Methodenartikel

Protocol voor RNA-isolatie uit meerdere tardigradensoorten

15 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/72120

⸱

1 september 2026

 ,  , 
1Biology Department, The University of North Carolina Asheville, 2Department of Biological Sciences, Florida International University, 3Biology Department, The University of North Carolina at Chapel Hill

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de procedures voor RNA-isolatie uit verschillende beerdiersoorten met behulp van een kolomgebaseerde RNA-isolatiekit, ontworpen om RNA te isoleren uit kleine hoeveelheden weefsel en voldoende hoeveelheden hoogwaardig RNA op te leveren voor downstream-toepassingen zoals RNA-sequencing en complementaire DNA-synthese.

Samenvatting

Beerdiertjes zijn microscopische dieren die bekendstaan om hun uitzonderlijke tolerantie voor omgevingsstress. Deze dieren kunnen uitdroging, extreme druk, lage temperaturen en hoge niveaus van ioniserende straling overleven. De moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze extremotolerante vermogens zijn echter nog niet volledig begrepen. De moleculaire benaderingen die worden gebruikt om deze mechanismen te onderzoeken, waaronder RNA-sequencing, RNA-interferentie (RNAi) en heterologe expressie van beerdiertjesgenen in systemen zoals bacteriën, vereisen de isolatie van hoogwaardig messenger RNA (mRNA) uit beperkt biologisch materiaal. In deze studie beschrijven we een reproduceerbaar protocol voor het isoleren van totaal RNA uit beerdiertjes dat (1) effectief is voor meerdere soorten, inclusief een heterotardigrade soort, (2) slechts 25–200 dieren vereist, afhankelijk van de lichaamsgrootte, en (3) RNA oplevert van voldoende hoeveelheid en kwaliteit voor downstream toepassingen. Het huidige protocol maakt een efficiënt RNA-herstel mogelijk uit een redelijk aantal beerdiertjes en ondersteunt moleculaire onderzoeken naar stresstolerantie bij verschillende beerdiertjessoorten.

Inleiding

Tardigraden staan bekend om hun vermogen om extreme stress te overleven die andere dieren niet zouden overleven, waaronder uitdroging, extreme druk, extreme temperaturen en DNA-beschadigende middelen zoals chemotherapeutica en ioniserende straling1,2,3,4,5,6,7,8. In recente jaren hebben wetenschappers de mechanismen die ten grondslag liggen aan de extreme veerkracht van tardigraden onderzocht met behulp van moleculaire benaderingen zoals RNA-sequencing, RNA-interferentie (RNAi) en heterologe expressie van tardigraden-genen in andere systemen, waaronder menselijke cellen en bacteriën8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Wanneer ze worden toegepast, zijn deze benaderingen een krachtig instrument gebleken om inzicht te krijgen in hoe tardigraden precies in staat zijn tot een dergelijke extreme stresstolerantie8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Al deze moleculaire benaderingen om de stresstolerantie van tardigraden te begrijpen, zijn echter afhankelijk van het vermogen om RNA uit deze kleine diertjes te isoleren in voldoende hoeveelheid en met adequate kwaliteit voor gebruik in downstream-processen.

Een eerdere methode voor RNA-isolatie uit beerdiertjes bleek succesvol voor onderzoekers die werkten met Hypsibius exemplaris23. Toen we echter probeerden dit protocol te repliceren in H. exemplaris, stelden we vast dat het onbetrouwbaar was wat betreft de resulterende RNA-concentratie en -kwaliteit (ongepubliceerde gegevens). Een alternatieve fenolgebaseerde methode voor RNA-isolatie is effectief gebleken voor H. exemplaris, Ramazzottius varieornatus en een heterotardigrade soort13,21,22,24,25,26. Er is aangetoond dat dit protocol RNA van voldoende kwaliteit en kwantiteit levert voor downstream processen, zowel van individuele dieren als van pools van dieren (~50). Dit protocol vereist echter dat de gebruiker werkt met fenolhoudende reagentia. Fenol is een gevaarlijke chemische stof die zorgvuldige hantering vereist, en een onjuiste uitvoering van dit protocol kan leiden tot fenoloverdracht, wat de RNA-zuiverheid en downstream toepassingen beïnvloedt. Een ander eerder gepubliceerd protocol voor RNA-isolatie uit beerdiertjes richt zich op de mogelijkheid om RNA te isoleren uit individuele dieren27. Hoewel dit een waardevol protocol is voor toepassingen zoals kwantitatieve PCR (qPCR)27, is het minder geschikt voor downstream toepassingen zoals RNA-sequencing, waarbij het doel is om een holistischer beeld te krijgen van hoe dieren reageren op een bepaalde stressfactor of conditie.

