Geneesmiddel-geneesmiddelinteractie tussen Eugenol en repaglinide bij type 2 diabetes mellitus en het mogelijke mechanisme ervan

Samenvatting

Deze studie had als doel mogelijke geneesmiddel-geneesmiddelinteracties tussen eugenol (EUG) en repaglinide (RPG) te onderzoeken bij patiënten met type 2 diabetes mellitus (T2DM).

Samenvatting

Deze studie onderzocht de mogelijke geneesmiddel-geneesmiddelinteractie (DDI) tussen eugenol (EUG) en repaglinide (RPG) bij type 2 diabetes mellitus (T2DM). Er werd een T2DM-rattenmodel ontwikkeld met een vetrijk dieet en streptozotocine (STZ). De enkeldosisgroep kreeg 0,4 mg/kg RPG, en de co-toedieningsgroepen werden voorbehandeld met EUG (50, 100, 150 mg/kg) gedurende zeven dagen voordat een enkele dosis RPG (0,4 mg/kg) werd toegediend. De bloedglucose- en farmacokinetische parameters van RPG werden beoordeeld in de plasmamonsters van ratten. Het effect van EUG op RPG-metabole stabiliteit en cytochroom P3A (CYP3A)-activiteit werd geëvalueerd in rattenlevermicrosomen (RLM). Bij T2DM-ratten vertoonde RPG-behandeling een hypoglykemisch effect, dat verder werd versterkt door EUG-co-toediening op een dosisafhankelijke manier (p < 0,001). EUG-co-toediening beïnvloedde de farmacokinetiek van RPG door het oppervlak onder de curve te vergroten (AUC, stijging met 88,64%, 164,59% en 244,72% versus enkele RPG, p < 0,001), plasmamaximale concentratie (C_max, verhoogd met 18,61%, 53,58% en 77,63% versus single RPG, p < 0,01), maximale concentratie (T_max, 1,0 uur voor EUG co-toediening versus 0,5 uur voor single RPG), halfwaardetijd (t_1/2, verlengd 33,86%, 49,61% en 88,19% vs enkele RPG, p < 0,01), gemiddelde retentietijd (MRT, verlengd 17,62%, 26,42%, 44,04% vs enkele RPG, p < 0,001), en een verlaagde clearancegraad (Clz/F, afgenomen 48,92%, 63,31% en 74,10% vs enkele RPG, p < 0,001) op dosisafhankelijke wijze. In vitro RLM-studie verbeterde EUG de metabole stabiliteit van RPG door de halfwaardetijd te verlengen (44,09 ± 3,25 min) en de intrinsieke clearance te verminderen (30,55 ± 3,69 μL/min/mg eiwit). EUG remde ook de activiteit van CYP3A met een IC₅₀ van 7,90 ± 1,79 μM. Gelijktijdige toediening van EUG bevorderde het hypoglykemische effect van RPG door de systemische blootstelling aan RPG bij T2DM-ratten te vergroten, mogelijk door de metabole stabiliteit van RPG te verbeteren en de activiteit van CYP3A te remmen.

