Stabiliserend eiwit en eiwit—RNA condensaten in laagsmeltende agarosehydrogels voor kwantitatieve biofysische metingen

Samenvatting

Hier presenteren we een robuuste methode om vloeistof-vloeistof fasegescheiden condensaten fysiek te immobiliseren binnen een poreuze, laagsmeltende agarosehydrogelmatrix zonder hun interne vloeistofdynamica te verstoren. De aanpak minimaliseert druppelsedimentatie, coalescentie en oppervlaktebevochtigde artefacten, waardoor reproduceerbare beeldvorming en kwantitatieve biofysische analyse over uren mogelijk zijn.

Samenvatting

Biomoleculaire condensaten gevormd door vloeistof-vloeistof fase-scheiding worden steeds vaker erkend als fundamentele organisatorische eenheden van de cel, met rollen variërend van RNA-verwerking tot assemblage van stressgranulaten. In vitro reconstitutie van dergelijke condensaten met gezuiverde eiwitten en RNA levert modelsystemen, maar vloeibare druppels worden grof, sedimenteren en verspreiden zich over oppervlakken in de loop van de tijd, wat aanzienlijke variabiliteit in kwantitatieve metingen over experimentele tijdsperioden introduceert. Het inbedden van deze condensaten in een spaarzaam, optisch transparant en chemisch inert hydrogel—hier bereid uit laagsmeltende agarose (LMA) bij 0,3–1,0% w/v—stabiliseert druppels in drie dimensies, waardoor methodologieën met langere meettijden of experimentele opstellingen met herhaalde metingen mogelijk zijn. Dit artikel presenteert een gedetailleerd, stapsgewijs protocol voor LMA-voorraadvoorbereiding, druppelvorming en inbedding, en geeft voorbeelden van specifieke downstream biofysische metingen. We tonen ook aan dat specifieke druppeleigenschappen, zoals moleculaire diffusie, behouden blijven na LMA-inbedding in de geteste representatieve systemen. Omdat de methode compatibel is met confocale, breedveld- of superresolutiemicroscopie, fluorescentieherstel na fotobleaching, of kernmagnetische resonantiespectroscopie, onder andere, kan het kwantitatieve karakterisering van biomoleculaire condensaten ondersteunen die relevant zijn voor gezondheid en ziekte.

Inleiding

Vloeistof-vloeistof fase-scheiding (LLPS) stimuleert de vorming van membraanloze organellen en biomoleculaire condensaten in cellen, waaronder stresskorrels, P-lichamen en nucleolus 1,2,3,4,5. Deze condensaten concentreren specifieke eiwitten en nucleïnezuren terwijl ze snelle uitwisseling met het omringende cytoplasma of nucleoplasma mogelijk maken – een kenmerk van vloeistofachtig gedrag 1,2,3,4,5. Dysregulatie van LLPS is in verband gebracht met verschillende ziekten, zoals neurodegeneratieve aandoeningen ^3,6,7, en wordt ook in verband gebracht met de replicatie van verschillende virussen, zoals SARS-CoV-2 ^8,9,10,11,12.

In vitro reconstitutie van condensaten met gezuiverde eiwitten en RNA onder gedefinieerde buffervoorwaarden is een hoeksteenbenadering geworden om LLPS-mechanismen te bestuderen ^3,4. Druppels in een reageerbuis of op een glasoppervlak zijn echter gevoelig voor drie grote artefacten: (i) zwaartekrachtsedimentatie, waardoor druppels zich op de bodem ophopen; (ii) samenvoeging, waarbij druppels in de loop van de tijd samensmelten tot minder, grotere structuren; en (iii) oppervlaktebevochtiging, waarbij druppels zich verspreiden en gedeeltelijk op de deklaag absorberen. Deze fenomenen verminderen de reproduceerbaarheid van kwantitatieve metingen en maken het moeilijk om individuele druppels in hun fysiologisch relevante dimensies^{te volgen 13}. Deze fenomenen beperken verder het gebruik van methoden die langere meettijden van minuten tot uren vereisen (bijv. nucleaire magnetische resonantie [NMR] spectroscopie of superresolutie microscopietechnieken zoals STORM) en verbieden herhaalde metingen over lange tijdschalen.