Deze beperkingen in de beschikbare protocollen voor RNA-isolatie leidden tot het onderzoek naar alternatieve methoden voor het isoleren van RNA uit tardigraden. De op kolommen gebaseerde RNA-isolatiekit die in dit protocol wordt gebruikt, is bedoeld voor het isoleren van RNA uit kleine hoeveelheden weefsel. Deze kit is eerder gebruikt voor het isoleren van RNA uit insectenweefsels voor daaropvolgende RNA-sequencinganalyse, wat suggereert dat deze geschikt zou kunnen zijn voor isolaties uit andere kleine, cuticula-bevattende dieren zoals tardigraden.28Deze studie beschrijft het stapsgewijze protocol voor het gebruik van deze kolomgebaseerde RNA-isolatiekit bij tardigraden, inclusief uitleg over specifieke voorzorgsmaatregelen die genomen moeten worden bij het uitvoeren van dit protocol met tardigraden. Dit artikel rapporteert het succes van dit protocol bij zes tardigradensoorten (H. exemplaris, Milnesium sp., Paramacrobiotus experimentalis, Paramacrobiotus fairbanksi, Paramacrobiotus gadabouti, en de heterotardigrada Viridiscus celatus). De studie heeft gevalideerd dat RNA van aanzienlijke kwaliteit en kwantiteit kan worden verkregen uit slechts 25 dieren. Er worden ook voorbeelden gegeven van de resulterende RNA-concentratie en kwaliteitsgegevens, welke geschikt zijn voor downstream-toepassingen zoals RNA-sequencing (met minimale bias, exponentiële bibliotheekamplificatie) en complementaire DNA (cDNA)-synthese. Dit RNA-isolatieprotocol is reeds nuttig gebleken voor het ontsluieren van mechanismen van stralingstolerantie in H. exemplaris8Het succes van dit protocol bij verschillende beerdiersoorten suggereert dat het breder toepasbaar zou zijn voor het onderzoek naar stress-tolerantiemechanismen, ontwikkelingsmechanismen en evolutionaire processen.

Protocol

Het volgende protocol vereist geen institutionele ethische goedkeuring voor dierproeven, aangezien ongewervelde dieren zijn vrijgesteld van deze vereiste. De gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de Tabel met Materialen.

1. Voorbereiding van apparatuur en werkruimte voor RNA-isolatie

  1. Zet een warmteblok of waterbad op 42 °C ter voorbereiding op de RNA-extractie.
  2. Zorg voor een rek voor microcentrifugebuisjes, pipetten (2 µL, 20 µL, 200 µL en 1000 µL) en gefilterde pipetpunten van de juiste maat.
  3. Reinig het werkvlak, het buisjesrek, de pipetten en de tipdozen met RNase Away, een verdunde bleekoplossing (10%) of 70% ethanol om eventuele resterende RNase te denatureren.
    OPMERKING: Overmatige RNase op de apparatuur of in het gebied waar u RNA isoleert, kan leiden tot onvoldoende RNA-kwaliteit na isolatie als gevolg van degradatie. Verminder dit risico door voldoende tijd te geven aan de RNase-denaturerende chemicaliën en door het gebied en de apparatuur volledig te laten drogen voordat u verdergaat.
  4. Draag handschoenen tijdens alle stappen van dit protocol en behandel de handschoenen gedurende het hele protocol regelmatig met een RNase-denaturerende oplossing om RNase-degradatie van het RNA te voorkomen.

2. Verzamelen van dieren voor RNA-isolatie

  1. Verplaats 25–200 dieren (afhankelijk van de soortgrootte) van hun kweekschalen naar een schaal met schoon bronwater om de hoeveelheid niet-tardigradenmateriaal (algen of andere voedselbronnen zoals nematoden of rotiferen, afhankelijk van de soort) te verminderen, met behulp van een pipetteerbal bevestigd aan een aspiratiebuis-assemblagekamer voorzien van een glazen capillair (Figuur 1A), een Irwin-lus of een micropipet.
  2. Neem een RNase-vrije buis van 1,5 mL en een stamper.
  3. Verplaats de dieren naar de bodem van de RNase-vrije buis van 1,5 mL met behulp van een pipetteerbal bevestigd aan een aspiratiebuis-assemblagekamer voorzien van een glazen capillair of een Irwin-lus, waarbij u er bijzonder goed op let zo min mogelijk water samen met de dieren over te brengen.
  4. Centrifugeer 3 min bij 4.500 g om de tardigraden als pellet op de bodem van de microcentrifugebuis te brengen.
  5. Terwijl u de buis met de gepelletteerde tardigraden onder een dissectiemicroscoop observeert, gebruikt u een 20 µL pipet of een pipetteerbal bevestigd aan een aspiratiebuis-assemblagekamer voorzien van een glazen capillair met een opening die kleiner is dan de tardigraden waarvan u RNA isoleert, om voorzichtig zoveel mogelijk water te verwijderen zonder de pellet tardigraden te verstoren. Zie Figuur 1B voor een weergave van een acceptabele hoeveelheid resterend water.
    OPMERKING: Let erop dat u hier een dun laagje water achterlaat, zodat de dieren niet uitdrogen in de korte tijd tussen het verwijderen van het water en het toevoegen van de extractiebuffer (XB). Als de dieren uitdrogen, kan dit leiden tot een slechte RNA-kwaliteit na isolatie.
  6. Voeg 100 µL extractiebuffer (XB) toe aan de buis met de tardigraden.

3. Mechanische disruptie van tardigraden en RNA-extractie

  1. Gebruik de RNase-vrije stamper om de tardigraden te lyseren door de stamper gedurende ~30 s voorzichtig maar stevig tegen de bodem van de buis te wrijven. In totaal zouden 20–30 maal malen voldoende moeten zijn om de tardigraden te lyseren.
  2. Verwijder de stamper uit de buis, waarbij u er voorzichtig op let dat zoveel mogelijk vloeistof op de bodem van de buis achterblijft.
  3. Controleer de inhoud van de microcentrifugebuis onder de dissectiemicroscoop om er zeker van te zijn dat er geen zichtbare intacte dieren meer aanwezig zijn.
  4. Incubeer het mengsel 30 min bij 42 °C op een schuddend warmteblok met een zachte schudbeweging (300 rpm).
    OPMERKING: De extractiebuffer (XB) stabiliseert het RNA om degradatie bij deze temperatuur te voorkomen.

