Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Detectie van intratumorale immuuncelantigenen in een immunocompetent glioblastoom stamcelachtig model met behulp van substraatgebaseerde immunohistochemie

71 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/72193

⸱

21 augustus 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, North Carolina Agricultural and Technical State University, 2Brain Tumor Research Center, Department of Neurosurgery, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School

In dit artikel

Samenvatting

De studie biedt een gedetailleerde, reproduceerbare substraatgebaseerde immunohistochemie-workflow voor de consistente detectie van enkele en dubbele antigenen in coupes van tumorweefsel afgeleid van glioblastoomstamcellen, gefixeerd in formaline en ingebed in paraffine (FFPE). Het protocol ondersteunt de identificatie van diverse immuun- en tumormarkers en pakt technische uitdagingen aan, met potentiële toepasbaarheid in andere tumormodellen.

Samenvatting

Glioblastoom (GBM) is de meest voorkomende en dodelijke primaire hersenmaligniteit, waarvoor geen effectieve therapieën bestaan. Het wordt gekenmerkt door een sterk immunosuppressieve tumoromgeving, die mede wordt aangestuurd door behandelresistente GBM stamcelachtige cellen (GSC's). Hier beschrijven we reproduceerbare substraatgebaseerde enkel- en tweekleurige immunohistochemische (IHC) protocollen voor het detecteren van oppervlakte- en intracellulaire antigenen geassocieerd met tumorinfiltrerende immuuncellen in formaline-gefixeerde, paraffine-ingebedde (FFPE) hersentumorsecties. De hersentumoren waren afkomstig van muizen-GSC's, die orthotoop werden geïmplanteerd in immuuncompetente muizen. De workflow voor enkelkleurige IHC maakt gebruik van een chromogene detectiemethode op basis van mierikwortelperoxidase (HRP) voor de visualisatie van individuele immuuncelantigenen, terwijl de workflow voor tweekleurige IHC een sequentiële kleuringsstrategie op basis van alkalische fosfatase (AP) hanteert voor de gelijktijdige detectie van twee immuuncelantigenen binnen dezelfde weefselsectie, inclusief workflows die primaire antilichamen met dezelfde gastheerorigine gebruiken. Deze methoden bieden een praktisch en reproduceerbaar kader voor chromogene analyse van tumorinfiltrerende immuuncel-geassocieerde antigenen in GBM-weefsels en kunnen worden aangepast voor andere preklinische tumormodellen en potentieel voor menselijke FFPE-monsters.

Inleiding

Glioblastoom (GBM) is een agressieve, zeer invasieve en heterogene primaire maligne hersentumor die gepaard gaat met een slechte overleving van patiënten, ondanks de huidige standaardbehandelingen1. Een bepalend kenmerk van GBM is de sterk immunosuppressieve tumormicro-omgeving (TME), die bijdraagt aan resistentie tegen immuuntherapeutische strategieën2,3. Meerdere mechanismen drijven de immunosuppressie bij GBM aan, waaronder een verminderde infiltratie van effector T-cellen en de inductie van T-celdysfunctie en -uitputting4. Daarnaast bevorderen GBM-stamcelachtige cellen (GSCs), een subpopulatie van GBM-cellen, immuunevasie verder door een immunologisch "koude" TME in stand te houden, gekenmerkt door beperkte cytotoxische immuunactiviteit5. Deze kenmerken benadrukken het belang van een nauwkeurige karakterisering van tumorinfiltrerende immuuncelpopulaties en hun functionele toestanden in de GBM TME.

Immunohistochemie (IHC) blijft een van de meest gebruikte methoden voor het evalueren van immuuncelinfiltratie in tumorweefsels, omdat het de weefselarchitectuur behoudt terwijl het visualisatie, lokalisatie en semikwantitatieve beoordeling van cellulaire markers in situ mogelijk maakt6,7,8,9,10,11,12. Vorige immunohistochemische en immunoprofileringstudies hebben ons begrip van het immuunlandschap van GBM aanzienlijk vergroot en immuuncelpopulaties geïdentificeerd die geassocieerd zijn met tumorprogressie en therapeutische respons12,13,14,15,16. Enkelkleurige chromogene IHC is bijzonder nuttig voor het detecteren van individuele immuunmarkers in formaline-gefixeerde, paraffine-ingebedde (FFPE) weefselcoupes12,13,15,17,18,19,20. In tegenstelling hiermee maakt tweekleurige chromogene IHC gelijktijdige visualisatie van twee markers binnen dezelfde weefselcoupe mogelijk, wat de beoordeling van het cellulaire fenotype, de proliferatie of de activatietoestand vergemakkelijkt12,19,21.

Ondanks deze vorderingen blijven praktische en gestandaardiseerde substraatgebaseerde chromogene IHC-protocollen die toepasbaar zijn op immuuncompetente, uit GSC afgeleide GBM-modellen beperkt. Bovendien blijft chromogene IHC bij GBM uitdagender dan bij veel andere solide tumoren vanwege de schaarse en heterogene infiltratie van immuuncellen, de uitgebreide intratumorale heterogeniteit en de sterk immunosuppressieve en complexe TME, wat de nauwkeurige visualisatie en interpretatie van meerdere cellulaire populaties binnen dezelfde weefselcoupe bemoeilijkt2,3,4. Duale chromogene IHC brengt extra technische uitdagingen met zich mee, vooral wanneer beide primaire antilichamen in dezelfde gastsoort zijn opgewekt. Dit vereist een zorgvuldige optimalisatie van de antilichaamcompatibiliteit, een sequentiële kleuringsstrategie voor de gelijktijdige detectie van twee antigenen binnen dezelfde weefselcoupe en de selectie van een chromogeen substraat om een duidelijke onderscheiding van markers onder lichtmicroscopie te garanderen.

Hier beschrijven we reproduceerbare substraatgebaseerde enkel- en tweekleurige IHC-protocollen die succesvol representatieve tumor-infiltrerende immuuncel-geassocieerde oppervlakte- en intracellulaire antigenen detecteren in een immunocompetent orthotoop 005 GSC-afgeleid GBM-model22,23,24. Deze substraatgebaseerde chromogene IHC-protocollen kunnen ook worden aangepast aan andere preklinische tumormodellen en potentieel aan humane FFPE-tumorbiopten. De geoogste muizenbreinweefsels werden overnacht (~12 u) gefixeerd in 10% neutraal gebufferde formaline vóór routinematige weefselverwerking en paraffine-inbedding, zoals eerder beschreven19. FFPE-blokken werden gesneden (dikte van 5 µm19) op positief geladen microscopieglazen en bewaard bij kamertemperatuur tot gebruik. Enkelkleurige IHC maakt gebruik van een detectiesysteem op basis van mierikwortelperoxidase (HRP) met 3,3′-diaminobenzidine (DAB) als substraat om een bruin signaal te genereren voor visualisatie van individuele antigenen onder een lichtmicroscoop. Deze workflow is geschikt voor het detecteren van zowel membraan-geassocieerde als intracellulaire antigenen in FFPE-weefselcoupes.

