Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Protocol voor RNA-isolatie uit meerdere tardigradensoorten

255 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/72120

⸱

1 september 2026

 ,  , 
1Biology Department, The University of North Carolina Asheville, 2Department of Biological Sciences, Florida International University, 3Biology Department, The University of North Carolina at Chapel Hill

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de procedures voor RNA-isolatie uit verschillende beerdiersoorten met behulp van een kolomgebaseerde RNA-isolatiekit, ontworpen om RNA te isoleren uit kleine hoeveelheden weefsel en voldoende hoeveelheden hoogwaardig RNA op te leveren voor downstream-toepassingen zoals RNA-sequencing en complementaire DNA-synthese.

Samenvatting

Beerdiertjes zijn microscopische dieren die bekendstaan om hun uitzonderlijke tolerantie voor omgevingsstress. Deze dieren kunnen uitdroging, extreme druk, lage temperaturen en hoge niveaus van ioniserende straling overleven. De moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze extremotolerante vermogens zijn echter nog niet volledig begrepen. De moleculaire benaderingen die worden gebruikt om deze mechanismen te onderzoeken, waaronder RNA-sequencing, RNA-interferentie (RNAi) en heterologe expressie van beerdiertjesgenen in systemen zoals bacteriën, vereisen de isolatie van hoogwaardig messenger RNA (mRNA) uit beperkt biologisch materiaal. In deze studie beschrijven we een reproduceerbaar protocol voor het isoleren van totaal RNA uit beerdiertjes dat (1) effectief is voor meerdere soorten, inclusief een heterotardigrade soort, (2) slechts 25–200 dieren vereist, afhankelijk van de lichaamsgrootte, en (3) RNA oplevert van voldoende hoeveelheid en kwaliteit voor downstream toepassingen. Het huidige protocol maakt een efficiënt RNA-herstel mogelijk uit een redelijk aantal beerdiertjes en ondersteunt moleculaire onderzoeken naar stresstolerantie bij verschillende beerdiertjessoorten.

Inleiding

Tardigraden staan bekend om hun vermogen om extreme stress te overleven die andere dieren niet zouden overleven, waaronder uitdroging, extreme druk, extreme temperaturen en DNA-beschadigende middelen zoals chemotherapeutica en ioniserende straling1,2,3,4,5,6,7,8. In recente jaren hebben wetenschappers de mechanismen die ten grondslag liggen aan de extreme veerkracht van tardigraden onderzocht met behulp van moleculaire benaderingen zoals RNA-sequencing, RNA-interferentie (RNAi) en heterologe expressie van tardigraden-genen in andere systemen, waaronder menselijke cellen en bacteriën8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Wanneer ze worden toegepast, zijn deze benaderingen een krachtig instrument gebleken om inzicht te krijgen in hoe tardigraden precies in staat zijn tot een dergelijke extreme stresstolerantie8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Al deze moleculaire benaderingen om de stresstolerantie van tardigraden te begrijpen, zijn echter afhankelijk van het vermogen om RNA uit deze kleine diertjes te isoleren in voldoende hoeveelheid en met adequate kwaliteit voor gebruik in downstream-processen.

Een eerdere methode voor RNA-isolatie uit beerdiertjes bleek succesvol voor onderzoekers die werkten met Hypsibius exemplaris23. Toen we echter probeerden dit protocol te repliceren in H. exemplaris, stelden we vast dat het onbetrouwbaar was wat betreft de resulterende RNA-concentratie en -kwaliteit (ongepubliceerde gegevens). Een alternatieve fenolgebaseerde methode voor RNA-isolatie is effectief gebleken voor H. exemplaris, Ramazzottius varieornatus en een heterotardigrade soort13,21,22,24,25,26. Er is aangetoond dat dit protocol RNA van voldoende kwaliteit en kwantiteit levert voor downstream processen, zowel van individuele dieren als van pools van dieren (~50). Dit protocol vereist echter dat de gebruiker werkt met fenolhoudende reagentia. Fenol is een gevaarlijke chemische stof die zorgvuldige hantering vereist, en een onjuiste uitvoering van dit protocol kan leiden tot fenoloverdracht, wat de RNA-zuiverheid en downstream toepassingen beïnvloedt. Een ander eerder gepubliceerd protocol voor RNA-isolatie uit beerdiertjes richt zich op de mogelijkheid om RNA te isoleren uit individuele dieren27. Hoewel dit een waardevol protocol is voor toepassingen zoals kwantitatieve PCR (qPCR)27, is het minder geschikt voor downstream toepassingen zoals RNA-sequencing, waarbij het doel is om een holistischer beeld te krijgen van hoe dieren reageren op een bepaalde stressfactor of conditie.