4. Conditioneren van de RNA-isolatiekolom

  1. Zet in de laatste 10 min van de extractie-incubatie de kolom voor de RNA-collectie en -zuivering in elkaar. Plaats een zuiveringskolom in een opvangbuisje en label de kolom op de juiste wijze.
  2. Voeg 250 µL Conditioning Buffer (CB) direct toe aan de kolom.
  3. Incubeer gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
  4. Centrifugeer 1 min bij 16,000 × g en gooi het doorstroomvolume weg. De kolom is nu klaar om het RNA-supernatans uit de volgende stap op te vangen.
  5. Haal de 10x DNase I Reaction Buffer en het Nuclease-Free Water uit de vriezer om deze volledig te laten ontdooien voor stap 6 hieronder.

5. Binding van RNA aan de kolom

  1. Centrifugeer na de extractie-incubatie de buis met de mechanisch gedisrupteerde tardigraden en extractiebuffer (XB) gedurende 2 min bij 3,000 × g.
  2. Neem een nieuwe RNase-vrije buis en label deze op de juiste wijze.
  3. Verwijder voorzichtig het supernatant van de gepelletteerde tardigraden-cuticula's met een 200 µL pipet met een filtertip. Zorg ervoor dat het cuticula-pellet niet wordt verstoord en dat alleen het supernatant wordt verwijderd.
    OPMERKING: Het overbrengen van cuticula naar volgende stappen zal leiden tot een lagere efficiëntie van de RNA-opbrengst van de kolom door fysieke verstopping van de kolom. Om deze potentiële fout te voorkomen, kan de pipetpunt met supernatant onder de microscoop worden gecontroleerd om de afwezigheid van cuticula te bevestigen. Als er cuticula aanwezig is, breng het supernatant dan terug in de buis en herhaal de centrifugatiestap.
  4. Overbreng het supernatant naar de nieuw gelabelde, RNase-vrije buis.
  5. Pipetteer 100 µL 70% ethanol in de buis met het RNA en meng dit grondig door meerdere keren op en neer te pipetteren. Bij deze stap moeten er duidelijke viskeuze filamenten zichtbaar zijn na toevoeging van de ethanol. Dit is een goed teken dat er RNA aanwezig is in het supernatant.
  6. Pipetteer het gehele mengsel (200 µL) op de voorbereide kolom uit stap 4.
    OPMERKING: Let er bij het pipetteren van oplossingen op de kolom in deze en volgende stappen op dat de vloeistof in het midden van de kolom wordt gedoseerd en vermijd fysiek contact tussen de pipetpunt en de kolom. Mechanische punctie van de kolom zal leiden tot problemen met de RNA-kwaliteit en -kwantiteit in latere stappen.
  7. Om RNA aan de kolom te binden, centrifugeert u gedurende 2 min bij 100 × g, gevolgd door centrifugatie bij 16,000 × g gedurende 30 s om het doorstroomvolume te verwijderen.

6. Bereiden van DNase I-oplossing

  1. Laat de 10x DNase I Reaction Buffer en het Nuclease-Free Water volledig ontdooien voordat u de oplossing bereidt.
  2. Bereid voor elke RNA-isolatie in een aparte 1,5 mL microcentrifugebuis een oplossing van 40 µL voor, bestaande uit 32 µL Nuclease-Free Water, 4 µL 10x DNase I Reaction Buffer en 4 µL DNase I Enzyme. Bewaar de oplossing op ijs totdat deze in stap 7.3 op de kolom wordt aangebracht.

7. Wassen van het RNA en DNase I-behandeling

  1. Pipetteer 100 µL Wasbuffer 1 (W1) direct op de zuiveringskolom die het gebonden RNA bevat (uit stap 5.7).
  2. Centrifugeer 1 min bij 8,000 × g en verwijder het doorstroomvolume.
  3. Pipetteer 40 µL DNase I-oplossing uit stap 6 direct op de zuiveringskolom en incubeer 15 min bij kamertemperatuur om DNA-contaminatie te verwijderen.
  4. Pipetteer 40 µL Wasbuffer 1 (W1) op de zuiveringskolom en centrifugeer 30 s bij 8,000 × g .
  5. Pipetteer 100 µL Wasbuffer 2 (W2) op de zuiveringskolom en centrifugeer 1 min bij 8,000 × g.
  6. Pipetteer nogmaals 100 µL Wasbuffer 2 (W2) op de zuiveringskolom en centrifugeer 2 min bij 16,000 × g. Gooi het doorstroomvolume weg.
  7. Centrifugeer de kolom 1 min bij 16,000 × g om de kolom te drogen.

