aan H&E-kleuring uit te voeren om de long te evalueren op aangrenzende sneden.
   7. Dehydrateer de slides achtereenvolgens in 95% ethanol gedurende 1–2 minuten, gevolgd door 100% ethanol twee keer gedurende 1–2 minuten om restwater te verwijderen.
   8. Maak de secties 2 keer in xyleen schoon gedurende 3 minuten totdat het weefsel optisch transparant lijkt.
   9. Monteer coverslips met een xyleencompatibele permanente synthetische hars en laat slides plat drogen bij RT.
      OPMERKING: Volledige uitdroging en het verwijderen zijn essentieel om troebelheid te voorkomen en langdurig behoud van de gekleurde delen te waarborgen.
      Pauzepunt: Bewaar gekleurde monteerde dia's bij RT tot beeldvorming.

3. Elastische vezelbeeldvorming en netwerkanalyse

1. Beeldverwerving
   1. Maakt helderveldbeelden met hoge resolutie van longweefseldoorsneden met een dia-scanner met een 40× objectief. Zorg voor consistente belichting en witbalansinstellingen over alle samples.
      OPMERKING: Beelden werden gedurende het hele onderzoek met identieke scannerinstellingen gemaakt, waaronder vergroting, ruimtelijke resolutie (0,25 μm/pixel), belichting en belichting.
   2. Teken een interessegebied (ROI) dat het gehele longweefsel omvat om volledige dekking tijdens de scan te garanderen.
   3. Definieer een achtergrondreferentiegebied zonder weefsel om te meten en trek de achtergrondintensiteit af tijdens beeldanalyse.
   4. Gebruik de automatische scherpsteldetectie van de scanner om een optimaal aantal brandpunten over het weefsel toe te wijzen, zodat een uniforme scherpte en beeldkwaliteit worden gegarandeerd.
   5. Neem de afbeelding op met uniforme belichtings- en belichtingsinstellingen.
      OPMERKING: Als automatisch scherpstellen faalt in dichte of ongelijke gebieden, gebruik dan handmatige fijne scherpstelling om ervoor te zorgen dat alle weefselstructuren, inclusief alveolaire en vaatgebieden, scherp worden vastgelegd.
2. Beelddeconvolutie: schatting van kleurvectoren in QuPath¹². Kleurvectoren geven de specifieke RGB-absorptiewaarden van elke histologische kleurstof weer en maken het mogelijk om overlappende vlekken te scheiden tijdens kleurdeconvolutie.
   OPMERKING: In dit protocol werden kleuringsvectoren gedefinieerd in QuPath, aangezien vooraf gedefinieerde kleurvectoren voor resorcine-fuchsine niet beschikbaar zijn in Fiji.
   1. Open de afbeelding in QuPath en selecteer het brightfield-afbeeldingstype.
      OPMERKING: Om bias te minimaliseren, bereken je kleurvectoren met representatieve afbeeldingen uit de dataset en pas je dezelfde waarden toe op alle afbeeldingen.
   2. Teken een interessegebied (ROI) dat voornamelijk elastische vezels bevat om het eerste kleurcomponent te definiëren.
   3. Navigeer in het tabblad Afbeelding naar de Stain-vectorsecties.
   4. Klik op Kleuring 1 en stel vervolgens de kleurvector in vanuit ROI om de kleurvector voor elastische vezels (meestal paars-violet) te definiëren.
   5. Selecteer een ROI met niet-elastisch weefsel (bijv. achtergrond of collageen) en klik op beits 2, en stel vervolgens de kleurvector in vanuit de ROI om de secundaire kleurcomponent te definiëren.
   6. QuPath berekent automatisch Stain 3, overeenkomend met de achtergrond.
