Redox-responsieve oppervlakte-versterkte Raman scattering micronaalden voor het monitoren van acupunctuurresponsen bij ratten met verminderde glucosetolerantie

Samenvatting

Deze verkennende rattenmodelstudie presenteert een redoxgevoelige oppervlakte-versterkte Raman scattering (SERS)-actieve micronaald voor gelijktijdige acupunctuurinterventie en ratiometrische tracking van SERS-indices gerelateerd aan lokale oxidatieve capaciteit en redoxpotentiaal bij ratten met verminderde glucosetolerantie.

Samenvatting

Verminderde glucosetolerantie (IGT) wordt geassocieerd met verstoorde redoxhomeostase en verhoogde oxidatieve stress, maar dynamische in vivo tracking van redox-gerelateerde veranderingen tijdens acupunctuurinterventie blijft technisch uitdagend. Deze studie ontwikkelde een redoxgevoelig, oppervlak-versterkt Raman scattering (SERS)-actief micronaaldsysteem voor gelijktijdige acupunctuurinterventie en relatieve ratiometrische tracking van oxidatieve capaciteit (OC)- en redoxpotentieel (RP)-gerelateerde SERS-indices bij ratten met IGT. Oxidatieve en redoxgevoelige SERS-probes werden voorbereid door gouden nanoschalen (GNS) te functionaliseren met respectievelijk p-fenyleendiamine (p-PDA) voor OC-responsiviteit en anthraquinon voor RP-responsiviteit. De sondes werden in twee geëtste groeven op acupunctuurnaalden geladen om SERS-actieve micronaalden te construeren. In deze verkennende studie werden specifieke ziekteverwekkervrije mannelijke Sprague–Dawley-ratten gebruikt. Drie ratten dienden als normale controlegroepen, en 20 ratten kregen een vetrijk dieet en kregen streptozotocine (STZ) toegediend om IGT op te wekken. Na screening werden 18 in aanmerking komende IGT-ratten verdeeld in groepen met een hoog vetdieet en een normaal dieet, met 9 ratten per dieetgroep. Elke dieetgroep werd verder onderverdeeld in acupunctuurpunt-twisting, niet-acupunctuur-site twisting en acupunctuurpunt direct-insertie subgroepen, met 3 ratten per subgroep. Needling werd tweemaal daags uitgevoerd gedurende 7 opeenvolgende dagen, en nuchtere bloedsuikerindices (FPG), 2 uur postprandiale bloedglucose (2hPG) en OC- en RP-gerelateerde SERS-indices werden geregistreerd. De resultaten toonden aan dat naalden op acupunctuurpunten met twisting geassocieerd was met lagere FPG- en 2hPG-waarden en veranderde OC- en RP-gerelateerde SERS-indices in dit IGT-ratmodel. Omdat externe kalibratiecurves, onafhankelijke biochemische oxidatieve stressassays, probe-leachingtests en biocompatibiliteitsassays niet zijn opgenomen, moeten de SERS-verhoudingen worden geïnterpreteerd als relatieve redox-geassocieerde optische indices in plaats van absolute biochemische concentraties of absolute redoxpotentiaalwaarden. Deze bevindingen ondersteunen de haalbaarheid van SERS-actieve micronaalden als een verkennend preklinisch platform voor het combineren van acupunctuurinterventie met lokale ratiometrische SERS-tracking bij IGT-ratten.

Inleiding

Verminderde glucosetolerantie (IGT), een afname van het vermogen van het lichaam om glucose te verdragen, vormt een overgangsfase tussen normale bloedglucose en diabetische bloedglucose¹. IGT is dus een belangrijk vroegtijdig waarschuwingssignaal en een omkeerbaar stadium in de ontwikkeling van type 2 diabetes². Klinische gegevens tonen aan dat ongeveer 30% van de bevolking met IGT binnen 5–10 jaar naar type 2 diabetes zal doorgroeien³; Met tijdige interventie kan dit percentage echter worden teruggebracht tot minder dan 10^%.