Dual-color IHC maakt de gelijktijdige detectie van twee antigenen binnen dezelfde weefselcoupe mogelijk, maar vereist extra optimalisatie om de compatibiliteit van antilichamen en een duidelijke scheiding van de chromogene signalen te waarborgen. Dual-color IHC-kleuring is relatief eenvoudig wanneer de primaire antilichamen zijn opgewekt in verschillende gastsoorten, waardoor het gebruik van soortspecifieke secundaire antilichamen mogelijk is. Gelijktijdige detectie wordt echter technisch uitdagender wanneer beide primaire antilichamen afkomstig zijn van dezelfde gastsoort. Om deze uitdaging aan te pakken, maakt de hier beschreven dual-color IHC-workflow gebruik van een sequentiële chromogene kleuringsstrategie op basis van alkalische fosfatase (AP), waarbij verschillende substraten worden gebruikt om een duidelijke visuele discriminatie tussen twee antigeensignalen onder lichtmicroscopie mogelijk te maken.

Beide workflows bevatten stappen voor deparaffinering van weefsel, rehydratatie, antigeen-retrieval, blokkeren, kleuren, dehydratatie, inklaring en montage. De bereiding van reagentia is cruciaal voor de kleuringskwaliteit en reproduceerbaarheid (zie Aanvullend bestand 1). Evenzo zijn passende verdunningen van primaire antilichamen essentieel voor een succesvol kleuringsprotocol; deze worden vlak voor gebruik uitgevoerd in 2,5% normaal paarden- of geitenserum, afhankelijk van de gastheersoort van het corresponderende secundaire antilichaam (zie Tabel 1). Een lijst met soortspecifieke secundaire antilichamen die worden gebruikt voor enkelvoudige en dubbele kleuringsmethoden wordt tevens gepresenteerd in Tabel 2. Enkelvoudige IHC maakt gebruik van op xyleen gebaseerde inklaring- en montagereagentia, terwijl dubbele IHC xyleenvrije alternatieven vereist (bijv. Histo-Clear), aangezien het substraat gedeeltelijk oplosbaar is in xyleen (zie de lijst met substraten in Tabel 3).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit protocol is uitgevoerd in overeenstemming met alle relevante regelgevende en institutionele richtlijnen, inclusief die van het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (IACUC-protocolnummers: 2004N000067 en LA24-0045).

OPMERKING: Verschillende stappen in zowel de enkel- als de tweekleurige IHC-protocollen maken gebruik van brandbare reagentia, waaronder ethanol en weefselklaarmaakmiddelen. Daarom moeten procedures met brandbare chemicaliën, waaronder deparaffinering, rehydratatie, dehydratatie, klaarmaken en montage, worden uitgevoerd in een gecertificeerde chemische zuurkast volgens de geldende laboratoriumveiligheidsvoorschriften. Brandbare reagentia dienen te worden bereid en bewaard in correct geëtiketteerde glazen flessen met schroefdop in aangewezen kasten voor brandbare stoffen, in overeenstemming met de institutionele veiligheidsrichtlijnen. De materialen en reagentiavolumes zijn geconfigureerd voor batchverwerking van maximaal 48 microscoopglaasjes (twee kleuringsrekken, 24 glaasjes per rek), hoewel de workflow eenvoudig kan worden geschaald op basis van de experimentele behoeften.

1. Enkelvoudige kleur IHC voor FFPE-doorsneden van hersentumoren

OPMERKING: Het volgende protocol beschrijft substraatgebaseerde enkelkleurige IHC voor de detectie van representatieve oppervlakte- en intracellulaire antigenen in FFPE-coupes van hersentumoren, afgeleid van het orthotope 005 GSC-model.