Deze beperkingen in de beschikbare protocollen voor RNA-isolatie leidden tot het onderzoek naar alternatieve methoden voor het isoleren van RNA uit tardigraden. De op kolommen gebaseerde RNA-isolatiekit die in dit protocol wordt gebruikt, is bedoeld voor het isoleren van RNA uit kleine hoeveelheden weefsel. Deze kit is eerder gebruikt voor het isoleren van RNA uit insectenweefsels voor daaropvolgende RNA-sequencinganalyse, wat suggereert dat deze geschikt zou kunnen zijn voor isolaties uit andere kleine, cuticula-bevattende dieren zoals tardigraden.28Deze studie beschrijft het stapsgewijze protocol voor het gebruik van deze kolomgebaseerde RNA-isolatiekit bij tardigraden, inclusief uitleg over specifieke voorzorgsmaatregelen die genomen moeten worden bij het uitvoeren van dit protocol met tardigraden. Dit artikel rapporteert het succes van dit protocol bij zes tardigradensoorten (H. exemplaris, Milnesium sp., Paramacrobiotus experimentalis, Paramacrobiotus fairbanksi, Paramacrobiotus gadabouti, en de heterotardigrada Viridiscus celatus). De studie heeft gevalideerd dat RNA van aanzienlijke kwaliteit en kwantiteit kan worden verkregen uit slechts 25 dieren. Er worden ook voorbeelden gegeven van de resulterende RNA-concentratie en kwaliteitsgegevens, welke geschikt zijn voor downstream-toepassingen zoals RNA-sequencing (met minimale bias, exponentiële bibliotheekamplificatie) en complementaire DNA (cDNA)-synthese. Dit RNA-isolatieprotocol is reeds nuttig gebleken voor het ontsluieren van mechanismen van stralingstolerantie in H. exemplaris8Het succes van dit protocol bij verschillende beerdiersoorten suggereert dat het breder toepasbaar zou zijn voor het onderzoek naar stress-tolerantiemechanismen, ontwikkelingsmechanismen en evolutionaire processen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het volgende protocol vereist geen institutionele ethische goedkeuring voor dierproeven, aangezien ongewervelde dieren zijn vrijgesteld van deze vereiste. De gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de Tabel met Materialen.

1. Voorbereiding van apparatuur en werkruimte voor RNA-isolatie

  1. Zet een warmteblok of waterbad op 42 °C ter voorbereiding op de RNA-extractie.
  2. Zorg voor een rek voor microcentrifugebuisjes, pipetten (2 µL, 20 µL, 200 µL en 1000 µL) en gefilterde pipetpunten van de juiste maat.
  3. Reinig het werkvlak, het buisjesrek, de pipetten en de tipdozen met RNase Away, een verdunde bleekoplossing (10%) of 70% ethanol om eventuele resterende RNase te denatureren.
    OPMERKING: Overmatige RNase op de apparatuur of in het gebied waar u RNA isoleert, kan leiden tot onvoldoende RNA-kwaliteit na isolatie als gevolg van degradatie. Verminder dit risico door voldoende tijd te geven aan de RNase-denaturerende chemicaliën en door het gebied en de apparatuur volledig te laten drogen voordat u verdergaat.
  4. Draag handschoenen tijdens alle stappen van dit protocol en behandel de handschoenen gedurende het hele protocol regelmatig met een RNase-denaturerende oplossing om RNase-degradatie van het RNA te voorkomen.