IGT is een dynamisch en complex proces, en een aanhoudende omgeving met hoge glucose is een belangrijke trigger voor oxidatieve stofwisselingsstoornissen⁵. Wanneer het lichaam zich in een langdurige staat van hyperglykemie bevindt, functioneert de mitochondriale ademhalingsketen abnormaal en neemt de snelheid van de productie van reactieve zuurstofsoorten toe met 30–50%, wat direct de oxidatieve kracht in het lichaam verhoogt⁶; Tegelijkertijd remmen hoge suikerspiegels de activiteit van belangrijke enzymen, zoals glutathionreductase, waardoor het antioxidantensysteem verhindert overtollige reactieve zuurstofsoorten tijdig te verwijderen en de oxidatie-reductiebalans verder verstoort. Daarnaast gaat IGT gepaard met pathologische veranderingen, waaronder insulineresistentie en milde beperking van de β-celfunctie, wat resulteert in een reeks biologische en biochemische reacties ^7,8. Samen met de evolutie van de redoxtoestand verergeren deze veranderingen de verstoring van het glucosemetabolisme verder en verhogen ze het potentiële risico op complicaties bij diabetes, waaronder retinopathie, nefropathie en hart- en vaatziekten ^9,10. Daarom zou het monitoren van de oxidatieve capaciteit (OC) en het redoxpotentieel (RP) bij individuen of diermodellen met IGT ons begrip van de mechanismen achter de ontwikkeling van IGT moeten verbeteren en het ontwerpen van gerichte therapeutische strategieën moeten sturen.

Acupunctuur heeft een geschiedenis van meer dan 3.000 jaar en heeft een goede klinische effectiviteit aangetoond bij de behandeling van veel ziekten¹¹. Bovendien hebben talrijke experimentele studies bij dieren aangetoond dat acupunctuur gunstige effecten heeft op het reguleren van oxidatieve stresstoestanden in diermodellen door het antioxidantenenzymsysteem te versterken en lipideperoxidatie¹² te verminderen. Als traditionele Chinese medische praktijk heeft acupunctuur ook aanzienlijke voordelen aangetoond bij de behandeling van diabetes en IGT. Guanyuan (CV4) en Sanyinjiao acupunctuurpunten (SP6) zijn gerapporteerd als activeer van de SIRT1/PGC-1α-route in skeletspieren, waardoor insulineresistentie bij obesitas-diabetische muizen¹³ worden verminderd. Bovendien moduleren Tianshu-acupunctuurpunten (ST25) de activiteit van glucose-remmende neuronen in het laterale hypothalamische gebied en dragen ze bij aan de regulatie van het glycolipidenmetabolisme¹⁴. De meeste studies naar de mechanismen van intravasculaire acupunctuur richten zich echter vooral op het neuromodulatieve, immunomodulerende en gastro-intestinale systeem, waarbij acupunctuur het glucosemetabolisme kan beïnvloeden door de autonome functie te moduleren of indirect het bloedsuikergehalte kan reguleren door het evenwicht van de darmflora^{te verbeteren 15,16}. Het specifieke mechanisme van het effect van acupunctuur bij de behandeling van IGT-behandeling en de effecten ervan op oxidatieve stress hebben geen diepgaand onderzoek en ondersteuning van experimentele gegevens gehad.

Oppervlakte-versterkte Ramanverstrooiing (SERS) biedt grote gevoeligheid en specificiteit, waardoor de detectie van een grote verscheidenheid aan analyten mogelijk is. SERS-nanoprobes gebaseerd op nanovezeloptica¹⁷, chitosanmembranen¹⁸ en eerdere studies hebben aangetoond dat acupunctuurnaalden¹⁹ kunnen worden gebruikt voor het detecteren van biomarkers, neurotransmitters en andere aspecten van cellulaire biochemie in vivo. Acupunctuurnaalden zijn in het bijzonder veelbelovende hulpmiddelen voor diepweefselonderzoek, waardoor minimaal invasieve in situ monitoring gevolgd wordt door ex vivo analyse. Acupunctuur, als een goed gevestigde therapeutische methode, heeft een zeer breed scala aan klinische toepassingen. Recente studies hebben aangetoond dat SERS-compatibele optische vezels, wondverband en micronaaldapparaten in situ of minimaal invasieve tracking van redox-geassocieerde signalen in biologisch relevante omgevingen kunnen ondersteunen^20,21. Tegelijkertijd zijn SERS-actieve acupunctuurnaalden en gerelateerde micronaaldsystemen naar voren gekomen als veelbelovende dragers voor het integreren van sensorcapaciteit met weefselinterventie¹⁹, wat resulteert in SERS-actieve micronaalden met in vivo respons en in vitro SERS detectiemogelijkheden.