  1. Deparaffinatie (20 min):
    1. Plaats de coupes in een polyoxymethyleen (POM) coupenrek en dompel het rek onder in kleurcontainers, eerst in Xyleen I en daarna in Xyleen II, telkens 10 min in een zuurkast. Zorg ervoor dat de weefselcoupes tijdens de deparaffinatie volledig ondergedompeld blijven in xyleen.
      WAARSCHUWING: Voer deze stap uit onder een chemische zuurkast met passende persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), waaronder een laboratoriumjas, een veiligheidsbril, een mondmasker en handschoenen. Laat de coupes in dit stadium of in een van de volgende stappen niet uitdrogen, omdat dit weefselschade en verlies van coupes kan veroorzaken. Bewaar xyleenoplossingen in luchtdichte glazen containers en hergebruik ze als ze schoon ogen.
  2. Geleidelijke rehydratie (15 min):
    1. Rehydrateer de coupes opeenvolgend in 100%, 90% en 70% ethanol gedurende telkens 5 min. Dompel hiervoor de coupes 5 min lang onder in 100% ethanol in de kleurcontainer (breng de 100% ethanol daarna terug in de glazen fles voor hergebruik), gevolgd door 90% ethanol gedurende 5 min (breng dit daarna terug in de fles), en tot slot in 70% ethanol gedurende 5 min (breng dit daarna terug in de fles).
      WAARSCHUWING: Voer deze stap uit onder een chemische zuurkast en gebruik PBM zoals beschreven in stap 1.1. Deze ethanoloplossingen kunnen in verschillende experimenten worden hergebruikt indien ze in luchtdichte glazen containers worden bewaard, mits ze schoon ogen.
  3. Waterspoeling (5 min):
    1. Plaats de coupes 5 min lang in gedistilleerd water; hiermee is het rehydratieproces voltooid.
      OPMERKING: Bereid tijdens deze stap 600 mL (voor 1 coupenrek) tot 800 mL (voor 2 coupenrekken) 1× antigeen-retrievalbufferoplossing (10 mM natriumcitraatbuffer) in een magnetronbestendig glazen bekerglas van 2 L, volgens de instructies vermeld in Supplementary File 1.
  4. Antigeen-retrieval (~20 min):
    1. Dek het bekerglas van 2 L met de vers bereide 10 mM natriumcitraat-antigeen-retrievalbuffer af met vershoudfolie om overmatige verdamping tijdens het voorverwarmen en het langdurige verwarmen in de magnetron te voorkomen.
    2. Maak enkele gaatjes in de folie om te voorkomen dat de buffer wegspat door de overmaat aan druk die ontstaat tijdens het koken van de weefselcoupes.
      OPMERKING: Gebruik PBM zoals in stap 1.1.
    3. Verwarm de vers bereide 10 mM natriumcitraat-antigeen-retrievalbufferoplossing 3 min lang voor. Plaats het coupenrek met gerehydrateerde weefselcoupes in de voorverwarmde retrieval-oplossing.
    4. Verwarm de weefselcoupes vervolgens 15 min in de magnetron op het hoogste vermogen (bijv. P10), terwijl het bekerglas zorgvuldig wordt gecontroleerd om er zeker van te zijn dat de coupes ondergedompeld blijven en niet uitdrogen door verdamping.
      OPMERKING: Als alternatief kan antigeen-retrieval worden uitgevoerd in een plastic kleurbak in een dampgaarkast gedurende ongeveer 15 min, wat een mildere verwarmingsmethode is die minder monitoring vereist. Natriumcitraatbuffer (10 mM, pH 6.0) is succesvol gevalideerd en gebruikt als antigeen-retrievalbuffer voor alle primaire antilichamen vermeld in Tabel 1. Afhankelijk van het primaire antilichaam en de aanbevelingen van de fabrikant kunnen andere buffers, zoals EDTA of Tris-EDTA, vereist zijn voor antilichamen die niet in deze studie zijn geëvalueerd. 
  5. Afkoeling (10–20 min):
    1. Haal het bekerglas uit de magnetron, plaats het op de werkbank en laat het 20 min lang afkoelen tot kamertemperatuur. Om de afkoeling te versnellen, kan het bekerglas ~10 min lang in ijskoud kraanwater worden geplaatst.
      WAARSCHUWING: Het glas zal extreem heet zijn; gebruik hiervoor geschikte hittebestendige handschoenen of een bekerglashouder. Gebruik PBM zoals in stap 1.1.
  6. Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) wasbeurt (~10 min):
    1. Haal het coupenrek uit het bekerglas en dompel de coupes onder in een 1× DPBS-oplossing in de kleurcontainer.
    2. Spoel de coupes twee keer in 1× DPBS gedurende telkens 5 min met behoedzame, statische wasbeurten om loslating van het weefsel te voorkomen.
  7. Hydrofoob scherm (<1 min/coupe):
    1. Verwijder tijdens de DPBS-wasbeurt (stap 1.6) elke coupe voorzichtig individueel en veeg voorzichtig rond de weefselcoupe met pluisvrije doekjes (bijv. Kim Wipes), waarbij contact met het weefsel zelf wordt vermeden.
    2. Gebruik een hydrofoob scherm, zoals een peroxidase-anti-peroxidase (PAP) pen, om een vloeistofafstotende barrière rond elke weefselcoupe te trekken, en plaats de coupe vervolgens terug in de DPBS-wasoplossing in de kleurcontainer. Herhaal deze stappen voor alle coupes.
      OPMERKING: Een hydrofoob scherm rond het weefsel voorkomt het overvloeien van reagentia tussen coupes en helpt antilichamen op het weefsel te behouden.
  8. Blokkeren van endogene peroxidase (5 min):
    1. Giet de 1× DPBS uit de kleurcontainer en voeg een 3% H₂O₂-oplossing toe, waarbij wordt gewaarborgd dat de coupes of weefselcoupes 5 min lang volledig ondergedompeld zijn.
      OPMERKING: Langdurige incubatie in 3% H₂O₂ kan het weefsel beschadigen. Het blokkeren van de endogene peroxidase-activiteit is een cruciale stap om achtergrondruis door endogene peroxidase tijdens de kleurontwikkeling te voorkomen. Gebruik PBM zoals in stap 1.1.
  9. DPBS wasbeurt (~12 min):
    1. Giet de 3% H₂O₂-oplossing weg en spoel de coupes opnieuw twee keer in 1× DPBS gedurende telkens 5 min.
    2. Verwijder na de tweede wasbeurt de coupes uit het coupenrek, leg ze plat in de bevochtigingskamer en voeg gedistilleerd water toe aan de randen van de bevochtigingskamer.
    3. Laat de coupes niet uitdrogen en ga direct over naar het blokkeren in stap 1.10.
      OPMERKING: Elke bevochtigingskamer vermeld in de Table of Materials heeft ruimte voor en kan 30 coupes accommoderen.
  10. Serumblokkering (~70 min):
    1. Voeg 50 µL van een 5% runder-serumalbumine (BSA) oplossing per coupe toe en incubeer 30 min op kamertemperatuur, terwijl het deksel van de bevochtigingskamer gesloten blijft om verdamping van de blokkeringsbuffer uit de weefselcoupes te voorkomen.
    2. Klop de coupes na 30 min voorzichtig tegen pluisvrije doekjes op de werkbank om de BSA te verwijderen.
    3. Voeg vervolgens 2,5% normaal paarden- of geiten-serum toe (één druppel per coupe), passend bij de gastsoort van het secundaire antilichaam, en incubeer de coupes nogmaals 30 min op kamertemperatuur met het deksel van de bevochtigingskamer gesloten. Klop de coupes voorzichtig tegen absorberend papier of pluisvrije doekjes om het serum te verwijderen en ga direct over naar stap 1.11.
      OPMERKING: Laat de coupes niet uitdrogen. Bereid de primaire antilichamen, verdund in de juiste blokkeringsbuffer (zie Tabel 1), vlak voor het einde van de blokkeringsstap voor, zodat ze klaar zijn voor gebruik in stap 1.11 zodra de blokkering is voltooid.
  11. Incubatie met primair antilichaam (~16 u):
    1. Breng ~50 µL van de primaire antilichamen, optimaal verdund in de juiste blokkeringsbuffer (zie Tabel 1), aan op de weefselcoupes en incubeer deze overnight (~16 u) bij 4 °C in een bevochtigingskamer.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de aangewezen gebieden van de bevochtigingskamer zijn gevuld met gedistilleerd water om de kamer gedurende de nacht bevochtigd te houden. Neem daarnaast voorzorgsmaatregelen om ervoor te zorgen dat de aangewezen gebieden/kamers voor de weefselcoupes niet zijn gevuld met gedistilleerd water, omdat dit kan leiden tot overstroming van de weefselcoupes.
