Methodenartikel

Het richten van Cas9 voor het uitvoeren van rescue-experimenten in stabiel getransduceerde knockout HEK293-cellen

93 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/72172

⸱

28 augustus 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological and Environmental Sciences, Le Moyne College, 2Department of Immunology and Microbial Disease, Albany Medical College

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol elimineert het Cas9-eiwit na genoomredigering om robuuste rescue-experimenten in stabiel getransduceerde knockout-cellijnen te faciliteren.

Samenvatting

De CRISPR-Cas9-genbewerkingstechnologie heeft de moleculaire biologie gerevolutioneerd. Vaak wordt deze technologie ingezet om een gen te deleten dat codeert voor een eiwit van belang. Het resulterende fenotype biedt waardevolle inzichten in de functie van het eiwit. Het functionele belang van het doeleiwit kan worden bevestigd door het eiwit opnieuw te introduceren om de verloren gegane functie te herstellen (rescue). Dit wordt doorgaans bereikt door het eiwitcoderende cDNA in trans te introduceren met behulp van een expressievector. Echter, in knockout-cellijnen die het CRISPR-Cas9-systeem stabiel tot expressie brengen, kan het nieuw geïntroduceerde expressieplasmid eveneens door Cas9 worden gesplitst. Het hier gepresenteerde protocol biedt een strategie om deze potentiële barrière voor rescue-experimenten te omzeilen. Deze aanpak wordt gedemonstreerd met behulp van HEK293-cellen waarin het gen dat codeert voor het E3-ubiquitine-ligase scaffold-eiwit CUL4B werd onderbroken door CRISPR-Cas9. Transductie van deze cellen met een gids-RNA (gRNA) gericht op het geïntegreerde Cas9-transgen leidde tot het verlies van detecteerbaar Cas9-eiwit. De ablatie van Cas9 maakte herstel van de CUL4B-expressie en -functie mogelijk na introductie van een CUL4B-expressieplasmid. Deze resultaten leveren een proof of concept voor een breed toepasbare aanpak om eiwitfuncties te bestuderen via rescue-experimenten.

Inleiding

CRISPR-Cas9 is een krachtige tool voor genoommodificatie, afgeleid van een natuurlijk voorkomend adaptief immuunsysteem dat door prokaryoten wordt gebruikt ter verdediging tegen bacteriofageninfecties. Vanwege de lage kosten, het hoge succespercentage en het gebruiksgemak heeft CRISPR-Cas9-technologie andere tools voor genoommodificatie, zoals zinkvingernucleasen (ZFN's) en transcription activator-like effector nucleasen (TALEN's), overtroffen voor nauwkeurige genetische modificatie, met name in celculturen. Het twee-componentensysteem bestaat uit een Cas9-nuclease en een gids-RNA (gRNA). Via Watson-Crick-basenparing stuurt het gRNA Cas9 naar een genomisch doelwit dat grenst aan een protospacer adjacent motif (PAM). De PAM-sequentie dient als een kritische herkenningsplaats die de nucleaseactiviteit mogelijk maakt. Op die plaats veroorzaakt Cas9 een dubbelstrengse breuk (DSB). Bij afwezigheid van een homologe reparatietemplate repareert de cel de DSB via non-homologous end joining (NHEJ). Dit reparatiemechanisme kan inserties of deleties (indels) introduceren, wat leidt tot frameshift-mutaties en functionele knockout van het doelgen. Disruptie van het doelgen wordt derhalve bereikt door Cas9 samen met een engineered gRNA te introduceren. De 20-nucleotiden gRNA-sequentie is complementair aan een genomische site direct grenzend aan de PAM. Het resulterende functionele verlies van het doelgen onthult de specifieke rollen van dat gen in cellulaire processen1.

Een rescue-experiment, of complementatie-assay, houdt in dat het ontbrekende eiwit wordt hersteld om aan te tonen dat het geobserveerde fenotype wordt omgekeerd. Deze benadering dient als een strikte controle om onbedoelde experimentele effecten uit te sluiten, zoals die voortvloeien uit 'off-target' CRISPR-Cas9-deleties. De meest gebruikelijke methode voor het opnieuw introduceren van een eiwit van belang is via transfectie of transductie van een exogene expressievector. Dit geïntroduceerde DNA is echter vatbaar voor dezelfde CRISPR-Cas9-targeting als de endogene locus. Dit risico is bijzonder hoog in stabiel getransduceerde cellijnen, waarbij constitutieve Cas9-expressie gekoppeld is aan antibioticaselectie om een homogene en consistente knockout-populatie te garanderen; een strategie die vaak vereist is in cellijnen die moeilijk te transfecteren of transduceren zijn, zoals die afkomstig zijn van immuun-, hematopoëtische of neuronale lineages.

Een methode om vector-targeting te omzeilen is het introduceren van exogeen mRNA dat codeert voor het eiwit van belang, waardoor Cas9-gemedieerde klieving en de noodzaak voor nucleaire transcriptie worden omzeild. Vergeleken met plasmide-DNA is synthetisch mRNA echter kostbaarder om te produceren, inherent minder stabiel en levert het een zeer kortstondige expressie op. Bovendien zijn specifieke chemische modificaties vereist om te voorkomen dat cytosolische aangeboren immuunreacties worden geactiveerd2.

Om te voorkomen dat het Cas9/gRNA-complex expressieplasmiden target, kan wobble-base engineering van de coderende sequentie worden toegepast. Door gebruik te maken van de degeneratie van de genetische code kunnen synonieme mutaties worden geïntroduceerd om de vereiste PAM-sequentie te elimineren en/of de gRNA-complementariteit te verstoren, zonder de aminozuursequentie van het gecodeerde eiwit te veranderen. Het gebruik van synonieme mutaties is echter niet zonder risico. Deze wijzigingen kunnen leiden tot suboptimaal codongebruik, wat de translatiekinetiek kan verstoren en kan leiden tot verkeerde eiwitvouwing, verminderde mRNA-stabiliteit of schadelijke veranderingen in de RNA-secundaire structuur3,4. Hoewel minder frequent, omvatten andere potentiële gevolgen de introductie van cryptische polyadenyleringssignalen, de verstoring van post-transcriptionele regulatieve motieven en een verhoogde CpG-dichtheid5,6. Bovendien kunnen gemanipuleerde sequenties onbedoeld cellulaire stressresponsen triggeren als de resulterende mRNA-structuur de ribosomale progressie hindert7,8.

Naast de uitdagingen die gepaard gaan met het gebruik van synthetische mRNA's of wobble-base engineering, introduceert de constitutieve expressie van Cas9 na bewerking verschillende storende variabelen in downstream assays. Omdat de specificiteit van Cas9 imperfect kan zijn, verhoogt aanhoudende expressie de kans op off-target splitsing, wat leidt tot de cumulatieve acquisitie van onbedoelde mutaties in de loop van de tijd9,10,11. Bovendien kunnen chronische genomische surveillance en repetitieve DSB's een aanhoudende DNA-schaderespons triggeren, wat cellen uiteindelijk richting celcyclusarrest, senescentie of apoptose drijft12,13. Deze constitutieve productie legt ook een metabolische belasting op, waardoor clonale drift wordt gepotentieerd waarbij cellen met een lage expressie cellen met een hoge expressie verdringen, wat resulteert in inconsistente transgeenniveaus over opeenvolgende passages. Ten slotte kan Cas9, als groot prokaryoot eiwit, stress triggeren via aangeboren immuunsignalering of het proteostase-apparaat van de gastheer overbelasten, waardoor de unfolded protein response wordt geïnduceerd14,15,16.