Inleiding

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is een chronische stofwisselingsstoornis die wordt gekenmerkt door insulineresistentie of verminderde insuline-efficiëntie, die miljoenen mensen wereldwijd treft¹. Complexe interacties met genetische vatbaarheids- en leefstijlfactoren zijn betrokken bij T2DM, wat leidt tot een verminderde glucoseopname, overmatige levergluconeogenese en chronische laaggradige ontsteking². T2DM kan leiden tot ernstige complicaties als het verkeerd wordt behandeld, waaronder hart- en vaatziekten, nierziekten, retinopathie en neuropathie, wat de levenskwaliteit van patiënten aanzienlijk beïnvloedt en de sterfte verhoogt². Huidige medicijnbehandelingen van T2DM omvatten metformine, sulfonylureum, GLP-1 receptoragonisten en DPP-4 remmers, enzovoort³. Repaglinide (RPG) is een soort kortwerkende meglitinide die werkt door insulineafgifte te stimuleren en de eigenschap van dosisflexibiliteit⁴ heeft. In vergelijking met sulfonylurea bieden gliniden superieure controle van postprandiale hyperglykemie, verminderen ze het risico op bepaalde bijwerkingen zoals hypoglykemie en bieden ze een gunstiger veiligheidsprofiel, vooral bij patiënten met nierfalen ^5,6. RPG wordt snel opgenomen na orale toediening, bereikt piekplasmaconcentraties meestal binnen 30–60 minuten, en de korte halfwaardetijd resulteert in een korte stimulatie van insulineafgifte. Klinisch wordt RPG gebruikt als monotherapie of in combinatie met andere orale antihyperglykemische middelen om de glycemische controle te optimaliseren⁷. De klinische toepassing ervan wordt echter beperkt door een lage orale biobeschikbaarheid (ongeveer 56%), een snelle leverstofwisseling en het potentiële risico op hypoglykemie 8,9,10,11,12,13,14. Deze nadelen benadrukken de noodzaak van een uitgebreid behandelplan.

Eugenol (EUG), chemisch bekend als 4-allyl-2-methoxyfenol, is een organische verbinding met de chemische formule C₁₀H₁₂O₂¹⁵. EUG is een kleurloze tot lichtgele vloeistof en is een actieve fenolische verbinding die voornamelijk voorkomt in kruidnagels (Eugenia caryophylllata Thunb.) en andere aromatische planten¹⁶. Veel aandacht is getrokken naar EUG vanwege de verschillende farmacologische eigenschappen, waaronder antioxidante, ontstekingsremmende, antibacteriële, pijnstillende en antitumoractiviteit^. Recente studies hebben aangetoond dat EUG de potentiële waarde als aanvullende therapie voor T2DM heeft getoond, aangezien zowel in vitro als in vivo experimenteel bewijs aangeeft dat EUG de insulinegevoeligheid verbetert, de opname van glucose in perifere weefsels bevordert, de levergluconeogenese remt en de functie van de alvleesklier β-cel beschermt^20,21. Deze veelzijdige maatregelen, gecombineerd met relatief lage toxiciteit²², positioneren EUG als een veelbelovende kandidaat voor een natuurlijk geneesmiddel dat tekortkomingen van traditionele klinische geneesmiddelen kan aanvullen en T2DM-gerelateerde complicaties kan verlichten via een synergetisch mechanisme.

De cytochroom P450-enzymen (P450's) spelen een cruciale rol in het proces van geneesmiddelmetabolisme en mediëren geneesmiddel-geneesmiddelinteracties (DDI's) door specifieke subtypes te induceren of te remmen, wat van vitaal belang is voor veilige en effectieve geneesmiddelbehandeling²³. Opmerkelijk is dat RPG voornamelijk in de lever wordt gemetaboliseerd door CYP2C8 en CYP3A4^24,25. Wanneer het samen met quercetine (QCT) wordt toegediend, verbetert QCT de biobeschikbaarheid van RPG in vivo door het hepatische first-pass en systemisch metabolisme via CYP450s²⁶ te remmen. Er is ook gerapporteerd dat EUG de activiteit van CYP450's, waaronder 1A2, 2C9, 2D6 en 3A4, op een concentratieafhankelijke manier onderdrukt, wat wijst op mogelijke interacties wanneer EUG wordt gecombineerd met geneesmiddelen die door deze enzymen²⁷ worden gemetaboliseerd. Ondanks het veelbelovende potentieel van EUG als aanvullende therapie voor T2DM en de bekende gevoeligheid van RPG voor CYP-gemedieerde DDI's, blijft het onduidelijk of EUG de systemische blootstelling, metabole stabiliteit of CYP3A-gemedieerde metabolisme van RPG verandert. Aangezien zowel EUG als RPG waarschijnlijk gezamenlijk worden toegediend in de klinische praktijk of in voedingssupplementen, vormt het ontbreken van DDI-gegevens tussen hen een potentieel risico op onbedoelde veranderingen in de plasmaconcentraties van RPG. Dergelijke veranderingen kunnen leiden tot een verminderde therapeutische werkzaamheid of een verhoogd risico op hypoglykemie. Deze bewijskloof vormt dus een aanzienlijk obstakel voor de rationele en veilige combinatie van natuurlijke producten met conventionele antidiabetica. Daarom is het essentieel om systematisch het effect van EUG op de farmacokinetiek en farmacodynamiek van RPG te evalueren en het onderliggende metabole mechanisme te verduidelijken, met bijzondere aandacht voor de activiteit van CYP3A. Gezien het bovenstaande bewijs zou men kunnen speculeren dat EUG het metabolisme van RPG kan beïnvloeden door de activiteit van CYP450 te veranderen. Dit is de eerste studie die de interactie tussen EUG en RPG in een T2DM-setting onderzoekt. De bevindingen zullen naar verwachting een kritieke kenniskloof opvullen en een mechanistische basis bieden voor het optimaliseren van de veilige gezamenlijke administratie van EUG en RPG in T2DM-beheer. Als co-toediening wordt overwogen, moet de mogelijkheid van verhoogde blootstelling aan RPG worden overwogen en moeten tekenen van hypoglykemie worden gemonitord, vooral wanneer EUG in hoge doses of als geconcentreerd supplement wordt ingenomen. Bovendien is het belangrijk dat ratten CYP3A-isoformen uitstralen die functioneel analoog zijn aan menselijke CYP3A4, maar directe extrapolatie van kwantitatieve bevindingen naar mensen vereist voorzichtigheid vanwege soortverschillen in enzymexpressie en katalytische activiteit.