2. Verzamelen van dieren voor RNA-isolatie

  1. Verplaats 25–200 dieren (afhankelijk van de soortgrootte) van hun kweekschalen naar een schaal met schoon bronwater om de hoeveelheid niet-tardigradenmateriaal (algen of andere voedselbronnen zoals nematoden of rotiferen, afhankelijk van de soort) te verminderen, met behulp van een pipetteerbal bevestigd aan een aspiratiebuis-assemblagekamer voorzien van een glazen capillair (Figuur 1A), een Irwin-lus of een micropipet.
  2. Neem een RNase-vrije buis van 1,5 mL en een stamper.
  3. Verplaats de dieren naar de bodem van de RNase-vrije buis van 1,5 mL met behulp van een pipetteerbal bevestigd aan een aspiratiebuis-assemblagekamer voorzien van een glazen capillair of een Irwin-lus, waarbij u er bijzonder goed op let zo min mogelijk water samen met de dieren over te brengen.
  4. Centrifugeer 3 min bij 4.500 g om de tardigraden als pellet op de bodem van de microcentrifugebuis te brengen.
  5. Terwijl u de buis met de gepelletteerde tardigraden onder een dissectiemicroscoop observeert, gebruikt u een 20 µL pipet of een pipetteerbal bevestigd aan een aspiratiebuis-assemblagekamer voorzien van een glazen capillair met een opening die kleiner is dan de tardigraden waarvan u RNA isoleert, om voorzichtig zoveel mogelijk water te verwijderen zonder de pellet tardigraden te verstoren. Zie Figuur 1B voor een weergave van een acceptabele hoeveelheid resterend water.
    OPMERKING: Let erop dat u hier een dun laagje water achterlaat, zodat de dieren niet uitdrogen in de korte tijd tussen het verwijderen van het water en het toevoegen van de extractiebuffer (XB). Als de dieren uitdrogen, kan dit leiden tot een slechte RNA-kwaliteit na isolatie.
  6. Voeg 100 µL extractiebuffer (XB) toe aan de buis met de tardigraden.

3. Mechanische disruptie van tardigraden en RNA-extractie

  1. Gebruik de RNase-vrije stamper om de tardigraden te lyseren door de stamper gedurende ~30 s voorzichtig maar stevig tegen de bodem van de buis te wrijven. In totaal zouden 20–30 maal malen voldoende moeten zijn om de tardigraden te lyseren.
  2. Verwijder de stamper uit de buis, waarbij u er voorzichtig op let dat zoveel mogelijk vloeistof op de bodem van de buis achterblijft.
  3. Controleer de inhoud van de microcentrifugebuis onder de dissectiemicroscoop om er zeker van te zijn dat er geen zichtbare intacte dieren meer aanwezig zijn.
  4. Incubeer het mengsel 30 min bij 42 °C op een schuddend warmteblok met een zachte schudbeweging (300 rpm).
    OPMERKING: De extractiebuffer (XB) stabiliseert het RNA om degradatie bij deze temperatuur te voorkomen.

4. Conditioneren van de RNA-isolatiekolom

  1. Zet in de laatste 10 min van de extractie-incubatie de kolom voor de RNA-collectie en -zuivering in elkaar. Plaats een zuiveringskolom in een opvangbuisje en label de kolom op de juiste wijze.
  2. Voeg 250 µL Conditioning Buffer (CB) direct toe aan de kolom.
  3. Incubeer gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
  4. Centrifugeer 1 min bij 16,000 × g en gooi het doorstroomvolume weg. De kolom is nu klaar om het RNA-supernatans uit de volgende stap op te vangen.
  5. Haal de 10x DNase I Reaction Buffer en het Nuclease-Free Water uit de vriezer om deze volledig te laten ontdooien voor stap 6 hieronder.

5. Binding van RNA aan de kolom

  1. Centrifugeer na de extractie-incubatie de buis met de mechanisch gedisrupteerde tardigraden en extractiebuffer (XB) gedurende 2 min bij 3,000 × g.
  2. Neem een nieuwe RNase-vrije buis en label deze op de juiste wijze.
  3. Verwijder voorzichtig het supernatant van de gepelletteerde tardigraden-cuticula's met een 200 µL pipet met een filtertip. Zorg ervoor dat het cuticula-pellet niet wordt verstoord en dat alleen het supernatant wordt verwijderd.
    OPMERKING: Het overbrengen van cuticula naar volgende stappen zal leiden tot een lagere efficiëntie van de RNA-opbrengst van de kolom door fysieke verstopping van de kolom. Om deze potentiële fout te voorkomen, kan de pipetpunt met supernatant onder de microscoop worden gecontroleerd om de afwezigheid van cuticula te bevestigen. Als er cuticula aanwezig is, breng het supernatant dan terug in de buis en herhaal de centrifugatiestap.
  4. Overbreng het supernatant naar de nieuw gelabelde, RNase-vrije buis.
  5. Pipetteer 100 µL 70% ethanol in de buis met het RNA en meng dit grondig door meerdere keren op en neer te pipetteren. Bij deze stap moeten er duidelijke viskeuze filamenten zichtbaar zijn na toevoeging van de ethanol. Dit is een goed teken dat er RNA aanwezig is in het supernatant.
  6. Pipetteer het gehele mengsel (200 µL) op de voorbereide kolom uit stap 4.
    OPMERKING: Let er bij het pipetteren van oplossingen op de kolom in deze en volgende stappen op dat de vloeistof in het midden van de kolom wordt gedoseerd en vermijd fysiek contact tussen de pipetpunt en de kolom. Mechanische punctie van de kolom zal leiden tot problemen met de RNA-kwaliteit en -kwantiteit in latere stappen.
  7. Om RNA aan de kolom te binden, centrifugeert u gedurende 2 min bij 100 × g, gevolgd door centrifugatie bij 16,000 × g gedurende 30 s om het doorstroomvolume te verwijderen.