Fysieke immobilisatie binnen een hydrogelnetwerk behandelt alle drie de artefacten gelijktijdig. Agarose vormt een fysiek gekruiste gel bij temperaturen onder 34–38 °C. Bij concentraties van 0,3–1,0% w/v is de maasgrootte van agarose groot genoeg om intacte druppels op micrometerschaal te omvatten, terwijl het voldoende poreus blijft om de moleculaire dynamica binnen druppels¹³ niet te belemmeren. Daarnaast maakt de porositeit van de agarosematrix diffusie van macromoleculen en kleine moleculen in en uit de ingebedde druppels mogelijk. Voor bijzonder temperatuurgevoelige systemen waarbij eiwitten met gevouwen domeinen of die een bovenste/lagere kritische oplossing (UCST/LCST)-type fase-scheiding volgen, kan laagsmeltende agarose (LMA) met een geleringspunt van 26–30 °C worden gebruikt. Alternatieve anti-natmaakmethoden, zoals oppervlaktepassivatie, kunnen condensaatadhesie en dus natheid verminderen, maar vereisen vaak gespecialiseerde voorbereiding en voorkomen druppelsedimentatie of coalescentie niet. Daarentegen biedt agarose-inbedding een eenvoudige, breed toegankelijke methode om condensaten ruimtelijk te immobiliseren. Belangrijk is dat agarose is gevalideerd om de conformationele toestand van fused in sarcoom (FUS) en andere RNA-bindende eiwitten bij druppelvorming tot agaroseconcentraties van 1,0% w/v¹³ niet te verstoren. Dit protocol standaardiseert de agarose-embeddingbenadering voor algemeen gebruik met veel fase-scheidende eiwit- of eiwit-RNA-systemen van interesse, en biedt stapsgewijze richtlijnen voor de voorbereiding van reagens en monsters.

Protocol

1. Bereiding van agarose-bouillon

BELANGRIJK: Bereid de agarosevoorraad voor in dezelfde buffer die wordt gebruikt om de fasegescheiden monsters te maken (hierna "druppelbuffer" genoemd) om buffer^{mismatch 14} te voorkomen. Voorbeeld: Het nucleocapsidemonster wordt bereid in buffer A (25 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7,2), die ook gebruikt moet worden om de agarosevoorraad te bereiden.
OPMERKING: Definitieve experimentele voorwaarden, waaronder maar niet beperkt tot buffersamenstelling, eiwitconcentratie, het gebruik van additieven en de uiteindelijke monstervolumes, zijn sterk afhankelijk van het specifieke biologische systeem dat wordt onderzocht en de specifieke downstream-toepassing. Evenzo zijn de verwervingsparameters, de instrumentopstelling en data-analyse sterk afhankelijk van het monster en het specifieke experiment. Zo wordt de bereiding van het SARS-CoV-2 nucleocapside met poly(A) beschreven in Figuur 1A (confocale fluorescentiemicroscopie).

1. Weeg de juiste hoeveelheid LMA of gewone agarose in een buisje van 1,5 mL met druppelbuffer. Voorbeeld: Voor een 2% w/v aandeel, los 20 mg agarose op in 1 mL buffer A.
   OPMERKING: De uiteindelijke concentratie van de agarosevoorraad moet 1–2% w/v zijn, afhankelijk van de gewenste eindconcentratie van de agarose in het monster. Meer dan 2% w/v wordt niet aanbevolen omdat pipeten steeds moeilijker wordt. Knip het smalle uiteinde van de pipettip af om het pipetten makkelijker te maken, vooral bij hoge agarosepercentages. Raadpleeg het discussiegedeelte om te bepalen of LMA of gewone agarose vereist is voor de monsters.
2. Verhit de agarosefond tot 80–90 °C in een verwarmingsblok of waterbad en los de agarose volledig op door vortexen (duurt ongeveer 10 minuten).
   VOORZICHTIG: Gesmolten agarose is heet. Behandel het met voorzichtigheid.
3. Breng de agarosevoorraad in evenwicht tot 37 °C (LMA) of 55 °C (gewone agarose) in het verwarmingsblok of waterbad. Controleer of de oplossing helder en vloeibaar blijft bij deze temperatuur. Controleer indien nodig de temperatuur van de agarose-bouillon met een thermometer.
   PAUZEPUNT: Gesmolten agarosevoorraden kunnen 30–60 minuten warm worden gehouden.
   Het verwarmen van de agarose in een waterbad wordt sterk aanbevolen om een homogenere verwarming te garanderen en de doeltemperatuur met voldoende precisie te behouden. Dit is vooral belangrijk bij het werken met LMA, omdat kleine temperatuurafwijkingen kunnen leiden tot voortijdige gelatie.
4. Na het voorbereiden van het monster (sectie 2) bewaar je overgebleven agarosebouillons bij +4 °C. Volg de stappen 1.2 en 1.3 hierboven om de agarosevoorraad opnieuw te smelten en in balans te brengen vóór gebruik.
   OPMERKING: We raden aan de agarosevoorraad maximaal 2 weken op +4 °C te houden en deze niet meer dan 2–3 stolle/smeltcycli te ondergaan. Gebruik goede productiepraktijken om besmetting te voorkomen. Gooi voorraad eerder weg als ze niet opnieuw smelten of opnieuw uitharden, of als zichtbare besmetting optreedt.

