Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Neonatale intracerebrale transplantatie voor microglia-vervanging en lijnanalyse in vivo

146 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/72119

⸱

28 juli 2026

 ,  , 
1Department of Human Genetics, University of Utah School of Medicine, 2Department of Pathology & Laboratory Medicine, Abramson Family Cancer Research Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol maakt efficiënte neonatale intracerebrale transplantatie van gedefinieerde microgliapopulaties mogelijk, wat robuuste langdurige engraftment en analyse van microglia-lijn en in vivo-integratie over meerdere donorbronnen en ontvangermodellen ondersteunt.

Samenvatting

Microgliavervanging via myeloïde celtransplantatie is uitgegroeid tot een veelbelovende experimentele benadering voor het bestuderen van neurologische processen en ziekten. Bestaande transplantatiestrategieën worden echter vaak beperkt door inefficiënte engraftment, afhankelijkheid van bestralingsgebaseerde conditionering of beperkte flexibiliteit tussen donor- en ontvangersystemen. Hier beschrijven we een neonataal intracerebrale transplantatieprotocol voor het introduceren van gezuiverde microgliapopulaties (Hoxb8 en niet-Hoxb8 microglia) in het zich ontwikkelende muizenbrein. Deze methode maakt efficiënte donorcel-enplantatie en integratie binnen het hersenparenchym mogelijk onder fysiologisch permissieve omstandigheden. Belangrijk is dat het protocol compatibel is met meerdere donorbronnen, waaronder embryonale hematopoëtische voorlopers en postnatale hersenafgeleide microglia, en kan worden toegepast op verschillende ontvangermodellen met verminderde of afwezige endogene microglia, waaronder conditionele Csf1r-deficiënte muizen en Csf1rΔFIRE-muizen . Donorcellen worden gezuiverd door fluorescentie-geactiveerde celsortering en biderzijdig afgeleverd in neonatale muizenhersenen met behulp van glazen micropipetten voor een efficiënte en minimaal invasieve toediening. Ontvangende muizen worden verouderd zodat donorcellen kunnen uitbreiden en de microglia-niche kunnen bevolken, en uitkomsten worden beoordeeld door histologische analyse van donorcelverdeling en markerexpressie. Deze aanpak biedt een robuust en schaalbaar platform voor het bestuderen van microglia-ontogenese en in vivo-integratie over diverse experimentele contexten.

Inleiding

Microgliavervanging door transplantatie van myeloïde cellen is uitgegroeid tot een krachtige strategie om microgliabiologie te onderzoeken en als een potentieel therapeutisch paradigma voor neurologische aandoeningen. In de afgelopen jaren is het vakgebied verder gegaan naar strategieën die in staat zijn om grootschalige microglia-vervanging in het centrale zenuwstelselte bevorderen. Recente studies hebben aangetoond dat donor-afgeleide macrofagen en voorlopers de hersenen kunnen inplanten, microglia-achtige transcriptieprogramma's kunnen aannemen en in sommige gevallen ziekte-geassocieerde fenotypes 2,3,4,5,6,7,8 kunnen verbeteren. Deze bevindingen ondersteunen het concept dat hersenmacrofagenvervanging kan worden ingezet om neurologische ziekteprocessen te bestuderen en mogelijk te wijzigen.

Een centrale uitdaging bij microgliatransplantatie is het bereiken van robuuste engraftmenten terwijl experimentele verwarringen worden geminimaliseerd. Veel gevestigde vervangingsstrategieën vertrouwen op bestraling, chemotherapie of microglia-depletieparadigma's om een engrafable nichete creëren 6,9,10,11,12,13. Ondanks hun effectiviteit kunnen deze methoden microglia-veroudering induceren, de bloed-hersenbarrière verstoren en ontstekingssignalen veranderen, wat allemaal de interpretatie van donorcelgedrag kan bemoeilijken 9,14. Meer recent onderzoek is begonnen met het onderzoeken van conditioner-onafhankelijke of verminderde toxiciteitsbenaderingen voor microgliavervanging 5,8,15.

Ontwikkelingstiming is een belangrijke factor voor het succes van transplantatie. De neonatale hersenen bieden een permissieve omgeving die de uitbreiding en langdurige integratie van donorcellen ondersteunt, waarschijnlijk door verminderde structurele barrières en voortdurende vestiging van de endogene microglia-niche. Recente transplantatiestudies met vroege postnatale bevalling (P0–P5) tonen robuuste parenchymale engraftment en het verwerven van microglia-achtige identiteit aan, wat het belang van ontwikkelingscontext voor efficiënte vervanging benadrukt 7,8,16,17.

Hoxb8-microglia bieden een bijzonder informatief systeem voor het bestuderen van lijnspecifieke bijdragen aan de microgliabiologie. Deze cellen ontstaan uit embryonale hematopoëtische voorlopers en vormen een gedefinieerde subset van parenchymale microglia met gedragsconsequenties wanneerdisfunctioneel 17,18,19,20,21. Recent werk met primaire Hoxb8-voorlopers en microglia- en oestrogeenreceptor (ER)-Hoxb8-voorlopersystemen toont aan dat deze cellen kunnen worden uitgebreid, genetisch gemanipuleerd en succesvol in de hersenen kunnen worden geïntegreerd, waar ze microglia-achtige transcriptieprofielen en functionele kenmerken aannemen 7,8,17. Deze vooruitgang benadrukt verder het nut van transplantatiemethoden voor het ontleden van microglia-lijn en heterogeniteit.