6. Bereiden van DNase I-oplossing

  1. Laat de 10x DNase I Reaction Buffer en het Nuclease-Free Water volledig ontdooien voordat u de oplossing bereidt.
  2. Bereid voor elke RNA-isolatie in een aparte 1,5 mL microcentrifugebuis een oplossing van 40 µL voor, bestaande uit 32 µL Nuclease-Free Water, 4 µL 10x DNase I Reaction Buffer en 4 µL DNase I Enzyme. Bewaar de oplossing op ijs totdat deze in stap 7.3 op de kolom wordt aangebracht.

7. Wassen van het RNA en DNase I-behandeling

  1. Pipetteer 100 µL Wasbuffer 1 (W1) direct op de zuiveringskolom die het gebonden RNA bevat (uit stap 5.7).
  2. Centrifugeer 1 min bij 8,000 × g en verwijder het doorstroomvolume.
  3. Pipetteer 40 µL DNase I-oplossing uit stap 6 direct op de zuiveringskolom en incubeer 15 min bij kamertemperatuur om DNA-contaminatie te verwijderen.
  4. Pipetteer 40 µL Wasbuffer 1 (W1) op de zuiveringskolom en centrifugeer 30 s bij 8,000 × g .
  5. Pipetteer 100 µL Wasbuffer 2 (W2) op de zuiveringskolom en centrifugeer 1 min bij 8,000 × g.
  6. Pipetteer nogmaals 100 µL Wasbuffer 2 (W2) op de zuiveringskolom en centrifugeer 2 min bij 16,000 × g. Gooi het doorstroomvolume weg.
  7. Centrifugeer de kolom 1 min bij 16,000 × g om de kolom te drogen.

8. Elueren van RNA

  1. Neem voor elke RNA-isolatie een 0,5 mL buis (inbegrepen in de kit) en label deze op de juiste wijze. Dit is de buis waarin het RNA na isolatie terechtkomt.
  2. Plaats de kolom met gebonden en gewassen RNA in de gelabelde 0,5 mL buis. De kolom moet stevig in deze buis klikken.
  3. Kijk van opzij naar de buis, positioneer de pipetpunt direct boven het kolommembraan, breng 11 µL Elution Buffer (EB) aan op de kolom en laat dit 1 min bij kamertemperatuur incuberen.
    OPMERKING: Als de Elution Buffer (EB) niet direct op de kolom wordt verdeeld, resulteert dit in lagere RNA-opbrengsten. Indien er vloeistofdruppels rond de rand van de kolom worden waargenomen, duidt dit op een onjuiste verdeling van de Elution Buffer (EB) op de kolom. In dat geval wordt aanbevolen deze stap te herhalen met het doorstroomvolume uit stap 8.5, waarbij men ervoor zorgt dat de Elution Buffer (EB) direct in het centrum van de kolom wordt aangebracht.
  4. Plaats de 0,5 mL buis met de kolom in de bij de kit geleverde opvangbuis voor een juiste passing tijdens centrifugatie (Figuur 2).
  5. Centrifugeer de kolom bij 1.000 × g gedurende 1 min om de Elution Buffer (EB) te verdelen, en centrifugeer vervolgens bij 16.000 × g gedurende 1 min om het RNA te elueren.
  6. Plaats de 0,5 mL buis met het RNA onmiddellijk op ijs.