Om deze complicaties te beperken, zijn verschillende strategieën voor transiënte Cas9-inhibitie ontwikkeld, waaronder faag-afgeleide Anti-CRISPR-eiwitten (Acrs)17,18, kleine-molecule-remmers of degron-gefuseerde systemen zoals PROTACs19,20, en optogenetische controlemechanismen19,21. Deze benaderingen brengen echter praktische hindernissen met zich mee die hun bruikbaarheid voor rescue-assays beperken. Acrs remmen via moleculaire mimicry en vereisen daarom stoichiometrische optimalisatie voor precisie. Acrs kunnen bovendien dezelfde proteostatische en immunogene stress verergeren die gepaard gaat met Cas9-overexpressie. Chemische modulatie introduceert farmacokinetische complexiteiten, potentiële cytotoxiciteit en PROTAC-geassocieerde 'hook effects', waarbij overmatige ligandconcentraties paradoxaal genoeg de productieve vorming van ternaire complexen voorkomen22. Optogenetische platforms worden beperkt door cellulaire fototoxiciteit en de behoefte aan gespecialiseerde hardware om een consistente lichttoevoer te garanderen19,21. Belangrijk is dat deze methoden, omdat ze slechts tijdelijke of reversibele inhibitie bieden, vaak onvoldoende zijn voor toepassingen waarin Cas9 constitutief tot expressie komt.

In tegenstelling hiermee bieden zelf-inactiverende CRISPR-systemen een permanente oplossing door het Cas9-transgen autonoom en definitief te disrupten direct na een succesvolle bewerking van het doelgen. Door residuele nucleaseactiviteit te elimineren, beschermt deze aanpak daaropvolgende rescue-vectoren permanent tegen splitsing, terwijl tegelijkertijd proteostatische stress op lange termijn en off-target genomische drift worden verminderd. Hoewel zelf-gerichte gRNA's kunnen worden afgeleverd via transiënte ribonucleoproteïne- of lipide-gebaseerde transfecties23,24, zijn deze methoden gevoelig voor verdunning en stochastische variatie, wat resulteert in een "mozaïek"populatie waarin sommige cellen aan inactivering ontsnappen25,26,27.

Om deze beperkingen te overwinnen, maakt het hier beschreven protocol gebruik van een lentiviraal afleversysteem voor Cas9-zelfinactivering, wat duidelijke praktische voordelen biedt voor de modificatie van stabiele cellijnen. Lentivirale aflevering waarborgt de gekoppelde overerving van het Cas9-transgen en de daarop gerichte regulator, waardoor de 'dilutie-ontsnapping' die typisch is voor snel delende populaties effectief wordt voorkomen. Bovendien staat de uitgebreide ladingscapaciteit van lentivirale vectoren de co-expressie van selectiemarkers toe om een homogene, Cas9-gedeleteerde populatie te garanderen, terwijl hun brede tropisme, veroorzaakt door VSV-G pseudotyping, een hoogefficiënte aflevering in moeilijk te transfecteren celtypen faciliteert25,28,29.

Als proof-of-concept demonstratie van deze methode beschrijft dit protocol de zelf-inactivatie van Cas9 om fenotypische redding van het E3-ubiquitine-ligase scaffold-eiwit CUL4B te faciliteren in CUL4B-knockout HEK293-cellen30.

Protocol

Voor deze studie werden gevestigde geïmmortaliseerde menselijke cellijnen (HEK293 en HEK293FT) gebruikt; er was geen sprake van menselijke proefpersonen, primair menselijk weefsel of dierproeven. Daarom was goedkeuring van een institutionele ethische commissie niet vereist.

1. Genereren van het Cas9-specifieke gRNA lentivirale construct

  1. Voeg de Cas9-specifieke gRNA-sequentie (Tabel 1) in de pLentiGuide-Puro lentivirale vector in.
  2. Vervang het antibioticumresistentiegen door een gen dat verschilt van de resistentiemarker die wordt gebruikt voor de selectie van de stabiel getransduceerde CRISPR-Cas9-cellijn.
  3. Verifieer de succesvolle insertie en sequentiegetrouwheid van zowel het Cas9-specifieke gRNA als het vervangende antibioticumresistentiegen via Sanger-sequencing met behulp van vectorspecifieke primers.
    OPMERKING: In dit protocol werd het puromycineresistentiegen (PuroR) vervangen door het hygromycine B-resistentiegen (HygroR) om de vector Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro te genereren. Alternatieve antibioticumresistentiegenen zijn onder meer blasticidine S (BlastR), G418/Geneticin (NeoR) en zeocin (ZeoR).

2. Productie van lentivirus dat Cas9-specifiek gRNA codeert

  1. Seed 2.5 × 106 HEK293FT-cellen in een weefselkweekbehandelde schaal van 10 cm.
    OPMERKING: Houd de cellen in stand in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; hoog glucose) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) (hierna aangeduid als cDMEM) en incubeer deze bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO22HEK293FT-cellen worden gebruikt omdat ze hogere lentivirale titers genereren dan andere cellijnen afgeleid van HEK293.31.
  2. Incubeer de cellen gedurende 12 uur tot ze een confluentie van ten minste 60% bereiken vóór transfectie.
    WAARSCHUWING: Voer alle procedures met lentivirale vectoren van de derde generatie uit onder Bioveiligheidsniveau 2 (BSL-2) condities, met gebruik van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) en goedgekeurde contaminatieprocedures (bijv. een biologische veiligheidskast klasse II, secundaire containment en 70% ethanol), zoals beschreven door Pauwels et al.32.
  3. Bereid een standaard calciumfosfaat- (CaPhos) transfectiemengsel. Verdun 20 µg van totaal plasmide-DNA in steriel water van moleculaire biologie-kwaliteit tot een eindvolume van 450 µLVoeg toe 50 µL van 2,5 M CaCl₂2, gevolgd door 500 µL van 2× HEPES-gebufferde zoutoplossing (HBS; pH 7,05), om een eindvolume van 1 mL te verkrijgen in een 1,5 mL microcentrifugebuis.
    OPMERKING: Gebruik sequentie-geverifieerd, hoofdzakelijk supercoiled plasmid DNA dat voldoet aan de volgende kwaliteitscriteria: A260/A280 = 1,8–2,0, A260/A230 = 2,0–2,2 en endotoxine <0,1 EU/µgBereid het transfectiemengsel voor met een bij benadering equimolaire ratio bestaande uit 5 µg Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro, 5.6 µg pLP1 (Gag/Pol), 3.8 µg pLP2 (Rev), en 5.6 µg pLP/VSVG (vesiculair stomatitis virus-glycoproteïne).
  4. Meng de CaPhos-transfectieoplossing grondig door voorzichtig te pipetteren.
  5. Voeg 1 mL van het CaPhos-transfectiemengsel druppelsgewijs toe aan de HEK293FT-celcultuur.
  6. Schud de kweekschaal voorzichtig om de transfectiecomplexen gelijkmatig te verspreiden.
  7. Incubeer de cellen gedurende 12 u.
    OPMERKING: Calciumfosfaat-transfectie wordt over het algemeen niet beïnvloed door standaard onderhoudsantibiotica33Echter wordt een antibioticumvrij medium aanbevolen voor gevoeligere transfectiemethoden, zoals lipofectie, omdat polyanionische antibiotica de vorming van DNA-lipidecomplexen kunnen beïnvloeden.34.
  8. Aspireer het cultuurmedium en gooi dit weg.
  9. Was de cellen één keer met 10 mL steriele 1 op kamertemperatuur× fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
  10. Zuig de PBS af en gooi deze weg.
  11. Voeg 10 mL vers cDMEM op kamertemperatuur toe.
  12. Plaats de cellen terug in de incubator en laat de lentivirale deeltjes gedurende 36 uur accumuleren in het kweekmedium.
    OPMERKING: Onder deze omstandigheden wordt geschat dat ongeconcentreerd lentiviraal supernatant ongeveer 1,0 oplevert × 106 transducerende eenheden (TU)/mL na 48 u, hoewel de werkelijke titer experimenteel bepaald dient te worden zoals beschreven door Kutner et al.35 of Barde et al.36Bewaar het lentivirale supernatant bij −80 °C tot maximaal 2 jaar. Vermijd herhaalde vries-dooi-cycli, aangezien deze de virale titer met ongeveer 55% kunnen verlagen37,38,39,40.

