Deze studie presenteert een ambispectieve workflow in twee centra voor het meten van serum carcinoembryonaal antigeen, plaveiselcelcarcinoomantigeen en koolhydraatantigeen 125, en het valideren van hun gecombineerde diagnostische en prognostische waarde bij plaveiselcelcarcinoom van de slokdarm.
Onderzoeksartikel
Een gecombineerd serumbiomarkerpanel voor diagnostische en prognostische beoordeling bij plaveiselcelcarcinoom van de slokdarm
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Plavepselcarcinoom van de slokdarm blijft moeilijk vroegtijdig te diagnosticeren en nauwkeurig te stratificeren voorafgaand aan de behandeling. De conventionele tumor-node-metastase-stadiëring verschaft essentiële anatomische informatie, maar weerspiegelt de circulerende biologische heterogeniteit niet volledig. Deze ambispectieve observationele tweecentrumstudie ontwikkelde en extern valideerde een gecombineerd serumbiomarkerpanel bestaande uit carcinoembryonaal antigeen, plavepselcarcinoomantigeen en koolhydraatantigeen 125 voor diagnostische discriminatie en prognostische risicobeoordeling bij plavepselcarcinoom van de slokdarm. In totaal werden 277 deelnemers geïncludeerd uit een tertiair ziekenhuis en een gemeentelijk gezondheidscentrum, waaronder 167 patiënten met plavepselcarcinoom van de slokdarm, 55 patiënten met goedaardige slokdarmziekten en 55 gezonde controles. De cohort uit het tertiaire ziekenhuis werd gebruikt voor modelontwikkeling en interne validatie, en de cohort uit het gemeentelijk centrum werd gebruikt voor externe validatie. Serumbiomarkers vóór de behandeling werden gemeten voorafgaand aan de initiële behandeling, logaritmisch getransformeerd, gestandaardiseerd met behulp van parameters van de trainingscohort en ingevoerd in diagnostische logistische regressiemodellen en prognostische Cox proportional hazards-modellen. Het gecombineerde panel vertoonde een hogere diagnostische discriminatie dan elke individuele marker, met een area under the receiver operating characteristic curve van 0,869 in de trainingscohort en 0,842 in de externe validatiecohort. Een hogere gecombineerde biomarkerlast was geassocieerd met een tumorgrootte van ten minste 5 cm, pT3–4 ziekte, lymfekliermetastasen en tumor-node-metastase stadium III–IV ziekte. In de overlevingsanalyse voorspelde een hoge gecombineerde biomarkerlast onafhankelijk een slechtere algehele overleving en progressievrije overleving na correctie voor belangrijke clinicopathologische factoren. Het geïntegreerde prognostische model, dat de biomarkerlast combineerde met clinicopathologische variabelen, presteerde beter dan de tumor-node-metastase-stadium alleen, met een C-index van 0,792 in de trainingscohort en een C-index van 0,761 bij externe validatie. Deze bevindingen ondersteunen het gebruik van het serumpanel van carcinoembryonaal antigeen, plavepselcarcinoomantigeen en koolhydraatantigeen 125 als een praktische, niet-invasieve aanvulling voor beoordeling vóór de behandeling en geïndividualiseerde risicostratificatie bij plavepselcarcinoom van de slokdarm.
Inleiding
Plavepselcarcinoom van de slokdarm is een belangrijk histologisch subtype van slokdarmkanker en vormt nog steeds een aanzienlijke klinische last in Oost-Azië, in het bijzonder in China1. Hoewel endoscopische diagnose, beeldvormende beoordeling, chirurgie, chemoradiotherapie en systemische behandeling het klinische beheer hebben verbeterd, blijft de prognose voor veel patiënten onbevredigend2. Een belangrijke reden hiervoor is dat de ziekte vaak pas wordt ontdekt nadat lokale invasie of nodale verspreiding al heeft plaatsgevonden3. Een andere reden is dat patiënten in hetzelfde tumor-node-metastase-stadium nog steeds kunnen verschillen in behandelrespons, recidiverisico en overlevingsuitkomst4. Deze verschillen wijzen erop dat anatomische stadiëring alleen de biologische variabiliteit van het plavepselcarcinoom van de slokdarm niet volledig kan beschrijven.
De huidige klinische evaluatie rust hoofdzakelijk op endoscopie met biopsie, radiologische stadiëring en postoperatieve pathologische beoordeling. Deze methoden zijn onmisbaar, maar hebben beperkingen bij herhaaldelijke monitoring, risicoschatting vóór de behandeling of brede screening. Endoscopie is invasief en minder geschikt voor frequente follow-up, terwijl computertomografie en endoscopische echografie subtiele invasies of kleine metastatische laesies kunnen missen5. Op beeldvorming en moleculen gebaseerde prognostische modellen hebben de risicovoorspelling bij plaveiselcelcarcinoom van de slokdarm verbeterd, maar veel hiervan vereisen gespecialiseerde platforms, nabewerking van beelden, weefselsequencing of computationele workflows die niet routinematig beschikbaar zijn in alle klinische laboratoria6,7. Een kosteneffectieve en reproduceerbare bloedgebaseerde aanpak kan daarom nuttige aanvullende informatie bieden, vooral wanneer clinici risicostratificatie vóór de behandeling nodig hebben voorafgaand aan de definitieve therapie.
Serumtumormarkers zijn in deze context aantrekkelijk omdat ze routinematig beschikbaar zijn, minimaal invasief zijn en eenvoudig te herhalen zijn. Carcinoembryonaal antigeen weerspiegelt de tumorlast en abnormale cellulaire differentiatie, terwijl plaveiselcelcarcinoomantigeen nauwer verbonden is met de maligne transformatie van het plaveisel/>epitheel8. Carbohydraatantigeen 125 is bij verschillende maligniteiten gekoppeld aan systemische inflammatoire activiteit, serosale betrokkenheid en ziekteprogressie9. Deze markers vertegenwoordigen niet hetzelfde biologische signaal. In plaats daarvan kunnen ze overlappende maar verschillende dimensies van de tumorlast, het plaveiselcel-fenotype, de systemische respons en de gastheer-tumorinteractie vastleggen. Om deze reden kan een gecombineerd panel beter presteren dan elke enkele marker wanneer het doel is om plaveiselcelcarcinoom van de slokdarm te identificeren en het klinische risico in te schatten10.
Eerdere studies hebben serumtumormerkers, ontstekingsindicatoren, beeldvormingskenmerken, moleculaire profielen en samengestelde prognostische modellen geëvalueerd bij het plaveiselcelcarcinoom van de slokdarm en aanverwante gastro-intestinale kankers11,12. Veel gepubliceerde modellen richten zich echter uitsluitend op diagnose of prognose, maken gebruik van cohorten uit één enkel centrum, missen onafhankelijke externe validatie of bieden beperkte details over markertransformatie, de selectie van afkapwaarden, kalibratie en de reproduceerbaarheid van het model. De noviteit van de huidige studie is de ontwikkeling van een praktisch serumpanel met drie markers, waarbij gebruik wordt gemaakt van routinematig gemeten carcinoembryonaal antigeen, plaveiselcelcarcinoomantigeen en koolhydraatantigeen 125 om zowel diagnostische discriminatie als prognostische risicostratificatie te ondersteunen binnen één enkele workflow over twee centra. Het model is ontwikkeld in een cohort van een tertiair ziekenhuis en vervolgens, zonder heroptimalisatie, getest in een onafhankelijk cohort van een gemeenschapscentrum, waardoor de stabiliteit over verschillende klinische omgevingen kon worden geëvalueerd.
In deze studie is een gecombineerd serumbiomarkerpanel ontwikkeld en gevalideerd op basis van carcinoembryonaal antigeen, plaveiselcelcarcinoomantigeen en koolhydraatantigeen 125. De analyse volgde twee gekoppelde doelstellingen. De eerste was om te evalueren of het gecombineerde panel de diagnostische discriminatie tussen plaveiselcelcarcinoom van de slokdarm en niet-maligne controles verbeterde in vergelijking met individuele serummarkers. De tweede was om vast te stellen of de gecombineerde biomarkerbelasting vóór de behandeling prognostische informatie toevoegde bovenop conventionele clinicopathologische variabelen en het tumor-node-metastase stadium. Deze structuur stelde de studie in staat om te beoordelen of een routinematig beschikbaar serumbiomarkerpanel kon fungeren als een niet-invasieve aanvulling op de pathologische diagnose, beeldvormingsbeoordeling en anatomische stagering bij de klinische evaluatie vóór de behandeling.
Protocol
Deze studie met menselijke deelnemers, klinische dossiers en serummonsters werd uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki en de institutionele vereisten voor onderzoek met menselijke proefpersonen13. Het studieprotocol is beoordeeld en goedgekeurd door het Jiangsu Province Hospital of Chinese Medicine onder goedkeuringsnummer CJ28J12-45. Voor retrospectief verzamelde geanonimiseerde klinische gegevens en residuele serummonsters is de vereiste voor aanvullende schriftelijke geïnformeerde toestemming kwijtgescholden in overeenstemming met de institutionele ethische regelgeving. Voor prospectief verzamelde monsters is voorafgaand aan de inclusie schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen. Alle deelnemersinformatie en serummonsters werden geanonimiseerd vóór de analyse. Studie-identificatoren werden gebruikt voor datakoppeling, en er is geen persoonlijk identificeerbare informatie opgenomen in de analytische dataset.
Studieopzet en cohorttoewijzing
Deze ambispectieve observationele studie in twee centra evalueerde de diagnostische en prognostische waarde van een gecombineerd serumbiomarkerpaneel bestaande uit carcinoembryonaal antigeen (CEA), plaveiselcelcarcinoom-antigeen (SCC-Ag) en koolhydraatantigeen 125 (CA125) bij plaveiselcelcarcinoom van de slokdarm (ESCC). Retrospectieve gegevens werden verkregen uit geschikte klinische dossiers en resterende serummonsters van vóór de behandeling, en prospectieve werving werd gebruikt om aanvullende serummonsters van vóór de behandeling te verzamelen en de follow-up binnen hetzelfde studiekader te voltooien. Deelnemers werden geworven uit één tertiair ziekenhuis en één gemeentelijk gezondheidscentrum tussen januari 2021 en december 2024, waarbij de follow-up voortduurde tot 31 december 2025. Centrum A was het tertiaire ziekenhuis en diende als trainingscohort voor modelontwikkeling, coëfficiëntschatting, selectie van afkapwaarden en interne validatie. Centrum B was het gemeentelijk gezondheidscentrum en diende als extern validatiecohort. De studie is gerapporteerd in overeenstemming met de Transparent Reporting of a multivariable prediction model for Individual Prognosis or Diagnosis (TRIPOD)-richtlijnen14.
In totaal werden 277 deelnemers geïncludeerd, waarvan 194 afkomstig waren van Centrum A en 83 van Centrum B. De trainingscohort bestond uit 114 ESCC-patiënten, 40 controles met goedaardige slokdarmziekten en 40 gezonde controles. De externe validatiecohort bestond uit 53 ESCC-patiënten, 15 controles met goedaardige slokdarmziekten en 15 gezonde controles. Om informatielekkage te verminderen en de stabiliteit van het model in een onafhankelijke klinische setting te testen, werd toewijzing op basis van het centrum gebruikt in plaats van een willekeurige verdeling. De diagnostische analyse vergeleek de serumspiegels van CEA, SCC-Ag en CA125 tussen ESCC-patiënten, patiënten met goedaardige slokdarmziekten en gezonde controles. De prognostische analyse was beperkt tot ESCC-patiënten en beoordeelde of de gecombineerde biomarkerlast de risicostratificatie voor algehele overleving (OS) en progressievrije overleving (PFS) verbeterde. Het studieontwerp, de screening van deelnemers, de cohorttoewijzing, de workflow voor serumbiomarkers, de ontwikkeling van het diagnostische model, de externe validatie en de vergelijking van het prognostische model zijn samengevat in Figuur 1.