9. Validatie van RNA-kwantiteit en -kwaliteit met een microvolume-spectrofotometer

OPMERKING: Andere methoden kunnen worden gebruikt om de RNA-kwantiteit en -kwaliteit te beoordelen. Hier wordt een methode met een microvolume-spectrofotometer gebruikt. Een fluorometer of een microfluïdisch gelelektroforese-instrument kan ook worden gebruikt29.

  1. Veeg de voet van de microvolume-spectrofotometer af met een pluisvrije doek om er zeker van te zijn dat deze vrij is van andere vloeistoffen.
  2. Selecteer de RNA -instelling op de spectrofotometer voor de analyse.
  3. Nul de spectrofotometer door 1 µL van de Elution Buffer (EB) te gebruiken die in stap 8.3 is gebruikt.
  4. Veeg na het nullen de Elution Buffer (EB) van de voet af met een pluisvrije doek.
  5. Houd de 0,5 mL buis met RNA op ijs en pipetteer 1 µL RNA op de voet van de spectrofotometer. Laat de arm van de spectrofotometer zakken om de absorbantie van het monster te meten, teneinde de hoeveelheid en de kwaliteit van het geïsoleerde RNA te kwantificeren en te beoordelen.
    OPMERKING: Raadpleeg de onderstaande sectie "Resultaten" voor details over de acceptabele kwaliteit en hoeveelheid voor downstream-applicaties.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een kritische stap in dit protocol, zoals hierboven vermeld, is het verwijderen van een passende hoeveelheid water uit de verzamelde tardigraden voordat de extractiebuffer (XB) voor RNA-extractie wordt toegevoegd. Het achterlaten van te veel water zal leiden tot verdunning van de extractiebuffer (XB) en tot een subpar (d.w.z. RIN < 7, 260/280-ratio <1,8, 260/230-ratio <1,8 en/of concentratie <5 ng/µL) RNA-extractie uit de dieren, wat resulteert in een verminderde RNA-concentratie en -kwaliteit na elutie. Het ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het doel van dit protocol is om de isolatie van RNA uit tardigraden te faciliteren met een voldoende hoge kwantiteit en kwaliteit om toepasbaar te zijn voor downstream-applicaties die onderzoek naar de stresstolerantie van tardigraden mogelijk maken. Het hier gepresenteerde protocol beschrijft gebieden waar gebruikers problemen kunnen ondervinden, waaronder het verwijderen van voldoende water vóór het toevoegen van extractiebuffer (XB) (stap 2.5), het lyseren van de lichamen van de tardigraden (stap 3.1–3.3), het overbre...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te melden.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door startfondsen van UNC Asheville (aan CCH) en een NSF-beurs 2225683 aan Jason Pienaar (postdoctoraal adviseur van PK). Wij danken de UNC High Throughput Sequencing Facility voor de technische ondersteuning.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1,5 mL MicrofugebuisjesUSA Scientific1615-5500Seal-Rite 1,5 mL gegradueerd microcentrifugebuisje, natuurlijk, polypropyleen, 500/zak