3. Oogsten van lentivirus coderend voor Cas9-specifiek gRNA en transductie van doelcellen

  1. Zaad 1.0 × 106 adherente doelcellen in een weefselkweekbehandelde schaal van 10 cm.
  2. Incubeer de doelcellen 12 uur voor lentivirale transductie.
    OPMERKING: De doelcellen zijn HEK293-cellen die stabiel tot expressie brengen Streptococcus pyogenes Cas9, een CUL4B-targeterend gRNA (Tabel 1), en een puromycineresistentiegen (PuroR). Houd de cellen in stand in cDMEM dat 10 µg/mL puromycine en verifieer de disruptie van CUL4B via western blot-analyse vóór de zelf-inactivatie van Cas9. Voer alle daaropvolgende experimenten uit met HEK293-cellen van een vroege passageΔCUL4B cellen.
  3. Oogst het lentivirus-bevattende medium door het supernatant van de HEK293FT-producercellen voorzichtig over te brengen naar een steriele conische buis van 15 mL, waarbij u er op let dat de cellaag niet wordt verstoord.
    OPMERKING: Voer de HEK293FT-producentcellen af volgens de vastgestelde richtlijnen voor biologische veiligheid32.
  4. Centrifugeer het opgevangen supernatant bij 1.000 × g gedurende 10 min bij kamertemperatuur (KT) om eventuele resterende HEK293FT-producerende cellen te pelletteren.
  5. Zuig het kweekmedium af en gooi dit weg uit de eerder gezaaide HEK293-cellenΔCUL4B cellen
  6. Overbreng 7 mL van het geklaarde lentivirale supernatant naar de 10 cm petrischaal met de HEK293-cellen.ΔCUL4B cellen. Vermijd het verstoren van de pellet onderin de centrifugebuis en laat ten minste 1 mL residueel supernatant achter om overdracht van producercellen te minimaliseren.
    OPMERKING: Filtreer het supernatant door een 0.45 µm filter, indien gewenst, om resterende producerende cellen verder te elimineren. Verwijder het overgebleven supernatant conform de richtlijnen voor biosafety32Bij een geschatte titer van 1,0 × 106 TU/mL, wordt verwacht dat een inoculum van 7 mL een multipliciteit van infectie (MOI) tussen 3,5 en 5,5 zal produceren41.
  7. Incubeer de getransduceerde HEK293-cellenΔCUL4B de cellen gedurende 24 uur incuberen om volledige lentivirale transductie en integratie mogelijk te maken.
  8. Aspireer en verwijder het virale supernatant.
  9. Was de cellen één keer met 10 mL steriele 1 op kamertemperatuur× PBS.
  10. Aspireer de PBS en gooi deze weg.
  11. Voeg 10 mL vers cDMEM op kamertemperatuur toe.
  12. Plaats de cellen terug in de incubator en kweek ze gedurende vier dagen om transgene expressie en Cas9-disruptie mogelijk te maken.
    OPMERKING: Als de lentivirale Cas9 gRNA-vector geen fluorescent reporter codeert, transduceer dan een parallelle sentinel-cultuur met een vergelijkbaar gegenereerde lentivirale vector die een fluorescent reporter tot expressie brengt. Gebruik de sentinel-cultuur om de transplantatie-efficiëntie en de timing van de targetgen-depletie te schatten via kwalitatieve fluorescentiemicroscopie of kwantitatieve flowcytometrie. In deze studie werd GFP-expressie vier dagen na transplantatie eenvoudig gedetecteerd met fluorescentiemicroscopie.

4. Antibiotische selectie van Cas9-specifieke gRNA-transductanten

OPMERKING: Vier dagen na transductie moeten de doelcellen confluent of bijna confluent zijn en overgebracht worden naar een groter kweekvat. Voer de celoverdracht gelijktijdig uit met de start van de antibioticaselectie.

  1. Snuif het kweekmedium van de HEK293ΔCUL4B -cellen af en gooi dit weg.
  2. Was de cellen één keer met 10 mL steriele 1× fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) op kamertemperatuur.
  3. Snuif de PBS af en gooi deze weg.
  4. Voeg 2 mL steriele trypsin-EDTA-oplossing op kamertemperatuur toe aan de kweekschaal.
  5. Incubeer de cellen gedurende 5 min om loslating te bevorderen.
  6. Voeg 8 mL cDMEM op kamertemperatuur toe om het trypsine te neutraliseren.
  7. Overbreng de celsuspensie naar een steriele conische buis van 15 mL.
  8. Tritureer de celsuspensie 15–20 keer om cellulaire aggregaten grondig te dissociëren.
  9. Centrifugeer de cellen bij 200 × g gedurende 10 min op kamertemperatuur.
  10. Bereid, terwijl de cellen centrifugeren, een T150 weefselkweek-behandelde fles voor die 20 mL cDMEM bevat, aangevuld met 250 µg/mL hygromycine B.
    OPMERKING: De vereiste concentratie hygromycine B voor selectie kan variëren tussen celtypen. Voer een kill-curve uit met 50–500 µg/mL hygromycine B om de minimale concentratie te bepalen die nodig is om alle niet-getransduceerde cellen binnen 7–10 dagen te elimineren. Als er een alternatieve antibioticumresistentiemarker wordt gebruikt in de Cas9 gRNA-vector, voer dan een kill-curve uit met 2–10 µg/mL blasticidine S, 400–800 µg/mL G418/Geneticine of 50–400 µg/mL zeocine.
  11. Snuif het supernatant af en gooi dit weg zonder de celpellet te verstoren.
  12. Resuspendeer de celpellet in 10 mL cDMEM aangevuld met 250 µg/mL hygromycine B.
  13. Overbreng de 10 mL celsuspensie naar de voorbereide T150-fles met 20 mL selectiemedium.
  14. Schud de fles voorzichtig om de cellen gelijkmatig te verdelen.
  15. Incubeer de cellen onder selectie gedurende drie dagen.
  16. Snuif op dag 3 van de selectie het selectiemedium af en vervang dit door 30 mL vers cDMEM aangevuld met 250 µg/mL hygromycine B.
    OPMERKING: Het vervangen van het selectiemedium verwijdert niet-adherente dode cellen, vult voedingsstoffen aan en behoudt de antibioticumactiviteit.
  17. Zet de incubatie voort totdat de overlevende cellaag een confluentie van ongeveer 90% bereikt, gewoonlijk na nog eens vier dagen.