8. Elueren van RNA

  1. Neem voor elke RNA-isolatie een 0,5 mL buis (inbegrepen in de kit) en label deze op de juiste wijze. Dit is de buis waarin het RNA na isolatie terechtkomt.
  2. Plaats de kolom met gebonden en gewassen RNA in de gelabelde 0,5 mL buis. De kolom moet stevig in deze buis klikken.
  3. Kijk van opzij naar de buis, positioneer de pipetpunt direct boven het kolommembraan, breng 11 µL Elution Buffer (EB) aan op de kolom en laat dit 1 min bij kamertemperatuur incuberen.
    OPMERKING: Als de Elution Buffer (EB) niet direct op de kolom wordt verdeeld, resulteert dit in lagere RNA-opbrengsten. Indien er vloeistofdruppels rond de rand van de kolom worden waargenomen, duidt dit op een onjuiste verdeling van de Elution Buffer (EB) op de kolom. In dat geval wordt aanbevolen deze stap te herhalen met het doorstroomvolume uit stap 8.5, waarbij men ervoor zorgt dat de Elution Buffer (EB) direct in het centrum van de kolom wordt aangebracht.
  4. Plaats de 0,5 mL buis met de kolom in de bij de kit geleverde opvangbuis voor een juiste passing tijdens centrifugatie (Figuur 2).
  5. Centrifugeer de kolom bij 1.000 × g gedurende 1 min om de Elution Buffer (EB) te verdelen, en centrifugeer vervolgens bij 16.000 × g gedurende 1 min om het RNA te elueren.
  6. Plaats de 0,5 mL buis met het RNA onmiddellijk op ijs.

9. Validatie van RNA-kwantiteit en -kwaliteit met een microvolume-spectrofotometer

OPMERKING: Andere methoden kunnen worden gebruikt om de RNA-kwantiteit en -kwaliteit te beoordelen. Hier wordt een methode met een microvolume-spectrofotometer gebruikt. Een fluorometer of een microfluïdisch gelelektroforese-instrument kan ook worden gebruikt29.

  1. Veeg de voet van de microvolume-spectrofotometer af met een pluisvrije doek om er zeker van te zijn dat deze vrij is van andere vloeistoffen.
  2. Selecteer de RNA -instelling op de spectrofotometer voor de analyse.
  3. Nul de spectrofotometer door 1 µL van de Elution Buffer (EB) te gebruiken die in stap 8.3 is gebruikt.
  4. Veeg na het nullen de Elution Buffer (EB) van de voet af met een pluisvrije doek.
  5. Houd de 0,5 mL buis met RNA op ijs en pipetteer 1 µL RNA op de voet van de spectrofotometer. Laat de arm van de spectrofotometer zakken om de absorbantie van het monster te meten, teneinde de hoeveelheid en de kwaliteit van het geïsoleerde RNA te kwantificeren en te beoordelen.
    OPMERKING: Raadpleeg de onderstaande sectie "Resultaten" voor details over de acceptabele kwaliteit en hoeveelheid voor downstream-applicaties.

Resultaten

Een kritische stap in dit protocol is, zoals hierboven vermeld, het verwijderen van een passende hoeveelheid water van de verzamelde tardigraden voordat de extractiebuffer (XB) voor RNA-extractie wordt toegevoegd. Het achterlaten van te veel water leidt tot verdunning van de extractiebuffer (XB) en tot een suboptimale RNA-extractie uit de dieren (d.w.z. RIN < 7, 260/280 ratio < 1,8, 260/230 ratio < 1,8 en/of concentratie < 5 ng/µL), wat resulteert in een verminderde RNA-concentratie en -kwaliteit na elutie. Het verwijderen van te veel water zal de dieren snel uitdrogen, wat potentieel leidt tot lethaliteit en een verminderde RNA-kwaliteit door verhoogde RNase-activiteit na de dood. Ter ondersteuning bij de succesvolle uitvoering van dit protocol wordt een visuele weergave gegeven van de juiste hoeveelheid water die in de buis met de tardigraden moet blijven voordat de extractiebuffer (XB) wordt toegevoegd (Figuur 1B).

Tot op heden is dit protocol geprobeerd bij zes verschillende beerdiersoorten, waaronder een heterotardigraad (V. celatus). Deze isolaties resulteerden in RNA-concentraties variërend van 11 ng/µL tot 106,6 ng/µL (bevestigd met een microvolume-spectrofotometer, Tabel 1) en 9 ng/µL tot 113 ng/µL (bevestigd via microfluidische gelelektroforese, Tabel 2). Het aantal dieren dat nodig is voor RNA-isolatie varieert afhankelijk van de grootte van de soort waarvan geïsoleerd wordt. Grotere beerdiertjes, zoals Paramacrobiotus-soorten en Milnesium sp., leveren voldoende RNA-concentraties op vanaf slechts 25 dieren (Tabel 1). Voor kleinere soorten, zoals H. exemplaris en V. celatus, zijn isolaties succesvoller met 100 of meer dieren (Tabel 1). De meerderheid van de isolaties heeft een 260/280-ratio van rond de 2, wat duidt op zuiver RNA30. Isolaties van sommige soorten (V. celatus en H. exemplaris, en de Paramacrobiotus-soorten) resulteren incidenteel in een lage 260/230-ratio, wat wijst op contaminatie door reagentia30. Dit gebeurde vaak bij het gebruik van minder dieren (100 voor V. celatus en H. exemplaris, en 25 voor Paramacrobiotus-soorten), wat suggereert dat te weinig dieren het risico op reagentia-contaminatie in het uiteindelijk geëlueerde RNA kunnen verhogen. Door de beoordeling van de RNA-kwaliteit via microfluidische gelelektroforese kan een RNA-integriteitsgetal (RIN) worden berekend. Een RIN tussen 9–10 duidt op RNA van hoge kwaliteit met weinig degradatie31 en over het algemeen wordt geadviseerd om niet door te gaan met downstream-processen zoals RNA-sequencing als de RIN lager is dan 7. Enkele voorbeeldresultaten van microfluidische gelelektroforese worden gepresenteerd (Figuur 3) van monsters met hoge en lage/niet-detecteerbare RIN-waarden. Sommige van deze monsters werden uitgesloten van verdere analyse (Tabel 2, Figuur 3A,D). Echter, sommige monsters met een lage/niet-detecteerbare RIN werden geselecteerd voor library prep voor RNA-sequencing en resulteerden toch in kwalitatieve RNA-sequencingresultaten (Tabel 2, Figuur 3B,F, niet gepubliceerde gegevens, zie "Discussie" voor meer informatie).