70% EthanolVWR71001-654Voor het reinigen van werkbanken/apparatuur
Arcturis PicoPure RNA Isolation KitFisherKIT0204Kit bevattende componenten voor het isolatieprotocol dat in dit manuscript wordt beschreven
CentrifugeEppendorf5405000441Centrifuge 5425, draaiknoppen, niet-gekoeld, met Rotor FA-24x2, 120 V/50-60 Hz (US)
Deer Park Spring WaterElke supermarktN/ADit is het medium voor tardigradenculturen en wordt gebruikt om tardigraden te spoelen voorafgaand aan de RNA-isolatie
DissectiemicroscoopZeissN/AZeiss Stemi 305, zoomfactor 5:1 en totale vergroting 8x-40x, met transilluminatie Unit M LED
DNase IFisherFEREN0521Thermo Scientific DNase I, RNase-vrij (1 U/µL)
Gefilterde pipetpunten 10 µLVWR76322-528Elke gefilterde pipetpunt is geschikt
Gefilterde pipetpunten 1000 µLVWR76322-154Elke gefilterde pipetpunt is geschikt
Gefilterde pipetpunten 20 µLVWR76322-134Elke gefilterde pipetpunt is geschikt
Gefilterde pipetpunten 200 µLVWR76322-150Elke gefilterde pipetpunt is geschikt
Glazen capillairenFisher50-821-811World Precision Instrument Standard Glass Capillaries - 1B120-6 (6 inch, OD 1,2 mm, zonder filament). Deze worden over een vlam uitgetrokken tot twee glazen capillairen met versmalle uiteinden en vervolgens gebroken tot de juiste diameter om de gekozen tardigradensoort met een mondpipet op te nemen.
WarmteblokEppendorf5382000023Eppendorf ThermoMixer C, basisapparaat zonder thermoblock, 100-130 V/50-60 Hz (US/JP/Zuid-Amerika/TW)
High Sensitivity RNA Screen Tape LadderAgilent5067-5581Ladder voor hooggevoelige analyse van totaal RNA op TapeStation-systemen
High Sensitivity RNA ScreenTapeAgilent5067-5579Voor hooggevoelige analyse van totaal RNA op TapeStation-systemen
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample BufferAgilent5067-5580Buffer voor hooggevoelige analyse van totaal RNA op TapeStation-systemen
Microfluidische gelelektroforeseAgilentG2991BAAgilent 4200 TapeStation Systeem
Microvolume spectrofotometerFisher13400607Thermo Scientific NanoDrop UltraC FL, detectortype: 2048-elementen, CMOS lineaire beeldsensor, display: 10 inch High Definition kleuren display, talen: Chinees, Engels, Frans, Japans, Duits, lichtbron: Xenon-flits, spectrale bandbreedte: kleiner dan of gelijk aan 1,8 nm (FWHM bij Hg 254 nm), spanning: 12 VDC
MondpipetMillipore SigmaA5177Aspiratieslangassemblages voor gekalibreerde microcapillaire pipetten
Nuclease-vrij waterFisherFERR0581Thermo Scientific Water, nuclease-vrij
Pipetten (2,5 µL, 20 µL, 200 µL en 1000 µL)Eppendorf2231300004Eppendorf Research plus, 4-pack
RNase AwayFisher21-402-178Thermo Scientific RNase AWAY oppervlakte-decontaminatiemiddel
RNase-vrije buis en stamperFisher12-141-368RNase-vrije buisjes en stampers voor RNA-isolatie