2. Monstervoorbereiding

1. Verwarm alle materialen die direct in contact komen met de agarose (bijv. pipetten, buizen, microscopieglaasjes) tot ongeveer 37 °C door ze 2–3 minuten op het verwarmingsblok of in een broedmachine te plaatsen.
2. Bereid de agarosevoorraad voor zoals beschreven in Sectie 1.
3. Bereid druppelbuffer, de fase-scheidende componenten (bijv. eiwit- of RNA-voorraden) en eventuele andere toevoegingen (bijv. vernauwingsmiddelen, kleurstoffen) voor de monsters voor volgens het standaardprotocol. Evenwicht naar kamertemperatuur (RT). Voorbeeld: Buffer A (25 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7,2), nucleocapside-eiwitvoorraad (60 μM, in buffer A), poly(A)-voorraad (30 μM, in buffer A).
   OPMERKING: Voor fluorescentieherstel na fotobleaching (FRAP), confocale fluorescentiemicroscopie of stochastische optische reconstructiemicroscopie (STORM), voeg een kleine fractie van fluorescentie-gelabeld eiwit of RNA toe aan de eiwit- of RNA-voorraden (aanbevolen: <5% gelabelde fractie).
4. Bereken de volumes druppelbuffer, agarosevoorraad, de fase-scheidende componenten (bijv. eiwit of RNA van interesse) en eventuele aanvullende additieven (bijv. crowding-agenten) die nodig zijn voor het monster. Voorbeeld: 6 μL buffer A, 5 μL van 2% agarosevoorraad (eind 0,5%), 5 μL nucleocapside-eiwit (laatste 15 μM), 4 μL poly(A) (eind 6 μM). Eindvolume 20 μL.
   OPMERKING: Hoewel sterk afhankelijk van de schotel, buis, plaat of ander vat dat voor het experiment wordt gebruikt, zijn de veelgebruikte volumes 150 μL voor een 3 mm NMR-buis, 20 μL voor microscopie- of FRAP-experimenten in een 6-kanaals microscopie-dia, en 20–30 μL voor STORM-experimenten in 18-put microscopie-dia's (zie de Materiaaltabel).
   1. Als startwaarden gebruik je de uiteindelijke 0,3–0,5% van agarose voor standaard biofysische tests, en 0,8–1,0% w/v voor langdurige stabilisatie (bijvoorbeeld verouderingsexperimenten).
      OPMERKING: Voor langdurige stabilisatie en opslag van monsters moeten maatregelen worden genomen om uitdroging van het monster te voorkomen (bijvoorbeeld het afsluiten van de monstercontainer, het opslaan in een bevochtigde kamer en het toevoegen van een verdampingsbarrière) en om ervoor te zorgen dat de samenstelling en pH van de buffer stabiel blijven tijdens langdurige incubaties.
   2. Voor NMR-monsters voeg je de laatste 5% v/v D2O toe aan het monster voor locking.
      OPMERKING: De concentratie van alle andere componenten en het totale monstervolume hangen sterk af van de specifieke toepassing en experimentele opstelling.
5. Voeg de bijbehorende volumes buffer, fase-scheidende componenten, agarosevoorraad en additieven toe aan een voorverwarmde 1,5 mL buis.
   OPMERKING: We raden aan eerst de buffer en agarose toe te voegen, gevolgd door eventuele aanvullende toevoegingen. We raden verder aan om de fase-scheidende componenten als laatste toe te voegen om condensaatvorming te stimuleren. De optimale mengvolgorde hangt echter af van het systeem en moet vooraf worden bepaald. Dit is vooral relevant voor systemen waarin stoichiometrie en de volgorde van optelling een sterke invloed kunnen hebben op de grootte van druppels of compartimentering. Voorbeeld: De mengvolgorde voor het nucleocapsidemonster is eerst Buffer A, tweede agarosestock, derde nucleocapside-eiwit en laatste poly(A), met behulp van de volumes vermeld in stap 2.4. In dit voorbeeld wordt LLPS geactiveerd door de toevoeging van poly(A). Voor systemen waarin LLPS zichtbare troebelheid produceert, kan troebelheid dienen als een kwalitatieve QC-indicator; echter, aanvangstijd en zichtbaarheid zijn systeemafhankelijk, en het ontbreken van onmiddellijke troebelheid duidt op zichzelf niet op protocolfalen.
   1. Houd de slang in het verwarmingsblok of waterbad terwijl je een paar keer op en neer pipettert. Vermijd het introduceren van luchtbellen.