Hier beschrijven we een neonataal intracerebraal transplantatieplatform dat geoptimaliseerd is voor veelzijdigheid tussen donor- en ontvangersystemen. In tegenstelling tot benaderingen die afhankelijk zijn van bestraling of systemische conditionering, gebruikt deze methode directe bilaterale intracerebrale levering aan neonatale muizen, waardoor donorcelen in een ontwikkelingspermissieve hersenomgeving kunnen plaatst en systemische verstoring wordt geminimaliseerd. De techniek is compatibel met meerdere donorbronnen, waaronder embryonale hematopoëtische voorlopers en postnatale hersenafgeleide microglia, en kan worden toegepast op verschillende ontvangermodellen met verminderde of afwezige endogene microglia. Een groot praktisch voordeel is dat de dunne neonatale schedel snelle handmatige injectie met glazen micropipetten mogelijk maakt, waardoor boren of stereotaxische fixatie niet nodig is en toch brede parenchymale engraftment wordt bereikt.

Samen biedt deze aanpak een robuust, flexibel en schaalbaar systeem voor het bestuderen van microglia-ontogene, heterogeniteit en in vivo-integratie in diverse experimentele contexten. Dit positioneert neonatale intracerebrale transplantatie als een complementair en experimenteel gecontroleerd alternatief voor systemische microglia-vervangingsstrategieën.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle methoden en experimenten in deze studie zijn uitgevoerd op muizen. Experimentele procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de University of Utah, Public Health Service Assurance #D16-00018 (A3031-01).

1. Bereiding van fokparen voor donor- en ontvangende nestjes

  1. Plaats fokparen in dezelfde kooi in dezelfde kooi om getimede paringen te starten.
  2. Controleer elke ochtend vrouwtjes op de aanwezigheid van een vaginale plug om een succesvolle paring te bevestigen.
  3. Verwijder verstopte vrouwtjes van mannetjes en huisvest ze individueel tot de bevalling, die ongeveer 18–20 dagen duurt.
  4. Behandel zwangere moeders voorzichtig gedurende 5 minuten per dag, 7–10 dagen voor de geboorte, om stress te verminderen die gepaard gaat met het omgaan met neonatale dieren.
  5. Blootstel moedertjes tijdens de dagelijkse behandelingen aan een wattenstaafje met betadine-geur, om de stress van de moeder te verminderen wanneer de pups na de operatie worden teruggebracht.
  6. Maak schone kooien klaar met broedmateriaal voor zwangere vrouwtjes vóór de verwachte bevalling.

2. Het oogsten en verwerken van neonatale hersenen

  1. Euthanaser neonatale donormuizen (P0–P4) door isoflurane-overdosis met behulp van een bell jar of een vergelijkbare afgesloten kamer met een valse vloer om direct contact met het anestheticum te voorkomen.
  2. Zodra de ademhaling stopt en het ontbreken van reflexen is bevestigd, onthoofd je onmiddellijk.
  3. Oogst de hele hersenen, inclusief het cerebellum en de reukbollen. Plaats de hersenen in 3 mL koude 1× Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) in een plastic Petrischaal op ijs.
  4. Met steriele scalpels en pincetten snijd je de hersenen in ongeveer 1–2 mm grotestukjes van 3 stukken.
  5. Breng het gemalen hersenweefsel (1 hersenen per weefseldissociatiebuis) over in weefseldissociatiebuizen met enzymatische verteringsreagentia die volgens het door de fabrikant aanbevolen protocol worden geleverd met het neurale weefseldissociatiesysteem.
  6. Plaats de buizen in een mechanisch dissociatieapparaat met verwarmingscapaciteit en incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten met het door de fabrikant aanbevolen neurale weefseldissociatieprogramma.
  7. Pre-soak 70 μm celfilters met 400 μL van 1× HBSS.
  8. Voer het gedissocieerde weefsel door de voorgeweekte zeven die over een 50 mL kegelvormige buis op ijs worden geplaatst.
  9. Was de buizen met 10 mL 1× HBSS en laat ze door filters om maximale celherstel te garanderen.
  10. Verwijder filters en spin cellen op 300 × g voor 10 minuten bij kamertemperatuur. Aspireer het supernatant.
  11. Sussen de cellen opnieuw in 1 mL rode bloedcel se lysebuffer in steriel ultrazuiver water per monster en incubeer 10 minuten bij 4 °C.
  12. Blus de lysereactie met 10 mL van 1× HBSS/1% BSA/5% FBS.
  13. Verwijder filters en spin cellen op 300 × g voor 10 minuten bij 4 °C. Aspireer het supernatant.
  14. Bepaal celnummers met behulp van een hemocytometer. Het typische bereik van celopbrengst is 3,2–4,0 × 10,6 vóór sortering.
  15. Cellen resuspendeer in 5% FBS in 1× HBSS bij de gewenste concentratie voor downstream antistofkleuring.