Protocol

Deze studie werd goedgekeurd door het Ethisch Comité van de Jilin Academie van Chinese Medische Wetenschappen (datum: 2024.11.21/Nr.2024112) in overeenstemming met de ARRIVE-richtlijnen²⁸. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Huisvestingsomstandigheden voor dieren

Mannelijke Sprague-Dawley-ratten (200–250 g) werden in een laboratorium gehuisvest onder de volgende omstandigheden: temperatuur: 22 °C ± 2 °C, relatieve luchtvochtigheid: 40–60%, en een licht/donker cyclus van 12 uur, met vrije toegang tot voedsel en water om een week acclimatisatie^{te garanderen 29,30}.

2. Diermodellering, behandeling en monsterverwerking

De steekproefgrootte werd bepaald op basis van een vermogensanalyse met behulp van de F-test (G*Power 3.1.9.7). Er werd een a priori vermogensanalyse uitgevoerd met een effectgrootte van 0,6, een α-niveau van 0,05 en een gewenste macht van 0,8, wat een totale steekproefgrootte van 55 opleverde. Deze berekening gaf aan dat er minstens 9 ratten per groep nodig waren. Daarom werden tien ratten per groep gebruikt, wat een werkelijke kracht van 0,86 behaalde.

Voordat het T2DM-model werd ingevoerd, werden alle ratten 12 uur vast. Vervolgens werden ze willekeurig verdeeld in twee groepen: de controlegroep (n = 10) en de T2DM-groep (n = 50). De opstelling van het T2DM-ratmodel werd uitgevoerd volgens de eerder gerapporteerde methode³¹. Kort gezegd kregen ratten in de T2DM-groep vier weken lang een vetrijk dieet (met een vetgehalte van 60%) en kregen daarna één intraperitoneale injectie van 30 mg/kg STZ opgelost in een steriele citraatbuffer (pH 4,4). Drie dagen na de STZ-injectie werd de staartader bloedglucose van de ratten gemeten met een bloedglucosemeter, en ratten met een bloedglucoseconcentratie van meer dan 16,7 mmol/L werden beschouwd als succesvol de T2DM gevestigd. Voor de controlegroep kregen de ratten een normaal dieet en intraperitoneale injecties van 0,9% normale zoutoplossing in dezelfde periode als de T2DM-groep.