figure-results-1
Figuur 1: Opstelling voor RNA-isolatie. Afbeeldingen die een pipetbulb tonen die is bevestigd aan een aspiratorbuis-assemblagekamer, voorzien van een glazen capillair voor het verplaatsen van dieren en het verwijderen van water (A), en een weergave van een acceptabele hoeveelheid overgebleven water vóór toevoeging van extractiebuffer (XB) aan Paramacrobiotus-tardigraden (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Opstelling van de elutiebuis voor de uiteindelijke elutie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Representatieve resultaten van microfluïdische gelelektroforese voor H. exemplaris en P. gadabouti. (A) RNA-gel van H. exemplaris blootgesteld aan ioniserende straling. (B) RNA-gel van P. gadabouti en H. exemplaris onder controlecondities. (C–F) Representatieve piekprofielen van een hoogwaardig H. exemplaris RNA-monster (C), van een H. exemplaris monster van twijfelachtige kwaliteit (D), van een goedwaardig P. gadabouti monster (E), en van een H. exemplaris monster met duidelijke degradatie (piek bij 147 bp) (F). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Representatieve RNA-concentraties en kwaliteitsinformatie van verschillende tardigradensoorten verzameld met een microvolume-spectrofotometer. *Concentraties onder 20 ng/µL, gedetecteerd met een microvolume-spectrofotometer, kunnen leiden tot onnauwkeurige absorbentieverhoudingen. **Lage 260/230-verhouding veroorzaakt door een onjuiste centrifugatiesnelheid bij stap 5.7. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Representatieve RNA-concentraties en kwaliteitsinformatie van twee tardigradensoorten verzameld met een microfluïdisch gelelektroforesesysteem. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

Het doel van dit protocol is om de isolatie van RNA uit tardigraden te faciliteren met een voldoende hoge kwantiteit en kwaliteit om toepasbaar te zijn voor downstream-applicaties die onderzoek naar de stresstolerantie van tardigraden mogelijk maken. Het hier gepresenteerde protocol beschrijft gebieden waar gebruikers problemen kunnen ondervinden, waaronder het verwijderen van voldoende water vóór het toevoegen van extractiebuffer (XB) (stap 2.5), het lyseren van de lichamen van de tardigraden (stap 3.1–3.3), het overbrengen van het supernatant naar de kolom voor zuivering (stap 5.3) en het elueren van het RNA (stap 8.3). Fouten in een van deze stappen kunnen leiden tot een verminderde concentratie of kwaliteit van het resulterende RNA. Indien de resulterende RNA-concentratie lager is dan 5 ng/µL (geverifieerd met een microvolume-spectrofotometer), kan de gebruiker overwegen de RNA-isolatie opnieuw uit te voeren met (1) meer startdieren (>100 voor kleine soorten of >50 voor grotere soorten), of (2) het protocol te herhalen, waarbij speciale aandacht wordt besteed aan de stappen voor waterverwijdering, lysering van de tardigraden en elutie.

Dit artikel geeft voorbeelden van RNA-kwaliteitsbeoordelingen (RIN, 260/280 ratio, 260/230 ratio) die als geschikt of ongeschikt werden beschouwd voor RNA-sequencing (Tabel 1, Tabel 2, Figuur 3). Af en toe worden lage (<1,0) 260/230 ratio's waargenomen bij sommige RNA-isolaties met dit protocol (Tabel 1), wat wijst op de aanwezigheid van residuele organische verbindingen. Meestal was dit geassocieerd met een laag aantal dieren. Als het verhogen van de hoeveelheid diermateriaal geen optie is, of als gebruikers consistent een lage 260/230 ratio tegenkomen, wordt aangeraden om een extra wasstap met Wash Buffer 2 (W2) toe te voegen (herhaal stap 7.6) en/of de tijd voor de droogspin-centrifugatie in stap 7.7 te verlengen om de verwijdering van deze contaminanten te waarborgen. Daarnaast moet worden opgemerkt dat de ene representatieve H. exemplaris-isolatie met een lage 260/230 ratio (Tabel 1) werd uitgevoerd door een eerste-jaar bachelorstudent die het protocol voor het eerst gebruikte en achteraf realiseerde dat stap 5.7 (centrifugeren om ethanol te verwijderen na binding van RNA aan de kolom) werd uitgevoerd bij de onjuiste centrifugatiesnelheid (te traag). Dit leidde waarschijnlijk ertoe dat er ethanol op de kolom achterbleef en door het protocol werd meegenomen, wat resulteerde in de slechte 260/230 ratio. Latere isolaties door deze gebruiker resulteerden in 260/230 waarden binnen een redelijk bereik (niet lager dan 1,5). Daarom moeten alle gebruikers, en in het bijzonder beginnende gebruikers, nauw letten op de centrifugatiesnelheden tijdens het uitvoeren van het protocol om deze potentiële problemen te voorkomen. Ondanks incidenteel lage 260/230 ratio's of een lage RIN bij H. exemplaris, kon RNA met vergelijkbare kwaliteitsmetingen nog steeds worden gebruikt voor downstream RNA-sequencing om differentiële genexpressie te onderzoeken na blootstelling aan ioniserende straling of andere stressoren8 (Tabel 1, Tabel 2 en ongepubliceerde gegevens). Op dezelfde manier resulteerde RNA geïsoleerd uit P. gadabouti met dit protocol in een hoge RNA-concentratie en -kwaliteit (geverifieerd door RIN, Tabel 2, Figuur 3) en leverde dit zinvolle RNA-sequencing data op (ongepubliceerde gegevens). Anekdotisch gezien heeft deze studie succesvol RNA van H. exemplaris met lage concentraties (5–9 ng/µL) gebruikt om cDNA te maken voor succesvolle downstream klonering van H. exemplaris-genen8. Wanneer RNA van H. exemplaris resulteerde in een lage/niet detecteerbare concentratie en RIN (gemeten met microfluidische gelelektroforese), werd het RNA voor deze behandeling opnieuw geïsoleerd voordat men verderging met de library-preparatie voor RNA-sequencing (Tabel 2, Figure 3A,D). De beslissing om de RNA-isolatie voor dit monster opnieuw uit te voeren (Figuur 3A,D), in plaats van door te gaan met sequencing zoals gedaan is bij andere monsters van H. exemplaris met een niet detecteerbare RIN (Figuur 3B,F), was gebaseerd op het ontbreken van duidelijke banden op de microfluidische gel, wat kan duiden op een laadfout, gedegradeerd RNA of een onvoldoende RNA-concentratie. Daarentegen leverde RNA geïsoleerd uit H. exemplaris dat een relatief lage concentratie, een niet detecteerbare RIN en bewijzen van enige RNA-degradatie vertoonde (aangegeven door hogere niveaus van kleine RNA-fragmenten), bruikbare RNA-sequencing data op na library-preparatie (ongepubliceerde gegevens, Tabel 2, Figuur 3B,F). Hoewel er hier enkele richtlijnen worden gegeven om te bepalen of RNA-monsters geschikt zijn voor downstream toepassingen, dient de gebruiker zijn eigen oordeel te gebruiken en de specifieke downstream toepassing te overwegen bij de beoordeling of de kwaliteit en kwantiteit van het RNA voldoende zijn om verder te gaan.