      OPMERKING: Zolang de agarose nog vloeibaar is, kunnen druppels fuseren. Daarom kan het variëren van de pre-incubatietijd op het verwarmingsblok of in een waterbad vóór het starten van de gelatie een nuttig hulpmiddel zijn om druppels van verschillende groottes te onderzoeken. Het karakteriseren van druppelgroeikinetiek in afwezigheid van agarose vóór het kiezen van het pre-incubatietijdinterval stelt onderzoekers in staat om reproduceerbaar een specifiek druppelgroottebereik te targeten.
6. Voor microscopie/FRAP-monsters:
   1. Gebruik een gewone pipet om het monster snel over te brengen naar/op de gekozen microscopie-dia-achtige (bijvoorbeeld kanaalmicroscopie-glaasje met coverslip-bodem).
   2. Laat gelatie bij RT 5–10 minuten toe (zie noot in de discussiesectie).
      OPMERKING: Verplaats de microscopie-glaasje niet tijdens deze periode. Bescherm fluorescerende monsters tegen licht.
   3. Meet het monster volgens het standaardprotocol. Voorbeeld: draaiende schijf confocale microscoop, 100x 1,45 plan apo olieobjectief, excitatiegolflengte 561 nm voor Cy3-kleurstof, verwerving 100 ms bij 30% laservermogen (Cy3) en 50 ms bij 6% lichtintensiteit (brightfield). Voor FRAP: Bleekgebied 1/10^{van de} druppeldiameter geplaatst in het midden van de druppel, 25 prebleekframes (opname zonder vertraging), 60 post-bleekframes (genomen met intervallen van 1 seconde), laserpuls voor bleeken 15 ms bij 70% laservermogen. Het herstel van FRAP analyseren door grootschalige normalisatie in open-access software; Rapporteer kinetische fittingparameters alleen als er een fitting wordt uitgevoerd.
7. Voor STORM-voorbeelden:
   1. Gebruik een gewone pipet om het monster snel over te brengen naar de STORM-slide van keuze (bijvoorbeeld een 18-well chamber-slide met coverslip-bodem). Geef het monster als druppel.
   2. Laat gelatie bij RT 5–10 minuten toe (zie noot in de discussiesectie).
      OPMERKING: Verplaats de microscopie-glaasje niet tijdens deze periode. Bescherm fluorescerende monsters tegen licht.
   3. Vul de hele put met STORM-buffer. Sluit de put af volgens het standaardprotocol.
   4. Evenwichtig het monster minstens 1–2 uur voorafgaand aan de meting zodat de STORM-buffer kan diffunderen in de agarosehydrogel.
      OPMERKING: Succesvolle diffusie van de STORM-buffer in het monster kan eenvoudig worden geverifieerd als de fluorescerende kleurstoffen knipperen tijdens STORM-verwerving. Afhankelijk van de monsterspecificaties kunnen langere evenwichtstijden nodig zijn.
   5. Meet het monster volgens het standaardprotocol dat wordt gebruikt. Voorbeeld: Ti2 omgekeerde microscoop, SR apochromat TIRF 100x 1.49 olieobjectief, sterk hellende dunne verlichting. Opname van 20.000 frames per monster, gezichtsveld 64 x 64 pixels, belichtingstijd 10 ms met een 125 mW 647 nm laser voor Cy5-kleurstof, en het gebruik van een 20 mW 405 nm laser om de overgang van de langlevende donkere toestand naar de grondtoestand te ondersteunen. Beelden werden verwerkt met maximum likelihood schatting en multi-emitter fitting. Er werd driftcorrectie toegepast, en alleen datapunten met een lokalisatieprecisie van 25 nm of beter werden in de uiteindelijke visualisatie opgenomen. De definitieve beelden worden geproduceerd met de methode van gemiddelde verschoven histogrammen bij 20x vergroting (1 pixel = 8 nm in de eindafbeelding).
8. Voor NMR-monsters:
   1. Gebruik een lange, dunne glazen pipet (voorverwarmd) om het monster snel in de NMR-buis te brengen. Geef het monster onderin de buis.
   2. Laat gelatie bij RT 5–10 minuten toe (zie noot in de discussiesectie).
      OPMERKING: Schud de NMR-buis niet tijdens deze periode.
   3. Meet het monster volgens het standaardprotocol dat wordt gebruikt. Voorbeeld: Veldsterkte van NMR 750 MHz met PATXI kamertemperatuurprobe, 3 mm buis, opname bij 25 °C, standaard pulssequentie (stebpgp1s19) voor diffusie (DOSY) experimenten, parameters: 4.096 punten met 32 scans, gradiëntsterkte 2–95%, diffusietijd 0,08 s, gradiëntpuls 12 ms, relaxatievertraging (d1) 5 s.