5. Validatie van Cas9-klaring en in trans CUL4B-redding

OPMERKING: Zodra de cellen een confluentie van ongeveer 90% bereiken, dient de Cas9-ablatie in de initiële experimenten te worden bevestigd en moet de resterende celpopulatie onmiddellijk worden cryopreserveerd42. Deze aanpak minimaliseert de ontwikkeling van secundaire compensatiemechanismen.

  1. Zaai HEK293ΔCUL4B-cellen met een laag passagegetal die stabiel een Cas9-targeting gRNA tot expressie brengen (hierna aangeduid als HEK293ΔCUL4BΔcas9) in vier putjes van een met weefselkweekbehandelde 6-wells plaat met een dichtheid van 2,5 × 105 cellen per putje.
  2. Zaai HEK293ΔCUL4B-cellen in vier putjes van een aparte 6-wells plaat. Zaai ouderlijke HEK293-cellen in ten minste één extra putje om als controle te dienen.
    OPMERKING: Gebruik de HEK293ΔCUL4B en de ouderlijke HEK293-culturen respectievelijk als controles voor Cas9- en CUL4B-expressie.
  3. Incubeer alle culturen gedurende 12 u om volledige celadhesie en actieve proliferatie mogelijk te maken.
  4. Bereid calciumfosfaat (CaPhos) transfectiemengsels voor die 0, 0,5, 1,0 of 2,0 µg pCMV-FLAG-CUL4B bevatten. Pas elk mengsel aan naar een constant totaal van 10 µg plasmide-DNA door een lege pCMV-vector toe te voegen.
  5. Verdun elk DNA-mengsel in steriel water van moleculaire biologie-kwaliteit tot een eindvolume van 180 µL, voeg 20 µL 2,5 M CaCl2 toe en voeg vervolgens 200 µL 2× HEPES-gebufferde zoutoplossing (HBS; pH 7,05) toe om een eindvolume van 400 µL te verkrijgen in een 1,5 mL microcentrifugebuis.
    OPMERKING: Voer bij gebruik van expressieplasmiden onder controle van sterke promotors (bijv. CMV) een DNA-titratie uit om eiwitexpressieniveaus te bereiken die vergelijkbaar zijn met de endogene expressie. Gebruik sequentie-geverifieerd, overwegend supercoiled plasmide-DNA met A260/A280-waarden van 1,8–2,0, A260/A230-waarden van 2,0–2,2 en een endotoxinegehalte van <0,1 EU/µg.
  6. Meng elke CaPhos-transfectieoplossing grondig door voorzichtig te pipetteren.
  7. Voeg 200 µL van elk transfectiemengsel druppelsgewijs toe aan het aangewezen putje met HEK293ΔCUL4BΔcas9-cellen. Wissel de pipetpunten tussen monsters om kruiscontaminatie te voorkomen.
  8. Voeg de resterende 200 µL van elk bijbehorend transfectiemengsel druppelsgewijs toe aan het aangewezen putje met HEK293ΔCUL4B-cellen.
  9. Incubeer de getransfecteerde culturen gedurende 12 u.
  10. Aspireer het kweekmedium uit elk putje.
  11. Was de cellen één keer met 1 mL steriele 1× PBS op kamertemperatuur.
  12. Aspireer en verwijder de PBS.
  13. Voeg 2 mL vers cDMEM op kamertemperatuur toe aan elk putje.
  14. Incubeer de culturen nogmaals 24 u om CUL4B-expressie en daaropvolgende functionele responsen mogelijk te maken.
  15. Oogst de cellen met standaard trypsinisatieprocedures.
  16. Overbreng elke celsuspensie naar een afzonderlijke 1,5 mL microcentrifugebuis.
  17. Was elke celsuspensie één keer met 1× PBS.
  18. Centrifugeer de monsters kort op 14.000 × g bij kamertemperatuur om de cellen te pelletteren.
  19. Aspireer en verwijder de PBS-supernatant.
    WAARSCHUWING: β-mercaptoethanol is een vluchtige huid- en luchtweginirritant met een sterke geur. Hanteer stamoplossingen in een gecertificeerde chemische zuurkast terwijl u geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen draagt, waaronder chemisch bestendige handschoenen, een laboratoriumjas en een veiligheidsbril. Voer gecontamineerde punten, buisjes en afval af volgens de institutionele richtlijnen voor gevaarlijk afval.
  20. Lyseer elke celpellet direct in 200 µL Laemmli-monsterbuffer aangevuld met 5% (v/v) β-mercaptoethanol.
  21. Denatureer de eiwitten door de monsters 15 min op 95 °C te verhitten.
  22. Scheid 20–40 µg totaal eiwit per lane via standaard natriumlaurylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE).
  23. Transfer de gescheiden eiwitten op een polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan.
  24. Blok het membraan 30 min op kamertemperatuur met behulp van blokbuffer.
    OPMERKING: Bereid de blokbuffer met gebruik van 5% (w/v) vetvrije melkpoeder of 5% (w/v) runder serumalbumine (BSA) opgelost in standaard wasbuffer (0,1% Tween 20 in ofwel 1× Tris-gebufferde zoutoplossing of 1× PBS).
  25. Was het membraan drie keer gedurende elk 10 min met standaard wasbuffer.
  26. Incubeer het membraan 12 u bij 4 °C met voorzichtig schudden met primaire antilichamen tegen CUL4B, Cas9, WDR5, CDC6 of α-TUBULINE.
    OPMERKING: Verdun de primaire antilichamen 1:1.000 in standaard wasbuffer.
  27. Verwijder de primaire antilichamenoplossing en was het membraan drie keer gedurende elk 10 min met standaard wasbuffer.
  28. Incubeer het membraan 12 u bij 4 °C met voorzichtig schudden met het juiste mierikwortelperoxidase (HRP)-geconjugeerde anti-muis of anti-konijn IgG secundair antilichaam.
    OPMERKING: Verdun de secundaire antilichamen 1:3.000 in blokbuffer.
  29. Verwijder de secundaire antilichamenoplossing en was het membraan drie keer gedurende elk 10 min met standaard wasbuffer.
  30. Breng het enhanced chemiluminescent (ECL) substraat gelijkmatig aan over het membraan en incubeer gedurende 1 min.
  31. Leg de chemiluminescente signalen vast met een digitaal beeldsysteem.
    OPMERKING: Bevestig indien gewenst de succesvolle genonderbreking via Sanger-sequencing van de getargete genomische regio na PCR-amplificatie van geïsoleerd genomisch DNA43.