  12. DPBS (0,1% Tween 20) wasbeurt (~18–20 min):
    1. Plaats een coupenrek in een kleurcontainer en vul deze met wasbuffer (1× DPBS, 0,1% Tween 20).
    2. Verwijder na de overnight incubatie de coupes uit de bevochtigingskamer, verwijder de primaire antilichamen door de coupes voorzichtig tegen absorberend papier te kloppen, plaats de coupes vervolgens in een coupenrek dat is ondergedompeld in wasbuffer (1× DPBS, 0,1% Tween 20) in een kleurcontainer en giet de wasbuffer weg.
    3. Was de coupes vervolgens drie keer in 1× DPBS (0,1% Tween 20) gedurende telkens 5 min. Verwijder daarna de coupes uit het coupenrek, leg ze plat in de bevochtigingskamer en ga direct over naar stap 1.13.
      OPMERKING: Elke wastijd kan worden verlengd naar 10–15 min als er na de kleurontwikkeling in stap 1.15 een hoge achtergrondkleuring wordt waargenomen. Het wassen moet behoedzaam en statisch gebeuren (geen schudden of wiegen) om loslating van het weefsel van de coupes te voorkomen.
  13. Incubatie met secundair antilichaam (~32–35 min):
    1. Voeg één druppel per coupe van het juiste HRP-geconjugeerde secundaire antilichaam toe (anti-konijn of anti-rat IgG, naar gelang; zie Tabel 2) en incubeer de weefselcoupes 30 min op kamertemperatuur met het deksel van de bevochtigingskamer gesloten.
      OPMERKING: Het secundaire antilichaam kan 1:1 worden verdund in PBS om de achtergrond in stap 1.15 te verminderen.
  14. DPBS (0,1% Tween 20) wasbeurt (~18–20 min):
    1. Verwijder na incubatie met het secundaire antilichaam de coupes uit de bevochtigingskamer en klop de coupes voorzichtig tegen absorberend papier om de secundaire antilichamen te verwijderen.
    2. Plaats de coupes vervolgens in een coupenrek dat is ondergedompeld in wasbuffer (1× DPBS met 0,1% Tween 20) in een kleurcontainer voor een korte wasbeurt, en giet de wasbuffer weg.
    3. Was de weefselcoupes vervolgens drie keer met 1× DPBS (0,1% Tween 20) gedurende telkens 5 min.
      1. Plaats vóór het starten van de chromogeenontwikkelingsstap (d.w.z. stap 1.15) een apart coupenrek in een kleurcontainer gevuld met gedistilleerd water; dit is een voorbereidende stap voor stap 1.16 om de chromogene reactie te stoppen.
      2. Bereid tijdens de laatste wasbeurt de DAB-werkoplossing vers (1 druppel chromogeen per 1 mL substraat; zie Supplementary File 1).
  15. Chromogeenontwikkeling (30 s–5 min):
    1. Verwijder na de derde wasbeurt in stap 1.14 de coupes uit het coupenrek en leg ze plat op de werkbank op een witte achtergrond.
    2. Breng 50 µL DAB-werkoplossing aan op elke coupe en monitor visueel de ontwikkeling van een bruine kleur tegen een witte achtergrond of onder een lichtmicroscoop.
      OPMERKING: Gebruik PBM zoals in stap 1.1. Het gebruik van wit absorberend papier helpt bij het visualiseren van de bruine kleurontwikkeling tijdens de DAB-chromogeenfase. De kleurontwikkeling kan 20–60 s duren voor sommige markers en 2–5 min voor andere (zie details in stap 1.16).
  16. Reactie stoppen (1–2 min):
    1. Zodra het gewenste bruine kleursignaal in stap 1.15 verschijnt, moet de reactie onmiddellijk worden gestopt door de coupe in een container met gedistilleerd water te dippen, zoals voorbereid in stap 1.14.3.1.
    2. Houd de coupes 1 min lang in gedistilleerd water. Giet het gedistilleerde water weg en ga vervolgens over naar stap 1.17 (tegenkleuring).
      OPMERKING: Coupes kunnen tot 1 u in gedistilleerd water blijven zonder dat dit de kleuring beïnvloedt. De tijd die nodig is voor de kleurontwikkeling bepaalt wanneer de stap om de reactie te stoppen moet worden gestart. Indien er 2–3 markers (zoals CD3, CD4, CD8 of anderen) op dezelfde coupe aanwezig zijn (zoals in deze studie), kunnen de reactietijden variëren; in het hier beschreven systeem duurt de kleurontwikkeling over het algemeen rond de 30 s voor CD8+ cellen, 1–3 min voor CD3+ of CD4+ cellen, of langer (3–5 min) voor Granzyme B+ en Ki67+ cellen. Vanwege verschillen in de timing van de kleurontwikkeling kan de gehele coupe niet in gedistilleerd water worden ondergedompeld om de reactie te stoppen. Stop in plaats daarvan elke reactie individueel voor elke coupe door 200–300 µL gedistilleerd water direct op elke coupe aan te brengen.
  17. Tegenkleuring (<1 min):
    1. Om het contrast met de bruine kleuring te verhogen, voegt u verdunde hematoxyline (1:3 in gedistilleerd water) toe aan de kleurcontainer, waarbij wordt gewaarborgd dat de coupes ~10–20 s lang ondergedompeld blijven in de verdunde hematoxyline.
      OPMERKING: Als de DAB-achtergrond sterk is, kleur dan langer tegen (tot 1 min) of gebruik kort onverdunde hematoxyline.
  18. Kraanwaterwasbeurt (6 min):
    1. Giet de hematoxyline uit de kleurcontainer en breng deze terug in de glazen fles voor hergebruik.
    2. Spoel de coupes 1 min lang af met kraanwater, en spoel ze vervolgens 5 min lang af onder langzaam stromend kraanwater, waarbij de coupes van de directe waterstroom af zijn gericht. Giet het kraanwater weg en ga over naar stap 1.19.
      OPMERKING: De resterende stappen tot aan het eindslaan worden in een zuurkast uitgevoerd.
  19. Geleidelijke dehydratie (15–17 min):
    1. Dompel de coupes 5 min lang onder in 70% ethanol in de kleurcontainer (breng de 70% ethanol daarna terug in de glazen fles voor hergebruik), gevolgd door 90% ethanol gedurende 5 min (breng dit daarna terug in de fles), en tot slot in 100% ethanol gedurende 5 min (breng dit daarna terug in de fles).
    2. Ga over naar stap 1.20.
      OPMERKING: Voer deze stap uit in een chemische zuurkast. Dezelfde ethanoloplossingen uit stap 1.2 worden in deze dehydratiestap gebruikt en kunnen vele malen worden hergebruikt als ze schoon ogen.
  20. Klareren:
    1. Gebruik dezelfde Xyleen I en II oplossingen die zijn gebruikt voor de deparaffinatie (stap 1.1) om de weefselcoupes/coupes te reinigen.
    2. Dompel de coupes eerst 10 min lang onder in de Xyleen I-oplossing in de kleurcontainer (breng Xyleen I daarna terug in de glazen fles voor hergebruik) en vervolgens nog eens 10 min lang in de Xyleen II-oplossing.
    3. Houd de coupes in Xyleen II tot het eindslaan (d.w.z. stap 1.21) is voltooid.
      OPMERKING: Laat de coupes tijdens deze stap nooit uitdrogen, omdat uitgedroogde coupes fragiel worden; indien nodig kunnen coupes langer in Xyleen II blijven voor het eindslaan.
  21. Eindslaan:
    1. Verwijder de coupes één voor één uit Xyleen II en leg ze plat in een chemische zuurkast. Breng één druppel op xyleen gebaseerd montagemedium aan op een passend dekglas, en plaats het dekglas vervolgens op de coupe, met het montagemedium richting de weefselcoupes.
    2. Druk het dekglas voorzichtig met de duim aan om het montagemedium gelijkmatig over alle drie de coupes te verspreiden en luchtbellen te verwijderen.
      OPMERKING: Een dekglas van 24 × 50 mm is vereist om drie coupes op een slide te dekken; een dekglas van 24 × 40 mm voor twee coupes; en een dekglas van 24 × 24 mm voor één coupe. Het is belangrijk om het eindslaan binnen 30 s per coupe te voltooien, omdat het montagemedium snel kan uitdrogen door de constante luchtstroom in de zuurkast, waardoor Xyleen II snel uit de coupe verdampt en de coupes fragiel worden.
  22. Luchtdrogen en lichtmicroscopie:
    1. Laat de coupes in de zuurkast ten minste 2 u luchtdrogen voordat ze worden geëvalueerd en gefotografeerd met een lichtmicroscoop. Zodra ze droog zijn, kunnen de ingesloten coupes jarenlang bij kamertemperatuur in coupenbakken worden bewaard.