Resultaten

Het protocol werd toegepast op condensaten gevormd door het FUS N-terminale domein (FUS NTD) of door het SARS-CoV-2 nucleocapside (N) eiwit met poly(A) of s2m RNA als representatieve voorbeelden van zowel eiwit-only als eiwit-RNA druppels. Om te beoordelen of agarose de condensaatvorming onder de geteste omstandigheden detecteerbaar beïnvloedt, vormden we druppels met N-eiwit en poly(A) in aanwezigheid en afwezigheid van 0,5% w/v LMA. Omdat LMA na ongeveer 5 minuten bij RT stijgt, hebben we fluorescentiemicroscopiebeelden op dit tijdstip opgenomen en geobserveerd dat druppels in beide gevallen ongeveer even groot waren (Figuur 1A,B). Om het preventieve effect van agarose op druppelbevochtiging en fusie aan te tonen, maakten we 60 minuten na monstervoorbereiding een nieuwe set beelden. Hoewel de met agarose ingebedde druppels niet van grootte veranderden, vertoonden condensaten zonder LMA een drastische toename door fusie en oppervlaktebevochtiging (Figuur 1A,B). Hoewel we de druppels relatief vroeg na de nucleatie hebben ingebed, kunnen druppels van verschillende groottes worden ingebed door de pre-inbedding inbeddingtijd te variëren. Ondanks het inbedden van de druppels in agarosehydrogel, waren de gemeten condensaatdynamiek niet detecteerbaar veranderd. FRAP-herstel en daarmee de schijnbare druppeldiffusie waren zeer vergelijkbaar met en zonder LMA in het monster (Figuur 1C). Bovendien hebben eerdere diffusion-ordered NMR-spectroscopie (DOSY) experimenten met FUS NTD-condensaten aangetoond dat diffusiesnelheden niet detecteerbaar werden beïnvloed door agaroseconcentratie, althans niet binnen het bereik van 0,25–1% w/v (Figuur 1D) (aangepast van Emmanouilidis et ^al.13). Deze resultaten tonen aan dat een agarose-hydrogel geschikt is om fasegescheiden condensaten in ruimte en tijd op te vangen, waardoor herhaalde metingen over langere tijdsperioden mogelijk zijn.

Hoewel zowel microscopie- als FRAP-metingen vrij snel te registreren zijn (seconden tot minuten), vergen sommige experimenten enkele minuten (bijv. STORM, 1D ¹H NMR) of zelfs uren (bijv. 2D [¹⁵N ¹H] HSQC NMR) om te verkrijgen. Voor dergelijke experimenten is het cruciaal dat druppels tijdens de verwerving stil blijven en niet in de loop van de tijd sedimenteren. Hier laten we zien dat we N-eiwit + s2m RNA-druppels in LMA lang genoeg hebben gestabiliseerd om STORM-beelden te kunnen verkrijgen (Figuur 1E). Bovendien hadden NMR-spectra van FUS NTD-druppels in aanwezigheid en afwezigheid van agarose vergelijkbare lijnbreedtes, wat wijst op geen detecteerbare interactie tussen agarosehydrogels en het eiwit onder deze omstandigheden (Figuur 1F) (aangepast van Emmanouilidis et ^al.13). Daarentegen vertoonden spectra van agarose-ingebedde condensaten een hogere signaalintensiteit, waarschijnlijk omdat niet-gestabiliseerde druppels tijdens de verworving in de NMR-buis sedimenteerden en daardoor niet langer beschikbaar waren voor meting (Figuur 1F) (aangepast van Emmanouilidis et ^al.13). Samenvattend maakt stabilisatie van condensaten in agarose-hydrogels niet alleen tijdsverloopsexperimenten mogelijk, maar ook het gebruik van methodologieën met verlengde opnametijden, terwijl de gemeten druppeleigenschappen in de geteste representatieve systemen behouden blijven.