Wetenschappers die RNA uit tardigraden willen isoleren, moeten rekening houden met meerdere aspecten bij het bepalen van welk protocol het meest geschikt is voor hun doel. Alle eerder beschreven methoden voor RNA-isolatie (inclusief de hier beschreven methode) hebben RNA opgeleverd van voldoende hoeveelheid en kwaliteit om downstream-toepassingen zoals RNA-sequencing, cDNA-synthese en qPCR te ondersteunen8,12,13,17,21,22,25,27. Kosten zijn vaak een overweging, vooral voor onderzoekslaboratoria met kleine budgetten of onderwijslaboratoria. Het hier beschreven protocol is per isolatiereactie duurder dan eerder beschreven protocollen. We zouden echter aanvoeren dat de kostenstijging gepaard gaat met voordelen ten opzichte van eerder beschreven protocollen. In vergelijking met andere kolomgebaseerde RNA-isolatieprotocollen23, kan het hier beschreven RNA-isolatieprotocol voldoende RNA van adequate kwaliteit produceren uit een kleinere hoeveelheid startmateriaal (minder dieren). Daarnaast, zoals vermeld in de inleiding, werkte het eerder beschreven kolomgebaseerde RNA-isolatieprotocol inconsistent in onze praktijk, wat vaak resulteerde in extreem lage RNA-opbrengsten die onvoldoende waren voor downstream-processen (ongepubliceerde gegevens). Het hier beschreven protocol is ook aanzienlijk veiliger in vergelijking met een fenolgebaseerde RNA-isolatiebenadering, aangezien het niet vereist dat gebruikers gevaarlijke chemicaliën hanteren waarvoor een zuurkast nodig is. Bovendien is een veelvoorkomend gebruikersprobleem bij fenolgebaseerde RNA-extractieprotocollen de overdracht van fenol, wat de RNA-zuiverheid beïnvloedt en downstream-toepassingen kan verstoren. Deze problemen maken fenolgebaseerde RNA-extractie minder toegankelijk voor bachelorstudenten (zowel in onderzoekslaboratoria als in lokalen). De fenolgebaseerde methode is echter het meest kosteneffectief. Het hier beschreven protocol is niet geschikt voor het isoleren van RNA uit een enkel dier om transcriptomische reacties per individu te beoordelen (zoals gepubliceerd in Kirk et al.), maar is in plaats daarvan waardevol voor het onderzoeken van gedeelde veranderingen tussen individuen als reactie op een stressfactor, waardoor een holistischer beeld van stressreacties wordt verkregen. Gebruikers moeten daarom de belangrijkheid van kosten, de beschikbaarheid van dieren en de toegankelijkheid van bestaande protocollen voor de gebruiker afwegen om te bepalen welk protocol het beste bij hun behoeften past.