2. Tweekleurige IHC voor FFPE-breintumorsecties

OPMERKING: Het volgende protocol beschrijft een substraatgebaseerde duale-kleur chromogene IHC-workflow voor de gelijktijdige detectie van twee antigenen binnen dezelfde FFPE-sectie van een hersentumor. In vergelijking met enkelvoudige IHC is de duale-kleur workflow tijdrovender omdat deze opeenvolgende kleuringscycli vereist met onafhankelijke incubaties van primaire antilichamen, inclusief incubatiestappen overnacht voor elke kleuringsronde. Deze uitgebreide workflow maakt echter betrouwbare gelijktijdige antigeendetectie mogelijk binnen dezelfde weefselsectie, terwijl de weefselmorfologie behouden blijft en er een duidelijke scheiding van het chromogene signaal onder lichtmicroscopie gewaarborgd wordt.

  1. Deparaffinering (20 min):
    1. Volg hetzelfde deparaffineringsproces als hierboven beschreven voor enkelkleurige IHC in stap 1.1 in een chemische zuurkast, maar gebruik xyleenvrije helderingsmiddelen (bijv. Histo-Clear I en Histo-Clear II in plaats van xyleen).
      WAARSCHUWING: Gebruik PBM zoals in stap 1.1 en voer deze stap uit onder een chemische zuurkast. Histo-Clear wordt aanbevolen omdat het chromogeen gedeeltelijk oplosbaar is in xyleen, en xyleenvrije verwerking helpt de kleurintensiteit te behouden tijdens dual-color IHC. Laat de secties niet uitdrogen. Deze helderingsoplossingen kunnen worden hergebruikt als ze in luchtdichte glazen containers worden bewaard en schoon lijken.
  2. Geleidelijke rehydratatie (15 min):
    1. Zelfde als enkelkleurige IHC zoals beschreven in stap 1.2. Rehydrateer de secties sequentieel met een geleidelijke afname van de ethanolconcentratie (100%, 90% en 70%) gedurende 5 min per stap.
      ​OPMERKING: Hier wordt een aparte set xyleenvrije gradiënt-ethanol gebruikt, aangezien de gradiënt-ethanol die voor enkelkleurige IHC in stap 1.2 werd gebruikt, waarschijnlijk verontreinigd is met Xyleen II.
  3. Spoelen met water (5 min):
    1. Zelfde als enkelkleurige IHC in stap 1.3; plaats de dia's 5 min in gedestilleerd water om het rehydratatieproces te voltooien.
      ​OPMERKING: Zelfde als stap 1.3; bereid de oplossing voor antigeen-retrieval voor tijdens deze periode van 5 min.
  4. Antigeen-retrieval (~20 min): Volg dezelfde procedure voor antigeen-retrieval als beschreven voor enkelkleurige IHC in stap 1.4.
  5. Afkoelen (10–20 min): Volg hetzelfde afkoelingsproces als beschreven voor enkelkleurige IHC in stap 1.5.
  6. DPBS-wasstap (10 min): Volg het proces voor het uitwassen van de antigeen-retrievaloplossing zoals beschreven voor enkelkleurige IHC in stap 1.6.
  7. Hydrofoob barrieren (<1 min/dia):
    1. Maak tijdens de DPBS-wasstap in stap 2.6 een hydrofobe barrière rond de weefelsecties volgens hetzelfde proces/protocol als in stap 1.7.
    2. Gebruik de hydrofobe barrièrepen om een vloeistofafstotende barrière rond elke weefselsectie te tekenen, en plaats de dia vervolgens terug in de DPBS-wasoplossing in de kleuringscontainer. Herhaal deze stappen voor alle dia's.
  8. Blokkeren van alkalische fosfatase (5 min):
    1. Nadat de hydrofobe barrières op alle weefselsecties zijn aangebracht, worden de dia's uit de kleuringscontainer gehaald, plat in de bevochtigingskamer geplaatst, wordt er één druppel endogene alkalische fosfatase-blokkeeroplossing (bijv. BLOXALL) per sectie toegevoegd en worden de secties 5 min geïncubeerd. Ga onmiddellijk over naar stap 2.9.
      ​OPMERKING: Aangezien AP-geconjugeerde secundaire antilichamen worden gebruikt in het dual-color IHC-protocol, is het essentieel om de endogene alkalische fosfatase-activiteit te blokkeren om het achtergrondsignaal tijdens de rode of blauwe kleurontwikkeling te verminderen. De BLOXALL-blokkeeroplossing wordt hier gebruikt om endogene alkalische fosfatase te remmen. Het remt ook endogene peroxidase, waardoor deze blokkeeroplossing ook in het enkelkleurige IHC-protocol kan worden gebruikt om endogene peroxidase-activiteit te blokkeren, in plaats van een 3% H₂O₂-oplossing.
  9. DPBS-wasstap (10 min):
    1. Spoel de dia's twee keer gedurende 5 min in een 1× DPBS-oplossing in de kleuringscontainer.
    2. Verwijder na de tweede wasbeurt de dia's uit de kleuringscontainer, plaats ze plat in de bevochtigingskamer en voeg gedestilleerd water toe aan de randen van de bevochtigingskamer.
      OPMERKING: Laat de secties niet uitdrogen, ga dus onmiddellijk over naar het blokkeren van aspecifieke antigeen-antilichaambinding in stap 2.10.
  10. Serumblokkering (~70 min):
    1. Volg hetzelfde proces voor serumblokkering als in het enkelkleurige IHC-protocol beschreven in stap 1.10.
      1. Blokkeer eerst met de universele blokkeringsbuffer (5% BSA; 50 µL/sectie) gedurende 30 min bij kamertemperatuur en vervolgens met 2,5% normaal paardenserum (één druppel/sectie), passend bij de gastsoort van het secundaire AP-geconjugeerde anti-rabbit IgG-antilichaam, gedurende nog eens 30 min bij kamertemperatuur met het deksel van de bevochtigingskamer gesloten.
      2. Tik na deze periode voorzichtig op de dia's met absorberend papier om het serum te verwijderen en ga over naar stap 2.11.
        OPMERKING: Bereid primair antilichaam I (zie Tabel 1) voor tijdens de laatste minuut van de blokkeringsstap, zoals beschreven in stap 1.10.
  11. Incubatie primair antilichaam I (~16 u):
    1. Volg hetzelfde incubatieproces met het primaire antilichaam als in stap 1.11. Voeg bijvoorbeeld ~50 µL rabbit anti-CD3 antilichaam, verdund 1:100 in 2,5% normaal paardenserum (zie Tabel 1), toe aan elke weefselsectie.
    2. Incubeer overnight (~16 u) bij 4 °C in een bevochtigingskamer.
  12. DPBS (0,1% Tween 20) wasstap (~18–20 min):
    1. Volg dezelfde wasprocedure (3 wasstappen, 5 min elk) als beschreven voor het enkelkleurige IHC-protocol in stap 1.12.
    2. Plaats de dia's na de derde wasbeurt plat in de bevochtigingskamer. Ga onmiddellijk over naar stap 2.13.
      OPMERKING: Zelfde opmerkingen als stap 1.12, bijv. elke wastijd kan worden verlengd tot 10–15 min, en het wassen moet voorzichtig en statisch gebeuren. Laat de secties niet uitdrogen.
  13. Incubatie secundair antilichaam I (~32–35 min):
    1. Voeg één druppel per sectie van het AP-geconjugeerde anti-rabbit IgG secundaire antilichaam (zie Tabel 2) toe en incubeer de weefselsecties 30 min bij kamertemperatuur met het deksel van de bevochtigingskamer gesloten.
      OPMERKING: Het secundaire antilichaam kan 1:1 in PBS worden verdund om de achtergrond in stap 2.15 te verminderen.
  14. DPBS (0,1% Tween 20) wasstap (~18–20 min):
    1. Volg dezelfde wasprocedure met 1× DPBS/0,1% Tween 20, zoals in stap 1.14.
    2. OPMERKING: Bereid tijdens de laatste wasstap de verse substraat-werkoplossing (5 mL, zoals aanbevolen; zie Tabel 3) volgens de instructies van de fabrikant (zie reagensbereiding in Supplementary File 1).
  15. Rode kleurontwikkeling (12–15 min):