Figuur 1: Condensaatstabilisatie door agarose-inbedding zonder detecteerbaar verstoring van gemeten druppeleigenschappen. (A) Fluorescentiemicroscopie van 15 μM nucleocapside-eiwit met 6 μM Cy3-poly(A) (5% gelabeld) in buffer A (25 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 7,2) in aanwezigheid (+ agarose) of afwezigheid (geen agarose) van 0,5% w/v LMA. Beelden werden 5 minuten of 60 minuten na het mengen / agarose inbedding gemaakt. Beelden zijn representatief voor 7 beelden die zijn verkregen in n = 2 onafhankelijke experimenten. Schaalbalk = 5 μm. (B) Kwantificering van de druppelstralen van de condensaten zoals weergegeven in (A). De gegevens worden weergegeven als boxplots (box = interkwartielbereik, middenlijn = mediaan, whiskers = bereik van resterende data, punt = uitschieters). Gemiddelde straal ± standaarddeviatie (sd) en het aantal geanalyseerde druppels in elke toestand worden direct op de grafiek weergegeven. De gegevens volgen een normale verdeling. Individuele druppels werden niet behandeld als onafhankelijke biologische replicaten voor statistische inferentie. Er werd geen statistische test uitgevoerd; Verdelingen worden beschrijvend weergegeven. (C) FRAP van de druppels getoond in (A) op tijdstip 5 min. Fotobleaching werd uitgevoerd met de 561 nm laser (Cy3). De gegevens tonen de genormaliseerde intensiteit (gemiddelde ± sd van n = 3 onafhankelijke replicaties per conditie), die wordt verkregen door het gebleekte signaal te normaliseren naar de waarden vóór het bleekmiddel, een ongebleekt gebied van hetzelfde monster en de achtergrondfluorescentie. (D) Onverminderd DOSY-signaal van 200 μM FUS NTD-eiwit in buffer B (30 mM HEPES, 200 mM KCl, 600 mM ureum, pH 7,3) in aanwezigheid van 0,25, 0,5 of 1,0% met reguliere agarose. N = 1. (E) Confocale fluorescentiemicroscopie en STORM-beelden van 15 μM Cy5-nucleocapside-eiwit (5% gelabeld) met 6 μM viraal s2m RNA in buffer A met 0,5% w/v LMA. Representatief voor n = 3 onafhankelijke experimenten. Schaalbalk = 1 μm in beide afbeeldingen. (F) 1D ¹H NMR-spectra (links) en 2D [¹⁵N ¹H] HSQC NMR-spectra (rechts) van 200 μM FUS NTD in buffer B in aanwezigheid of afwezigheid van 0,5% w/v reguliere agarose. N = 1. Panelen (D) en (F) zijn gereproduceerd uit Emmanouilidis et ^al.13 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Het succes van agarose-inbedding van biomoleculaire condensaten hangt af van verschillende factoren. Ten eerste moet agarose worden gehandhaafd op temperaturen die hoog genoeg zijn om voortijdige gelatie te voorkomen, en tegelijkertijd laag genoeg om biomoleculaire structuren of interacties niet te verstoren. Laagsmeltende agarose heeft een gelingpunt van 26–30 °C en een smeltpunt van 60–65 °C, terwijl gewone agarose een gelingpunt van 34–38 °C en een smeltpunt van 90–95 °C heeft. Ten tweede zijn snelle menging en overdracht in het eindreactievat (bijv. NMR-buis) cruciaal, omdat kleine afwijkingen in timing of temperatuur kunnen leiden tot ongelijke inbedding en daarmee verminderde reproduceerbaarheid.

Ondanks deze kritieke punten kan de methode gemakkelijk worden aangepast aan verschillende experimentele behoeften. Voor fasescheidende systemen met intrinsiek ongeordende eiwitten of systemen die niet gevoelig zijn voor warmtedenaturatie, kan gewone agarose worden gebruikt in plaats van LMA om kosten te besparen. Bij het voorbereiden van monsters met eiwitten met gevouwen domeinen, of een ander temperatuurgevoelig (bio)molecuul dat gevoelig is voor warmtedenaturatie, moet LMA worden gebruikt om denaturatie te voorkomen. Een controlemonster dat alleen warmte bevat/geen agarose bevat, kan worden voorbereid om de effecten van agarose-inbedding te scheiden van de effecten van tijdelijke monsterverwarming. Om het risico op deze temperatuurafhankelijke denaturatie-effecten te verminderen, is laagsmeltende agarose bijzonder geschikt voor temperatuurgevoelige monsters, terwijl de agaroseconcentratie kan worden aangepast om de maasgrootte en de mate van mechanische opsluiting te moduleren. Voor zeer gevoelige diffusiemetingen, zoals de recent ontwikkelde NMR-methode genaamd LLPS REDIFINE^15,16, is de laagste agaroseconcentratie die sedimentatie voorkomt meestal te verkiezen, meestal 0,3–0,5% w/v. Voor rijpingsexperimenten die weken tot maanden stabiliteit vereisen, is 0,8–1% w/v te verkiezen. Deze parameters moeten geoptimaliseerd worden om effectieve stabilisatie te garanderen zonder de morfologie of dynamiek van het condensaat merkbaar te veranderen en moeten altijd worden aangepast aan het specifieke systeem. Deze validatie vereist een vergelijking van monsters met en zonder agarose-inbedding (en verder identieke omstandigheden) of vergelijking van verschillende agaroseconcentraties (om concentratieafhankelijke mesh-effecten uit te sluiten), bijvoorbeeld met microscopie om druppelmorfologie te beoordelen, FRAP om diffusie te beoordelen, of een andere methode die geschikt is om druppeleigenschappen te beoordelen die belangrijk zijn voor de onderzoeker.