3. Celantilichaamkleuring voor FACS-sortering van microgliapopulaties

  1. Suspensieer cellen in 1 mL kleuringsbuffer (5% FBS in 1× HBSS) met een Fc-receptorblokkerende antistof (gezuiverde CD16/32, 1:2000) en incubeer cellen gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  2. Spin cellen naar 240 × g voor 3 minuten bij 4 °C. Aspireer het supernatant.
  3. Incubeer cellen met fluorescerend geconjugeerde antilichamen (CD45 APC, 1:160; CD11b Alex Fluor 700, 1:160) in 1 mL kleuringsbuffer voor 30 minuten op ijs in het donker.
  4. Spin cellen naar 240 × g voor 3 minuten bij 4 °C. Aspireer het supernatant.
  5. Voeg een levensvatbaarheidskleurstof toe (bijv. 3 μM DAPI in 1× HBSS) om dode cellen uit te sluiten.
  6. Voer FACS-sortering uit met een hogesnelheidscelsorter uitgerust met geschikte lasers voor DAPI, GFP, tdTomato, CD45-APC en CD11b-Alexa Fluor 700 detectie.
  7. Gebruik waar mogelijk een 100 μm nozzle met lage manteldruk om de cellevensvatbaarheid te maximaliseren. Houd de monsterafnamebuizen en gesorteerde cellen gedurende de hele procedure op ijs.
  8. Gebruik ongekleurde cellen, eenkleurige compensatieregelaars en fluorescentie-minus-één regelaars wanneer nodig om spanningen, compensatie en poorten in te stellen.
  9. Poort eerst cellen op voorwaartse verstrooiingsgebied versus zijdelings verstrooiingsgebied om puin uit te sluiten.
  10. Gate singlets met zijdelingse verstrooiingshoogte versus zijverspreidingsbreedte.
  11. Sluit dode cellen uit door DAPI⁻-cellen te gateen.
  12. Vanaf live singlets, gate on CD45lage CD11b⁺ microglia.
  13. Binnen deCD45 lage CD11b⁺ microgliapoort gebruik je GFP en tdTomato-fluorescentie om donor-microgliapopulaties te scheiden (Hoxb8 microglia: DAPI⁻ CD45lage CD11b⁺ tdTomato⁺ GFP⁺, non-Hoxb8 microglia: DAPI⁻ CD45lage CD11b⁺ tdTomato⁻ GFP⁺).
  14. Sorteer elke populatie in steriele verzamelbuizen met koude 1x HBSS.
  15. Na sortering analyseer je opnieuw een kleine aliquot van gesorteerde cellen om zuiverheid en levensvatbaarheid vóór transplantatie te bevestigen.
  16. Verzamel gesorteerde cellen in steriel 1× HBSS en houd ze in het donker op ijs tot transplantatie.
    OPMERKING: Typische opbrengsten voor Hoxb8-microglia variëren van 3,70–4,60 x 104-cellen en niet-Hoxb8-microglia 1,10–1,14 x 105 cellen per neonatale hersenen (P0–P4), hoewel de opbrengsten kunnen variëren afhankelijk van leeftijd, genotype en weefselverwerkingsefficiëntie. Transplanteer gezuiverde levende cellen zo snel mogelijk, idealiter binnen 60 minuten na celsortering.

4. Het oogsten en verwerken van foetale leverhematopoëtische voorlopers

  1. Euthanaseer zwangere dammen met 5% isoflurane toegediend in zuurstof via een precisieverdamper totdat de ademhaling stopt en het ontbreken van reflexen wordt bevestigd.
  2. Na een isoflurane-overdosis voer je een secundaire fysieke methode uit door cervicale ontwrichting te voorkomen om overlijden te voorkomen, in overeenstemming met de richtlijnen voor inrichting voor dierenzorg en gebruik.
  3. Verwijder de baarmoederhoorns van de zwangere muizen en plaats ze in een koude 3 ml van 1× HBSS in plastic petrischaaltjes (60 mm × 15 mm).
  4. Ontleed E12.5-embryo's uit de baarmoeder en plaats ze in vers koude 3 ml van 1× HBSS in plastic petrischalen.
  5. Ontleed foetale levers met fijne pincetten en plaats ze in verse 3 ml koude 1× HBSS met 5% FBS in Petrischalen.
  6. Mechanisch dissocieer gepoold foetaal leverweefsel met een 26 G naald en een 3 mL spuit.
  7. Spin cellen naar beneden bij 240 × g voor 5 minuten bij 4 °C. Aspireer het supernatant.
  8. Was cellen met 1× HBSS.
  9. Voer de celsuspensie door een 80 μm celfilter.
  10. Incubeer cellen in 20 μL rode bloedcel lysebuffer (0,15 M ammoniumchloride, 1 mM KHCO3) gedurende 5 minuten, gevolgd door het toevoegen van 13 mL 1× HBSS voor het afkoelen.
  11. Ga 5 minuten door met incubatie om rode bloedcellen te lyseren.
  12. Spin cellen naar beneden bij 200 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.