   7. Een voorbeeld voor vectoren berekend en toegepast in Fiji: Resorcine-Fuchsin R:0.6201225, G:0.6541292, B:0.43308553; Onspecifiek signaal R:0.31585205; G:0.815618; B:0.48477295; Achtergrond R:-0.105005614, G:-0.4780256, B:0.87204665.
      OPMERKING: Deze waarden zijn gekleurd voor afbeeldingen die alleen met resorcine-fuchsine zijn gekleurd. Als er een tegenkleuring aanwezig is, moeten nieuwe kleurvectoren worden berekend.
   8. Sla deze op als aangepaste kleurvectoren en pas ze toe voor consistente kleurdeconvolutie over alle monsters.
      OPMERKING: Het definiëren van aangepaste kleurvectoren uit representatieve regio's verbetert de nauwkeurigheid van kleurdeconvolutie, vooral bij resorcine-fuchsinekleuring, waar elastine- en achtergrondtinten per batch kunnen verschillen.
3. Afbeelding kleurdeconvolutie in Fiji^13,14.
   1. Open Fiji (ImageJ) en laad het brightfield-beeld van de gekleurde weefselsectie.
   2. Optioneel: Transformeer de afbeelding naar RGB-formaat (Afbeelding → Type → RGB Color) alleen als de afbeelding niet al in RGB is (bijvoorbeeld 8-bits afbeeldingen). Deze stap opent een nieuw afbeeldingsvenster; Sla het op om de originele ruwe data te behouden.
   3. Voer kleurdeconvolutie uit door Afbeelding > Kleur > Kleurdeconvolutie > Gebruikerswaarden te selecteren.
   4. Hier komt de aangepaste kleurvector die eerder van QuPath werd verkregen.
   5. Voer de plugin uit om drie afzonderlijke grijstintenbeelden te genereren die overeenkomen met elastische vezels, weefsel exclusief elastische vezels, en achtergrond.
   6. Gebruik afbeeldingen direct voor TWOMBLI zonder extra voorbewerking. TWOMBLI vereist scherpe beelden met voldoende resolutie; gladstrijken (bijvoorbeeld Gaussische waas) moet worden vermeden om structurele details te behouden.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de regio's die in QuPath zijn geselecteerd voor vectorschatting representatief zijn voor typische kleuring, aangezien deze aangepaste vectoren uniform worden toegepast op alle afbeeldingen voor consistente vergelijking.
   7. Bewaar het elastische vezelkanaal als een TIFF-bestand voor downstream kwantificering en analyse.
4. ROI-selectie voor vezelanalyse
   1. Voor elke longsectie selecteert u vijf onbevooroordeelde vierkante ROI's in het alveolaire gebied en vijf ROI's in het peribronchiolaire gebied (elk 100 μm x 100 μm).
   2. Dupliceer elke ROI op de ruwe afbeelding (afbeelding > duplicaat) om de originele data te behouden.
   3. Dupliceer dezelfde ROI's op de analyse van de gedeconvoluteerde elastische vezels.
   4. Sla alle gedupliceerde ROI's op als individuele TIFF-bestanden voor analyse later in de stroom.
      OPMERKING: Gebieden met weefselplooien, doorsnedingsartefacten, scheuren, grote bloedvaten of slecht bewaard gebleven alveolaire architectuur werden uitgesloten van de analyse. Alleen de gedeconvolveerde elastische vezel-ROI's werden gebruikt als input voor TWOMBLI-analyse, terwijl overeenkomstige ruwe beeldduplicaten als referentiebestanden voor kwaliteitscontrole en visuele inspectie werden behouden. Regio's van belang (ROI's) moeten worden geselecteerd met systematische willekeurige steekproef om een onbevooroordeelde representatie van het weefsel te waarborgen. Om operatorbias verder te minimaliseren, wordt een geautomatiseerd ROI-selectiescript dat compatibel is met QuPath verstrekt in Supplementary File 1 en Supplementary File 2, en de implementatie ervan wordt beschreven in Sectie 3.5.