T2DM-ratten werden verder onderverdeeld in vier groepen met 10 ratten per groep: de T2DM + RPG-groep (enkele RPG), de T2DM + RPG + EUG (50 mg/kg) groep (co-RPG+EUG 50 mg/kg), de T2DM + RPG + EUG (100 mg/kg) groep (co-RPG+EUG 100 mg/kg), en de T2DM + RPG + EUG (150 mg/kg) groep (co-RPG+EUG 150 mg/kg). Na 12 uur vasten kregen ratten in de groep met één RPG oraal 0,4 mg/kg RPG (gesuspendeerd in normale zoutoplossing) via een gavage^{needle 26}. Ratten in de co-RPG+EUG-groepen kregen respectievelijk 50, 100 en 150 mg/kg EUG mondeling, eenmaal per dag gedurende zeven opeenvolgende dagen, en op de achtste dag, na een extra nuchtere periode van 12 uur, kreeg de co-toedieningsgroep daarnaast 0,4 mg/kg RPG via intragastrische gavage. Vervolgens werden bloedglucosewaarden beoordeeld met behulp van bloedmonsters die uit de staartader zijn genomen.

Voor farmacokinetische analyse werd het bloedmonster (0,2 mL) op verschillende tijdstippen (0,2 uur) genomen uit de posterieure orbitale veneuze plexus van de ratten in de hepariniseerde microcentrifugebuizen (0,25 uur, 0,5 uur, 1 uur, 2 uur, 4 uur, 6 uur en 8 uur na de dosis). Na het verzamelen werden de monsters gecentrifugeerd (1500 × g, 10 min, 4 °C) om het plasma te scheiden (lichtgeel, helder), dat werd opgeslagen bij -80 °C tot analyse. De plasmamonsters werden vervolgens geanalyseerd op RPG-concentratie met behulp van de HPLC-methode zoals beschreven in stap 4.

3. Metabolismestudie in de verzamelde rattenlevermicrosomen

Om het mechanisme achter de in vivo farmacokinetische veranderingen te onderzoeken, werd het effect van EUG op de metabole stabiliteit van de RPG en de activiteit van CYP3A geëvalueerd in RLM. RPG (3 μM) werd geïncubeerd met of zonder EUG in een PBS-buffer bij 37 °C met een totaalvolume van 200 μL, inclusief RLM (0,5 mg/mL microsomaal eiwit) en een NADPH-regeneratiesysteem (1,3 mM NADP, 3,54 mM glucose 6-fosfaat, 0,4 U/mL glucose 6-fosfaat dehydrogenase en 3,3 mM MgCl₂). Na een pre-incubatie van 5 minuten bij 37 °C zonder NADPH werd de reactie gestart door het toevoegen van het NADPH-regeneratiesysteem. Het mengsel werd vervolgens geïncubeerd bij 37 °C in een schudbad. Op verschillende incubatietijden (0 min, 5 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min) werden 30 μL monsters verzameld en overgebracht naar een microcentrifugebuis met ijskoud acetonitril om de reactie te beëindigen. De monsters werden gecentrifugeerd (12.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C) om het supernatant (helder) te verkrijgen. De resulterende supernatanten werden vervolgens geanalyseerd op RPG-concentratie met dezelfde HPLC-methode zoals beschreven in stap 4.

4. HPLC-analyse

De RPG-concentratie in plasma (vanaf stap 2) en microsomale incubaties (vanaf stap 3) werd geanalyseerd met de HPLC-methode gerapporteerd door Kim et ^al.26. De specifieke bewerkingsstappen zijn als volgt: monsters (120 μL) werden gemengd met 300 μL acetonitril met ketoconazol (interne standaard, 100 ng/mL) om eiwitprecipitatie te bereiken. Daarna werd het mengsel vortex en gecentrifugeerd op 15.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Het supernatant werd overgebracht naar een microkolom-centrifugebuis en verdampte bij 25 °C onder een stikstofatmosfeer. Het residu werd na het drogen opnieuw opgelost met 50 μL mobiele fase, vervolgens gevortexed en gecentrifugeerd. Vervolgens werd 40 μL van het supernatant in de HPLC-kolom geïnjecteerd (250 mm × 4,6 mm, deeltjesgrootte 5 μm). De kolom werd geëlueerd bij 25 °C in een isocratische elutiemodus met 10 mM fosfaatbuffer (pH 6,0) en acetonitril (volumeverhouding 46,4: 53,6), met een debiet van 1 mL/min. De eluent werd gemonitord met een fluorescentiedetector met een excitatiegolflengte van 240 nm.