De stroom van deelnemers omvatte screening, exclusies, diagnostische groepering en toewijzing per centrum. In totaal werden 326 personen gescreend. Negenenveertig personen werden uitgesloten, waaronder 12 met een antitumorbehandeling voorafgaand aan de bloedafname, 8 met een andere primaire maligniteit, 9 met een ernstige infectie, auto-immuunziekte of ongecontroleerde comorbiditeiten die waarschijnlijk de serumtumormarkers beïnvloeden, 11 met hemolyse, lipemie, geelzuchtinterferentie, onvoldoende serumvolume of een verlengd verwerkingsinterval, en 9 met ontbrekende cruciale klinische, pathologische of follow-upgegevens. De uiteindelijke analytische populatie bestond uit 277 deelnemers: 167 ESCC-patiënten, 55 controles met goedaardige slFockziekten en 55 gezonde controles.
Rationale voor steekproefomvang
De steekproefomvang werd bepaald door de opeenvolgende beschikbaarheid van geschikte deelnemers, serummonsters vóór de behandeling en follow-upinformatie gedurende de vooraf gedefinieerde studieperiode. Het diagnostische model maakte gebruik van drie continue serumbiomarkers als potentiële predictoren. In de trainingscohort waren 114 ESCC-gevallen en 80 non-ESCC-controles beschikbaar, wat overeenkomt met 38,0 ESCC-gevallen en 26,7 non-ESCC-controles per potentiële biomarker-predictor. Dit ondersteunde laag-dimensionale logistieke regressie en verminderde het risico op overfitting. De externe validatiecohort bestond uit 53 ESCC-gevallen en 30 non-ESCC-controles en werd uitsluitend gebruikt voor validatie zonder herberekening van de coëfficiënten. De onderbouwing van de steekproefomvang was in lijn met huidige principes voor predictiemodellen, waarbij de nadruk ligt op de frequentie van de uitkomst, het aantal parameters van de potentiële predictoren, de verwachte modelprestaties en onafhankelijke validatie in plaats van willekeurige splitsing van de gegevens15.
Werving van deelnemers, geschiktheid en gegevensverzameling
Deelnemers werden continu gedurende de studieperiode geïncludeerd. In Centrum A werden ESCC-patiënten geworven vanuit de afdelingen thoraxchirurgie, gastroenterologie en oncologie. In Centrum B werden ESCC-patiënten geïdentificeerd via gemeenschapsgebaseerde screening, follow-upgegevens of verwijzingspaden, en zij werden alleen geïncludeerd wanneer pathologische bevestiging en serummonsters van vóór de behandeling beschikbaar waren. Controles met benigne slokdarmaandoeningen werden geworven uit personen die een gastroscopie ondergingen vanwege dysfagie, refluxsymptomen of vermoedelijke afwijkingen aan de slokdarm en bij wie non-maligne pathologische bevindingen waren vastgesteld. Gezonde controles werden geselecteerd uit routineonderzoeken in dezelfde periode en hadden geen voorgeschiedenis van maligniteit, actieve infectie, ernstige lever- of nierdysfunctie, of beeldvormend/endoscopisch bewijs van ruimte-innemende laesies in de slokdarm.
ESCC-patiënten kwamen in aanmerking als er sprake was van primair ESCC bevestigd door gastroscopisch biopt of postoperatieve pathologie, als er geen antitumorbehandeling was ondergaan vóór de bloedafname, en als er volledige baseline klinische gegevens, pathologische verslagen en serummonsters van vóór de behandeling beschikbaar waren. Deelnemers werden uitgesloten bij de aanwezigheid van een andere primaire maligniteit, eerdere antitumorbehandeling vóór de bloedafname, een ernstige acute infectie, een actieve auto-immuunziekte, ongecontroleerde comorbiditeiten die waarschijnlijk de serumwaarden van tumormarkers beïnvloeden, zichtbare hemolyse, lipemie, geelzuchtinterferentie, onvoldoende serumvolume, ontbrekende belangrijke klinische variabelen of niet beschikbare follow-upgegevens. De prognostische analyse was beperkt tot ESCC-patiënten met een bekend tumor-node-metastasis (TNM) stadium en meetbare overlevings- of progressie-uitkomsten. Patiënten met een follow-up van minder dan 6 maanden werden behouden als er binnen die periode overlijden of progressie optrad.
De basisvariabelen omvatten leeftijd, geslacht, rookgeschiedenis, geschiedenis van alcoholconsumptie, bodymassindex, deelnemend centrum, diagnostische groep, type laesie en serumspiegels van CEA, SCC-Ag en CA125. Voor ESCC-patiënten omvatten aanvullende variabelen de tumorlocatie, tumorlengte, histologische differentiatie, invasiediepte, lymfekliertstatus, TNM-stadium, lymfovasculaire invasie, initiële behandelmethode, recidief, progressie, overlevingsstatus en de datum van de laatste follow-up. Rookgeschiedenis werd gedefinieerd als huidige rookstatus of eerdere regelmatige consumptie van ten minste 100 sigaretten gedurende het leven. Geschiedenis van alcoholconsumptie werd gedefinieerd als alcoholinname ten minste één keer per week gedurende meer dan 6 maanden. De TNM-stadiëring werd bepaald volgens de achtste editie van het stadiëringssysteem voor slokdarmkanker van het American Joint Committee on Cancer/Union for International Cancer Control16. Pathologische coupes van ESCC-gevallen en gevallen met goedaardige laesies werden onafhankelijk beoordeeld door twee senior pathologen, waarbij eventuele meningsverschillen werden opgelost door een derde patholoog.
Twee getrainde onderzoekers extraheerden onafhankelijk klinische informatie uit elektronische medische dossiers, pathologierapporten, laboratoriuminformatiesystemen, behandelingsverslagen, follow-upverslagen en overlijdensregistraties met behulp van een vooraf gedefinieerd datadictionary. Verschillen werden opgelost door de originele dossiers te controleren, waarbij een derde onderzoeker indien nodig de definitieve beslissing nam. De tumorlocatie werd gecategoriseerd als de bovenste, middelste of onderste thoracale slokdarm. Histologische differentiatie werd gecategoriseerd als goede, matige of slechte differentiatie. Eenheden van continue variabelen werden voor de analyse gestandaardiseerd over beide deelnemende centra.
Bloedafname, serumverwerking en biomarkermeting
Alle bloedmonsters werden afgenomen vóór de initiële behandeling, binnen 7 dagen na pathologische bevestiging en ten minste 3 dagen vóór het begin van de behandeling. Perifere veneuze bloedmonsters van 5–8 mL werden verzameld tussen 7:00 AM en 9:00 AM na een nacht vasten met behulp van serumscheidingsbuizen. De afname werd uitgesteld indien de deelnemer binnen 72 h vóór de afname een bloedtransfusie, een albumininfusie van groot volume of een invasieve procedure had ondergaan. De monsters kregen 30 min de tijd om te stollen bij kamertemperatuur en werden vervolgens 10 min gecentrifugeerd bij 1.500 × g . Het serum werd gescheiden en verdeeld over 3–5 met barcodes gelabelde buisjes, met 300–500 µL per aliquot. De aliquoten werden bewaard bij −80°C tot aan de analyse, waarbij geen enkele aliquot aan meer dan één vries-dooi-cyclus werd blootgesteld. Monsters met zichtbare hemolyse, lipemie, geelzuchtinterferentie, onvoldoegend volume of een interval tussen afname en invriezen van langer dan 2 h werden uitgesloten.
Serum CEA, SCC-Ag en CA125 werden gemeten met geautomatiseerde chemiluminescente immunoassay-systemen volgens de instructies van de fabrikant. Serumaliquots werden voor het testen ontdooid bij 4°C, voorzichtig gemengd en indien mogelijk in één run geanalyseerd. Indien batch-testen noodzakelijk was, werd de volgorde van de monsters zo bepaald dat systematische groepering op basis van ziektestatus, centrum, pathologisch stadium of follow-upresultaat werd vermeden. Monsters die het analytische meetbereik overschreden, werden verdund en opnieuw getest volgens de instructies van het reagens. Het laboratoriumpersoneel was geblinderd voor de deelnemersgroep, het pathologische stadium, de behandelstatus en het follow-upresultaat.
De klinische drempelwaarden waren 5,0 ng/mL voor CEA, 1,5 ng/mL voor SCC-Ag en 35 U/mL voor CA125, gebaseerd op lokale laboratoriumnormen en de referentie-intervallen van de fabrikanten. Deze drempelwaarden werden gebruikt om marker-elevatie en een hoge gecombineerde biomarkerlast te definiëren voor clinicopathologische associatie- en overlevingsstratificatie-analyses. Voor de diagnostische classificatie werden datagestuurde afkapwaarden uitsluitend in de trainingscohort geselecteerd met behulp van de Youden-index en vervolgens ongewijzigd toegepast op de externe validatiecohort. Instrumentkalibratie en interne kwaliteitscontrole werden uitgevoerd vóór de tests. Controles op hoog en laag niveau werden tijdens elke testdag meegenomen, en het testen ging alleen door wanneer de kwaliteitscontroleresultaten binnen het geaccepteerde bereik vielen.
De reproduceerbaarheid tussen assays en tussen centra werd vóór de uiteindelijke modelanalyse beoordeeld met behulp van geblindeerde bridging-serumaliquots en routinematige kwaliteitscontrolematerialen. Een bridging-set van 30 geblindeerde serumaliquots werd getest over de twee laboratoriumworkflows. De variatiecoëfficiënten tussen de centra waren 4,8% voor CEA, 5,6% voor SCC-Ag en 5,1% voor CA125. De overeenkomstige intraclass-correlatiecoëfficiënten waren 0,94 voor CEA, 0,92 voor SCC-Ag en 0,93 voor CA125. Er werd geen centrumspecifieke herkalibratie van de assay uitgevoerd, omdat geen enkele systematische afwijking het vooraf gedefinieerde laboratorium-kwaliteitscontrolegebied overschreed. De uiteindelijke biomarkerwaarden werden geharmoniseerd door middel van unit-standaardisatie en statistische standaardisatie op basis van de trainingscohort vóór de constructie van het model.
Gecombineerde biomarkerdefinitie en modelconstructie
Het gecombineerde serum-biomarkerpanel bestond uit CEA, SCC-Ag en CA125. Voor de clinicopathologische associatieanalyse en Kaplan-Meier overlevingsstratificatie werd elke marker geclassificeerd als verhoogd of niet-verhoogd op basis van de vooraf gedefinieerde klinische drempelwaarde. Een hoge gecombineerde biomarkerlast werd gedefinieerd als de verhoging van ten minste twee van de drie markers. Voor diagnostische en prognostische modellering werden de drie biomarkers behouden als continue variabelen, getransformeerd met behulp van de natuurlijke logaritme en gestandaardiseerd met het gemiddelde en de standaarddeviatie van de trainingscohort. Dezelfde transformatieparameters werden toegepast op de externe validatiecohort.