5. Het toepassen van de geautomatiseerde ROI-selectie in QuPath met behulp van een geautomatiseerd ROI-selectiescript.
   1. Open de afbeelding in QuPath en stel het afbeeldingstype in op Brightfield.
   2. Selecteer in het menu Tools-formaat de gewenste annotatietool om de eerste annotaties te maken. Vierkante annotaties worden aanbevolen.
   3. Teken vierkante aantekeningen in het longweefsel. Elke annotatie mag slechts één regio van belang (ROI) omvatten voor analyse, hetzij een alveolair gebied of een peribronchiale zone.
   4. Zodra de annotaties zijn aangemaakt, navigeer je naar Annotaties en selecteer je Lock-annotaties om per ongeluk beweging of wijziging te voorkomen.
   5. Voeg de klassen "alveoli" en "peribronchiale gebied" toe aan de klassenlijst door op de knop "+" naast de klaslijst in het annotatiepaneel te klikken.
   6. Wijs elke annotatie toe aan de juiste klasse. Selecteer een annotatie, kies de bijbehorende klasse en klik op Set geselecteerd. De annotatiekleur verandert en de toegewezen klasse ("alveoli" of "peribronchiale gebied") wordt weergegeven in het annotatie-eigenschappenpaneel.
   7. Open het bijbehorende script en voer het uit. Na voltooiing zal een bericht aangeven dat de ROI's succesvol zijn gegenereerd. De nieuw aangemaakte ROI's verschijnen in de annotatiehiërarchie als kindannotaties van de oorspronkelijke klasse-definiërende annotatie.
   8. Om de ROI's te exporteren, selecteer je ze en navigeer je naar Bestand → Exporteren Afbeeldingen → originele pixels. Sla de geëxporteerde ROI's op als TIFF-bestanden.
      OPMERKING: De scripts zijn ontworpen om alleen de klassennamen "alveoli" en "peribronchiale gebied" te herkennen. Deze namen moeten precies worden ingevoerd zoals gespecificeerd. Standaard genereren de scripts willekeurig vijf niet-overlappende vierkante ROI's die binnen elke annotatie 100 μm × 100 μm meet. Kandidaat-ROI's worden alleen geaccepteerd als hun hoeken en centrum volledig binnen de annotatiegrenzen liggen, zodat volledige inclusie binnen het geselecteerde gebied wordt gegarandeerd. Zowel het aantal als de afmetingen van de ROI's kunnen binnen het script worden aangepast om aan specifieke experimentele eisen te voldoen. Voor analyses worden minstens drie biologische replicaten en minimaal vijf ROI's per monster aanbevolen.
6. TWOMBLI-analyse
   1. Sla alle ROI-afbeeldingen van elastische vezels op in een speciale map voor analyse.
   2. Maak twee submappen aan binnen de werkmap: a. Maskermap – voor binaire maskers gegenereerd door TWOMBLI. b. HDM-map – voor High-Density Matrix (HDM) afbeeldingen gegenereerd door TWOMBLI.
   3. Start de TWOMBLI-plugin: Open Fiji en start TWOMBLI (Plugins -> Macros -> Run).
   4. Selecteer het juiste analyseparameterbestand. De volgende TWOMBLI-parameters werden gebruikt voor de analyse van elastische vezels, vermeld in Tabel 1.