De gelatietijd is een andere belangrijke overweging. De tijd die agarose nodig heeft om te stollen, hangt af van verschillende factoren, zoals het type buffer, pH, de uiteindelijke agaroseconcentratie, de starttemperatuur en of er gebruik wordt gemaakt van laagsmeltende of gewone agarose. Meestal bestook de agarose binnen 5–10 minuten. De gelatie van de agarosevoorraad kan worden gebruikt als indicatie voor de gelatie van het monster. Evenzo maakt het variëren van de pre-incubatietijden vóór agarose-inbedding een reproduceerbare karakterisering van verschillende druppelgroottes mogelijk. Bufferkeuze is ook cruciaal¹⁴. Het is van vitaal belang dat de agarosevoorraad wordt voorbereid in dezelfde buffer als die wordt gebruikt om de monsters te bereiden, om buffermismatch te voorkomen. De buffer moet er een zijn waarin bekend is dat het systeem zich kan faseren.

Temperatuurgevoeligheid moet voor elk systeem worden meegenomen. Veel fase-scheidingssystemen vertonen thermo-reversibel fasegedrag, bekend als UCST/LCST-type LLPS. Daarom moet korte blootstelling aan licht verhoogde temperaturen tijdens het mengen van agarose worden gevalideerd om te waarborgen dat dit het fasegedrag of de gemeten druppeleigenschappen niet verstoort. Als er problemen ontstaan, kunnen deze meestal worden opgelost door temperatuurcondities te verfijnen, de verwerkingstijd te minimaliseren of de agaroseconcentratie aan te passen. Zo wordt LMA-aandelen idealiter verwarmd tot 37 °C, maar LMA-aandelen blijven liquide bij 33–35 °C.

Probleemoplossing is belangrijk omdat verschillende faalmodi kunnen ontstaan, afhankelijk van het monster en de experimentele opstelling. Als druppels oplossen bij het mengen met agarose, kan dit veroorzaakt worden door te warm LMA of door buffer mismatch. In dit geval moet de LMA-voorraad precies op of enkele graden onder de streeftemperatuur worden gehouden en voorbereid worden in een identieke buffer als het eiwit/RNA van belang. Als er voortijdige gelatie optreedt in de pipettip, kan dit komen doordat de LMA te koud is of dat de tips niet voorverwarmd zijn. Om dit te voorkomen moeten tips en buizen worden voorverwarmd tot 37 °C, moet de bediener snel werken en moet het verwarmingsblok op de gewenste temperatuur worden gehouden. Als natting, coalescentie of sedimentatie in de loop van de tijd plaatsvindt, kan dit komen doordat de gel te dun is of door ongelijkmatige gelatie. In dit geval kan de LMA-concentratie worden verhoogd en moet zelfs gelatie bij kamertemperatuur worden gegarandeerd. Als de agaroseoplossing zichtbare deeltjes bevat, kan dit te wijten zijn aan onvolledige agarose-oplossing. In dit geval moet de agarose worden verhit tot volledig transparant en grondig gemengd worden vóór gebruik (bijvoorbeeld in vortex). Als er luchtbellen worden toegevoegd tijdens het mengen of pipetteren, kunnen deze de beeldvorming verstoren en leiden tot een ongelijke condensaatverdeling. Om de vorming van bellen te minimaliseren, moeten oplossingen voorzichtig worden gemengd door langzaam omhoog en omlaag te pipetten. Als heterogene gelatie of ongelijke condensaatverdeling wordt waargenomen, kan dit te wijten zijn aan onvoldoende menging of lokale temperatuurgradiënten tijdens gelatie. In dit geval moeten monsters op het verwarmingsblok (of waterbad) worden bewaard totdat alle componenten zijn toegevoegd, onmiddellijk maar voorzichtig gemengd en onder uniforme temperatuuromstandigheden zijn laten stollen. Steile temperatuurgradiënten moeten worden vermeden; Stolling bij kamertemperatuur wordt aanbevolen (en stolling in de koelkast moet worden vermeden). In langetermijnexperimenten kan de verdamping van het monster de concentraties opgeloste stoffen en condensaateigenschappen veranderen. Om verdamping te minimaliseren, moeten monsters correct worden afgesloten en waar mogelijk in een vochtigheidsgecontroleerde omgeving worden bewaard.

In tegenstelling tot methoden zoals paraformaldehydefixatie fixeert agarose-inbedding monsters niet chemisch. Daarom blijven condensaten dynamisch, wat voordelig is voor functionele studies maar de langetermijnopslag beperkt. Voor langere experimentele tijdsperioden moeten voorzorgsmaatregelen worden genomen om verdamping en bufferveranderingen, zoals pH-verschuivingen, te voorkomen. Bovendien, hoewel agarose over het algemeen weinig interactie heeft in deze assays, moeten potentiële indirecte effecten op diffusie of de lokale omgeving worden meegenomen. Als agarose–biomolecuulinteracties worden vermoed, zoals niet-specifieke binding van het eiwit aan agarose, kunnen alternatieve hydrogelmatrices zoals fotogekruiste polyethyleenglycoldiacrylaat (PEG-DA), met bijpassende gaasgrootte en porositeit, worden overwogen. De afwezigheid van interacties moet worden gevalideerd door FRAP te meten in de aanwezigheid en afwezigheid van de matrix.