De gestandaardiseerde log-getransformeerde biomarkers werden berekend met behulp van de volgende parameters van de trainingscohort:
zlnCEA = (lnCEA - 1.42)/0.71
zlnSCC - Ag = (lnSCC - Ag - 0.28)/0.57
zlnCA125 = (lnCA125 - 3.05)/0.62
Het gecombineerde diagnostische panel werd opgesteld met behulp van multivariabele logistische regressie in de trainingscohort. De diagnostische lineaire voorspeller werd als volgt berekend:
LPdiagnostic = -0,46 + 0,59 × zlnCEA + 1,05 × zlnSCC - Ag+0,42 × zlnCA125
De individuele voorspelde waarschijnlijkheid van ESCC werd als volgt berekend:
PESCC = 1/1+exp(-LPdiagnostic)
De optimale diagnostische afkapwaarde voor het gecombineerde panel was 0.57, geselecteerd in de trainingscohort met behulp van de Youden-index en ongewijzigd toegepast bij de externe validatie.
De prognostische biomarkerscore werd opgesteld met behulp van Cox proportional hazards-modellering. Het model op basis van enkel het TNM-stadium werd gebruikt als vergelijking voor de anatomische stadiëring. Het biomarkermodel maakte gebruik van de gecombineerde biomarkerbelasting. Het clinicopathologische model maakte gebruik van leeftijd, tumorlengte, histologische differentiatie, pT-stadium, lymfekliersituatie en de initiële behandelmethode. Het geïntegreerde model voegde een hoge gecombineerde biomarkerbelasting toe aan het clinicopathologische model. Voor de OS werd de geïntegreerde prognostische lineaire predictor als volgt berekend:
LPOS = 0,33 × leeftijd ≥65 jaar + 0,36 × tumorlengte ≥5cm + 0,25 × slechte differentiatie + 0,31 × pT3
- stadium 4 + 0,66 × lymfekliermetastase
-0.58 × behandeling op basis van radicale chirurgie
+0,81 × hoge gecombineerde biomarkerlast
Voor de PFS werd de geïntegreerde prognostische lineaire predictor als volgt berekend:
LPPFS = 0,27 × leeftijd ≥ 65 jaar + 0,31 × tumorgrootte ≥ 5 cm + 0,24 × slechte differentiatie + 0,25 × pT3
-4stadium + 0,55 × lymfekliermetastase
- 0,46 × behandeling op basis van radicale chirurgie
+0,71 × hoge gecombineerde biomarkerlast
Alle binaire variabelen in de prognostische vergelijkingen werden gecodeerd als 1 bij aanwezigheid en 0 bij afwezigheid. Alle coëfficiënten, standaardisatieparameters en afkapwaarden werden geschat in de trainingscohort en direct toegepast op de externe validatiecohort zonder heroptimalisatie.
Diagnostische en prognostische eindpunten
Pathologische diagnose werd gebruikt als de diagnostische referentiestandaard. Het primaire diagnostische eindpunt was het onderscheid tussen ESCC en non-ESCC controles, inclusief benigne slziekte en gezonde controles. Secundaire diagnostische eindpunten omvatten het onderscheid tussen ESCC en benigne slziekte, ESCC en gezonde controles, en ESCC in een vroeg stadium en non-maligne controles. ESCC in een vroeg stadium werd gedefinieerd als ziekte in TNM-stadium I–II. De diagnostische prestaties werden geëvalueerd met behulp van receiver operating characteristic-curven, area under the curve, sensitiviteit, specificiteit, positief voorspellende waarde, negatief voorspellende waarde, nauwkeurigheid, F1-score, precision-recall-curven, kalibratiecurven, Brier-scores, kalibratie-intercepten, kalibratieshellingen en decision curve-analyse.
De prognostische analyse werd uitsluitend uitgevoerd bij patiënten met ESCC. Het primaire prognostische eindpunt was OS, gedefinieerd als het interval vanaf de datum van de eerste definitieve antitumorbehandeling tot het overlijden door een willekeurige oorzaak. Het secundaire prognostische eindpunt was PFS, gedefinieerd als het interval vanaf de eerste behandeling tot gedocumenteerde ziekteprogressie, recidief of overlijden. Voor patiënten die een radicale chirurgische ingreep ondergingen, werden lokaal recidief, metastase op afstand of tumorgerelateerd overlijden geteld als PFS-event wanneer er na de operatie geen residuele laesie aanwezig was. Voor patiënten die definitieve chemoradiotherapie of palliatieve behandeling ontvingen, werd progressie bepaald op basis van beeldvormingsresultaten, endoscopische beoordeling en klinische evaluatie.
Follow-upgegevens werden verzameld via poliklinische bezoeken, ziekenhuisgegevens, follow-upgegevens uit de gemeenschap, verwijzingsgegevens en telefonisch contact. Patiënten werden elke 3 maanden gevolgd gedurende de eerste 2 jaar na de behandeling, elke 6 maanden van jaar 3 tot 5, en daarna jaarlijks. Patiënten bij wie geen overlijden, recidief of progressie was vastgesteld op de datum van de laatste follow-up, werden gecensureerd bij hun laatste bevestigde contact. Uitkomstgebeurtenissen werden onafhankelijk beoordeeld door twee onderzoekers. Wanneer gebeurtenisdata tussen bronnen verschilden, werden beeldvormingsverslagen, ontslagdocumenten, endoscopieverslagen, verwijzingsdocumenten en overlijdensaktes gecontroleerd om de definitieve datum van de gebeurtenis te bepalen. De uiterste datum voor de follow-up was 31 december 2025 voor beide deelnemende centra.
Statistische analyse
Statistische analyses werden uitgevoerd met R 4.3.2 en SPSS 27.0. Continue variabelen werden samengevat als gemiddelde ± standaarddeviatie of mediaan (interkwartielafstand), afhankelijk van de distributie. Categorische variabelen werden samengevat als aantallen en percentages. Vergelijkingen tussen groepen werden uitgevoerd met de t-toets voor onafhankelijke steekproeven, de Mann-Whitney U-toets, eenweg-variantieanalyse, de Kruskal-Wallis-toets, de chi-kwadraattoets of de exacte toets van Fisher, naar gelang van de situatie. Ontbrekende gegevens werden beoordeeld vóór de constructie van het model. Deelnemers bij wie essentiële gegevens over de diagnostische status, biomarkerwaarden vóór de behandeling, het TNM-stadium of de overleving/progressie ontbraken, werden uitgesloten op basis van de vooraf gedefinieerde geschiktheidscriteria. Niet-essentiële covariabelen met een percentage ontbrekende gegevens lager dan 5,0% werden behandeld middels multiple imputatie via geketende vergelijkingen met 20 geïmputeerde datasets en 20 iteraties17. De imputatiemodellen omvatten de diagnostische groep, het centrum, leeftijd, geslacht, rookgeschiedenis, alcoholgebruik, biomarkerwaarden, TNM-stadium, behandelmethode, OS-status, PFS-status en follow-up tijd. Complete-case analyses werden uitgevoerd als sensitiviteitsanalyses.
Het diagnostische model werd ontwikkeld in de trainingscohort. Receiver operating characteristic-curves werden gebruikt om de oppervlakte onder de curve (AUC), sensitiviteit, specificiteit, positief voorspellende waarde, negatief voorspellende waarde, accuratesse en de F1-score te berekenen. De oppervlaktes onder de curve werden vergeleken met behulp van de DeLong-test18. Precision-recall-curves werden gebruikt als aanvullende diagnostische evaluatie. De kalibratie werd beoordeeld met behulp van kalibratiecurves, Brier-scores, kalibratie-intercepten en kalibratieshellingen. Het klinisch nut werd geëvalueerd met behulp van decision curve-analyse19. Interne validatie werd uitgevoerd met 1.000 bootstrap-resamples om de optimisme-gecorrigeerde discriminatie en kalibratie te schatten. Externe validatie werd uitgevoerd door de vergelijking van de trainingscohort, de standaardisatieparameters en de afkapwaarde direct toe te passen op Centrum B zonder herfitting.
Voor de prognostische analyse werden Kaplan-Meier-curves gegenereerd om de OS en PFS tussen groepen met verschillende biomarker-belasting te vergelijken, en de log-ranktest werd gebruikt om verschillen in overleving te beoordelen. Cox proportional hazards-regressie werd gebruikt om hazard ratio's en 95% betrouwbaarheidsintervallen te schatten. Variabelen met klinische relevantie en variabelen die in de univariabele analyse geassocieerd waren met uitkomsten, werden meegenomen in multivariabele modellen. De prestaties van het model werden geëvalueerd met behulp van de C-index van Harrell, tijdsafhankelijke receiver operating characteristic-curves, kalibratiecurves, Brier-scores en decision curve-analyse20. Prognostische kalibratie werd beoordeeld na 1, 3 en 5 jaar. De aanname van proportionele hazards werd getoetst met behulp van Schoenfeld-residuen en log-minus-log survival-plots21. De P-waarden van de globale Schoenfeld-test waren 0,42 voor het OS-model en 0,37 voor het PFS-model. Multicollineariteit werd beoordeeld met behulp van variance inflation factors vóór de uiteindelijke modelinterpretatie, en alle kandidaatvariabelen in de definitieve diagnostische en prognostische modellen hadden variance inflation factors onder de 2,1. De incrementele prognostische waarde bovenop het TNM-stadium en conventionele clinicopathologische modellen werd beoordeeld met behulp van net reclassification improvement en integrated discrimination improvement. Modelparameters die in de trainingscohort waren geschat, werden toegepast op de externe validatiecohort zonder herfitting22. Alle tests waren tweezijdig, en P < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.
Resultaten
Deelnemersstroom en reproduceerbaarheid van de assay
In totaal werden 326 personen gescreend, waarvan er 49 werden uitgesloten: 12 hadden een antitumorbehandeling ondergaan vóór de bloedafname, 8 hadden een andere primaire maligniteit, 9 hadden een ernstige infectie, een auto-immuunziekte of ongecontroleerde comorbiditeiten die waarschijnlijk van invloed zouden zijn op de serumtumormarkers, 1 vertoonden hemolyse, lipemie, geelzuchtinterferentie, een onvoldoende serumvolume of een verlengd verwerkingstijdinterval, en bij 9 ontbraken essentiële klinische, pathologische of follow-upgegevens. De uiteindelijke analytische populatie bestond uit 27 deelnemers: 167 patiënten met een plaveiselcelcarcinoom van de slokdarm (ESCC), 55 patiënten met een benigne slokdarmaandoening en 5 gezonde controles. Centrum A droeg 194 deelnemers bij aan de trainingscohort en Centrum B droeg 83 deelnemers bij aan de externe validatiecohort. De deelnemersstroom, cohortallocatie, workflow voor biomarkeronderzoek, ontwikkeling van het diagnostische model, externe validatie en het raamwerk voor prognostische modellering worden weergegeven in Figuur 1, en de details van de screening en exclusie zijn samengevat in Aanvullende tabel 1.
De reproduceerbaarheid tussen verschillende assays en centra werd beoordeeld met behulp van 30 geblindeerde bridging serumaliquots. De variatiecoëfficiënten tussen de centra waren 4,8% voor carcinoembryonaal antigeen (CEA), 5,6% voor plaveiselcelcarcinoomantigeen (SCC-Ag) en 5,1% voor koolhydraatantigeen 125 (CA125). De overeenkomstige intraclassecorrelatiecoëfficiënten waren respectievelijk 0,94, 0,92 en 0,93. Er was geen centrumspecifieke herkalibratie nodig vóór de statistische standaardisatie en modelontwikkeling. De resultaten van de reproduceerbaarheid van de assay zijn opgenomen in Aanvullende Tabel 2.