      OPMERKING: Deze parameters kunnen variëren afhankelijk van de intensiteit van de kleuring. Parameters werden empirisch geoptimaliseerd met behulp van meerdere representatieve beelden van longweefselsecties die onder gestandaardiseerde omstandigheden waren gekleurd. Optimalisatie werd uitgevoerd door de gegenereerde maskers te vergelijken met het oorspronkelijke kleuringpatroon en de instellingen te selecteren die de beste overlap boden tussen het gesegmenteerde masker en het onderliggende elastische vezelnetwerk. Eenmaal vastgesteld, werden dezelfde parameters toegepast op alle afbeeldingen binnen de dataset.
   5. Kies de optie "donkere vezels boven lichte achtergrond".
   6. Genereer en sla binaire maskers op in de Masker-map.
   7. Genereer en sla binaire afbeeldingen op in de HDM-map.
   8. Extraheren kwantitatieve netwerkparameters zoals vezellengte, vertakkingspunten, kromming, dichtheid en uitlijning.
      OPMERKING: TWOMBLI-analyse vereist scherpe, hoge resolutie beelden (>1 pixel/μm). Slechte kleurdeconvolutie, onscherpe gebieden of beeldcompressie kunnen de nauwkeurigheid van de kwantificering van glasvezelnetwerken aantasten.
7. Kwantificering en statistische analyse
   1. Exporteer TWOMBLI-netwerkparameters als een CSV-bestand.
   2. Importeer de ruwe CSV-gegevens in GraphPad Prism voor statistische analyse en visualisatie.
      OPMERKING: De volgende parameter wordt aanbevolen: Masker Totale Lengte, die het totale aantal elastische vezels binnen de ROI weerspiegelt, waardoor vezelabundantie en -verlies kunnen worden gekwantificeerd. Vezeleindpunten geven de mate van vezelfragmentatie aan; Een verhoogd aantal eindpunten wijst op verstoorde of gebroken vezels. Vezeltakpunten meten hoe onderling verbonden vezels zijn, wat de structurele complexiteit en integriteit van het ECM-netwerk weerspiegelt. Een hoger aantal vertakkingspunten duidt op een complexer en meer verweven netwerk. Lacuniteit kwantificeert de homogeniteit van vezelverdeling over de ROI. Lage lacuniteit duidt op een uniform netwerk met vergelijkbare gaps, terwijl hoge lacunariteit een heterogeen netwerk met variabele gapgroottes weerspiegelt die een complexere structuur beschrijven. Box Counting-Fractal Dimension vangt de complexiteit van de glasvezelarchitectuur weer. Hogere fractale dimensies duiden op meer ingewikkelde en gedetailleerde netwerken, terwijl lagere waarden eenvoudigere of verstoorde structuren weerspiegelen.
   3. Genereer kolomgrafieken die het gemiddelde ± SEM tonen voor elke gekwantificeerde netwerkparameter (bijv. vezellengte, vertakking, kromming en dichtheid).
   4. Testgegevensnormaliteit met behulp van de Shapiro-Wilk-test. Voor parametrische data pas je een tweezijdige, ongepaarde Student's t-test toe. Voor niet-parametrische data pas je een Mann-Whitney U-test toe. Voor vergelijkingen met meer dan twee experimentele groepen moet een eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) gevolgd door een geschikte post hoc meervoudige vergelijkingstest, of een Kruskal–Wallis-test voor niet-parametrische gegevens, worden toegepast.
      OPMERKING: Houd alle ruwe CSV-bestanden ongewijzigd om reproduceerbaarheid en traceerbaarheid van gegevens te waarborgen. Rapporteer het aantal ROI's en biologische replicaten dat voor elke aandoening is geanalyseerd in de figuurlegendes.