Dit rapport valideerde dat dit protocol RNA van voldoende hoeveelheid en kwaliteit produceert uit zes verschillende beerdiersoorten, waaronder een representatieve soort uit de Heterotardigrada. Daarnaast levert deze RNA-isolatiemethode voldoende RNA op uit een redelijk aantal dieren (25–200, afhankelijk van de soortgrootte). De validatie van dit RNA-isolatieprotocol in meerdere soorten opent de deur naar het begrijpen van fascinerende aspecten van de biologie van beerdiertjes. Dit is niet beperkt tot het onderzoek naar stresstolerantie, maar strekt zich ook uit tot het begrijpen van de evolutie van deze dieren, inclusief de evolutie van resistentiemechanismen en hun ontwikkeling. Dit protocol is bijzonder nuttig voor niet-modelsoorten en in het veld verzamelde beerdiersoorten waarbij de biomassa beperkt is en gestandaardiseerde RNA-isolatiemethoden ontbreken. Ten slotte is dit protocol toegankelijk voor onderzoekers en kan het reproduceerbaar worden uitgevoerd door bachelorstudenten, waardoor het een aanwinst is in onderzoeks- of onderwijslaboratoria aan instellingen die zich primair richten op de bacheloropleiding.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te melden.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door startfondsen van UNC Asheville (aan CCH) en een NSF-beurs 2225683 aan Jason Pienaar (postdoctoraal adviseur van PK). Wij danken de UNC High Throughput Sequencing Facility voor de technische ondersteuning.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1,5 mL MicrofugebuisjesUSA Scientific1615-5500Seal-Rite 1,5 mL gegradueerd microcentrifugebuisje, natuurlijk, polypropyleen, 500/zak
70% EthanolVWR71001-654Voor het reinigen van werkbanken/apparatuur
Arcturis PicoPure RNA Isolation KitFisherKIT0204Kit bevattende componenten voor het isolatieprotocol dat in dit manuscript wordt beschreven
CentrifugeEppendorf5405000441Centrifuge 5425, draaiknoppen, niet-gekoeld, met Rotor FA-24x2, 120 V/50-60 Hz (US)
Deer Park Spring WaterElke supermarktN/ADit is het medium voor tardigradenculturen en wordt gebruikt om tardigraden te spoelen voorafgaand aan de RNA-isolatie
DissectiemicroscoopZeissN/AZeiss Stemi 305, zoomfactor 5:1 en totale vergroting 8x-40x, met transilluminatie Unit M LED
DNase IFisherFEREN0521Thermo Scientific DNase I, RNase-vrij (1 U/µL)
Gefilterde pipetpunten 10 µLVWR76322-528Elke gefilterde pipetpunt is geschikt
Gefilterde pipetpunten 1000 µLVWR76322-154Elke gefilterde pipetpunt is geschikt
Gefilterde pipetpunten 20 µLVWR76322-134Elke gefilterde pipetpunt is geschikt
Gefilterde pipetpunten 200 µLVWR76322-150Elke gefilterde pipetpunt is geschikt
Glazen capillairenFisher50-821-811World Precision Instrument Standard Glass Capillaries - 1B120-6 (6 inch, OD 1,2 mm, zonder filament). Deze worden over een vlam uitgetrokken tot twee glazen capillairen met versmalle uiteinden en vervolgens gebroken tot de juiste diameter om de gekozen tardigradensoort met een mondpipet op te nemen.
WarmteblokEppendorf5382000023Eppendorf ThermoMixer C, basisapparaat zonder thermoblock, 100-130 V/50-60 Hz (US/JP/Zuid-Amerika/TW)
High Sensitivity RNA Screen Tape LadderAgilent5067-5581Ladder voor hooggevoelige analyse van totaal RNA op TapeStation-systemen
High Sensitivity RNA ScreenTapeAgilent5067-5579Voor hooggevoelige analyse van totaal RNA op TapeStation-systemen
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample BufferAgilent5067-5580Buffer voor hooggevoelige analyse van totaal RNA op TapeStation-systemen
Microfluidische gelelektroforeseAgilentG2991BAAgilent 4200 TapeStation Systeem
Microvolume spectrofotometerFisher13400607Thermo Scientific NanoDrop UltraC FL, detectortype: 2048-elementen, CMOS lineaire beeldsensor, display: 10 inch High Definition kleuren display, talen: Chinees, Engels, Frans, Japans, Duits, lichtbron: Xenon-flits, spectrale bandbreedte: kleiner dan of gelijk aan 1,8 nm (FWHM bij Hg 254 nm), spanning: 12 VDC
MondpipetMillipore SigmaA5177Aspiratieslangassemblages voor gekalibreerde microcapillaire pipetten
Nuclease-vrij waterFisherFERR0581Thermo Scientific Water, nuclease-vrij
Pipetten (2,5 µL, 20 µL, 200 µL en 1000 µL)Eppendorf2231300004Eppendorf Research plus, 4-pack
RNase AwayFisher21-402-178Thermo Scientific RNase AWAY oppervlakte-decontaminatiemiddel
RNase-vrije buis en stamperFisher12-141-368RNase-vrije buisjes en stampers voor RNA-isolatie