Basiskenmerken van de studiepopulatie
De mediane leeftijd van de totale populatie was 59 jaar (IQR, 53–6 jaar), en 198 deelnemers (71,5%) waren mannelijk. Actief of voormalig roken werd gerapporteerd bij 141 deelnemers (50,9%), en actief of voormalig alcoholgebruik werd gerapporteerd bij 127 deelnemers (45,8%). De cohort bestond uit 167 ESCC-patiënten (60,3%), 5 patiënten met goedaardige slokdarmziekten (19,9%) en 5 gezonde controles (19,9%). De mediane serumwaarden van CEA, SCC-Ag en CA125 waren respectievelijk 3,9 ng/mL (IQR, 2,0–6,6 ng/mL), 1,4 ng/mL (IQR, 0,8–2,3 ng/mL) en 2,8 U/mL (IQR, 13,9–35,7 U/mL). Leeftijd, geslacht, rookgeschiedenis, alcoholgebruik, diagnostische groep en baseline serumbiomarkers waren vergelijkbaar tussen de trainingscohort en de externe validatiecohort (Tabel 1).
Van de 167 ESCC-patiënten was de mediane leeftijd 61 jaar (IQR, 5–68 jaar), en 13 patiënten (79,6%) waren man. Tumoren waren het meest frequent gelokaliseerd in de middelste thoracale slokdarm (89/167, 53,3%), gevolgd door de onderste thoracale slokdarm (56/167, 3,5%) en de bovenste thoracale slokdarm (2/167, 13,2%). Matig gedifferentieerde en slecht gedifferentieerde tumoren waren verantwoordelijk voor respectievelijk 81 gevallen (48,5%) en 6 gevallen (39,5%). De tumorlengte was ten minste 5 cm bij 68 patiënten (40,7%), pT3–4 ziekte was aanwezig bij 121 patiënten (72,5%), lymfekliermetastasen waren aanwezig bij 10 patiënten (59,9%), en tumor-node-metastasis (TNM) stadium III–IV ziekte werd waargenomen bij 1 patiënten (6,5%). Lymfovasculaire invasie werd geïdentificeerd bij 65 patiënten (38,9%). De primaire behandeling bestond uit radicale chirurgie met of zonder adjuvante therapie bij 13 patiënten (67,7%), definitieve chemoradiotherapie bij 32 patiënten (19,2%), en palliatieve systemische of ondersteunende behandeling bij 2 patiënten (13,2%). De belangrijkste clinicopathologische variabelen waren vergelijkbaar tussen de trainings- en externe validatiecohorten van ESCC (Tabel 2).
Multidimensionale distributie van serumbiomarkers over de studiegroepen
De distributies van serum CEA, SCC-Ag en CA125 verschilden tussen ESCC-patiënten, controles met benigne slokdarmziekten en gezonde controles (Figuur 2). Na logaritmische transformatie vertoonden alle drie de biomarkers hogere niveaus in de ESCC-groep dan in de twee niet-maligne groepen. De mediane CEA-waarde was 5,2 ng/mL bij ESCC-patiënten, vergeleken met 2,4 ng/mL bij controles met benigne slokdarmziekten en 1,9 ng/mL bij gezonde controles. De mediane SCC-Ag-waarde was 1,9 ng/mL bij ESCC-patiënten, vergeleken met 0,9 ng/mL en 0,7 ng/mL in de andere groepen. De mediane CA125-waarde was 28,9 U/mL bij ESCC-patiënten, vergeleken met 18,7 U/mL en 16,1 U/mL in de andere groepen. Groepspecifieke distributies van serum-biomarkers zijn samengevat in Aanvullende Tabel 3.
CEA en SCC-Ag vertoonden een duidelijkere scheiding tussen ESCC en niet-maligne controles dan CA125. In de tweedimensionale distributie van log-getransformeerde CEA en SCC-Ag waren ESCC-monsters vaker geconcentreerd in het gebied met hogere waarden, terwijl gezonde controles vaker geclusterd waren in het gebied met lagere waarden. Een hoge gecombineerde biomarkerlast, gedefinieerd als een verhoging van ten minste twee van de drie markers, werd waargenomen bij 61 van de 167 ESCC-patiënten (36,5%), 8 van de 5 controles met benigne slzieziekten (14,5%) en 4 van de 5 gezonde controles (7,3%). De distributie van de verhoogde biomarkerlast verschilde significant tussen de drie groepen (P < 0,01), zoals ook gerapporteerd in Aanvullende Tabel 3.
Ontwikkeling van de gecombineerde diagnostische signatuur in de trainingscohort
De gecombineerde diagnostische signatuur werd ontwikkeld in de trainingscohort met behulp van log-getransformeerde waarden van CEA, SCC-Ag en CA125 (Figuur 3). Paarsgewijze correlatieanalyse toonde matige positieve correlaties aan tussen de drie markers. De sterkste correlatie werd waargenomen tussen CEA en SCC-Ag (r = 0.58), gevolgd door SCC-Ag en CA125 (r = 0.47) en CEA en CA125 (r = 0.41), wat gezamenlijke modellering ondersteunt zonder de markers als uitwisselbare metingen te behandelen.
Bij univariabele logistische regressie waren CEA, SCC-Ag en CA125 elk geassocieerd met de ESCC-status, met odds ratio's van respectievelijk 2,81, 3,94 en 2,14. In het multivariabele diagnostische model vertoonde SCC-Ag de grootste gecorrigeerde effectgrootte (OR, 2,87; 95% CI, 1,62–5,09; P < 0,01), gevolgd door CEA (OR, 1,80; 95% CI, 1,19–2,72; P = 0,006) and CA125 (OR, 1,52; 95% CI, 1,03–2,25; P = 0,034). De coëfficiënten van het diagnostische model zijn samengevat in Aanvullende Tabel 4. De uiteindelijke diagnostische lineaire voorspeller was:
LPdiagnostic = -0,46 + 0,59 × zlnCEA + 1,05 × zlnSCC - Ag +0,42 × zlnCA125
De individuele voorspelde waarschijnlijkheid van ESCC werd als volgt berekend:
PESCC = 1/1 + exp( -LPdiagnostic )
De voorspelde waarschijnlijkheidsverdeling van het gecombineerde diagnostische model toonde een scheiding tussen deelnemers met ESCC en deelnemers zonder ESCC. De optimale afkapwaarde was 0,57. Bij deze afkapwaarde behaalde het gecombineerde model een oppervlakte onder de receiver operating characteristic curve (AUC) van 0,869 (95% BI, 0,817–0,921), met een positief voorspellende waarde van 85,8% en een negatief voorspellende waarde van 73,0% in de trainingscohort.
Diagnostische prestaties en externe validatie van het gecombineerde biomarkerpanel
In de trainingscohort vertoonde SCC-Ag de hoogste diagnostische prestatie van de drie individuele biomarkers, met een AUC van 0.802 (95% BI, 0.735–0.869). De AUC's voor CEA en CA125 waren respectievelijk 0.71 (95% BI, 0.635–0.786) en 0.68 (95% BI, 0.591–0.74). Het gecombineerde panel behaalde de hoogste algehele discriminatie, met een AUC van 0.869 (95% BI, 0.817–0.921), een sensitiviteit van 79.8%, een specificiteit van 81.2%, een positief voorspellende waarde van 85.8%, een negatief voorspellende waarde van 73.0%, een accuratesse van 80.4% en een F1-score van 82.7% (Tabel 3).
De receiver operating characteristic-curves bevestigden de hogere diagnostische discriminatie van het gecombineerde panel vergeleken met individuele biomarkers (Afbeelding 4A). Bij de optimale afkapwaarde van 0,57 vertoonde het gecombineerde panel een sensitiviteit van 79,8% en een specificiteit van 81,2%. De AUC van het gecombineerde panel was significant hoger dan die van SCC-Ag alleen (P = 0,032). Bootstrap interne validatie met 1.0 resamples toonde een optimisme-gecorrigeerde AUC van 0,856, een optimisme-gecorrigeerde kalibratieshelling van 0,97 en een optimisme-gecorrigeerde Brier-score van 0,154. Schattingen van de interne validatie zijn opgenomen in Aanvullende Tabel 4.
In de externe validatiecohort toonde de precisie-recall-analyse de hoogste gemiddelde precisie aan voor het onderscheid tussen ESCC en gezonde controles (AP = 0,912; Figuur 4B). De gemiddelde precisie was 0,863 voor ESCC versus non-ESCC en 0,841 voor ESCC versus benigne slokdarmziekten. De gemiddelde precisie voor ESCC in een vroeg stadium versus niet-maligne controles was 0,535. De kalibratieanalyse toonde overeenstemming aan tussen de voorspelde waarschijnlijkheden en de waargenomen uitkomsten in beide cohorten (Figuur 4C). De Brier-score was 0,148, met een kalibratieshelling van 1,02 en een intercept van 0,01 in de trainingscohort. In de externe validatiecohort was de Brier-score 0,164 met een kalibratieshelling van 0,93 en een kalibratie-intercept van −0,04. De decision curve-analyse toonde een hoger netto voordeel aan voor het gecombineerde panel dan voor de 'behandel-alleen' en 'behandel-niemand' strategieën over de meeste waarschijnlijkheidsdrempels (Figuur 4D).
De resultaten van de externe validatie zijn samengevat in Tabel 4. Het gecombineerde panel behaalde een AUC van 0,842 (95% BI, 0,753–0,930) voor ESCC versus non-ESCC, met een sensitiviteit van 75,5%, een specificiteit van 76,7%, een accuratesse van 75,9%, een Brier-score van 0,164, een kalibratieshelling van 0,93 en een netto voordeel van 0,218 bij een drempelwaarschijnlijkheid van 0,30. De AUC's waren 0,801 (95% BI, 0,686–0,916) voor ESCC versus goedaardige slFockziekten, 0,89 (95% BI, 0,80–0,979) voor ESCC versus gezonde controles en 0,818 (95% BI, 0,704–0,932) voor ESCC in een vroeg stadium versus niet-maligne controles. De hoogste specificiteit werd waargenomen voor ESCC versus gezonde controles (86,7%), terwijl ESCC in een vroeg stadium versus niet-maligne controles een sensitiviteit van 70,6% en een specificiteit van 78,3% vertoonde.
Clinicopathologisch associatieprofiel van het gecombineerde biomarkerpanel bij ESCC
De associatie tussen de verhoging van serumbiomarkers en clinicopathologische kenmerken werd geëvalueerd bij ESCC-patiënten (Tabel 5). Leeftijd en geslacht vertoonden een beperkte associatie met de verhoging van individuele biomarkers. Patiënten van ten minste 65 jaar hadden een hoger aandeel met een hoge gecombineerde biomarkerlast dan patiënten jonger dan 65 jaar (47,6% vs. 29,8%; P = 0,028), terwijl geslacht niet geassocieerd was met de verhoging van individuele biomarkers of de gecombineerde biomarkerlast.