Resultaten

Om Cas9-geablateerde knockout-lijnen te genereren voor experimentele reconstitutie, werd lentivirus dat een Cas9-targeterende gRNA codeert (Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro) geproduceerd in HEK293FT-cellen met behulp van standaard verpakkingsplasmiden (pLP1, pLP2 en pLP/VSVG). Het resulterende virale supernatant werd geoogst en gebruikt om doelcellen te transduceren. Overleving tijdens selectie met hygromycine B bevestigde een succesvolle lentivirale transductie, en een daaropvolgende western blot-analyse verifieerde de Cas9-ablatie (Figuur 1).

Het CUL4B-eiwit werd gemakkelijk gedetecteerd in ouderlijke HEK293-cellen, maar was afwezig in leeg vector-getransfecteerde HEK293ΔCUL4B- en HEK293ΔCUL4BΔcas9-cellen. In overeenstemming met het verlies van CUL4B vertoonden WDR5 en CDC6 respectievelijk de verwachte toenames en afnames in steady-state expressie, wat de verstoring van de CUL4B-functie bevestigt. Cas9-eiwit werd gedetecteerd in HEK293ΔCUL4B-cellen, maar was niet detecteerbaar in ouderlijke HEK293- en HEK293ΔCUL4BΔcas9 -cellen, wat de succesvolle ablatie van Cas9 bevestigt. Zoals verwacht leidde transfectie van het CUL4B-expressiplasmid in HEK293ΔCUL4B-cellen slechts tot een minimale herstel van de CUL4B-eiwitexpressie. In contrast hiermee werd een robuuste CUL4B-expressie waargenomen na transfectie van HEK293ΔCUL4BΔcas9-cellen, vergezeld door herstel van de downstream eiwitexpressie, zoals blijkt uit verlaagde WDR5- en verhoogde CDC6-niveaus. Samen tonen deze bevindingen aan dat Cas9-ablatie een efficiënt herstel van CUL4B-expressie en -functie mogelijk maakt door Cas9-gemedieerde splitsing van het rescue-plasmid te voorkomen (Figuur 2).

figure-results-1
Figuur 1: Experimentele workflow voor de strategische ablatie van Cas9 en validatie van CUL4B-rescue. Deze workflow beschrijft de generatie van Cas9-geablateerde CRISPR-knockoutcellen door HEK293FT-productorcellen te co-transfecteren met pLP1, pLP2, pLP/VSVG en een Cas9 gRNA1_pLentiGuide-Hygro-construct via calciumfosfaattransfectie. Het resulterende lentivirale supernatant wordt verzameld, gecentrifugeerd om resterende productorcellen te verwijderen en gebruikt om doelcellen te transduceren. Na selectie wordt de succesvolle Cas9-ablatie bevestigd via western blot-analyse om een zuivere knockout-cellijn te creëren die gereed is voor experimentele CUL4B-reconstitutie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Herstel van CUL4B-expressie en -functie in CRISPR-Cas9-bewerkte HEK293-cellen. (A) Experimenteel schema van de transfectieworkflow. HEK293ΔCUL4B   en HEK293ΔCUL4BΔcas9 cellen werden getransfecteerd met ofwel een lege vector of toenemende hoeveelheden pCMV-FLAG-CUL4B. Cellen werden geoogst 36 h na transfectie, en lysaatproteïnen werden gescheiden via SDS-PAGE. (B) Western blot-analyse van de herstelefficiëntie en downstream functionele controles. De aangegeven proteïnen werden gevisualiseerd via Western blot. WDR5 en CDC6 dienden als controles voor de CUL4B-functie. α-TUBULIN diende als loading control. Parentale HEK293-cellen dienden als controle voor de basale expressie. De blots zijn representatief voor herhaalde experimenten (n = 2). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

DoelgengRNA-sequentie (5'′→3′)PAM (5′→3′)DoellocatieBeschrijving van het doelwit
CUL4BATCAAACCCTACAAACTCCAAGGXq24 Exon 3N-terminale regio van het menselijke CUL4B-ORF voor frame-shift knockout
cas9CGTGATCACCGACGAGTACAAGGORF (hSpCas9)geconserveerde interne regio van het Cas9-transgen om zelf-inactiverende indels te triggeren

Tabel 1: CRISPR-Cas9 guide RNA-sequenties en genomische doelwitspecificaties.

Discussie

Dit protocol maakte een robuuste herstel van de expressie en functie van het doeleiwit mogelijk in CRISPR-Cas9-bewerkte knockout-cellijnen waarin Cas9 na de bewerking was geëlimineerd. Een opvallende waarneming uit dit werk is de aanzienlijke mate waarin constitutieve Cas9-expressie de plasmid-gedreven transgeenexpressie onderdrukt. De kracht van dit protocol ligt in het vermogen om zowel het verloren eiwit als het daarmee geassocieerde fenotype te herstellen. Deze methode creëert bovendien een kader voor de fenotypische exploratie van een breed scala aan eiwitmodificaties. Zo kan de introductie van een fosfomimetische variant (bijv. serine naar aspartinezuur) waardevolle inzichten verschaffen in de rol van die post-translationele modificatie, zonder de storende achtergrond van het natuurlijke eiwit.

Bijgevolg is dit protocol breed toepasbaar op standaard adherente (bijv. HeLa, A549) en suspensie (bijv. Jurkat, THP-1) cellijnen. Echter, dit sequentiële selectiekader kan onpraktisch blijken voor primaire of niet-delende cellen (bijv. primaire neuronen of macrofagen). In deze gevoelige systemen zorgt de snelle klaring van niet-getransduceerde bystander-cellen voor de afgifte van cytotoxisch debris en pro-apoptotische stresssignalen in de gedeelde micro-omgeving, wat indirecte toxiciteit veroorzaakt46,47. Het kan op soortgelijke wijze falen in zeer aanpasbare, aneuploïde kankerlijnen (bijv. U87 glioblastoom of A375 melanoom) die geneigd zijn CRISPR-gemedieerde fenotypes te ontwijken via snelle chromosomale herschikkingen of de snelle selectie van reeds bestaande resistente klonen48,49. Uiteindelijk hangt de geschiktheid af van het vermogen van een cellijn om de metabole belasting van duale vector-expressie te tolereren, deze indirecte selectiedrukken te weerstaan en een stabiele groeikinetiek te behouden gedurende het meerweekse protocol.