5. Celantistofkleuring voor FACS-sortering van hematopoëtische voorlopercellen

  1. Incubeer foetale levercellen met fluorescentie-geconjugeerde antilichamen (Ter119 PerCP-Cy5.5, 1:50; Kit PE-Cy7, 1:100) in 5% FBS/1% BSA in 1× HBSS voor 30 minuten op ijs in het donker.
  2. Was cellen met 1× HBSS en draai het op 240 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  3. Voeg een levensvatbaarheidskleurstof toe (bijv. 3 μM DAPI in 1× HBSS) om dode cellen uit te sluiten.
  4. Voer FACS-sortering uit met behulp van een hogesnelheidscelsorteraar uitgerust met geschikte lasers en filters voor DAPI, Ter119 PerCP-Cy5.5, Kit PE-Cy7, tdTomato en GFP-detectie.
  5. Gebruik waar mogelijk een 100 μm nozzle met lage manteldruk om de cellevensvatbaarheid te maximaliseren. Houd de monsterafnamebuizen en gesorteerde cellen gedurende de hele procedure op ijs.
  6. Gebruik ongekleurde cellen, eenkleurige compensatieregelaars en fluorescentie-minus-één regelaars wanneer nodig om spanningen, compensatie en poorten in te stellen.
  7. Eerst poortcellen die voorste verstrooiingsgebied versus zijdelings verstrooiingsgebied gebruiken om puin uit te sluiten.
  8. Gate-singlets gebruiken voorwaartse verstrooiingshoogte versus voorwaartse verstrooiingsbreedte, gevolgd door zijverstrooiingshoogte versus zijverstrooiingsbreedte.
  9. Sluit dode cellen uit door DAPI⁻-cellen te gateen.
  10. Uit levende singlets worden erythroïde lijncellen uitgesloten door Ter119⁻-cellen te gateen.
  11. Binnen de Ter119⁻-populatie, gate onKit hoge hematopoëtische voorlopercellen.
  12. Binnen deDAPI ⁻ Ter119⁻ Kit hoge populatie, isoleer Hoxb8-lijn-positieve voorlopers door te gaten op tdTomato⁺-cellen.
  13. Als de donorlijn ook de Cx3cr1-GFP-reporter draagt, gebruik dan GFP-fluorescentie om te bevestigen dat de gesorteerde foetale levervoorloperpopulatie op dit stadium GFP⁻ of GFP-laag is, waarmee voorlopercellen worden onderscheiden van gedifferentieerde Cx3cr1-expressieve myeloïde cellen.
  14. Sorteer de uiteindelijke DAPI⁻ Ter119⁻ Kithigh tdTomato⁺ GFP-populatie in steriele verzamelbuizen met koude 1× HBSS.
  15. Na sortering analyseer je opnieuw een kleine aliquot van gesorteerde cellen om zuiverheid en levensvatbaarheid vóór transplantatie te bevestigen.
  16. Verzamel gesorteerde cellen in steriel 1× HBSS en houd ze in het donker op ijs tot transplantatie.
    OPMERKING: Typische opbrengsten variëren van ongeveer 5,0–7,0 × 104 Hoxb8 hematopoëtische voorlopers per E12.5 foetale leverpreparat, afhankelijk van embryogrootte en sorteerefficiëntie. Transplanteer gezuiverde levende cellen zo snel mogelijk, bij voorkeur binnen 60 minuten na sortering.

6. Bereiding van injectienaalden

  1. Laad borosilicaatglas-kapillairen (1,0 mm buitendiameter, 0,58 mm binnendiameter, met filament) in een micropipettrekker.
  2. Trek haarvaten met een tweelijns trekprogramma dat geoptimaliseerd is om lange, taps toelopende naalden te genereren die geschikt zijn voor neonatale intracerebrale transplantatie.
    1. Typische instellingen zijn: Warmte = 645, Trek = 30, Snelheid = 120, Vertraging = UIT en Druk = 200. Optimaliseer de uiteindelijke instellingen voor het specifieke glastype, omgevingsomstandigheden en de kalibratie van de trekker. Vervolgens trim je de resulterende naalden en schuin je ze om een uiteindelijke buitenste tipdiameter van ongeveer 30 μm te krijgen.
  3. Plaats de getrokken naalden op twee stroken plamuur in een grote plastic Petrischaal om de punten te beschermen tegen beschadiging voordat je ze afsnijdt en afschuint.
  4. Plaats de getrokken naald onder een dissectie-stereomicroscoop met ongeveer 10×–20× vergroting en ondersteun deze met een zachte brace.
    OPMERKING: Een hogere vergroting (20×–40×) kan worden gebruikt tijdens tipinspectie om de juiste tapervorming te controleren en eventuele defecten te identificeren vóór het trimmen en afschuiven.
  5. Gebruik een steriel scheermesje om de naaldpunt af te knippen en zo een buitendiameter van ongeveer 30 μm te verkrijgen.
  6. Bevestig de getrimde naald in een microgrinderhouder.
  7. Stel de afschuiningshoek aan op 30°–35°.
  8. Zet de molen en verlichting aan.
  9. Laat gedestilleerd water met een constante snelheid van ongeveer één druppel elke 4–5 seconden op de slijpsteen druppelen.
  10. Breng de naaldpunt voorzichtig in contact met de roterende slijpsteen totdat er een afgeschuinde rand ontstaat.
  11. Meet de buitendiameter van de afgeschuinde punt met een meetapparaat voor de tip wanneer beschikbaar.
  12. Selecteer naalden met een buitendiameter van bijna 30 μm voor transplantatie.
  13. Vul de naald met een steriele buffer en stoot voorzichtig de vloeistof uit om te controleren of de tip open en niet geblokkeerd is.