Tumorgerelateerde variabelen vertoonden sterkere associaties met een verhoogde biomarkerwaarde. Een hoge gecombineerde biomarkerlast was aanwezig bij 50,0% van de patiënten met een tumorlengte van ten minste 5 cm, vergeleken met 27,3% van de patiënten met een tumorlengte onder de 5 cm (P = 0,04). Een hoge gecombineerde biomarkerlast kwam ook vaker voor bij patiënten met een slechte differentiatie dan bij patiënten met een goede of matige differentiatie (50,0% vs. 28,2%; P = 0,06), bij patiënten met pT3–4 ziekte dan bij patiënten met pT1–2 ziekte (42,1% vs. 21,7%; P = 0,01), bij patiënten met lymfekliermetastasen dan bij patiënten zonder lymfekliermetastasen (43,0% vs. 26,9%; P = 0,038), en bij patiënten met TNM-stadium III–IV ziekte dan bij patiënten met TNM-stadium I–II ziekte (43,2% vs. 23,2%; P = 0,09).
Visualisatie op patiëntniveau toonde aan dat hogere gecombineerde risicoscores gepaard gingen met meer gevorderde clinicopathologische kenmerken (Figuur 5A). Patiënten met hogere scores werden vaker geclassificeerd als pT3–4, lymfekliierpositief, slecht gedifferentieerd of TNM-stadium III–IV. Boxplot-analyse toonde een opwaartse verdeling van biomarkers bij patiënten met een grotere tumorlengte, slechte differentiatie, pT3–4 ziekte, lymfekliierpositiviteit en TNM-stadium III–IV ziekte (Figuur 5B). Het Sankey-diagram liet zien dat patiënten met twee of drie verhoogde biomarkers vaker werden geclassificeerd als TNM-stadium III–IV, terwijl patiënten zonder verhoogde biomarkers vaker werden geclassificeerd als TNM-stadium I–II (Figuur 5C). De associatie tussen de gecombineerde biomarkerlast en de TNM-stadiumverdeling was statistisch significant (P < 0,01).
Prognostische stratificatie op basis van het gecombineerde serumbiomarkerpanel
De mediane follow-up tijd voor ESCC-patiënten was 34 maanden. Tijdens de follow-up werden 78 sterfgevallen en 96 events voor progressievrije overleving geregistreerd. De details van de follow-up en de events zijn samengevat in Aanvullende Tabel 5. Een hoge gecombineerde biomarkerlast was geassocieerd met slechtere overlevingsuitkomsten. In univariabele Cox-regressie was een hoge gecombineerde biomarkerlast geassocieerd met een verhoogd risico op overlijden (HR, 2,91; 95% BI, 1,89–4,46; P < 0,01) en progressie of overlijden (HR, 2,63; 95% BI, 1,80–3,84; P < 0,01). Na correctie voor leeftijd, tumorgrootte, differentiatie, pT-stadium, lymfekliermetastasen en behandelmethode bleef een hoge gecombineerde biomarkerlast onafhankelijk geassocieerd met de algehele overleving (OS; HR, 2,24; 95% BI, 1,41–3,54; P = 0,01) en de progressievrije overleving (PFS; HR, 2,03; 95% BI, 1,35–3,05; P = 0,01). Daarentegen waren verhoogde waarden van CEA, SCC-Ag en CA125 niet langer statistisch significant wanneer deze individueel werden opgenomen in de multivariabele modellen. De resultaten van de Cox-regressie zijn samengevat in Tabel 6.
Kaplan–Meier-analyse toonde een duidelijke scheiding aan tussen de groepen met een hoge en lage gecombineerde biomarkerlast (Figuur 6A,B). De mediane OS was 38 maanden in de groep met een lage last en 19 maanden in de groep met een hoge last (log-rank P < 0,01). De mediane PFS was 28 maanden in de groep met een lage last en 13 maanden in de groep met een hoge last (log-rank P < 0,001). Het geïntegreerde prognostische model vertoonde een hogere tijdsafhankelijke discriminatie dan het TNM-stadium alleen (Figuur 6C), met AUC's van respectievelijk 0,829, 0,806 en 0,781 na 1, 3 en 5 jaar, vergeleken met 0,701, 0,676 en 0,648 voor het TNM-stadium alleen. De verbetering van de C-index ten opzichte van het TNM-stadium alleen was 0,130 in de trainingscohort en 0,120 in de externe validatiecohort. De follow-up landmark heatmap liet een toenemende cumulatieve mortaliteit zien over de risicostrata (Figuur 6D). In het tertiel met een laag risico waren de cumulatieve mortaliteitskansen respectievelijk 6%, 12%, 24%, 37% en 52% na 6, 12, 24, 36 en 60 maanden. De overeenkomstige kansen waren 14%, 26%, 4%, 59% en 74% in het tertiel met een gemiddeld risico en 28%, 47%, 68%, 82% en 91% in het tertiel met een hoog risico.
Externe validatie en incrementele prognostische waarde van het geïntegreerde model
Het geïntegreerde model vertoonde de hoogste prognostische discriminatie van de geëvalueerde modellen in beide cohorten. In het trainingscohort was de C-index 0,792 voor het geïntegreerde model, vergeleken met 0,736 voor het clinicopathologische model, 0,703 voor het biomarkerpanel alleen en 0,62 voor het TNM-stadium alleen. In het externe validatiecohort was de C-index voor het geïntegreerde model 0,761, tegenover 0,708, 0,681 en 0,641 voor de andere modellen. Tijdsonafhankelijke AUC's gaven eveneens de voorkeur aan het geïntegreerde model. In het trainingscohort behaalde het geïntegreerde model AUC's van respectievelijk 0,829, 0,806 en 0,781 na 1, 3 en 5 jaar. In het externe validatiecohort waren de overeenkomstige AUC's 0,801, 0,74 en 0,748. Vergeleken met het TNM-stadium alleen vertoonde het geïntegreerde model een NRI van +0,274 en een IDI van +0,102. Interne validatie via bootstrapping toonde een optimisme-gecorrigeerde C-index van 0,79 voor het geïntegreerde model. De prestatiegegevens van de modellen worden gepresenteerd in Tabel 7, en aanvullende resultaten van de prognostische validatie worden vermeld in Aanvullende Tabel 5.
De grafiek van de modelvergelijking toonde de hoogste Harrell's C-index voor het geïntegreerde model in beide cohorten (Figuur 7A). Het nomogram combineerde leeftijd, tumorgrootte, histologische differentiatie, pT-stadium, lymfekliersstatus, initiële behandelmethode en een hoge gecombineerde biomarkerlast om de OS-kansen voor 1, 3 en 5 jaar te schatten (Figuur 7B). In het externe validatiecohort lagen de kalibratiecurves voor de 1-, 3- en 5-jaars OS dicht bij de ideale referentielijn (Figuur 7C). De Brier-scores waren respectievelijk 0,141, 0,164 en 0,178, met kalibratieshellingen van 0,97, 0,93 en 0,91. De decision curve-analyse toonde aan dat het geïntegreerde model een hoger netto voordeel had dan het TNM-stadium alleen, het clinicopathologische model en de 'behandel-alleen' of 'behandel-niemand' strategieën over het belangrijkste bereik van drempelwaarschijnlijkheden (Figuur 7D). Bij een drempelwaarschijnlijkheid van 0,30 was het netto voordeel 0,181 voor het geïntegreerde model, vergeleken met 0,139 voor het clinicopathologische model en 0,17 voor het TNM-stadium alleen. Deze resultaten van de kalibratie en decision-curve zijn samengevat in Aanvullende Tabel 5.
DATABESCHIKBAARHEID:
De datasets die tijdens de huidige studie zijn gegenereerd en geanalyseerd, zijn publiekelijk beschikbaar in de Figshare-repository: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.33154580.v1.
Figuur 1Onderzoeksopzet en analytische workflow. Schematisch overzicht van de screening van deelnemers, cohorttoewijzing, meting van serumbiomarkers, ontwikkeling van het diagnostische model, externe validatie en constructie van het prognostisch model. Centrum A diende als trainingscohort en Centrum B diende als extern validatiecohort. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2Distributie van serum CEA, SCC-Ag en CA125 over de studiegroepen. (A) Violin- en boxplots die de log-getransformeerde serumbiomarkerspiegels tonen bij ESCC-patiënten, controles met benigne slokdarmziekten en gezonde controles. (B) Bivariate distributie van log-getransformeerd CEA en SCC-Ag. (C) Radarplot die het gecombineerde biomarkerprofiel over de diagnostische groepen samenvat. (D) Verdeling van de verhoogde biomarkerlast over de diagnostische groepen. CEA = carcinoembryonaal antigeen; SCC-Ag = plaveiselcelcarcinoomantigeen; CA125 = koolhydraatantigeen 125; ESCC = plaveiselcelcarcinoom van de slokdarm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3Ontwikkeling van de gecombineerde diagnostische signatuur in de trainingscohort. (A) Correlatie-heatmap van log-getransformeerde CEA, SCC-Ag en CA125. (B) Resultaten van univariabele en multivariabele logistische regressie voor individuele biomarkers en het gecombineerde diagnostische model. (C) Voorspelde kansverdeling voor ESCC- en non-ESCC-deelnemers op basis van het gecombineerde diagnostische model. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4Diagnostische prestaties en externe validatie van het gecombineerde biomarkerpanel. (A) Receiver operating characteristic-curves waarin individuele biomarkers en het gecombineerde panel in de trainingscohort worden vergeleken. (B) Precisie-recall-curves over verschillende externe validatiescenario's. (C) Kalibratieplots voor de trainings- en externe validatiecohorten. (D) Decision curve-analyse die het netto voordeel weergeeft over verschillende drempelwaarschijnlijkheden. ROC = receiver operating characteristic. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5Klinicopathologisch associatieprofiel van het gecombineerde biomarkerpanel bij ESCC. (A) Overzicht op patiëntniveau van gecombineerde risicoscores, serumbiomarkerspiegels en clinicopathologische kenmerken. (B) Boxplots die de biomarkerdistributies weergeven over de belangrijkste clinicopathologische subgroepen. (C) Sankey-diagram dat de relatie tussen een verhoogde biomarkerlast en het TNM-stadium weergeeft. TNM = tumor-node-metastasis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6Prognostische stratificatie op basis van de gecombineerde biomarkerlast. (A) Kaplan-Meier-curves voor de algehele overleving op basis van de gecombineerde biomarkerlast. (B) Kaplan-Meier-curves voor progressievrije overleving op basis van de gecombineerde biomarkerlast. (C) Tijdsonafhankelijke receiver operating characteristic-curves die het geïntegreerde model vergelijken met enkel het TNM-stadium. (D) Heatmap die de cumulatieve mortaliteitskansen weergeeft over risicotertielen en follow-up landmarks. OS = algehele overleving; PFS = progressievrije overleving. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7Externe validatie en klinische vertaling van het geïntegreerde prognostische model. (A) Vergelijking van de C-index van Harrell tussen prognostische modellen in de trainings- en externe validatiecohorten. (B) Nomogram waarin leeftijd, tumorlengte, histologische differentiatie, pT-stadium, lymfekli status, initiële behandelmethode en een hoge gecombineerde biomarkerlast zijn opgenomen om de algehele overleving na 1, 3 en 5 jaar te schatten. (C) Kalibratieplots voor externe validatie van de algehele overleving na 1, 3 en 5 jaar. (D) Beslissingscurve-analyse waarbij het geïntegreerde model wordt vergeleken met enkel het TNM-stadium, het clinicopathologische model en strategieën waarbij iedereen wordt behandeld of niemand wordt behandeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Variabele | Totaal (n = 27) | Trainingscohort, Centrum A (n = 194) | Extern validatiecohort, Centrum B (n = 83) | P-waarde |
| Leeftijd, jaren, mediaan (IQR) | 59 (53–6) | 59 (52–65) | 60 (54–67) | 0.284 |
| Mannelijk geslacht, n (%) | 198 (71.5) | 137 (70.6) | 61 (73.5) | 0.62 |
| Huidige/voormalige roker, n (%) | 141 (50.9) | 95 (49.0) | 46 (5.4) | 0.321 |
| Huidig/voormalig alcoholgebruik, n (%) | 127 (45.8) | 87 (4.8) | 40 (48.2) | 0.603 |
| Diagnostische groep, n (%) | 0.701 | |||
| ESCC | 167 (60.3) | 14 (58.8) | 53 (63.9) | |
| Benigne slokdarmziekte | 5 (19.9) | 40 (20.6) | 15 (18.1) | |
| Gezonde controles | 5 (19.9) | 40 (20.6) | 15 (18.1) | |
| Serum CEA, ng/mL, mediaan (IQR) | 3.9 (2.0–6.6) | 3.8 (1.9–6.4) | 4.1 (2.1–6.8) | 0.367 |
| Serum SCC-Ag, ng/mL, mediaan (IQR) | 1.4 (0.8–2.3) | 1.4 (0.8–2.2) | 1.5 (0.9–2.4) | 0.418 |
| Serum CA125, U/mL, mediaan (IQR) | 2.8 (13.9–35.7) | 2.4 (13.5–34.9) | 23.6 (14.6–36.8) | 0.47 |
Tabel 1: Baselinekenmerken van deelnemers in de trainings- en externe validatiecohorten. Demografische kenmerken, cohortsamenstelling en baseline serumwaarden van CEA, SCC-Ag en CA125 zijn samengevat voor de totale populatie, het trainingscohort en het externe validatiecohort.