Referenties

  1. Møbjerg N, Neves RC. New insights into survival strategies of tardigrades. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 2021;254:110890.
  2. Møbjerg N, Halberg KA, Jørgensen A, Persson D, Bjørn M, Ramløv H, et al. Survival in extreme environments—on the current knowledge of adaptations in tardigrades. Acta Physiol (Oxf). 2011;202(3):409-420.
  3. Hibshman JD, Clegg JS, Goldstein B. Mechanisms of desiccation tolerance: themes and variations in brine shrimp, roundworms, and tardigrades. Front Physiol. 2020;11:592016.
  4. Hengherr S, Schill RO. Environmental adaptations: cryobiosis. In: Schill RO, editor. Water Bears: The Biology of Tardigrades. Cham: Springer; 2018. p. 295-310.
  5. Schill RO, Hengherr S. Environmental adaptations: desiccation tolerance. In: Schill RO, editor. Water Bears: The Biology of Tardigrades. Cham: Springer; 2018. p. 273-293.
  6. Guidetti R, Rizzo AM, Altiero T, Rebecchi L. What can we learn from the toughest animals of the Earth? Water bears (tardigrades) as multicellular model organisms in order to perform scientific preparations for lunar exploration. Planet Space Sci. 2012;74(1):97-102.
  7. Jönsson KI. Radiation tolerance in tardigrades: current knowledge and potential applications in medicine. Cancers (Basel). 2019;11(9):1333.
  8. Clark-Hachtel CM, Hibshman JD, De Buysscher T, Stair ER, Hicks LM, Goldstein B. The tardigrade Hypsibius exemplaris dramatically upregulates DNA repair pathway genes in response to ionizing radiation. Curr Biol. 2024;34(9):1819-1830.e6.
  9. Hashimoto T, Kunieda T. DNA protection protein, a novel mechanism of radiation tolerance: lessons from tardigrades. Life (Basel). 2017;7(2):26.
  10. Chavez C, Cruz-Becerra G, Fei J, Kassavetis GA, Kadonaga JT. The tardigrade damage suppressor protein binds to nucleosomes and protects DNA from hydroxyl radicals. Elife. 2019;8:e47682.
  11. Kamilari M, Jørgensen A, Schiøtt M, Møbjerg N. Comparative transcriptomics suggest unique molecular adaptations within tardigrade lineages. BMC Genomics. 2019;20(1):607.
  12. Boothby TC, Tapia H, Brozena AH, Piszkiewicz S, Smith AE, Giovannini I, et al. Tardigrades use intrinsically disordered proteins to survive desiccation. Mol Cell. 2017;65(6):975-984.e5.
  13. Yoshida Y, Arakawa K, Tomita M, et al. Time-series transcriptomic screening of factors contributing to the cross-tolerance to UV radiation and anhydrobiosis in tardigrades. BMC Genomics. 2022;23(1):405.
  14. Anoud M, et al. Comparative transcriptomics reveal a novel tardigrade-specific DNA-binding protein induced in response to ionizing radiation. Elife. 2024;13:RP92621.
  15. Förster F, Liang C, Shkumatov AV, et al. Transcriptome analysis in tardigrade species reveals specific molecular pathways for stress adaptations. Bioinform Biol Insights. 2012;6:69-96.
  16. Horikawa DD, Sakashita T, Katagiri C, et al. Analysis of DNA repair and protection in the tardigrade Ramazzottius varieornatus and Hypsibius dujardini after exposure to UVC radiation. PLoS One. 2013;8(6):e64793.
  17. Yoshida Y, Arakawa K, Tomita M, et al. RNA sequencing data for gamma radiation response in the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus. Data Brief. 2021;36:107111.
  18. Li L, et al. Multi-omics landscape and molecular basis of radiation tolerance in a tardigrade. Science. 2024;386(6720):eadl0799.
  19. Hibshman JD, Clark-Hachtel CM, Bloom KS, Goldstein B. A bacterial expression cloning screen reveals single-stranded DNA-binding proteins as potent desicco-protectants. Cell Rep. 2024;43(11):114956.
  20. Hashimoto T, Horikawa DD, Saito Y, et al. Extremotolerant tardigrade genome and improved radiotolerance of human cultured cells by tardigrade-unique protein. Nat Commun. 2016;7:12808.
  21. Yoshida Y, Hirayama A, Arakawa K. Transcriptome analysis of the tardigrade Hypsibius exemplaris exposed to the DNA-damaging agent bleomycin. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2024;100(7):414-28.
  22. Murai Y, et al. Multiomics study of a heterotardigrade, Echiniscus testudo, suggests the possibility of convergent evolution of abundant heat-soluble proteins in Tardigrada. BMC Genomics. 2021;22(1):813.
  23. Boothby TC. Total RNA extraction from tardigrades. Cold Spring Harb Protoc. 2018;2018(11):prot102376.
  24. Arakawa K, Yoshida Y, Tomita M. Genome sequencing of a single tardigrade Hypsibius dujardini individual. Sci Data. 2016;3:160063.
  25. Yoshida Y, Sugiura K, Tomita M, Matsumoto M, Arakawa K. Comparison of the transcriptomes of two tardigrades with different hatching coordination. BMC Dev Biol. 2019;19(1):20.
  26. Yoshida Y, Arakawa K, Tomita M, et al. RNA sequencing data for gamma radiation response in the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus. Data Brief. 2021;36:107111.
  27. Kirk MJ, Xu C, Paules J, Rothman JH. Single-animal, single-tube RNA extraction for comparison of relative transcript levels via qRT-PCR in the tardigrade Hypsibius exemplaris. J Vis Exp. 2025;(215):e66935. doi:10.3791/66935.  
  28. Linz DM, Hara Y, Deem KD, Kuraku S, Hayashi S, Tomoyasu Y. Transcriptomic exploration of the coleopteran wings reveals insight into the evolution of novel structures associated with the beetle elytron. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 2023;340(2):197-213.
  29. Agilent Technologies Inc. RNA ScreenTape Assay for TapeStation Systems. Part No. G2991-90121 Rev. D. Santa Clara (CA): Agilent Technologies; 2018.
  30. Manchester KL. Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations. Biotechniques. 1996;20(6):968-70.
  31. Imbeaud S, et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Res. 2005;33(6):e56.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Multi soortenprotocolboodschapper RNARNA sequencingRNA interferentiestresstolerantieheterologe expressieomgevingsstressmoleculaire mechanismen
Video binnenkort beschikbaar
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.