Hoewel deze benadering dient als een veelzijdig bewijs van concept voor de meeste cellijnen, vereist de implementatie ervan een zorgvuldige balans tussen leveringsefficiëntie en genomische integriteit. Zoals beschreven, zorgt het gebruik van lentivirale levering voor 'zelf'-gericht gRNA voor een homogene Cas9-geablateerde populatie, vooral in cellen die moeilijk te transfecteren zijn. Het risico op insertionele mutagenese door semi-willekeurige integratie blijft echter een punt van zorg. Deze risico's zijn beheersbaar door de MOI te optimaliseren. In permissieve lijnen zoals HEK293 wordt met een MOI van 1–5 een hoge verzadiging bereikt, terwijl integratie-gedreven mutagenese en cytotoxiciteit worden geminimaliseerd41. In contrast hiermee vereisen refractaire immuun- of neurale cellen doorgaans MOI's van 10–50, waarbij vaak enhancers zoals polybrene en/of spinoculatie nodig zijn om soortgelijke efficiënties te bereiken50,51,52,53,54,55.

Deze technische afweging strekt zich ook uit tot de keuze tussen polyklonaal- en monoklonaal geselecteerde populaties. De hier gegenereerde HEK293ΔCUL4BΔcas9 cellen zijn polyklonaal; een keuze die de experimentele tijdlijnen versnelt door de wekenlange expansie die vereist is voor subcloning van individuele cellen te omzeilen. Bovendien legt een polyklonale pool het gemiddelde fenotype van de cultuur vast, waardoor clonale artefacten of weefselspecifieke integratieproblemen effectief worden gebufferd. Hoewel monoklonale lijnen waarschijnlijker consistente resultaten opleveren vanwege de genetische homogeniteit, suggereren de hier gepresenteerde resultaten dat polyklonale selectie een levensvatbaar en vaak beter alternatief is wanneer snelheid en populatierepresentatie prioriteit hebben.

De temporele stabiliteit van het resulterende fenotype kan ook een kritieke variabele zijn. In het hier gepresenteerde systeem nam de regulerende impact van CUL4B op WDR5 en CDC6 af over opeenvolgende passages van de knockout-cellijnen, wat correleerde met een compensatoire opregulatie van het paralog CUL4A (gegevens niet getoond). Dit weerspiegelt de bevindingen van Nakagawa et al., die aantoonden dat CUL4A de CUL4B-functie gedeeltelijk kan herstellen in CUL4B-gedepleteerde cellen44. Dergelijke homeostatische compensatie komt veel voor in de celbiologie, vooral bij het targeten van een eiwit met een hoge structurele homologie en functionele redundantie ten opzichte van andere cellulaire eiwitten.

Om met deze secundaire compensatiemechanismen om te gaan, kunnen twee verschillende strategische benaderingen worden gehanteerd, afhankelijk van de experimentele doelen en de gebruikte cellijn. Voor onderzoekers die prioriteit geven aan efficiëntie of werken met sterk adaptieve cellijnen, is een verkorte experimentele tijdlijn essentieel. Deze strategie omvat de onmiddellijke validatie van het verlies van het doeleiwit, idealiter zodra de cultuur 90% confluentie bereikt na selectie, direct gevolgd door zelf-inactiverende Cas9-targeting en functionele assays. Door deze versnelde workflow te hanteren, is de kans groter dat de primaire biologische gevolgen van de knockout worden vastgelegd voordat het cellulaire homeostatische mechanisme voldoende tijd heeft gehad om redundante paralogen op te reguleren of het resulterende fenotype op andere wijze te beïnvloeden.