| Variabele | Totale ESCC (n = 167) | Trainingscohort (n = 14) | Extern validatiecohort (n = 53) | p-waarde |
| Leeftijd, jaren, mediaan (IQR) | 61 (55–68) | 61 (55–67) | 62 (56–68) | 0.386 |
| Mannelijk geslacht, n (%) | 133 (79.6) | 91 (79.8) | 42 (79.2) | 0.931 |
| Huidige/voormalige roker, n (%) | 110 (65.9) | 74 (64.9) | 36 (67.9) | 0.701 |
| Huidig/voormalig alcoholgebruik, n (%) | 95 (56.9) | 66 (57.9) | 29 (54.7) | 0.688 |
| Tumorlocatie, n (%) | 0.879 | |||
| Bovenste thoracale gedeelte | 22 (13.2) | 15 (13.2) | 7 (13.2) | |
| Midden-thoracale | 89 (53.3) | 60 (52.6) | 29 (54.7) | |
| Lagere thoracale | 56 (33.5) | 39 (34.2) | 17 (32.1) | |
| Histologische differentiatie, n (%) | 0.944 | |||
| Goed gedifferentieerd | 20 (12.0) | 14 (12.3) | 6 (11.3) | |
| Matig gedifferentieerd | 81 (48.5) | 56 (49.1) | 25 (47.2) | |
| Slecht gedifferentieerd | 66 (39.5) | 44 (38.6) | 22 (41.5) | |
| Tumorlengte ≥5 cm, n (%) | 68 (40.7) | 45 (39.5) | 23 (43.4) | 0.621 |
| stadium pT3–4, n (%) | 121 (72.5) | 82 (71.9) | 39 (73.6) | 0.821 |
| Lymfekliermetastasen, n (%) | 100 (59.9) | 68 (59.6) | 32 (60.4) | 0.924 |
| TNM-stadium III–IV, n (%) | 111 (66.5) | 75 (65.8) | 36 (67.9) | 0.785 |
| lymfovasculaire invasie, n (%) | 65 (38.9) | 42 (36.8) | 23 (43.4) | 0.404 |
| Primaire behandelmodaliteit, n (%) | 0.753 | |||
| Radicale chirurgie ± adjuvante therapie | 113 (67.7) | 79 (69.3) | 34 (64.2) | |
| Definitieve chemoradiotherapie | 32 (19.2) | 21 (18.4) | 11 (20.8) | |
| Palliatieve systemische/ondersteunende behandeling | 22 (13.2) | 14 (12.3) | 8 (15.1) |
Tabel 2: Klinisch-pathologische kenmerken van ESCC-patiënten in de trainings- en externe validatiecohorten. Tumorlocatie, histologische differentiatie, tumorlengte, pT-stadium, lymfekliervoetstatus, TNM-stadium, lymfovasculaire invasie en primaire behandelmethode worden vergeleken tussen ESCC-patiënten in de trainings- en externe validatiecohorten.
| Model | Optimale afkapwaarde | AUC (95% BI) | Sensitiviteit (%) | Specificiteit (%) | PPV (%) | NPV (%) | Nauwkeurigheid (%) | F1-score (%) |
| CEA | 4,85 ng/mL | 0.711 (0.635–0.786) | 58.8 | 76.2 | 77.9 | 56.6 | 66.2 | 67.1 |
| SCC-Ag | 1,52 ng/mL | 0.802 (0.735–0.869) | 70.2 | 78.8 | 82.5 | 65.6 | 73.8 | 76.1 |
| CA125 | 31,8 U/mL | 0.668 (0.591–0.744) | 44.7 | 82.5 | 78.5 | 52.4 | 60.3 | 57 |
| Gecombineerd panel | 0.57 | 0.869 (0.817–0.921) | 79.8 | 81.2 | 85.8 | 73 | 80.4 | 82.7 |
Tabel 3: Diagnostische nauwkeurigheid van individuele biomarkers en het gecombineerde serum biomarker-panel in de trainingscohort. De diagnostische prestaties worden gerapporteerd met gebruik van de optimale afkapwaarde, het oppervlak onder de receiver operating characteristic-curve, sensitiviteit, specificiteit, positief voorspellende waarde, negatief voorspellende waarde, nauwkeurigheid en de F1-score.
| Vergelijking | AUC (95% BI) | Sensitiviteit, % | Specificiteit, % | Nauwkeurigheid, % | Brier-score | Kalibratieshelling | Netto voordeel bij drempelwaarschijnlijkheid 0,30 |
| ESCC vs. niet-ESCC | 0.842 (0.753–0.930) | 75.5 | 76.7 | 75.9 | 0.164 | 0.93 | 0.218 |
| ESCC versus goedaardige slokdarmziekte | 0.801 (0.686–0.916) | 73.6 | 73.3 | 73.5 | 0.171 | 0.9 | 0.196 |
| ESCC versus gezonde controles | 0.889 (0.800–0.979) | 77.4 | 86.7 | 79.5 | 0.122 | 0.97 | 0.252 |
| Vroegstadium ESCC versus niet-maligne controles | 0.818 (0.704–0.932) | 70.6 | 78.3 | 76.3 | 0.153 | 0.89 | 0.173 |
Tabel 4: Externe validatie van de diagnostische prestaties van het gecombineerde serum-biomarkerpanel.De prestaties van het model zijn samengevat over vier diagnostische scenario's: ESCC versus non-ESCC, ESCC versus goedaardige slokdarmziekten, ESCC versus gezonde controles, en ESCC in een vroeg stadium versus niet-maligne controles.
| Kenmerk | Categorie | Verhoogd CEA (n %) | Verhoogd SCC-Ag (n %) | Verhoogd CA125 (n %) | Hoge gecombineerde belasting (n %) | P voor CEA | P voor SCC-Ag | P voor CA125 | P voor gecombineerde belasting |
| Leeftijd | <65 jaar (n = 104) | 40 (38.5) | 54 (51.9) | 29 (27.9) | 31 (29.8) | 0.129 | 0.108 | 0.151 | 0.028 |
| ≥65 jaar (n = 63) | 32 (50.8) | 41 (65.1) | 25 (39.7) | 30 (47.6) | |||||
| Geslacht | Vrouw (n=34) | 13 (38.2) | 17 (50.0) | 13 (38.2) | 12 (35.3) | 0.513 | 0.367 | 0.402 | 0.871 |
| Man (n = 13) | 59 (44.4) | 78 (58.6) | 41 (30.8) | 49 (36.8) | |||||
| Tumorlengte | <5 cm (n = 9) | 35 (35.4) | 49 (49.5) | 24 (24.2) | 27 (27.3) | 0.015 | 0.021 | 0.009 | 0.04 |
| ≥5 cm (n = 68) | 37 (54.4) | 46 (67.6) | 30 (4.1) | 34 (50.0) | |||||
| Differentiatie | Goed/matig (n = 103) | 38 (36.9) | 52 (50.5) | 27 (26.2) | 29 (28.2) | 0.018 | 0.032 | 0.027 | 0.06 |
| Slecht (n=64) | 34 (53.1) | 43 (67.2) | 27 (42.2) | 32 (50.0) | |||||
| pT-stadium | pT1–2 (n = 46) | 13 (28.3) | 20 (43.5) | 9 (19.6) | 10 (21.7) | 0.016 | 0.028 | 0.036 | 0.011 |
| pT3–4(n = 121) | 59 (48.8) | 75 (62.0) | 45 (37.2) | 51 (42.1) | |||||
| Lymfekliertatus | Negatief (n = 67) | 21 (31.3) | 31 (46.3) | 15 (2.4) | 18 (26.9) | 0.012 | 0.025 | 0.021 | 0.038 |
| Positief (n = 100) | 51 (51.0) | 64 (64.0) | 39 (39.0) | 43 (43.0) | |||||
| TNM-stadium | I–II (n = 56) | 16 (28.6) | 25 (4.6) | 1 (19.6) | 13 (23.2) | 0.08 | 0.021 | 0.014 | 0.09 |
| III–IV (n= 1) | 56 (50.5) | 70 (63.1) | 43 (38.7) | 48 (43.2) |
Tabel 5: Associaties tussen verhoogde serumbiomarkers en clinicopathologische kenmerken bij ESCC-patiënten. De proporties van verhoogd CEA, verhoogd SCC-Ag, verhoogd CA125 en een hoge gecombineerde biomarkerlast worden vergeleken tussen demografische en tumorgerelateerde subgroepen.