    1. Plaats de dia's na voltooiing van stap 2.14 plat op de werkbank met een witte achtergrond, zoals wit absorberend papier, zoals beschreven in stap 1.15.
    2. Meng de vers bereide rode substraat-werkoplossing grondig en voeg vervolgens 50 µL toe aan elke weefselsectie (gooi overtollige oplossing weg).
    3. Incubeer de weefselsecties bij kamertemperatuur tot de rode kleur verschijnt; controleer periodiek elke 2–3 min tegen een witte achtergrond of onder een lichtmicroscoop.
      OPMERKING: De tijd die nodig is voor de rode kleurontwikkeling varieert per marker en kan 20–30 min duren. Echter, voor het kleuren van CD3+ cellen in 005 hersentumorsecties met het AP-detectiesysteem vindt de rode kleurontwikkeling gewoonlijk plaats binnen 12–15 min.
  16. Spoelen met buffer (5 min):
    1. Zodra het gewenste rode kleursignaal in stap 2.15 verschijnt, worden de secties 5 min in 1× DPBS/0,1% Tween 20 gespoeld in een kleuringscontainer.
    2. Bereid tijdens deze wasstap het primaire antilichaam II vers in een geschikte blokkeringsbuffer (bijv. rabbit anti-Ki67 antilichaam verdund 1:100 in 2,5% normaal paardenserum; zie Tabel 1).
      OPMERKING: In tegenstelling tot het spoelen met gedestilleerd water dat wordt gebruikt bij enkelkleurige IHC (stap 1.16), wordt hier DPBS/0,1% Tween 20 gebruikt, niet alleen om de reactie te stoppen, maar ook om overtollig chromogeen grondig weg te wassen en voor te bereiden op de tweede kleuringscyclus.
  17. Incubatie primair antilichaam II (~16 u):
    1. Plaats de dia's in een bevochtigingskamer en voeg ~50 µL vers bereid rabbit anti-Ki67 antilichaam toe aan elke weefselsectie. Incubeer overnight (~16 u) bij 4 °C.
  18. DPBS (0,1% Tween 20) wasstap (~18–20 min):
    1. Volg dezelfde procedure als in stap 1.12.
    2. Verwijder na de derde wasbeurt de dia's uit de kleuringscontainer en plaats ze plat in de bevochtigingskamer. Ga onmiddellijk over naar stap 2.19.
  19. Incubatie secundair antilichaam II (~32–35 min):
    1. Volg dezelfde procedure als in stap 2.13. Voeg één druppel per sectie van het AP-geconjugeerde anti-rabbit IgG (zie Tabel 2) toe en incubeer de weefselsecties 30 min bij kamertemperatuur met het deksel van de bevochtigingskamer gesloten.
  20. DPBS (0,1% Tween 20) wasstap (~18–20 min):
    1. Volg dezelfde wasprocedure met 1× DPBS/0,1% Tween 20, zoals in stap 1.14.
      OPMERKING: Bereid tijdens de laatste wasstap de verse substraat-werkoplossing (5 mL, zoals aanbevolen; zie Tabel 3) volgens de instructies van de fabrikant (zie reagensbereiding in Supplementary File 1).
  21. Blauwe kleurontwikkeling (10–12 min):
    1. Plaats de dia's na voltooiing van stap 2.20 plat op de werkbank met een witte achtergrond.
    2. Meng de vers bereide blauwe substraat-werkoplossing grondig en voeg vervolgens 50 µL toe aan elke weefselsectie (gooi overtollige oplossing weg).
    3. Incubeer de weefselsecties bij kamertemperatuur tot de blauwe kleur verschijnt; controleer periodiek elke 2–3 min tegen een witte achtergrond of onder een lichtmicroscoop.
      OPMERKING: Net als bij de rode kleurontwikkeling in stap 2.15 kan de tijd die nodig is voor de blauwe kleurontwikkeling 20–30 min duren. Echter, voor het kleuren van Ki67+ cellen in 005 hersentumorsecties met het AP-detectiesysteem ontwikkelt de blauwe kleur zich binnen 10–12 min.
  22. Wassen met buffer (5 min):
    1. Zodra het gewenste blauwe kleursignaal in stap 2.21 verschijnt, worden de secties 5 min ondergedompeld in 1× DPBS/0,1% Tween 20 in een kleuringscontainer. Gooi de wasoplossing weg.
  23. Spoelen met water (1 min): Spoel de secties 1 min in gedestilleerd water. Gooi het gedestilleerde water na het spoelen weg.
  24. Geleidelijke dehydratatie (15–17 min):
    1. Dompel de dia's in de kleuringscontainer 5 min onder in 70% ethanol (plaats de 70% ethanol daarna terug in de glazen fles voor hergebruik), gevolgd door 90% ethanol gedurende 5 min (plaats deze daarna terug in de fles) en tot slot in 100% ethanol gedurende 5 min (plaats deze daarna terug in de fles).
    2. Herhaal elke stap in een zuurkast. Ga over naar stap 2.25.
      OPMERKING: Dezelfde (xyleenvrije) ethanoloplossingen uit stap 2.2 worden in deze dehydratiestap gebruikt en kunnen vele malen worden hergebruikt als ze schoon lijken.
  25. Xyleenvrije heldering:
    1. Gebruik dezelfde xyleenvrije oplossingen (bijv. Histo-Clear) als gebruikt in stap 2.1 om de weefselsecties/dia's te reinigen.
      1. Dompel de dia's eerst 10 min onder in xyleenvrije oplossing I in de kleuringscontainer (plaats de xyleenvrije oplossing I daarna terug in de glazen fles voor hergebruik) en vervolgens nog eens 10 min in xyleenvrije oplossing II.
      2. Bewaar de dia's in xyleenvrije oplossing II tot het inklissen (d.w.z. stap 2.26) is voltooid.
        OPMERKING: Indien nodig kunnen secties langer in xyleenvrije oplossing II blijven voor het inklissen.
        WAARSCHUWING: Gebruik PBM zoals in stap 1.1 en voer deze stap uit onder een chemische zuurkast.
  26. Xyleenvrij inklissen:
    1. Haal de dia's één voor één uit xyleenvrije oplossing II en plaats ze plat in een zuurkast. Plaats één druppel xyleenvrij inklismiddel op een bijpassend dekglas en plaats het dekglas vervolgens op de dia, met het inklismiddel naar de weefselsecties gericht.
    2. Druk het dekglas voorzichtig met de duim aan om het inklismiddel gelijkmatig over alle drie de secties te verspreiden en luchtbellen te verwijderen.
      OPMERKING: Voltooi het inklissen binnen 30 s per dia, aangezien het inklismiddel snel kan opdrogen. Gebruik PBM zoals in stap 1.1 en voer deze stap uit onder een chemische zuurkast.
  27. Luchtdrogen en lichtmicroscopie: Laat de dia's minimaal 2 u luchtdrogen in de zuurkast voordat ze worden geëvalueerd en afgebeeld met een lichtmicroscoop. Eenmaal droog kunnen de ingekliste dia's jarenlang bij kamertemperatuur in dia-doosjes worden bewaard.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Enkelkleurige IHC met behulp van het HRP-gebaseerde chromogene detectiesysteem produceerde een heldere en reproduceerbare kleuring in FFPE 005 hersentumorsecties. Representatieve beelden van de kleuring van oppervlakteantigenen zijn weergegeven in Figuur 1, waarin de succesvolle detectie van T-celmarkers (CD3, CD4, CD8), markers voor tumorgeassocieerde macrofagen (TAM) (CD68, F4/80) en het immuuncheckpointmolecuul programmed death ligand 1 (PD-L1) wordt aangetoond. In alle gevallen werd een ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Deze studie beschrijft een gedetailleerde en reproduceerbare substraatgebaseerde chromogene IHC-workflow voor enkel- en duale kleurdetectie van oppervlakte- en intracellulaire antigenen in FFPE-hersentumorweefsels afkomstig van een orthotopisch GSC-model. Het hoofddoel van deze studie was methodologisch om een praktisch stapsgewijs protocol vast te stellen voor betrouwbare chromogene antigeendetectie in immunocompetent GBM-weefsel.