5. Statistische analyse

Farmacokinetische analysesoftware werd gebruikt om farmacokinetische parameters te berekenen, waaronder AUC, C_max, T_max, t_1/2, MRT en clearance. Statistische analyse- en grafieksoftware werden gebruikt voor het genereren van figuren en data-analyse. Alle gegevens werden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie. Verschillen tussen groepen werden geanalyseerd met eenrichtings-ANOVA (voor glucoseniveauvergelijkingen) of tweerichtings-ANOVA (voor farmacokinetische parametervergelijkingen), waar toepasselijk, gevolgd door Tukey's post hoc-test voor meervoudige vergelijkingen. Het effect van EUG op CYP3A-activiteit werd geëvalueerd met behulp van niet-lineaire regressieanalyse. Een p-waarde < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

De halfwaardetijd van EUG bij RPG-metabole stabiliteit in RLM werd berekend door:
t_1/2 (min) = 0,693/ln(C_t/C₀ × 100).

Intrinsieke clearancesnelheid (μL/min/mg eiwit) = v × 0,693/t_1/2;
v (μL/mg) = incubatievolume/eiwitconcentratie.

Resultaten

EUG bevorderde het hypoglykemische effect van RPG bij T2DM-ratten
Het bloedglucoseniveau van de ratten in de T2DM-groep was verhoogd (p < 0,001, 95% BI: -13,90~-11,32) in vergelijking met dat van de controlegroep, wat wijst op de succesvolle geleiding van het T2DM-model (Figuur 1A). Toediening van één enkele RPG onderdrukte het bloedsuikerniveau bij de T2DM-ratten (p < 0,001, 95% BI: 5,26~7,84). Gelijktijdige toediening ...

Discussie

T2DM is een chronische metabole ziekte die langdurige behandeling vereist, en patiënten moeten vaak meerdere medicijnen nemen vanwege onderliggende aandoeningen zoals hart- en vaatziekten en nierziekte³². Het risico op DDI's neemt aanzienlijk toe bij co-toediening van medicijnen, omdat het de opname, het metabolisme of de werkzaamheid van hypoglykemische geneesmiddelen kan beïnvloeden, wat kan leiden tot acute risico's zoals hypoglykemisch coma en ongecontroleerde...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
acetonitrile	Merck, Germany	34851	≥99,9%
chromatographic column	Phenomenex, USA	00G-4041-E0	250 mm × 4,6 mm, particle size 5 μm
DAS	Beijing Bozhiyin, China	-	3.0
EUG	MUST Bio-technology, China	A0074	purity ≥99%
GraphPad Prism	GraphPad Software, USA	-	9.0.0
High Performance Liquid Chromatography	Shimadzu Corporation, Japan	228-45147-42	RF-20A
ketoconazole	Merck, Germany	K1003	Purity 99,0-101,0%
Male Sprague-Dawley rats	Shanghai Animal Center, China	-	200–250 g
NADPH	Merck, Germany	10107824001	97% (dry weight)
OneTouch Ultra2 blood glucose meter	Life Scan Inc., USA	https://shop.onetouch.com/onetouch-sup-reg-sup-ultra-sup-reg-sup-2-meter/product/OTSUS05_0019	-
PBS	Merck, Germany	P4474	ph 7.4
RLM	Merck, Germany	M9066	-
RPG	Merck, Germany	R9028	purity ≥98%
STZ	Merck, Germany	S0130	≥98% (HPLC)
EUG, eugenol; RPG, repaglinide; RLM, rat liver microsomes; NADPH, β-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate; STZ, streptozotocin; PBS, phosphate-buffered saline.