| Variabele | Univariaat HR voor OS (95% BI) | P-waarde | Multivariaat HR voor OS (95% BI) | P-waarde | Univariaat HR voor PFS (95% BI) | P-waarde | Multivariaat HR voor PFS (95% BI) | P-waarde |
| Leeftijd ≥65 jaar | 1.52 (1.01–2.31) | 0.046 | 1.39 (0.90–2.14) | 0.138 | 1.41 (0.97–2.06) | 0.074 | 1.31 (0.8–1.95) | 0.186 |
| Mannelijk geslacht | 1.18 (0.67–2.08) | 0.56 | — | — | 1.13 (0.69–1.84) | 0.632 | — | — |
| Tumorlengte ≥5 cm | 1.89 (1.25–2.86) | 0.003 | 1.4 (0.93–2.23) | 0.103 | 1.76 (1.2–2.5) | 0.03 | 1.36 (0.92–2.01) | 0.12 |
| Slechte differentiatie | 1.63 (1.07–2.47) | 0.024 | 1.29 (0.84–1.9) | 0.245 | 1.58 (1.09–2.28) | 0.016 | 1.27 (0.86–1.87) | 0.28 |
| pT3–4 stadium | 2.04 (1.19–3.49) | 0.09 | 1.36 (0.76–2.4) | 0.304 | 1.92 (1.18–3.1) | 0.09 | 1.29 (0.7–2.18) | 0.35 |
| Lymfekliermetastasen | 2.46 (1.50–4.03) | <0.01 | 1.94 (1.15–3.28) | 0.013 | 2.12 (1.37–3.28) | 0.01 | 1.73 (1.08–2.79) | 0.023 |
| Behandeling op basis van radicale chirurgie | 0.43 (0.28–0.65) | <0.01 | 0.56 (0.36–0.8) | 0.012 | 0.51 (0.35–0.74) | <0.01 | 0.63 (0.43–0.94) | 0.024 |
| Verhoogd CEA | 1.8 (1.24–2.85) | 0.03 | 1.34 (0.86–2.10) | 0.19 | 1.71 (1.18–2.49) | 0.05 | 1.26 (0.84–1.8) | 0.267 |
| Verhoogd SCC-Ag | 1.95 (1.25–3.03) | 0.03 | 1.29 (0.80–2.08) | 0.302 | 1.82 (1.22–2.72) | 0.04 | 1.25 (0.81–1.93) | 0.315 |
| Verhoogd CA125 | 1.79 (1.16–2.78) | 0.009 | 1.21 (0.76–1.93) | 0.421 | 1.68 (1.13–2.50) | 0.01 | 1.18 (0.7–1.82) | 0.46 |
| Hoge gecombineerde biomarkerlast | 2.91 (1.89–4.46) | <0.01 | 2.24 (1.41–3.54) | 0.01 | 2.63 (1.80–3.84) | <0.01 | 2.03 (1.35–3.05) | 0.01 |
Tabel 6: Univariabele en multivariabele Cox-regressieanalyses voor algehele overleving en progressievrije overleving. Hazardratio's en 95% betrouwbaarheidsintervallen worden gepresenteerd voor clinicopathologische variabelen, individuele verhoging van biomarkers en een hoge gecombineerde biomarkerlast.
| Model | C-index trainingscohort | 1-jaar AUC training | 3-jaar AUC training | 5-jaar AUC training | C-index externe validatie | 1-jaar AUC extern | 3-jaar AUC extern | 5-jaar AUC extern | NRI vs TNM | IDI vs TNM |
| Alleen TNM-stadium | 0.62 | 0.701 | 0.676 | 0.648 | 0.641 | 0.672 | 0.651 | 0.628 | — | — |
| Alleen biomarkerpanel | 0.703 | 0.74 | 0.713 | 0.689 | 0.681 | 0.709 | 0.687 | 0.6 | 0.18 | 0.049 |
| Clinicopathologisch model | 0.736 | 0.72 | 0.748 | 0.721 | 0.708 | 0.741 | 0.719 | 0.694 | 0.153 | 0.061 |
| Geïntegreerd model | 0.792 | 0.829 | 0.806 | 0.781 | 0.761 | 0.801 | 0.774 | 0.748 | 0.274 | 0.102 |
Tabel 7: Predictieve prestaties van verschillende prognostische modellen in de trainings- en externe validatiecohorten. De C-index van Harrell, de tijdsafhankelijke area under the curve, net reclassification improvement en integrated discrimination improvement worden vergeleken tussen het TNM-stadium alleen, het biomarkerpanel alleen, het clinicopathologische model en het geïntegreerde model.
Aanvullende Tabel 1: Screening, uitsluiting en definitieve cohorttoewijzing van deelnemers. De screeningsaantallen, redenen voor uitsluiting, de definitieve analytische populatie, de verdeling per diagnostische groep en de cohorttoewijzing per centrum zijn samengevat.Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende Tabel 2: Inter-assay en inter-centrum reproduceerbaarheid van serumbiomarker-metingen. De resultaten van de geblindeerde bridging-testen van serumaliquots zijn samengevat met behulp van inter-centrum variatiecoëfficiënten en intraclass-correlatiecoëfficiënten voor CEA, SCC-Ag en CA125.Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende Tabel 3: Serumbiomarkerdistributie en gecombineerde biomarkerbelasting over diagnostische groepen. Groepsspecifieke distributies van serum CEA, SCC-Ag en CA125, en het aandeel met een hoge gecombineerde biomarkerbelasting, zijn samengevat voor ESCC-patiënten, controles met benigne slokdarmziekten en gezonde controles.Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende Tabel 4: Coëfficiënten van het diagnostische model en bootstrap interne validatie.Het intercept van het diagnostische model, de coëfficiënten van biomarkers, univariabele en multivariabele logistische regressieschattingen, de afkapwaarde van de trainingscohort, het aantal bootstrap-resamples, de optimisme-gecorrigeerde oppervlakte onder de curve (AUC), de kalibratielijn en de Brier-score zijn samengevat.Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 5: Resultaten van follow-up, landmark-mortaliteit, kalibratie en beslissingscurve voor prognostische validatie. Een samenvatting van de follow-upduur, overlevingsgebeurtenissen, mediane OS en PFS per biomarker-burden-groep; verbetering van de C-index; optimisme-gecorrigeerde C-index; cumulatieve landmark-mortaliteitskansen; Brier-scores van de externe validatie; kalibratiehellingen; en schattingen van het netto voordeel uit de beslissingscurve.Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussie
Deze studie in twee centra ontwikkelde en extern valideerde een gecombineerd serum-biomarkerpanel waarin CEA, SCC-Ag en CA125 zijn geïntegreerd voor diagnostische en prognostische beoordeling bij ESCC. Het gecombineerde panel presteerde beter dan elke individuele biomarker bij het onderscheiden van ESCC van niet-maligne controles en behield een acceptabel onderscheidend vermogen in de externe validatiecohort. Deze bevinding is consistent met eerdere ESCC-studies waaruit blijkt dat serumtumormarkers klinisch relevante diagnostische en prognostische informatie kunnen verschaffen, hoewel de prestaties van enkelvoudige markers vaak beperkt worden door biologische overlap tussen maligne en niet-maligne aandoeningen23,24. De belangrijkste bijdrage van deze studie is daarom de ontwikkeling van een reproduceerbare workflow met drie markers die pre-behandelingsdiagnose, clinicopathologische correlatie en overlevingsstratificatie integreert in één enkel analytisch kader.
De verbeterde prestaties van het gecombineerde panel zijn biologisch plausibel omdat CEA, SCC-Ag en CA125 gedeeltelijk verschillende tumorgerelateerde processen weerspiegelen. SCC-Ag is nauw geassocieerd met plaveiselcelcarcinomen en vertoonde de sterkste op zichzelf staande diagnostische prestatie in deze cohort. CEA kan de tumorlast, het invasieve fenotype en de systemische maligne activiteit weerspiegelen, terwijl CA125 mogelijk bredere inflammatoire, serosale signalen of signalen van een gevorderd ziektestadium vastlegt in plaats van ESCC-specifieke biologie25,26. De matige correlaties tussen de drie biomarkers suggereren dat de markers aan elkaar gerelateerd waren maar niet redundant, wat gezamenlijke modellering ondersteunt in plaats van het vertrouwen op een enkele circulerende meting.
Een hoge gecombineerde biomarkerlast was geassocieerd met grotere tumoren, pT3–4 ziekte, lymfekliermetastasen en TNM-stadium III–IV ziekte, wat aangeeft dat het panel meer vastlegde dan een binair diagnostisch signaal. Dit patroon is klinisch relevant omdat het anatomische stadium centraal blijft staan bij de behandeling van ESCC, maar patiënten binnen hetzelfde stadium nog steeds kunnen verschillen in tumoragressiviteit, systemische last en overlevingsuitkomst27. Een op serum gebaseerd biomarkerprofiel kan daarom helpen bij het verfijnen van de risicobeoordeling vóór de behandeling, vooral wanneer clinici aanvullende informatie nodig hebben voorafgaand aan chirurgie, definitieve chemoradiotherapie, systemische behandeling of geïntensiveerde follow-up. In de overlevingsanalyse bleef een hoge gecombineerde biomarkerlast onafhankelijk geassocieerd met een slechtere OS en PFS na correctie voor belangrijke clinicopathologische variabelen, en het geïntegreerde model vertoonde een hogere C-index en tijdsafhankelijke AUC's dan het TNM-stadium alleen28.
Vergeleken met modellen op basis van beeldvorming, radiomics, genexpressie of multi-omics, heeft het huidige panel praktische voordelen maar een beperkter biologisch bereik. Radiomics- en transcriptomische modellen kunnen ruimtelijke heterogeniteit, kenmerken van de tumormicro-omgeving en moleculaire subtypen vastleggen, en sommige hebben veelbelovende prognostische prestaties getoond bij ESCC29,30. Deze benaderingen vereisen echter vaak gestandaardiseerde beeldvormingsprotocollen, geavanceerde computationele pipelines, weefselmonsters van hoge kwaliteit, sequencingplatforms of gespecialiseerde bio-informatische ondersteuning. Daarentegen worden CEA, SCC-Ag en CA125 routinematig gemeten in veel klinische laboratoria, zijn ze relatief goedkoop en kunnen ze tijdens de follow-up worden herhaald. De klinische waarde van het huidige panel ligt daarom in de toegankelijkheid en compatibiliteit met de workflow, en niet in het vermogen om beeldvorming, pathologie, moleculaire profilering of TNM-stadiëring te vervangen.
De kalibratie- en decision-curve-analyses ondersteunen een voorzichtige klinische vertaling. Het gecombineerde diagnostische model vertoonde een acceptabele kalibratie in zowel de trainings- als de externe validatiecohorten, en de decision-curve-analyse suggereerde een positief netto voordeel over klinisch relevante drempelwaarden. Het geïntegreerde prognostische model vertoonde eveneens een verbeterde discriminatie en een acceptabele kalibratie bij externe validatie. Deze bevindingen zijn belangrijk omdat modellen met enkel een hoge discriminatie nog steeds slecht gekalibreerd of klinisch onbruikbaar kunnen zijn31. Door AUC, C-index, kalibratie, Brier-scores en decision-curve-resultaten te rapporteren, biedt deze studie een completere evaluatie van de modelprestaties dan studies die uitsluitend vertrouwen op discriminatiemetrieken of hazard ratio's.
Enkele beperkingen moeten worden erkend. Hoewel de studie externe validatie omvatte, was deze beperkt tot twee centra en was de validatiecohort kleiner dan de trainingscohort. Biomarkerwaarden werden alleen gemeten bij de baseline vóór de behandeling, waardoor longitudinale veranderingen tijdens neoadjuvante therapie, chemoradiotherapie, postoperatieve surveillance of monitoring van recidieven niet zijn geëvalueerd, hoewel seriële trends in tumormarkers aanvullende prognostische informatie kunnen verschaffen32. Het serumpanel werd niet direct vergeleken met radiomics, genexpressie, circulerend tumor-DNA of andere liquid biopsy-modellen in dezelfde patiëntenpopulatie, en fout-positieve verhogingen kunnen voorkomen bij inflammatoire, benigne of comorbide aandoeningen. Samenvattend bood het gecombineerde serumpanel van CEA, SCC-Ag en CA125 een betere diagnostische discriminatie dan individuele biomarkers, was het geassocieerd met ongunstige clinicopathologische kenmerken en verbeterde het de prognostische stratificatie wanneer het werd toegevoegd aan conventionele klinische variabelen. Verdere multicentrische validatie, seriële biomarkerbeoordeling en directe vergelijking met beeldvormingsgebaseerde en moleculaire modellen zijn nodig voordat routinematige klinische implementatie kan plaatsvinden.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te melden.