Chromogene IHC blijft een veelgebruikte methode voor het evalu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

S.D.R. is mede-uitvinder van patenten met betrekking tot oncolytische herpes simplexvirussen, die in eigendom zijn van en beheerd worden door Georgetown University en Massachusetts General Hospital, en waarvoor royalty's zijn ontvangen van Amgen en Acti\Vec Inc., en heeft opgetreden als consultant en honoraria ontvangen van Replimune, Cellinta en Greenfire Bio, en honoraria en aandelen van EG 427. De overige auteurs verklaren dat dit manuscript is opgesteld in de afwezigheid van commerciële of financiële relaties die kunnen worden beschouwd als een potentieel belangenconflict.

Dankbetuigingen

D.S. werd gedeeltelijk ondersteund door een fonds van het College of Science and Technology aan de North Carolina Agricultural and Technical State University (NCA&T), een Faculty Fellowship Grant (GRADS-4C) aan NCA&T, en door een beurs van de NIH (1R16NS147983-01). Evenzo werd S.D.R. gedeeltelijk ondersteund door de Thomas A. Pappas Chair in Neurosciences, terwijl R.H.N. gedeeltelijk werd ondersteund door een NIH-beurs (1R35GM153737). Wij danken Dr. Inder Verma en Dr. Yasushi Soda voor de 005 GSC's.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2 L glazen flessen CorningCORN1395-2LGebruikt voor de bereiding en opslag van 10× DPBS, 1× DPBS, gedestilleerd water en natriumcitraatbuffer
2 L Pyrex glazen bekerglas Corning1000-2LGebruikt voor microwave-gemedieerde antigeenherstelling in natriumcitraatbuffer (werkvolume 600–800 mL)
2,5% normaal paardenserum of normaal geitenserumDeze worden geleverd als voorbereid samen met de secundaire antilichamen van Vector Laboratories. Gebruikt voor soortspecifieke blokkering en antilichaamverdunning, afhankelijk van de gastsoort van het secundaire antilichaam (anti-konijn of anti-rat IgG), om aspecifieke binding en achtergrondkleuring te minimaliseren
30% waterstofperoxide (H2O2)Fisher ScientificBP2633500
500 mL glazen flessenVWR InternationalVWRU10754-818Gebruikt voor de bereiding en opslag van brandbare reagentia voor enkleuren-IHC en xyleenvrije reagentia voor dubbele kleuren-IHC
Absorberend benchpapier met KimwipesGebruikt tijdens kleurprocedures om overtollig antilichaam of wasoplossing van weefselcoupes te verwijderen vóór volgende incubaties, waardoor overdracht van reagentia en kruiscontaminatie worden geminimaliseerd
Anti-CD3eAbcamab5690
Anti-CD4 eBioscience14-9766-80
Anti-CD68Abcamab125212
Anti-CD8a eBioscience14-0808-80
Anti-Cleaved caspase-3CST9661
Anti-F4/80Abcamab111101
Anti-FoxP3Abcamab54501
Anti-GFPAbcamab183734
Anti-Granzyme BAbcamab4059
Anti-Ki67Abcamab16667
Anti-NeuNCST24307
Anti-PD-L1Abcamab205921
Anti-pSTAT1CST9167
Anti-T-betAbcamab91109
AP anti-konijn IgGVector LaboratoriesMP-5401
AP anti-rat IgGVector LaboratoriesMP-5404-15
BLOXALL blokkeeroplossingVector LaboratoriesSP-6000-100Primair gebruikt in dubbele kleuren-IHC om endogene peroxidase- en alkalische fosfatase-activiteit te remmen
Bovien serumalbumine (BSA)Bioworld22070007-2Gebruikt voor de bereiding van 5% universele blokkeerbuffer om aspecifieke binding te verminderen
Cytoseal 60 permanent Medium voor insluiting Electron Microscopy Sciences18006Xyleen-compatibel medium voor insluiting, gebruikt voor enkelkleuren-IHC
DAB substraat en chromogeenDAKOK346811-2Gebruikt voor HRP-gebaseerde enkelkleur chromogene detectie. Vlak voor gebruik bereiden door 1 druppel chromogeen toe te voegen aan 1 mL DAB-substraat volgens de instructies van de fabrikant’s. Ongebruikte werkoplossing moet na bereiding worden weggegooid. DAB is een potentieel carcinogeen en moet worden gehanteerd volgens de institutionele richtlijnen voor bioveiligheid en chemische veiligheid
Gedestilleerd waterGebruikt voor de bereiding van reagentia, wasbeurten en bufferbereiding. Ultrapuur of Milli-Q water kan ook worden gebruikt
DPBS (Dulbecco’s fosfaatgebufferde zoutoplossing) Corning55-031-PC
Ethanol, 200 proof Decon Labs2701
Fisherbrand Superfrost Plus microscoopglaasjesFisher Scientific12-550-15Positief geladen microscopische glazen plaatjes voor weefselcoupes
Glazen dekglasjesCorning of Milipore SigmaGeschikte maten moeten worden gekozen op basis van het aantal weefselcoupes per glaasje. Gangbare maten zijn: 24 mm × 24 mm (één weefselcoupe), 24 mm × 40 mm (twee weefselcoupes), 24 mm × 50 mm (drie weefselcoupes)
HematoxylineFisher Scientific220-102
Histo-Clear (1 L)Electron Microscopy Sciences64111-01Xyleenvrij helderend middel gebruikt voor dubbele kleuren-IHC. Bereid twee flessen van 500 mL, gelabeld als Histo-Clear I en Histo-Clear II
HRP anti-muis IgGVector LaboratoriesMP-7402-15
HRP anti-konijn IgGVector LaboratoriesMP-7401
HRP anti-rat IgGVector LaboratoriesMP-7444-15
Bevochtingskamers Stellar ScientificHS-120879Voor incubatie van weefselcoupes met primaire en secundaire antilichamen
Hydrofoob barrière-pen (PAP-pen)Vector LaboratoriesH-4000Gebruikt om een waterafstotende barrière rond weefselcoupes te creëren om antilichamen en reagentia tijdens incubatie vast te houden en kruiscontaminatie tussen meerdere weefselcoupes op hetzelfde glaasje te voorkomen
KimwipesKimtech Science34155Gebruikt voor het voorzichtig verwijderen van residuele reagentia en wasbuffer van weefselcoupes
Magnetische roerder IKAI-10001529Voor de bereiding van natriumcitraat- en DPBS-stockoplossingen
MagnetronovenPanasonic (Model: NN-L931BFSN: 6H61050036Capaciteit van 2,2 cubic-foot. Vereist voor hitte-gemedieerde antigeenherstelling met behulp van een 2 L glazen bekerglas
Nikon lichtmicroscoop NikonSN: 707798Nikon Eclipse Ci-L sn: 707798, Sola light engine 5M5-LCR-VA sn: 11787, Software: NIS Elements BR 4.60.00 & NIS Elements BR Analysis 4.60.00, Camera's: Nikon DS-Fi3 sn: 110865 (kleur) & Photometrics CoolSNAP DYNO snA17A608015 (Z/W)
pH-meter VWR International77619-152Voor het aanpassen van de pH van de antigeenhersteltbuffer
Plastic folieFisher Scientific01810Gebruikt om de antigeenherstelbuffer losjes af te dekken tijdens het verwarmen in de magnetron om verdamping te minimaliseren en uitdroging van het weefsel te voorkomen
Polyoxymethyleen (POM) glaashouders MopecSP234Compatibel met de bovenstaande kleurcontainers; elke houder bevat tot 24 microscoopglaasjes
Precisiebalans Mettler Toledo30697420Voor het wegen van natriumcitraat- en DPBS-poeder
KoelkastThermo ScientificTSG3005CAVoor opslag van temperatuurgevoelige reagentia en antilichamen
GlaasjesopbergdozenFisher Scientific22-267294
Kleurcontainers/schalen MopecSP233Elke container biedt plaats aan één kleurrek voor 24 glaasjes
Roerstaven Fisher Scientific14-512-128Voor de bereiding van natriumcitraat- en DPBS-stockoplossingen
Trinatriumcitraatdihydraat Thermo Scientific ChemicalsAA3643936
Tween 20 Thermo ScientificAAJ20605AP
VectaMount PT permanent Medium voor insluiting Vector LaboratoriesH-5600-60Xyleenvrij permanent medium voor insluiting, gebruikt voor dubbele kleuren-IHC
Vector Blue alkalische fosfatase substraatkit Vector LaboratoriesSK-5300Gebruikt voor blauwe chromogene signaalontwikkeling tijdens dubbele kleuren AP-gebaseerde IHC. Omdat Vector Blue gedeeltelijk oplosbaar is in xyleen, moeten xyleenvrije helderende middelen en media voor insluiting worden gebruikt voor dubbele kleuren-kleurworkflows
Vector Red alkalische fosfatase substraatkitVector LaboratoriesSK-5100Gebruikt voor rode chromogene signaalontwikkeling tijdens dubbele kleuren AP-gebaseerde IHC
Xyleen (1 L) StatLab8400-1Gebruikt als deparaffinisatie- en helderingsmiddel voor enkelkleuren-IHC. Bereid twee flessen van 500 mL, gelabeld als Xyleen I en Xyleen II