Naast chemische fixatie worden oppervlakpassivatiestrategieën zoals BSA-, PEG- of oppervlakte-activant-gecoate oppervlakken en ondersteunde lipide-dubbellagen vaak gebruikt om condensaatadhesie en natheid te verminderen. Hoewel deze benaderingen effectief oppervlakinteracties minimaliseren, voorkomen ze niet de beweging van condensaat, sedimentatie of fusie. Agarose-embedding vult deze methoden daarom aan door fysieke immobilisatie te bieden terwijl de condensaatdynamiek behouden blijft, wat het bijzonder nuttig maakt voor langdurige experimenten, driedimensionale beeldvorming en kwantitatieve metingen die een stabiele plaatsing van het monster vereisen. De keuze van methode moet daarom worden geleid door het experimentele doel.

Al met al bieden agarosehydrogels een eenvoudige maar effectieve manier om condensaten in drie dimensies te stabiliseren. Dit voorkomt druppelbenatting en fusie zonder de gemeten intrinsieke eigenschappen in de geteste representatieve systemen merkbaar te verstoren, waardoor tijdverloopsexperimenten en technieken die lange verwervingstijden vereisen, zoals NMR-spectroscopie¹⁵, mogelijk maakt. Hoewel deze methode om verschillende redenen mogelijk niet geschikt is voor alle fasescheidingssystemen, is de hier gepresenteerde methode toepasbaar op de studie van verschillende biomoleculaire condensaten en kan bijzonder nuttig zijn voor het onderzoeken van rijpingsprocessen die relevant zijn voor neurodegeneratieve ziektemechanismen¹⁷.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1.5 mL tubes	elke merk is OK	N/A
18-well kamerschijven	ibidi	81816	voor STORM
agarose, lage geltemperatuur	Sigma-Aldrich	A9414	moleculaire biologie kwaliteit
agarose, ultra zuiver	Invitrogen	16500500
kanaalschijven	ibidi	80606	voor microscopie
confocale microscoop	Nikon	N/A
Cy5-kleurstof, NHS chemie	Jena Biosciences	FP-201-CY5	voor het labelen van eiwitten
D2O (deuteriumoxide)	Sigma-Aldrich	151882
easyFRAP	Koulouras et al. 2018	N/A	https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29901776/
Everspark 2.0 dSTORM buffer	idylle	KMO|ETE+
FUS NTD-eiwit	N/A	N/A	recombinant geëxpresseerd in ons lab, zoals beschreven in ref 13 (Emmanouilidis et al. Nat Chem Biol 2021)
verwarmingsblok of waterbad	elke merk is OK	N/A	elke fabrikant of model is voldoende
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
beeldanalysesoftware	Fiji	N/A	https://fiji.sc/
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NMR-spectrometer	Bruker	N/A	750 MHz, PATXI kamertemperatuur probe, zie ref 13 voor meer details (Emmanouilodis et al. Nat Chem Biol 2021)
NMR-buis	Bruker	N/A	3 mm, glas
P10, P20, P200 en P1000 pipetten	elke merk is OK	N/A
pCp-Cy3-kleurstof	Jena Biosciences	NU-1706-CY3	voor het labelen van RNA
poly(A) RNA	N/A	N/A	in ons lab in vitro getranscribeerd, lengte ca. 50 nucleotiden, zoals beschreven in Kathe et al. Mol Biol Cell 2024
s2m RNA	N/A	N/A	in ons lab in vitro getranscribeerd, lengte 45 nucleotiden, sequentie: 5'-GGUUCACCGAGGCCACGCGGAGU ACGAUCGAGUGUACAGUGAACC-3', zoals beschreven in Kathe et al. Mol Biol Cell 2024
SARS-CoV-2 nucleocapside-eiwit	N/A	N/A	recombinant geëxpresseerd in ons lab, zoals beschreven in Kathe et al. Mol Biol Cell 2024
software voor het plotten (bijv. R)	R-Project	Versie 4.2.1	https://www.r-project.org/
STORM-microscoop	Nikon N-STORM	N/A
ThunderSTORM-plug-in	Ovesny et al. 2014	N/A	https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC4207427/
tips voor de gebruikte pipetten	elke merk is OK	N/A
TopSpin	Bruker	Versie 3.2 en 4.1
ureum	Sigma-Aldrich	U5128