7. Voorbereiding van het injectieapparaat

  1. Stel een handmatig mondgestuurde pipet samen bestaande uit flexibele slangen, een mondstuk, een inlinefilter en een capillairhouder.
    OPMERKING: Een inline-filter is geïntegreerd in het mondgestuurde pipetapparaat om besmetting te voorkomen.
  2. Markeer de naald elke 2 mm (tot 2 markeringen per naald). Elke 2 mm komt overeen met ~2 μL.
  3. Steek de voorbereide glazen injectienaald ~1,5 cm in de capillairhouder en controleer of de constructie stevig en luchtdicht is.
  4. Breng een zachte zuiging uit via het mondstuk om een ongehinderde luchtstroom en de juiste weerstand te controleren.
  5. Bevestig dat het systeem een soepele controle van aspiratie en injectie mogelijk maakt voordat donorcellen worden geladen.
  6. Vul de glazen injectienaald terug met de voorbereide donorcelsuspensie (in totaal 4,5 μL) met een fijne pipettip.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de naald achterblijven voordat je begint met transplantatie. Gebruik één naald per muis.

8. Narcose van neonatale patiënten en voorbereiding op het chirurgisch veld

  1. Plaats de neonatale muis in rugligging op de operatietafel en induceer anesthesie met 2,0%–5,0% isofluraan, toegediend in zuurstof via een precisieverdamper.
  2. Plaats de muisneus in een neuskegel om gedurende de procedure een continue levering van isofluraan en zuurstof te waarborgen.
  3. Wacht ongeveer 1 minuut voor de inleiding van de anesthesie terwijl de ademhaling wordt gecontroleerd.
  4. Raak voorzichtig de ledematen aan en controleer of er geen terugtrekkingsreflex is om te controleren of de verdoving voldoende is.
  5. Zodra een geschikt anesthesievlak is bereikt, verlaag je de isofluranconcentratie tot 0,5%–2,0% voor onderhoud en ga je de anesthesie tot 10 minuten voort tijdens de transplantatieprocedure.
  6. Houd de neonatale muis op ongeveer 38 °C met een warmtekussen dat onder de operatietafel is geplaatst.
  7. Maak het injectieplaatsgebied op de kop schoon met afwisselende toepassingen van betadine en 70% ethanol met steriele wattenstaafjes.
  8. Breng een laatste laag betadine aan en laat de huid drogen voordat je injecteert.
    VOORZICHTIG: Isoflurane is een gevaarlijk anestheticum. Gebruik geschikte anesthesie-verwijderingssystemen en zorg voor voldoende ventilatie in de kamer, in overeenstemming met de institutionele veiligheidsrichtlijnen.

9. Uitvoering van neonatale intracerebrale transplantatie

  1. Stabiliseer de kop voorzichtig met handschoenen of een zachte steun om beweging tijdens de injectie te minimaliseren.
    OPMERKING: De ontvangende muizen worden getransplanteerd tussen P1 en P4.
  2. Identificeer bilaterale injectieplaatsen in het anterieure dorsale telencephalon (toekomstige frontale cortexregio), ongeveer 1–2 mm lateraal van de sagittale middenlijn en direct caudaal ten opzichte van de reukbollen. Plaats de injectieplaatsen symmetrisch in elke hemisfeer terwijl je zichtbare bloedvaten aan het oppervlak vermijdt.
    OPMERKING: Vanwege de dunne schedel en kleine grootte van neonatale muizen worden injecties uitgevoerd met behulp van visuele anatomische herkenningspunten in plaats van stereotaxische coördinaten.
  3. Inspecteer de schedel visueel en vermijd het plaatsen van de naald dicht bij zichtbare bloedvaten.
  4. Voer de afgeschuinde glazen micropipet voorzichtig door de huid en de zich ontwikkelende schedel.
  5. Leid de naald ongeveer 1–2 mm onder het schedeloppervlak naar de frontale hemisfeer.
  6. Geef donorcellen met gecontroleerde handmatige druk via het mondgestuurde pipetapparaat.
    OPMERKING: Bij het transplanteren van gezuiverde hematopoëtische voorlopers of neonatale microglia, injecteer 2–3 μL per hemisfeer, wat overeenkomt met ongeveer 2,5 × 104 cellen per injectie. Dit levert ongeveer 5 × 104 cellen per muishersenen.
  7. Trek de micropipet langzaam uit de hersenen om de terugstroom van geïnjecteerde cellen te minimaliseren en weefselschade te verminderen.
  8. Voer contralaterale injectie uit.
    OPMERKING: Gebruik één naald per muis om kruisbesmetting tussen muizen te voorkomen.

10. Herstellende getransplanteerde pasgeborenen

  1. Leg elke pup direct na de ingreep op een warmtematje.
  2. Houd de pups in de gaten totdat de normale lichaamskleur, spontane beweging en algemene activiteit weer zijn teruggekeerd.
    OPMERKING: De hersteltijd varieert van 5 minuten tot 10 minuten.
  3. Breng de jongen terug naar de dam.
  4. Wrijf elke pup grondig in met huiskooi-bodembedekking en broedmateriaal.
  5. Zet de welpen weer terug in de kooi bij de moeder.
  6. Bevestig dat de moeder de teruggebrachte jongen ophaalt en accepteert.