Referenties

  1. Sipos D, et al. Glioblastoma: Clinical presentation, multidisciplinary management, and long-term outcomes. Cancers (Basel). 2025;17(1):146.
  2. Himes BT, et al. Immunosuppression in glioblastoma: Current understanding and therapeutic implications. Front Oncol. 2021;11:770561.
  3. Lin H, et al. Understanding the immunosuppressive microenvironment of glioma: mechanistic insights and clinical perspectives. J Hematol Oncol. 2024;17(1):31.
  4. Puviindran BJ, et al. Within and beyond the tumor: Mechanisms of glioblastoma-induced immunosuppression. Neurooncol Adv. 2025;7(Suppl 4):iv4-iv18.
  5. He J, Yan X, Hu S. Glioma stem cells: drivers of tumor progression and recurrence. Stem Cell Res Ther. 2025;16(1):293.
  6. Dharmapuri S, et al. Multiplexed immunohistochemical analysis of the immune microenvironment of biliary tract cancers pre- & post-neoadjuvant chemotherapy: case series. Ann Transl Med. 2024;12(4):78.
  7. Hatogai K, et al. Comprehensive immunohistochemical analysis of tumor microenvironment immune status in esophageal squamous cell carcinoma. Oncotarget. 2016;7(30):47252-64.
  8. Liu X, et al. Spatial heterogeneity of infiltrating immune cells in the tumor microenvironment of non-small cell lung cancer. Transl Oncol. 2024;50:102143.
  9. Kazama A, et al. Tumor-infiltrating immune cell status predicts successful response to immune checkpoint inhibitors in renal cell carcinoma. Sci Rep. 2022;12(1):20386.
  10. Park DH, Kim YZ. Simple analysis using immunohistochemical staining for tumor-infiltrating lymphocytes in brain metastasis of small cell lung cancer. J Neurointensive Care. 2024;7(2):49-55.
  11. Bogajewska-Rylko E, et al. When is immunohistochemistry useful in assessing tumor necrotic tissue? Anticancer Res. 2021;41(1):197-201.
  12. Saha D, Rabkin SD. Immunohistochemistry for tumor-infiltrating immune cells after oncolytic virotherapy. Methods Mol Biol. 2020;2058:179-90.
  13. Saha D, et al. combinatorial effects of VEGFR kinase inhibitor Axitinib and oncolytic virotherapy in mouse and human glioblastoma stem-like cell models. Clin Cancer Res. 2018;24(14):3409-22.
  14. Li M, et al. Characterization and oncolytic virus targeting of FAP-expressing tumor-associated pericytes in glioblastoma. Acta Neuropathol Commun. 2020;8(1):221.
  15. Bommareddy PK, et al. Oncolytic herpes simplex virus expressing IL-2 controls glioblastoma growth and improves survival. J Immunother Cancer. 2024;12(4):e008880.
  16. Chernov A, Chutko A, Alaverdian D, Kashuro V, Galimova E. Chemotherapy sensitivity of primary glioblastoma cells and immunohistochemical markers to predict survival of patients with glioblastoma. Clin Transl Oncol. 2026;28(3):974-85.
  17. Saha D, Rabkin SD, Martuza RL. Temozolomide antagonizes oncolytic immunovirotherapy in glioblastoma. J Immunother Cancer. 2020;8(1):e000345.
  18. Jahan N, Talat H, Alonso A, Saha D, Curry WT. Triple combination immunotherapy with GVAX, anti-PD-1 monoclonal antibody, and agonist anti-OX40 monoclonal antibody is highly effective against murine intracranial glioma. Oncoimmunology. 2019;8(5):e1577108.
  19. Saha D, Martuza RL, Rabkin SD. Macrophage polarization contributes to glioblastoma eradication by combination immunovirotherapy and immune checkpoint blockade. Cancer Cell. 2017;32(2):253-67.e5.
  20. Lu L, Saha D, Martuza RL, Rabkin SD, Wakimoto H. Single agent efficacy of the VEGFR kinase inhibitor axitinib in preclinical models of glioblastoma. J Neurooncol. 2015;121(1):91-100.
  21. Saha D, Martuza RL, Rabkin SD. Oncolytic herpes simplex virus immunovirotherapy in combination with immune checkpoint blockade to treat glioblastoma. Immunotherapy. 2018;10(9):779-86.
  22. Marumoto T, et al. Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors. Nat Med. 2009;15(1):110-6.
  23. Cheema TA, et al. Multifaceted oncolytic virus therapy for glioblastoma in an immunocompetent cancer stem cell model. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(29):12006-11.
  24. Saha D, Martuza RL, Rabkin SD. Curing glioblastoma: oncolytic HSV-IL12 and checkpoint blockade. Oncoscience. 2017;4(7-8):67-9.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Glioblastoomstamcellentumormicro-omgevingimmunohistochemieprotocolchromogene detectiedual-color IHCFFPE-hersentumortumorinfiltrerende immuuncellenorthotopische implantatiealkalische fosfatasekleuring

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.