Resultaten

Dit protocol biedt kwantitatieve parameters van het elastische vezelnetwerk over verschillende longgebieden en experimentele omstandigheden. TWOMBLI-analyse, zoals eerder beschreven, levert parameters op zoals vezellengte, vertakkingsdichtheid, lacunariteit en fractale dimensie voor extracellulaire matrixbeoordeling¹⁰. Voortbouwend op dit kader maakt onze aanpak een uitgebreide karakterisering van de organisatie van elastische vezels mogelijk, waardoor veranderingen in vezelabundantie, connectiviteit, uniformiteit en structurele complexiteit in zowel fysiologische als pathologische longweefsels kunnen worden beoordeeld.

In gezond longweefsel vormen elastische vezels lange, continue en goed uitgelijnde netwerken langs de alveolaire septa en peribronchiale structuren. Daarentegen vertonen pathologische of metabolisch veranderde longen, zoals die van obese muizen, vaak een grotere vertakking en een grotere netwerkcomplexiteit, wat veranderingen in de organisatie van elastische vezels^{weerspiegelt 3}. Representatieve outputs, waaronder binaire maskers en kwantitatieve parameters, worden weergegeven in Figuur 1A, B. Deze output kan worden geïntegreerd met histologische en moleculaire analyses om de integriteit van ECM en de mate van^{remodellering te} beoordelen. Lacuniteit en het vullen van de opening worden geïllustreerd in gezond longweefsel om verschillen in ECM-organisatie te visualiseren (Figuur 1C). In combinatie met andere kwantitatieve metrics vangen deze parameters de netwerkcomplexiteit vast en onthullen ze veranderingen in weefselarchitectuur die worden gedreven door ECM-reorganisatie, wat inzicht geeft in verschillende patronen van structurele hermodellering binnen het elastische vezelnetwerk.

Nauwkeurige interpretatie van deze kwantitatieve output hangt in belangrijke mate af van hoogwaardige beeldacquisitie en -verwerking. Suboptimale beeldvormings- of verwerkingsomstandigheden, waaronder slechte scherpstelling, inconsistente verlichting of onnauwkeurige schatting van kleurvectoren, kunnen resulteren in gefragmenteerde of ruisachtige maskers en daardoor onbetrouwbare kwantitatieve uitkomsten (Figuur 1D). Daarom is zorgvuldige visuele inspectie van ruwe beelden en segmentatieresultaten essentieel om de datakwaliteit te waarborgen vóór interpretatie. Suboptimale maskers kunnen typisch worden herkend aan overmatige fragmentatie van continue vezels, discontinue of onvolledige segmentatie, opname van achtergrondruis als vezelstructuren, of slechte overlap tussen het oorspronkelijke kleurpatroon en het gegenereerde masker, wat aangeeft dat beeldverwerving, schatting van kleurvectoren of segmentatieparameters opnieuw moeten worden geëvalueerd. Om deze kenmerken te illustreren, werden secties met tegenkleuring bewust geanalyseerd, wat de identificatie van elastische vezels verstoort en resulteert in suboptimale segmentatie. Een voorbeeld van zo'n masker van lage kwaliteit is te zien in Figuur 1E. Om de robuustheid en reproduceerbaarheid van de workflow verder te beoordelen, werden beelddatasets onafhankelijk geanalyseerd door twee onderzoekers met dezelfde geoptimaliseerde analyseparameters (Figuur 2A). Daarnaast werden monsters afkomstig van onafhankelijke dieren opgenomen om de biologische variabiliteit te evalueren (Figuur 2B). Vergelijkbare kwantitatieve output werden verkregen over operatoren en biologische replicaten, wat de reproduceerbaarheid en gebruikersonafhankelijkheid van de voorgestelde beeldanalysepijplijn ondersteunt. Samen tonen deze analyses aan dat de workflow een robuuste beoordeling van elastische vezelorganisatie mogelijk maakt en vergelijkingen tussen fysiologische en pathologische aandoeningen vergemakkelijkt.