11. Monitoring van de postoperatieve gezondheid

  1. Observeer de pups dagelijks gedurende 10 minuten gedurende de eerste 3 dagen na de transplantatie.
  2. Beoordeel pups op normale activiteit, zuiggedrag en interactie met de moeder.
    OPMERKING: Stoor muizenkooien niet tijdens deze periode. Dit kan de druk op de dam verhogen.
  3. Blijf de pups om de dag monitoren tot het afbouwen na de eerste periode van 3 dagen.
  4. Beoordeel de pups op normale ontwikkeling, voedingsgedrag, activiteitsniveau en moederlijke zorg.
  5. Meet en registreer dagelijks het lichaamsgewicht tijdens de vroege postoperatieve periode.
  6. Beoordeel de pups op tekenen van stress, abnormale houding, lusteloosheid of verminderde voeding.
  7. Voer humane euthanasie uit wanneer nodig volgens de richtlijnen voor de institutionele dierenverzorging.
    1. Voor neonatale muizen wordt geëuthanaseerd door isoflurane-overdosis met behulp van een bell jar of een vergelijkbare afgesloten kamer met een valse vloer om direct contact met het narkose te voorkomen. Zodra de ademhaling stopt en het ontbreken van reflexen is bevestigd, onthoofd je onmiddellijk.
    2. Voor volwassen muizen euthanasen met 5% isofluraan toegediend in zuurstof via een precisieverdamper totdat de ademhaling stopt en het ontbreken van reflexen is bevestigd, gevolgd door cervicale dislocatie als secundaire fysieke methode om de dood te voorkomen.
      OPMERKING: Dieren met postoperatieve mortaliteit of afwezigheid van detecteerbare donorcel-engraftment aan het experimentele eindpunt werden uitgesloten van de analyse. Postoperatieve analgesie werd niet toegediend omdat neonatale intracerebrale transplantatie als minimaal invasief werd beschouwd.

12. Het verzamelen van hersenweefsel voor cryosectie en immunofluorescentiekleuring

  1. Verwijder de hersenen voorzichtig en bereid deze voor op een bevriessectieanalyse.
  2. Verwerk postnataal hersenweefsel voor cryosectie en snijd coronale doorsneden met een cryostaat volgens eerder beschreven procedures.
    OPMERKING: Voor elke muis worden 9–12 coronale secties geanalyseerd die de somatosensorische cortex beslaan.
  3. Bevestig secties op microscoopglaasjes en bewaar ze bij -20 °C tot het kleuren.
  4. Incubeer secties kort in een permeabilisatiebuffer met 0,2% Triton X-100 en 1% natriumdeoxycholaat.
  5. Bereid primaire antilichamen voor (kip anti-GFP, 1:500; Cavia-anti-tdTomatenantilichaam, 1:250; konijn anti-Iba1; 1:500) verdund in de juiste antilichaamverdunningsbuffer.
  6. Incubeer weefselsecties met primaire antilichamen 's nachts bij 4 °C.
  7. Was secties met fosfaatgebuffte zoutoplossing om ongebonden primaire antilichamen te verwijderen.
  8. Incubeer secties met fluorofor-geconjugeerde secundaire antilichamen (geitenantikonijn Alexa Fluor 647, 1:500; geitenanticavia Alexa Fluor 555, 1:500; geitenanti-kip Alexa Fluor 488, 1:500) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in het donker.
  9. Tegenkleuringssecties met DAPI om celkernen te visualiseren.
  10. Monteer secties met een antifade montagemedium en breng een glazen coverslip aan.

13. Het verkrijgen van confocale microscopiebeelden

  1. Neem fluorescentiebeelden met een confocale microscoop uitgerust met 10× of 20× objectieven.
  2. Maakt beelden op 512 × 512 of 1024 × 1024 pixelresolutie met scansnelheden van 200–400 Hz.
  3. Verzamel optische secties met z-stap intervallen van 2–5 μm door het weefsel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Neonatale intracerebrale transplantatie van gezuiverde microgliapopulaties resulteert in langdurige overleving en wijdverspreide inplanting van donor-afgeleide cellen binnen het ontvangende hersenparenchym. Gezuiverde donormicrogliapopulaties werden geïsoleerd door fluorescentie-geactiveerde celsortering met fluorescentie-lijnreporters (Hoxb8 microglia: tdTomato⁺ GFP⁺; non-Hoxb8 microglia: tdTomato⁻ GFP⁺) voorafgaand aan transplantatie (Figuur 1A