Dankbetuigingen
De auteurs danken het personeel van de afdeling Laboratoriumgeneeskunde van het Jiangsu Province Hospital of Chinese Medicine, het Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine en het Nanhu Community Health Service Center in Nanjing voor hun ondersteuning bij de monstername, laboratoriumtesten en het databeheer.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Access CEA-kalibratoren | Beckman Coulter | 33205 | Kalibratie voor serum CEA-assay |
| Toegang tot kwaliteitscontrole van CEA | Beckman Coulter | 33029 | Dagelijkse interne kwaliteitscontrole voor de serum-CEA-assay |
| Access CEA-reagensset | Beckman Coulter | 33200 | Meting van serum CEA op het UniCel DxI 800 Access Immunoassay System |
| Instelbare micropipet, 100–1000 µL | Eppendorf | 3123000063 | Serum aliquoteren na centrifugatie |
| ARCHITECT CA 125 II kalibratoren | Abbott Diagnostics | 02K4502 | Kalibratie voor serum CA125-assay |
| ARCHITECT CA 125 II controles | Abbott Diagnostics | 02K4511 | Dagelijkse interne kwaliteitscontrole voor de serum CA125-analyse |
| ARCHITECT CA 125 II Reagenskit | Abbott Diagnostics | 02K4529 | Serum CA125-meting op de ARCHITECT i2000SR Immunoassay Analyzer |
| ARCHITECT i2000SR immunoassay-analyzer | Abbott Diagnostics | i2000SR | Geautomatiseerd chemiluminescent microdeeltjes-immunoassayplatform voor SCC-Ag- en CA125-testen |
| ARCHITECT SCC-kalibrator | Abbott Diagnostics | 8D1801 | Kalibratie voor serum SCC-Ag-assay |
| ARCHITECT SCC-besturingen | Abbott Diagnostics | 8D1810 | Dagelijkse interne kwaliteitscontrole voor de serum SCC-Ag-assay |
| ARCHITECT SCC Reagent Kit | Abbott Diagnostics | 8D1828 | Meting van serum SCC-Ag op de ARCHITECT i2000SR Immunoassay Analyzer |
| Barcode-labelprinter | Brady | BMP51 | Barcode-etikettering van serumaliquoten en cryogene vials |
| Bloedafnamenaald | BD Biosciences | 367286 | Afname van perifeer veneus bloed |
| Cryogene bewaarbox | Corning | 431131 | Georganiseerde opslag van ingevroren serumaliquoten |
| Cryovial, 2,0 mL, externe schroefdraad, zelfstaand | Corning | 430659 | Opslag van serumaliquots met barcode-labeling bij −80 °C |
| Gegevensextractieformulier en vooraf gedefinieerd datadictionary | Studieteam | Niet van toepassing | Gestandaardiseerde extractie van klinische, pathologische, laboratorium- en follow-upvariabelen |
| dcurves-pakket | R-pakket | Versie 0.4.0 | Decision curve analysis en schatting van het klinische netto-voordeel |
| Elektronisch patiëntendossiersysteem | Deelnemende ziekenhuizen | Niet van toepassing | Extractie van demografische, klinische, behandelings- en follow-upgegevens |
| Gefilterde pipetpunten, 100–1000 µL | Eppendorf | 30073594 | Contaminatiegecontroleerd aliquoteren van serum |
| ggplot2-pakket | R-pakket | Versie 3.5.1 | Statistische visualisatie en figuurbereiding |
| IBM SPSS Statistics | IBM | Versie 27.0 | Baselinevergelijkingen en aanvullende statistische controles |
| Laboratoriuminformatiebeheersysteem | Deelnemend ziekenhuislaboratorium | Niet van toepassing | Ophalen en koppelen van testgegevens van serumbiomarkers |
| mice-pakket | R-pakket | Versie 3.16.0 | Meervoudige imputatie via geketende vergelijkingen |
| nricens-pakket | R-pakket | Versie 1.6 | Analyse van de netto verbetering van de reclassificatie |
| Pathologierapportagesysteem | Deelnemende ziekenhuizen | Niet van toepassing | Bevestiging van de ESCC-diagnose, benigne pathologie, tumoreigenschappen en stadiëringsgerelateerde variabelen |
| pROC-pakket | R-pakket | Versie 1.18.5 | Analyse van de receiver operating characteristic-curve en DeLong-vergelijking |
| R statistische software | R Foundation for Statistical Computing | Versie 4.3.2 | Statistische analyse, modelconstructie, validatie en figuurgeneratie |
| Gekoelde centrifuge | Eppendorf | 5810 R | Serumscheiding door centrifugatie bij 1.500 x g gedurende 10 min |
| rms-pakket | R-pakket | Versie 6.8-1 | Kalibratieanalyse, constructie van nomogrammen en ondersteuning van regressiemodellen |
| Bloedafnamebuis met serumseparator, 5 mL | BD Biosciences | 367955 | Afname van nuchtere perifeer veneus bloed voor serumbiomarkeronderzoek |
| survivalpakket | R-pakket | Versie 3.5-7 | Cox proportional hazards-regressie en overlevingsanalyse |
| survminer-pakket | R-pakket | Versie 0.4.9 | Kaplan–Visualisatie van de Meier-curve |
| Registratieformulier voor telefonische follow-up | Studieteam | Niet van toepassing | Verzameling en verificatie van informatie over overleving, recidief, progressie en laatste contact |
| timeROC-pakket | R-pakket | Versie 0.4 | Tijdsafhankelijke analyse van de receiver operating characteristic-curve |
| Ultra-lage temperatuurvriezer | Thermo Fisher Scientific | TSX60086A | Opslag van serumaliquots bij −80 °C |
| UniCel DxI 800 Access Immunoassay-systeem | Beckman Coulter | DxI 800 | Geautomatiseerd chemiluminescent immunoassay-platform voor CEA-bepaling in serum |
Referenties
- Bray F, et al. Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2024;74(3):229-263.
- Huang Y, et al. Postoperative serum squamous cell carcinoma antigen and carcinoembryonic antigen predict overall survival in surgical patients with esophageal squamous cell carcinoma. Front Oncol. 2023;13:1263990.
- Pi Y, et al. Validation of serum cystatin SN detection for diagnosis and poor prognosis of esophageal squamous cell carcinoma. Front Oncol. 2024;14:1337707.
- Wang W, et al. A novel molecular and clinical staging model to predict survival for patients with esophageal squamous cell carcinoma. Oncotarget. 2016;7(39):63526-63536.
- Puli SR, et al. Staging accuracy of esophageal cancer by endoscopic ultrasound: A meta-analysis and systematic review. World J Gastroenterol. 2008;14(10):1479-1490.
- Li T, et al. ESCCPred: A machine learning model for diagnostic prediction of early esophageal squamous cell carcinoma using autoantibody profiles. Br J Cancer. 2024;131(5):883-894.
- Guo JC, et al. Protein-coding genes combined with long noncoding RNA as a novel transcriptome molecular staging model to predict the survival of patients with esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Commun. 2018;38(1):4.
- Kosugi S, et al. Clinical significance of serum carcinoembryonic antigen, carbohydrate antigen 19-9, and squamous cell carcinoma antigen levels in esophageal cancer patients. World J Surg. 2004;28(7):680-685.
- Huang C, et al. Clinical significance of serum CA125, CA19-9, CA72-4, and fibrinogen-to-lymphocyte ratio in gastric cancer with peritoneal dissemination. Front Oncol. 2019;9:1159.
- Yang Y, et al. Clinical use of tumor biomarkers in prediction for prognosis and chemotherapeutic effect in esophageal squamous cell carcinoma. BMC Cancer. 2019;19(1):526.
- Wu LL, et al. Preoperative squamous cell carcinoma antigen and albumin serum levels predict the survival of patients with stage T1-3N0M0 esophageal squamous cell carcinoma: A retrospective observational study. J Cardiothorac Surg. 2020;15(1):115.
- Wu LL, et al. Prognostic modeling of patients undergoing surgery alone for esophageal squamous cell carcinoma: A histopathological and computed tomography based quantitative analysis. Front Oncol. 2021;11:565755.
- World Medical Association. World Medical Association Declaration of Helsinki: Ethical principles for medical research involving human participants. JAMA. 2025;333(1):71-74.
- Moons KGM, et al. Transparent Reporting of a Multivariable Prediction Model for Individual Prognosis or Diagnosis (TRIPOD): Explanation and elaboration. Ann Intern Med. 2015;162(1):W1-W73.
- Riley RD, et al. Calculating the sample size required for developing a clinical prediction model. BMJ. 2020;368:m441.
- Amin MB, et al., editors. AJCC Cancer Staging Manual. 8th ed. New York, NY: Springer; 2017.
- Rubin DB. Multiple Imputation for Nonresponse in Surveys. John Wiley & Sons; New York; 1987.
- DeLong ER, DeLong DM, Clarke-Pearson DL. Comparing the areas under two or more correlated receiver operating characteristic curves: A nonparametric approach. Biometrics. 1988;44(3):837-845.
- Vickers AJ, Elkin EB. Decision curve analysis: A novel method for evaluating prediction models. Med Decis Making. 2006;26(6):565-574.
- Harrell FE Jr, Lee KL, Mark DB. Multivariable prognostic models: Issues in developing models, evaluating assumptions and adequacy, and measuring and reducing errors. Stat Med. 1996;15(4):361-387.
- Schoenfeld D. Partial residuals for the proportional hazards regression model. Biometrika. 1982;69(1):239-241.
- Royston P, Altman DG. External validation of a Cox prognostic model: Principles and methods. BMC Med Res Methodol. 2013;13:33.
- Mao W, et al. Clinical significance of preoperative serum tumor markers in esophageal squamous cell carcinoma. J Cancer Res Ther. 2014;10(Suppl):C179-C185.
- Hu J, et al. Prognostic significance of serum carcinoembryonic antigen and squamous cell carcinoma antigen in patients with esophageal squamous cell carcinoma undergoing radical esophagectomy. Transl Cancer Res. 2020;9(4):2460-2471.
- Mei X, et al. Predictive significance of CYFRA21-1, squamous cell carcinoma antigen and carcinoembryonic antigen for lymph node metastasis in patients with esophageal squamous cancer. Int J Biol Markers. 2019;34(2):200-204.
- Shimada H, et al. Prediction of survival with squamous cell carcinoma antigen in patients with resectable esophageal squamous cell carcinoma. Surgery. 2003;133(5):486-494.
- Rice TW, Patil DT, Blackstone EH. 8th edition AJCC/UICC staging of cancers of the esophagus and esophagogastric junction: Application to clinical practice. Ann Cardiothorac Surg. 2017;6(2):119-130.
- Qiao Y, et al. Tumor marker index based on preoperative SCC and CYFRA 21-1 is a significant prognostic factor for patients with resectable esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Biomark. 2019;25(3):243-250.
- Yang M, et al. Computed tomography-based radiomics in predicting T stage and length of esophageal squamous cell carcinoma. Front Oncol. 2021;11:722961.
- Ye J, et al. Development and validation of a ferroptosis-related gene signature and nomogram for predicting the prognosis of esophageal squamous cell carcinoma. Front Genet. 2021;12:697524.
- Van Calster B, Vickers AJ. Calibration of risk prediction models: Impact on decision-analytic performance. Med Decis Making. 2015;35(2):162-169.
- Hong Z, et al. Prognostic value of carcinoembryonic antigen changes before and after operation for esophageal squamous cell carcinoma. World J Surg. 2022;46(11):2725-2732.