Figuur 1. Elastica Kleuringsanalyse-workflow. (A) Representatief ruwe beeld, geïsoleerd elastisch vezelsignaal verkregen door beelddeconvolutie, binair masker gegenereerd met TWOMBLI, en overlay van de oorspronkelijke elastische vezels met het bijbehorende masker, wat nauwkeurige segmentatie aantoont. (B) Representatieve kwantitatieve parameters gegenereerd door TWOMBLI-analyse. (C) Voorbeelden van lacuniteits- en gap-filling analyses in gezond muislongweefsel om verschillen in de organisatie van extracellulaire matrixen te illustreren. (D) Illustratie van gefragmenteerde en ruisachtige maskers als gevolg van suboptimale beeldverwerving of beeldverwerking. (E) Weefselsectie tegengekleurd met hematoxyline en eosine aantonend, wat een verminderde identificatie van elastische vezels en suboptimale maskervorming aantoont. Gebieden met een slechte overeenkomst tussen het oorspronkelijke kleuringspatroon en het gegenereerde masker zijn aangegeven. Schaal balk A, D = 100 μm, E = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Reproduceerbaarheid en robuustheid van de workflow voor elastische vezelanalyse. (A) Beelddatasets werden onafhankelijk geanalyseerd door twee onderzoekers met behulp van TWOMBLI-analyseparameters om de reproduceerbaarheid tussen operators te beoordelen. Kwantitatieve TWOMBLI-afgeleide metrics worden getoond. A en B geven de twee onafhankelijke operatoren aan. (B) Monsters afkomstig van onafhankelijke dieren werden geanalyseerd om de biologische variabiliteit te evalueren. Kwantitatieve TWOMBLI-afgeleide metrics worden getoond, die vergelijkbare output tonen over biologische replicaten en de robuustheid van de analysepijplijn ondersteunen. M1, M2 en M3 duiden op individuele gezonde dieren. n = 3, Statistische analyse werd uitgevoerd met eenrichtings-ANOVA gevolgd door Dunnetts meervoudige vergelijkingstest. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Parameters	Waarden
Contrastsaturatie	0.75
Minimale lijnbreedte	5
Maximale lijnwijdte	10
Minimun krommingsvenster	20
Maximum krommingsvenster	80
Minimun-taklengte	10
Maximun HDM-display	175
Minimun-gapdiameter	0

Tabel 1: Samenvatting van door TWOMBLI afgeleide kwantitatieve parameters. Overzicht van de parameters die door TWOMBLI zijn gegenereerd en hun interpretatie voor de beoordeling van de elastische vezelarchitectuur in longweefsel. Meetwaarden omvatten metingen van glasvezeloverfloddigheid, vertakkingen, uitlijning, connectiviteit en netwerkorganisatie.

Aanvullend Bestand 1: Onbevooroordeelde ROI-alveoli Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend Bestand 2: Onbevooroordeeld ROI peribronchiaal gebied Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Dit protocol biedt een robuuste, reproduceerbare workflow voor het onderzoeken van de musiene pulmonale extracellulaire matrix (ECM) architectuur, met bijzondere focus op fibroblast-gedreven elastische vezelremodellering. Elastische vezels zijn essentieel voor het behouden van longconformiteit en terugslag, en hun verstoring is kenmerkend voor meerdere longziekten, waaronder fibrose, longletsel, veroudering en stofwisselingsstoornissen². Ondanks hun centrale functionele rol is de kwantitatieve beoordeling van de organisatie en assemblage van elastische vezels beperkt gebleven. De workflow vult deze kloof aan door systematische en kwantitatieve karakterisering van de elastische vezelnetwerkarchitectuur mogelijk te maken.

Een belangrijke kracht van deze methode ligt in het integreren van een kwantitatieve beeldvormingsworkflow met structurele histologieanalyse. Hoewel conventionele benaderingen vaak de samenstelling van ECM of histologische kenmerken afzonderlijk beoordelen, maakt dit protocol objectieve kwantificering van elastische vezelorganisatie mogelijk, inclusief vezellengte, vertakking en netwerkcomplexiteit. Dit maakt directe vergelijking mogelijk tussen fysiologische en pathologische aandoeningen en biedt inzicht in fibroblast-gemedieerde ECM-remodellering³.

Er zijn echter verschillende technische aspecten cruciaal om experimentele consistentie en datakwaliteit te waarborgen. Resorcine-fuchsine kleuring is gevoelig voor variabelen zoals fixatietijd, doorsnededikte en consistentie van reagens, waardoor standaardisatie essentieel is voor reproduceerbaarheid. Kwantitatieve resultaten van TWOMBLI zijn afhankelijk van beeldkwaliteit, resolutie en consistente selectie van interessegebieden, en moeten daarom samen met histologische evaluatie worden geïnterpreteerd en gevalideerd over meerdere monsters. Daarnaast verschillen vezeldichtheid en morfologie tussen alveolaire en peribronchiale regio's, wat regio-specifieke optimalisatie vereist. Deze benadering vangt de wereldwijde organisatie van het elastische vezelnetwerk in twee dimensies en lost geen ultrastructurele kenmerken op, die hogere resolutietechnieken vereisen, zoals elektronenmicroscopie. Driedimensionale beeldvormingsmodaliteiten, waaronder confocale of multifotonmicroscopie, kunnen de analyse van vezelgeometrie en connectiviteit verder verbeteren.