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Neonatale intracerebrale transplantatie van gezuiverde microgliale voorlopers of gedefinieerde microgliale subpopulaties biedt een robuuste benadering voor het reconstrueren van het microgliale compartiment in vivo en het onderzoeken van lijnspecifieke eigenschappen van hersenmacrofagen. Deze methode maakt selectieve reconstitutie mogelijk met genetisch gedefinieerde donorcellen, waardoor directe beoordeling van donorcel-engraftment en rijping binnen de hersenomgeving mogelijk i...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs geven geen concurrerende financiële belangen aan.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (R01 MH093595) (M.R.C.), de Dauten Family Foundation en de University of Utah Flow Cytometry Facility. Csf1rΔFIRE-muizen werden gegenereerd door Dr. Ben Xu aan de Universiteit van Utah.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Bell jarVariousN/AGebruikt voor euthanasie
Borosilicaat glazen capillairen met
filament		Sutter InstrumentBF100-78-15Gebruikt voor injectienaalden
Bovine serum albumine (BSA)Sigma AldrichA8806Gebruikt om PB-buffer voor te bereiden. Er zijn verschillende merken beschikbaar. De hier vermelde is slechts een voorbeeld.
CD11b Alexa Fluor 700BioLegend101222Myeloïde cellen
CD45 APCBioLegend103112Hematopoietische cellen
Cell strainers (70 µm)Falcon352350Gebruikt om enkel-
cel suspensies te genereren. Er zijn verschillende merken beschikbaar. De hier vermelde is slechts een voorbeeld.
Chicken anti-GFP antilichaamAves LabsGFP-1020Immunofluorescence
kleuring
c-Kit PE-Cy7 antilichaamBioLegend105814Hematopoietische voorlopercellen
Confocale microscoopLeicaTCS SP5Gebruikt voor fluorescentie
beeldvorming
Conische buizen (15 mL/ 50 mL)Eppendorfhttps://www.eppendorf.com/us-en/Products/Lab-Consumables/Lab-Tubes/Eppendorf-Tubes-BioBased-p-PF-4440301Weefsel/cel verwerking. Er zijn verschillende merken beschikbaar. De hier vermelde is slechts een voorbeeld.
Cryostat machineLeicahttps://www.leicabiosystems.com/en-de/histology-equipment/cryostats/Gebruikt voor het genereren van bevroren weefsel
secties. Er zijn verschillende merken beschikbaar. De hier vermelde is slechts een voorbeeld.
DAPI nucleaire kleuringThermo Fisher ScientificD1306Gebruikt voor levensvatbaarheid en
nucleaire kleuring
DissectiemicroscoopLeicahttps://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/stereo-microscopes/Gebruikt voor het trimmen en voorbereiden van injectienaalden. Er zijn verschillende merken beschikbaar. De hier vermelde is slechts een voorbeeld.
FACSAria Flow Cytometer SorterBD BioscienceFACSAria Celzuivering
Fc block (gezuiverd CD16/32)Biolegend101302Blokkeert ongewenste antilichaambinding aan muiscellen die Fc-receptoren tot expressie brengen
Fetaal bovien serum (FBS)ThermoFisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/fbs.htmlGebruikt in celbereiding
buffers. Er zijn verschillende merken beschikbaar. De hier vermelde is slechts een voorbeeld.
Flexibele slang voor mondpijpVariousN/AComponent van handmatig
injectieapparaat
Flow cytometry analysesoftwareFlowJov10.8.1Gebruikt voor FACS-gegevens
analyse
Flow cytometry celsorteerderBD BiosciencesFACSAriaGebruikt voor celzuivering
gentleMACS Octo Dissociator met
verwarming		Miltenyi Biotec130-096-427Gebruikt voor hersenweefsel
dissociatie
Goat anti-chicken Alexa Fluor 488
secundair antilichaam		Thermo Fisher ScientificA-11039Secundair antilichaam
Goat anti-guinea pig Alexa Fluor
555 secundair antilichaam		Thermo Fisher ScientificA-21428Secundair antilichaam
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 647
secundair antilichaam		Thermo Fisher ScientificA-21245Secundair antilichaam
Goat anti-rat Alexa Fluor 647
secundair antilichaam		Thermo Fisher ScientificA-48265Secundair antilichaam
Guinea pig anti-tdTomato antilichaamFrontier InstituteAB_2631185Immunofluorescence
kleuring
Hanks' balanced zout oplossing
(HBSS)		Gibco14175-079Gebruikt tijdens cel
bereiding
HemocytometerVariousN/ACeltelling
Inline filter voor mondpijpVariousN/AVoorkomt contaminatie
MicrogrinderNarishigeEG-400Gebruikt om glazen
injectienaalden te bevelen
MicropipetpullerSutter InstrumentP-1000Gebruikt om fijne
injectienaalden te genereren
Mondpijp mondstukVariousN/AGebruikt voor handmatige controle van
injectie
Neural Tissue Dissociatie Kit (P)Miltenyi Biotec130-092-628Gebruikt voor enzymatische dissociatie van hersenweefsel
PetrischalenThermo Fisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/search/browse/category/us/en/90111022Gebruikt voor het opslaan van getrokken naalden of weefseloogst. Er zijn verschillende merken beschikbaar. De hier vermelde is slechts een voorbeeld.
Rabbit anti-Iba1 antilichaamWako019-19741Microglia marker
Rabbit anti-TMEM119 antilichaamAbcam209064Microglia-specifieke marker
Rat anti-CD206 antilichaamBioLegend141712Gebruikt om macrofaagpopulaties te identificeren
Rat anti-P2RY12 antilichaamBioLegend848002Microglia marker
Vesames/scalpelsVariousN/AGebruikt om naaldenpunten of
weefseloogst te trimmen
RBC lysis bufferChemCruzsc-296258Gebruikt voor het verwijderen van rode
bloedcellen
Stereotactisch apparaatKopf Instrumentshttps://kopfinstruments.com/Gebruikt voor chirurgische
implantatie. Er zijn verschillende merken beschikbaar. De hier vermelde is slechts een voorbeeld.