Als alternatief biedt een tetracycline-gecontroleerd (Tet-On/Off) systeem een levensvatbare oplossing voor studies die langetermijnstabiliteit of precisie-rescue-experimenten vereisen, in het bijzonder bij transfectie-refractaire modellen zoals immuun- en neuronale cellen56,57. Hoewel de implementatie van dit induceerbare kader extra ronden van lentivirale transductie en het gebruik van verschillende antibioticaresistentiemarkers vereist, biedt het een mechanisme voor duurzame herstel van het doeleiwit om de cellulaire omgeving te stabiliseren voordat kortstondige, doxycycline-gemedieerde 'loss and rescue'-gebeurtenissen worden getriggerd57.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben Google Gemini gebruikt om te helpen bij het verfijnen van de technische terminologie en het redigeren van het manuscript. De AI werd gebruikt als hulpmiddel voor linguïstische verbetering en heeft niet bijgedragen aan de oorspronkelijke synthese van gegevens, de conceptualisering van de studie of het eerste concept van de tekst. De auteurs hebben de output beoordeeld en bewerkt en dragen de volledige verantwoordelijkheid voor de inhoud van het definitieve manuscript. De auteurs verklaren dat er geen belangenverstrengeling is.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door startfondsen verstrekt door Le Moyne College, het Le Moyne College Research and Development Committee, het Le Moyne College Student Research Committee, het Walter L. '66 and MaryAnne Poland Jesuit Center for Research and Teaching Innovation Fund, en de Le Moyne College Department of Biological and Environmental Sciences. De auteurs erkennen het gebruik van BioRender.com bij het opstellen van de grafische illustraties. Figuur 1 is gemaakt in BioRender (Sharifi, J., 2026; https://BioRender.com/72u0wl3), en het bovenste paneel van Figuur 2 is gemaakt in BioRender (Sharifi, J., 2026; https://BioRender.com/lc6o2lu).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
anti-Cas9 antilichaamCell Signaling65832Dit muis monoklonale antilichaam zorgt voor specifieke detectie van S. pyogenes Cas9 in menselijke lysaten, waardoor het ideaal is voor het verifiëren van zelf-gerichte gRNA-gemedieerde Cas9-klaring.
anti-CDC6 antilichaamCell Signaling3387Dit konijn monoklonale antilichaam zorgt voor specifieke detectie van menselijk CDC6, waardoor het ideaal is voor het monitoren van downstream functionele effecten van CUL4B.
anti-CUL4B antilichaamSigma-AldrichC9995Dit affiniteitsgezuiverde konijn polyklonale antilichaam zorgt voor specifieke detectie van menselijk CUL4B zonder kruisreactie met de nauw verwante paralog CUL4A.
anti-muis IgG, HRP-gekoppeld secundair antilichaamCell Signaling7076Dit paard anti-muis IgG antilichaam is geconjugeerd aan mierikswortelperoxidase (HRP) en geoptimaliseerd voor chemiluminescente detectie van muis monoklonale primaire antilichamen.
anti-konijn IgG, HRP-gekoppeld secundair antilichaamCell Signaling7074Dit geit anti-konijn IgG antilichaam is geconjugeerd aan mierikswortelperoxidase (HRP) and geoptimaliseerd voor chemiluminescente detectie van konijn polyklonale en monoklonale primaire antilichamen.
anti-WDR5 antilichaamCell Signaling13105Dit konijn monoklonale antilichaam zorgt voor specifieke detectie van menselijk WDR5, waardoor het ideaal is voor het monitoren van downstream functionele effecten van CUL4B.
anti-α-TUBULINE antilichaamCell Signaling3873Dit muis monoklonale antilichaam richt zich op menselijk alpha-tubuline en is ideaal als uniforme loading control voor normalisatie in western blot-analyse.
Calciumfosfaat Transfectie KitThermoFisher ScientificK278001Deze kit bevat efficiënte reagentia voor transiënte transfectie, geoptimaliseerd voor de schaalbare, kosteneffectieve productie van lentivirale vectoren in adherente HEK293FT producer-cellen.
Cas9 gRNA1_pLentiGuide-HygroGenScript Biotech Corporation custom synthesiscas9 gRNA sequentie: CGTGATCACCGACGAGTACA, PAM sequentie: AGG
Cas9 gRNA1_pLentiGuide-PuroGenScript Biotech Corporation custom synthesiscas9 gRNA sequentie: CGTGATCACCGACGAGTACA, PAM sequentie: AGG
Dulbecco's Modified Eagle Medium GibcoD5796Dit medium met hoog glucosegehalte, aangevuld met L-glutamine en natriumpyruvaat, is geoptimaliseerd voor het behoud van groei, levensvatbaarheid en metabole stabiliteit in snel prolifererende zoogdiercellijnen (bijv. HEK293FT)
Foetaal Bovien Serum, Premium (Hitte-Ingeactiveerd)Corning35-016-CVDit serum van premium-kwaliteit, hitte-ingeactiveerd, levert essentiële groeifactoren en hormonen terwijl complement-gemedieerde cytotoxiciteit voor zoogdiercellijnen wordt geminimaliseerd.
HEK293American Type Culture CollectionCRL-1573Deze goed gekarakteriseerde menselijke embryonale niercellijn is zeer transfecteerbaar en dient als een robuust, standaardmodel voor het onderzoeken van gene knockout-fenotypes en eiwit-rescue kaders.
HEK293FT cellen ThermoFisher ScientificR70007Deze snelgroeiende, zeer transfecteerbare variant van de menselijke embryonale nierlijn tot overdruk het SV40 large T-antigeen stabiel tot expressie, waardoor deze is geoptimaliseerd voor het maximaliseren van virale titers tijdens de productie van lentivirale vectoren.
Hygromycine BsigmaaldrichH7772Dit aminonucleoside antibioticum wordt gebruikt als selectiemiddel in zoogdiercelculturen om stabiele transductanten te isoleren die de hygromycineresistentiemarker tot expressie brengen.
pCLIP-All-hCMV-Puro plasmide (CUL4B gRNA)Skyang Bio LLCsgRNA3:1019408_bCUL4B gRNA sequentie: ATCAAACCCTACAAACTCCA, PAM sequentie: AGG
pCMV-FLAGCUL4BN/AN/ADit zoogdier-expressieplasmide maakt gebruik van een cytomegalovirus (CMV) promoter om constitutieve expressie van een FLAG-tagged Cullin 4B eiwit (CUL4B) aan te sturen en is een gift van Jianping Jin.
pCMV-M1 Zoogdier-ExpressievectorAddgene23007Lege expressievector controle (een gift van Linda Wordeman)
pLentiGuide-PuroAddgene52963Deze lentivirale transfervector stuurt de menselijke U6-promoter expressie van een aanpasbare gRNA aan, samen met een door EF-alpha-promoter gestuurde puromycineresistentiemarker voor CRISPR-targeting in Cas9-expresserende cellen, en is een gift van Feng Zhang.
pLX302 EGFP-V5Addgene141348 GFP-coderende lentivirale vector voor het beoordelen van de transductie-efficiëntie (een gift van Kevin Janes)
PuromycineSigma-AldrichP8833Dit aminonucleoside antibioticum wordt gebruikt als selectiemiddel in zoogdiercelculturen om stabiele transductanten te isoleren die de puromycineresistentiemarker tot expressie brengen.
Steriele Fosfaatgebufferde Zoutoplossing (PBS)Corning21-040-CVDeze standaard gebalanceerde zoutoplossing wordt gebruikt voor het wassen van celmonolagen om sporen van cultuurmedia, serumproteïnen of enzymen effectief te verwijderen zonder de osmotische druk of cellevensvatbaarheid te verstoren.
Trypsine EDTA 1XCorning25-051-CIDeze standaard enzymatische dissociatie-oplossing wordt gebruikt om adherente zoogdiercellen los te maken van cultuurvaten door peptidebindingen te splitsen, terwijl EDTA tweewaardige kationen cheleert om intercellulaire adhesie te verstoren.
ViraPower Lentivirale Packaging MixThermoFisher ScientificK497500Deze geoptimaliseerde mengeling van packaging-plasmiden (pLP1, pLP2 en pLP/VSVG) wordt gebruikt voor co-transfectie in producer-cellen om de high-titer assemblage en replicatie-incompetente productie van lentivirale expressievectoren te faciliteren.