Verschillende stappen binnen de workflow zijn bijzonder cruciaal om betrouwbare en reproduceerbare resultaten te garanderen. Weefselfixatie, doorsnedekwaliteit en consistente resorcine-fuchsinekleuring hebben een aanzienlijke invloed op de visualisatie van elastische vezels en moeten daarom zorgvuldig gestandaardiseerd worden.  Slechte kleurintensiteit, ongelijkmatige kleuring of hoge achtergrond kunnen het gevolg zijn van variabele reagenskwaliteit, inconsistente kleuringsomstandigheden of onvoldoende weefselconservering. Daarnaast wordt het opnemen van gezonde en zieke longweefsels, technische kleuringscontroles en referentiemonsters die over experimentele batches zijn verwerkt aanbevolen om de kleuringsconsistentie en analytische robuustheid te monitoren. Weefsels rijk aan elastische vezels kunnen verder dienen als positieve controles om beeldacquisitie- en segmentatieprocedures te valideren. Nauwkeurige schatting van kleurvectoren tijdens beelddeconvolutie is een andere essentiële stap, aangezien onjuiste vectorkeuze kan leiden tot onvolledige vezelextractie en gefragmenteerde maskers. Afhankelijk van de experimentele vraag kan de workflow worden aangepast door de ROI-grootte en -getal aan te passen, beeldverwerkingsparameters aan te passen of driedimensionale beeldvormingsmethoden te integreren om de organisatie van elastische vezels verder te onderzoeken.

Al met al biedt deze methode een veelzijdig platform om ECM-remodellering te bestuderen in zowel fysiologische als pathologische contexten. Omdat de integriteit van elastische vezels direct verbonden is met longcompliance en mechanische functie, is deze aanpak bijzonder belangrijk om te begrijpen hoe structurele veranderingen in de ECM zich vertalen in veranderingen in de longfunctie. Het is zeer geschikt voor het onderzoeken van door fibroblasten veroorzaakte structurele veranderingen en biedt nieuwe mogelijkheden om ECM-remodeling en de bijdrage ervan aan het ziekteverloop en weefselfunctie beter te begrijpen. De benadering kan ook worden uitgebreid naar andere weefsels, waaronder cardiovasculair weefsel, huid, baarmoeder, bindweefselaandoeningen, fibrotische organen en menselijke monsters, of gecombineerd met geavanceerde ruimtelijke en hoogresolutiebeeldvormingstechnieken om de toepasbaarheid verder te vergroten.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Axio CS2 Slide Scanner	Carl Zeiss
Coplin Glass Staining jar	Sigma-Aldrich	S6016
DPX Mountant	Sigma-Aldrich	6522
Ethanol (100%) for histology	Carl Roth	9065.4
Fiji		https://imagej.net/software/fiji/	version 1.54t
Formalin solution, neutral buffered 10%	Sigma	HT501128
HISTOSETTE I Tissue Processing/Embedding Cassettes	Sigma-Aldrich	H0542
microtome	Thermo Fischer Scietific	HM355S
Micrsocope Slides	VWR	631-0108
Mouse: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:000664	Strain #:000664
paraffin embedding system	Epredia HistoStar embedding module
Prism		https://www.graphpad.com	version 11
Qupath		https://qupath.github.io	version 0.7.0
Resorcin-Fuchsin	Waldeck	2.00E-30
TWOMBLI plugin		https://github.com/wershofe/TWOMBLI
Xylene	Applichem GmBH	14020172