Referenties

  1. Rao Y, Bai Y, Li X, Du B, Peng B. The evolution of microglia replacement: A new paradigm for CNS disease therapy. Cell Stem Cell. 2025;32(12):1807-1832.
  2. Wu J, et al. Microglia replacement halts the progression of microgliopathy in mice and humans. Science. 2025;389(6756):eadr1015.
  3. Capotondo A, et al. Intracerebroventricular delivery of hematopoietic progenitors results in rapid and robust engraftment of microglia-like cells. Sci Adv. 2017;3(12):e1701211.
  4. Shibuya Y, et al. Treatment of a genetic brain disease by CNS-wide microglia replacement. Sci Transl Med. 2022;14(636):eabl9945.
  5. Mishra P, et al. Rescue of Alzheimer’s disease phenotype in a mouse model by transplantation of wild-type hematopoietic stem and progenitor cells. Cell Rep. 2023;42(8):112956.
  6. Colella P, et al. CNS-wide repopulation by hematopoietic-derived microglia-like cells corrects progranulin deficiency in mice. Nat Commun. 2024;15(1):5654.
  7. Nemec KM, et al. Microglia replacement by ER-Hoxb8 conditionally immortalized macrophages provides insight into Aicardi-Goutières syndrome neuropathology. eLife. 2026;14:RP102900.
  8. Van Deren DA, et al. Defective Hoxb8 microglia are causative for both chronic anxiety and pathological overgrooming in mice. Mol Psychiatry. 2026;31(2):915-928.
  9. Sailor KA, et al. Hematopoietic stem cell transplantation chemotherapy causes microglia senescence and peripheral macrophage engraftment in the brain. Nat Med. 2022;28(3):517-527.
  10. Priller J, et al. Targeting gene-modified hematopoietic cells to the central nervous system: Use of green fluorescent protein uncovers microglial engraftment. Nat Med. 2001;7(12):1356-1361.
  11. Elmore MRP, et al. Colony-stimulating factor 1 receptor signaling is necessary for microglia viability, unmasking a microglia progenitor cell in the adult brain. Neuron. 2014;82(2):380-397.
  12. Wilkinson FL, et al. Busulfan conditioning enhances engraftment of hematopoietic donor-derived cells in the brain compared with irradiation. Mol Ther. 2013;21(4):868-876.
  13. Mildner A, et al. Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nat Neurosci. 2007;10(12):1544-1553.
  14. Monje ML, Mizumatsu S, Fike JR, Palmer TD. Irradiation induces neural precursor-cell dysfunction. Nat Med. 2002;8(9):955-962.
  15. Lombroso SI, et al. Microglia replacement by peripheral delivery of CSF1R inhibitor-resistant hematopoietic cells. Mol Ther. 2026;34(2):850-866.
  16. Bennett FC, et al. A combination of ontogeny and CNS environment establishes microglial identity. Neuron. 2018;98(6):1170-1183.e8.
  17. De S, et al. Two distinct ontogenies confer heterogeneity to mouse brain microglia. Development. 2018;145(13):dev152306.
  18. Van Deren DA, et al. Defining the Hoxb8 cell lineage during murine definitive hematopoiesis. Development. 2022;149(8):dev200200.
  19. Nagarajan N, Capecchi MR. Optogenetic stimulation of mouse Hoxb8 microglia in specific regions of the brain induces anxiety, grooming, or both. Mol Psychiatry. 2024;29(6):1726-1740.
  20. Tränkner D, et al. A microglia sublineage protects from sex-linked anxiety symptoms and obsessive compulsion. Cell Rep. 2019;29(4):791-799.e3.
  21. Chen SK, et al. Hematopoietic origin of pathological grooming in Hoxb8 mutant mice. Cell. 2010;141(5):775-785.
  22. Foran DR, Peterson AC. Myelin acquisition in the central nervous system of the mouse revealed by an MBP-Lac Z transgene. J Neurosci. 1992;12(12):4890-4897.
  23. Dangata YY, Kaufman MH. Myelinogenesis in the optic nerve of (C57BL CBA) F1 hybrid mice: A morphometric analysis. Eur J Morphol. 1997;35(1):3-18.
  24. Rojo R, et al. Deletion of a Csf1r enhancer selectively impacts CSF1R expression and development of tissue macrophage populations. Nat Commun. 2019;10(1):3215.
  25. Askew K, et al. Coupled proliferation and apoptosis maintain the rapid turnover of microglia in the adult brain. Cell Rep. 2017;18(2):391-405.
  26. Lund H, et al. Competitive repopulation of an empty microglial niche yields functionally distinct subsets of microglia-like cells. Nat Commun. 2018;9(1):4845.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

NeurowetenschappenEditie 233Editie 233Lege waardeEditieHoxb8 microglianon Hoxb8 microgliahersenenobsessieve compulsieve stoornischronische angst
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.