Referenties

  1. Møbjerg N, Neves RC. New insights into survival strategies of tardigrades. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 2021;254:110890.
  2. Møbjerg N, Halberg KA, Jørgensen A, Persson D, Bjørn M, Ramløv H, et al. Survival in extreme environments—on the current knowledge of adaptations in tardigrades. Acta Physiol (Oxf). 2011;202(3):409-420.
  3. Hibshman JD, Clegg JS, Goldstein B. Mechanisms of desiccation tolerance: themes and variations in brine shrimp, roundworms, and tardigrades. Front Physiol. 2020;11:592016.
  4. Hengherr S, Schill RO. Environmental adaptations: cryobiosis. In: Schill RO, editor. Water Bears: The Biology of Tardigrades. Cham: Springer; 2018. p. 295-310.
  5. Schill RO, Hengherr S. Environmental adaptations: desiccation tolerance. In: Schill RO, editor. Water Bears: The Biology of Tardigrades. Cham: Springer; 2018. p. 273-293.
  6. Guidetti R, Rizzo AM, Altiero T, Rebecchi L. What can we learn from the toughest animals of the Earth? Water bears (tardigrades) as multicellular model organisms in order to perform scientific preparations for lunar exploration. Planet Space Sci. 2012;74(1):97-102.
  7. Jönsson KI. Radiation tolerance in tardigrades: current knowledge and potential applications in medicine. Cancers (Basel). 2019;11(9):1333.
  8. Clark-Hachtel CM, Hibshman JD, De Buysscher T, Stair ER, Hicks LM, Goldstein B. The tardigrade Hypsibius exemplaris dramatically upregulates DNA repair pathway genes in response to ionizing radiation. Curr Biol. 2024;34(9):1819-1830.e6.
  9. Hashimoto T, Kunieda T. DNA protection protein, a novel mechanism of radiation tolerance: lessons from tardigrades. Life (Basel). 2017;7(2):26.
  10. Chavez C, Cruz-Becerra G, Fei J, Kassavetis GA, Kadonaga JT. The tardigrade damage suppressor protein binds to nucleosomes and protects DNA from hydroxyl radicals. Elife. 2019;8:e47682.
  11. Kamilari M, Jørgensen A, Schiøtt M, Møbjerg N. Comparative transcriptomics suggest unique molecular adaptations within tardigrade lineages. BMC Genomics. 2019;20(1):607.
  12. Boothby TC, Tapia H, Brozena AH, Piszkiewicz S, Smith AE, Giovannini I, et al. Tardigrades use intrinsically disordered proteins to survive desiccation. Mol Cell. 2017;65(6):975-984.e5.
  13. Yoshida Y, Arakawa K, Tomita M, et al. Time-series transcriptomic screening of factors contributing to the cross-tolerance to UV radiation and anhydrobiosis in tardigrades. BMC Genomics. 2022;23(1):405.
  14. Anoud M, et al. Comparative transcriptomics reveal a novel tardigrade-specific DNA-binding protein induced in response to ionizing radiation. Elife. 2024;13:RP92621.
  15. Förster F, Liang C, Shkumatov AV, et al. Transcriptome analysis in tardigrade species reveals specific molecular pathways for stress adaptations. Bioinform Biol Insights. 2012;6:69-96.
  16. Horikawa DD, Sakashita T, Katagiri C, et al. Analysis of DNA repair and protection in the tardigrade Ramazzottius varieornatus and Hypsibius dujardini after exposure to UVC radiation. PLoS One. 2013;8(6):e64793.
  17. Yoshida Y, Arakawa K, Tomita M, et al. RNA sequencing data for gamma radiation response in the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus. Data Brief. 2021;36:107111.
  18. Li L, et al. Multi-omics landscape and molecular basis of radiation tolerance in a tardigrade. Science. 2024;386(6720):eadl0799.
  19. Hibshman JD, Clark-Hachtel CM, Bloom KS, Goldstein B. A bacterial expression cloning screen reveals single-stranded DNA-binding proteins as potent desicco-protectants. Cell Rep. 2024;43(11):114956.
  20. Hashimoto T, Horikawa DD, Saito Y, et al. Extremotolerant tardigrade genome and improved radiotolerance of human cultured cells by tardigrade-unique protein. Nat Commun. 2016;7:12808.
  21. Yoshida Y, Hirayama A, Arakawa K. Transcriptome analysis of the tardigrade Hypsibius exemplaris exposed to the DNA-damaging agent bleomycin. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2024;100(7):414-28.
  22. Murai Y, et al. Multiomics study of a heterotardigrade, Echiniscus testudo, suggests the possibility of convergent evolution of abundant heat-soluble proteins in Tardigrada. BMC Genomics. 2021;22(1):813.
  23. Boothby TC. Total RNA extraction from tardigrades. Cold Spring Harb Protoc. 2018;2018(11):prot102376.
  24. Arakawa K, Yoshida Y, Tomita M. Genome sequencing of a single tardigrade Hypsibius dujardini individual. Sci Data. 2016;3:160063.
  25. Yoshida Y, Sugiura K, Tomita M, Matsumoto M, Arakawa K. Comparison of the transcriptomes of two tardigrades with different hatching coordination. BMC Dev Biol. 2019;19(1):20.
  26. Yoshida Y, Arakawa K, Tomita M, et al. RNA sequencing data for gamma radiation response in the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus. Data Brief. 2021;36:107111.
  27. Kirk MJ, Xu C, Paules J, Rothman JH. Single-animal, single-tube RNA extraction for comparison of relative transcript levels via qRT-PCR in the tardigrade Hypsibius exemplaris. J Vis Exp. 2025;(215):e66935. doi:10.3791/66935.  
  28. Linz DM, Hara Y, Deem KD, Kuraku S, Hayashi S, Tomoyasu Y. Transcriptomic exploration of the coleopteran wings reveals insight into the evolution of novel structures associated with the beetle elytron. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 2023;340(2):197-213.
  29. Agilent Technologies Inc. RNA ScreenTape Assay for TapeStation Systems. Part No. G2991-90121 Rev. D. Santa Clara (CA): Agilent Technologies; 2018.
  30. Manchester KL. Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations. Biotechniques. 1996;20(6):968-70.
  31. Imbeaud S, et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Res. 2005;33(6):e56.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Multi-soortenprotocolboodschapper-RNARNA-sequencingRNA-interferentiestresstolerantieheterologe expressieomgevingsstressmoleculaire mechanismen

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.