Referenties

  1. Doudna JA, Charpentier E. Genome editing: The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 2014;346(6213):1258096.
  2. Leonhardt C, et al. Single-cell mRNA transfection studies: Delivery, kinetics and statistics by numbers. Nanomedicine. 2014;10(4):679-688.
  3. Liu Y, Yang Q, Zhao F. Synonymous but not silent: The codon usage code for gene expression and protein folding. Annu Rev Biochem. 2021;90:375-401.
  4. Chamary JV, Hurst LD. Evidence for selection on synonymous mutations affecting stability of mRNA secondary structure in mammals. Genome Biol. 2005;6(9):R75.
  5. Mauro VP, Chappell SA. A critical analysis of codon optimization in human therapeutics. Trends Mol Med. 2014;20(11):604-613.
  6. Bauer AP, et al. The impact of intragenic CpG content on gene expression. Nucleic Acids Res. 2010;38(12):3891-3908.
  7. Kudla G, Murray AW, Tollervey D, Plotkin JB. Coding-sequence determinants of gene expression in Escherichia coli. Science. 2009;324(5924):255-258.
  8. Simms CL, Yan LL, Zaher HS. Ribosome collision is critical for quality control during no-go decay. Mol Cell. 2017;68(2):361-373.e5.
  9. Fu Y, et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotechnol. 2013;31(9):822-826.
  10. Babu K, et al. Bridge helix of Cas9 modulates target DNA cleavage and mismatch tolerance. Biochemistry. 2019;58(14):1905-1917.
  11. Hsu PD, et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 2013;31(9):827-832.
  12. Ihry RJ, et al. p53 inhibits CRISPR-Cas9 engineering in human pluripotent stem cells. Nat Med. 2018;24(7):939-946.
  13. Haapaniemi E, Botla S, Persson J, Schmierer B, Taipale J. CRISPR-Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response. Nat Med. 2018;24(7):927-930.
  14. Yang S, Li S, Li XJ. Shortening the half-life of Cas9 maintains its gene editing ability and reduces neuronal toxicity. Cell Rep. 2018;25(10):2653-2659.e3.
  15. Kafri M, Metzl-Raz E, Jona G, Barkai N. The cost of protein production. Cell Rep. 2016;14(1):22-31.
  16. Mehta A, Merkel OM. Immunogenicity of Cas9 protein. J Pharm Sci. 2020;109(1):62-67.
  17. Liu Q, Zhang H, Huang X. Anti-CRISPR proteins targeting the CRISPR-Cas system enrich the toolkit for genetic engineering. FEBS J. 2020;287(4):626-644.
  18. Marino ND, Pinilla-Redondo R, Csörgő B, Bondy-Denomy J. Anti-CRISPR protein applications: Natural brakes for CRISPR-Cas technologies. Nat Methods. 2020;17(5):471-479.
  19. Gangopadhyay SA, et al. Precision control of CRISPR-Cas9 using small molecules and light. Biochemistry. 2019;58(4):234-244.
  20. Pandit B, et al. Bio-orthogonal chemistry-based strategy to turn off CRISPR-Cas9 activity in solution and live cells. NAR Mol Med. 2026;3(1):ugag008. Available from: https://doi.org/10.1093/narmme/ugag008
  21. Bubeck F, et al. Engineered anti-CRISPR proteins for optogenetic control of CRISPR-Cas9. Nat Methods. 2018;15(11):924-927.
  22. Kostic M, Jones LH. Critical assessment of targeted protein degradation as a research tool and pharmacological modality. Trends Pharmacol Sci. 2020;41(5):305-317.
  23. Kim S, Kim D, Cho SW, Kim J, Kim JS. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 2014;24(6):1012-1019.
  24. Hendel A, et al. Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells. Nat Biotechnol. 2015;33(9):985-989.
  25. Merienne N, et al. The self-inactivating KamiCas9 system for the editing of CNS disease genes. Cell Rep. 2017;20(12):2980-2991.
  26. Kelkar A, et al. Doxycycline-dependent self-inactivation of CRISPR-Cas9 to temporally regulate on- and off-target editing. Mol Ther. 2020;28(1):29-41.
  27. Dai Y, et al. Self-inactivating AAV-CRISPR at different ages enables sustained amelioration of Huntington's disease deficits in BAC226Q mice. Sci Adv. 2026;12(12):eaea8052.
  28. Sanjana NE, Shalem O, Zhang F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat Methods. 2014;11:783-784.
  29. Parr-Brownlie LC, et al. Lentiviral vectors as tools to understand central nervous system biology in mammalian model organisms. Front Mol Neurosci. 2015;8:14.
  30. Dobransky A, Root M, Hafner N, Marcum M, Sharifi HJ. CRL4-DCAF1 ubiquitin ligase-dependent functions of HIV viral protein R and viral protein X. Viruses. 2024;16(8)1313.
  31. Thermo Fisher Scientific. ViraPower Lentiviral Expression Systems User Guide. 2026. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/virapower_lentiviral_system_man.pdf
  32. Pauwels K, et al. State-of-the-art lentiviral vectors for research use: Risk assessment and biosafety recommendations. Curr Gene Ther. 2009;9(6):459-474.
  33. Guo L, et al. Optimizing conditions for calcium phosphate-mediated transient transfection. Saudi J Biol Sci. 2017;24(3):622-629.
  34. Thermo Fisher Scientific. Cationic Lipid Transfection. 2026. Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics/transfection-basics/methods/cationic-lipid-transfection.html
  35. Kutner RH, Zhang XY, Reiser J. Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors. Nat Protoc. 2009;4(4):495-505. Available from: https://doi.org/10.1038/nprot.2009.22
  36. Barde I, Salmon P, Trono D. Production and titration of lentiviral vectors. Curr Protoc Neurosci. 2010;53(1):4.21.1-4.21.23. Available from: https://currentprotocols.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/0471142301.ns0421s53
  37. Kumru OS, et al. Physical characterization and stabilization of a lentiviral vector against adsorption and freeze-thaw. J Pharm Sci. 2018;107(11):2764-2774.
  38. American Type Culture Collection. Lentiviral Vector Reference Material Information Sheet. 2026. Available from: https://www.atcc.org/-/media/product-assets/documents/protocols/virology/lentiviral-vector-reference-material-information-sheet.pdf?rev=a934bd06c07f4969b0aafec16506cd44
  39. Higashikawa F, Chang L. Kinetic analyses of stability of simple and complex retroviral vectors. Virology. 2001;280(1):124-131.
  40. Kowolik CM, Yee JK. Preferential transduction of human hepatocytes with lentiviral vectors pseudotyped by Sendai virus F protein. Mol Ther. 2002;5(6):762-769.
  41. Pichavant C, Tremblay JP. Generation of lentiviral vectors for use in skeletal muscle research. In: DiMario JX, editor. Myogenesis: Methods and Protocols. Humana Press; Totowa, NJ; 2012. p. 285-295.
  42. Stacey GN, Masters JR. Cryopreservation and banking of mammalian cell lines. Nat Protoc. 2008;3(12):1981-1989.
  43. Bauer DE, Canver MC, Orkin SH. Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9. J Vis Exp. 2015;(95):e52118.
  44. Nakagawa T, Xiong Y. X-linked mental retardation gene CUL4B targets ubiquitylation of H3K4 methyltransferase component WDR5 and regulates neuronal gene expression. Mol Cell. 2011;43(3):381-391.
  45. Zou Y, et al. CUL4B promotes replication licensing by up-regulating the CDK2-CDC6 cascade. J Cell Biol. 2013;200(6):743-756.
  46. Dachs GU, Hunt MA, Syddall S, Singleton DC, Patterson AV. Bystander or no bystander for gene-directed enzyme prodrug therapy. Molecules. 2009;14(11):4517-4545.
  47. Prise KM, O'Sullivan JM. Radiation-induced bystander signalling in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 2009;9(5):351-360.
  48. Clark MJ, et al. U87MG decoded: The genomic sequence of a cytogenetically aberrant human cancer cell line. PLoS Genet. 2010;6(1):e1000832.
  49. Cormier JN, et al. Heterogeneous expression of melanoma-associated antigens and HLA-A2 in metastatic melanoma in vivo. Int J Cancer. 1998;75(4):517-524.
  50. Sigma-Aldrich. Successful Transduction Using Lentivirus. Darmstadt, Germany; 2023. Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/technical-article/genomics/advanced-gene-editing/successful-transduction-lentivirus
  51. Swainson L, Mongellaz C, Adjali O, Vicente R, Taylor N. Lentiviral transduction of immune cells. Methods Mol Biol. 2008;415:301-320.
  52. Davis HE, Morgan JR, Yarmush ML. Polybrene increases retrovirus gene transfer efficiency by enhancing receptor-independent virus adsorption on target cell membranes. Biophys Chem. 2002;97(2-3):159-172.
  53. Denning W, et al. Optimization of the transductional efficiency of lentiviral vectors: Effect of sera and polycations. Mol Biotechnol. 2013;53(3):308-314.
  54. O'Doherty U, Swiggard WJ, Malim MH. Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding. J Virol. 2000;74(21):10074-10080.
  55. Sano S, et al. Lentiviral CRISPR/Cas9-mediated genome editing for the study of hematopoietic cells in disease models. J Vis Exp. 2019;(152):e59977.
  56. Gossen M, Bujard H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992;89(12):5547-5551.
  57. Gossen M, et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 1995;268(5218):1766-1769.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

BiologyCRISPRCas9KnockoutLentivirusTransductionStableSelectionRescueRestorationTransgeneTransfectionPlasmid
Video binnenkort beschikbaar
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.