De huidige studie bouwt voort op de eerder gerapporteerde SERS-actieve micronaaldstrategie voor het detecteren van oxidatieve capaciteits- en redoxpotentiaalgerelateerde signalen in glucose-geïnduceerde stressmodellen. Het huidige werk verschilt echter van de vorige studie zowel in biologische context als experimentele doeleinden. Specifiek past deze studie het SERS-actieve micronaaldplatform toe op een rattenmodel met verminderde glucosetolerantie en integreert lokale ratiometrische SERS-tracking met acupunctuurinterventie. De huidige studie vergelijkt acupunctuurpunten verder met aangrenzende niet-acupunctuurlocaties, evalueert verschillende needling-manipulaties en monitort redox-geassocieerde SERS-indices gedurende een interventieperiode van 7 dagen. In vergelijking met eerder gerapporteerde SERS-gebaseerde optische vezels, wondverband en SERS-actieve micronaalden die primair zijn ontworpen voor single-site of single-function biochemische detectie, biedt het huidige platform twee vooruitgang. Ten eerste zijn OC- en RP-responsieve probes geïntegreerd in twee onafhankelijke geëtste groeven op één acupunctuurnaald, waardoor gelijktijdige monitoring van complementaire redoxparameters mogelijk is. Ten tweede functioneert de acupunctuurnaald niet alleen als een SERS-sondedrager, maar ook als een therapeutisch hulpmiddel, waardoor redoxmonitoring tijdens de acupunctuurinterventie kan worden uitgevoerd in plaats van na de behandeling. Zoals te zien is in Figuur 1, ontstaan er na het inbrengen van de micronaalden in het weefsel kleine wondjes en reageren de sondes in de twee groeven met weefsels, waardoor ze niveaus van OC en RP in vivo kunnen detecteren. Het doel van de studie was om deze SERS-actieve micronaalden te gebruiken om veranderingen in de OC en RP bij ratten met IGT te onderzoeken en de effecten van acupunctuur gekoppeld aan acupunctuurpunten bij deze dieren te bepalen, waarmee waardevolle inzichten werden verkregen in het mechanisme van acupunctuur bij de behandeling van IGT en de relatie tussen redox en abnormale hyperglykemische toestanden.

Protocol

Dieren en modellen van IGT

Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van het Southeast University Suzhou Research Institute (goedkeuringsnummer SEU-IACUC-20250318007) en werden uitgevoerd volgens de institutionele richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. De ratten werden verkregen en ondergebracht onder specifieke-pathogene vrije (SPF) omstandigheden bij 25 °C met een 12 uur licht/12 uur donkere cyclus. Bij procedures die anesthesie vereisen, werden ratten verdoofd met isoflurane die via een inductiekamer in zuurstof werd toegediend en met een neuskegel werd onderhouden. Isoflurane werd gebruikt met 3% voor inductie en 1% voor onderhoud, waarbij de concentratie werd aangepast aan de ademhalingsfrequentie en de procedurele respons.

Voldoende anesthesiediepte werd bevestigd vóór naald of injectie door verlies van de rechtstaande reflex en het ontbreken van een reactie op de teenknelling. Tijdens de anesthesie werden het ademhalingspatroon, lichaamshouding en herstel gemonitord, en werden dieren op een verwarmingspad gelegd om de lichaamstemperatuur te behouden. Dieren werden per kooi 2 gehouden met vrije toegang tot voedsel en water, tenzij vasten vereist was voor glucosetest. Na aankomst werden ratten 1 week geacclimatiseerd voordat het model werd ingezet. Het dierenwelzijn werd dagelijks gecontroleerd, inclusief algemene activiteit, verzorging, voedselinname, lichaamsgewicht, toestand van de injectieplaats en herstel na narcose. Aan het einde van het onderzoek werden ratten geëuthanaseerd volgens het goedgekeurde dierenprotocol. Euthanasie werd uitgevoerd door geleidelijke vulling van CO₂-inhalatie, gevolgd door bevestiging van overlijden met behulp van de cervicale dislocatiemethode. Dieren die voldeden aan de criteria voor humane eindpunten, waaronder ernstig gewichtsverlies, aanhoudende immobiliteit, abnormale ademhaling, onvermogen om te eten of drinken, of ernstige stress, werden onmiddellijk geëuthanaseerd in plaats van te worden onderhouden tot het geplande eindpunt. Specifieke pathogene-vrije mannelijke Sprague–Dawley-ratten van 200 ± 20 g werden in deze studie gebruikt. Na 1 week acclimatisatie werden de ratten willekeurig in twee groepen verdeeld: de drie ratten in de normale groep kregen normaal voedsel, terwijl de 20 ratten in de modelgroep 3 weken lang werden gevoerd met vetrijk voedsel (50% basaal chow + 10% reuzel + 25% sucrose + 15% dooierpoeder). Dieren in de modelgroep kregen intraperitoneale injectie van 20 mg/kg 2% STZ-oplossing (opgelost in 0,1 mol/L, pH 4,4 citraat buffer) gedurende 12 uur, na 12 uur vasten zonder waterbeperking. Degenen in de normale groep kregen na het krijgen van normaal voedsel een intraperitoneale injectie van de overeenkomstige dosis citraatbufferoplossing. Een intraperitoneale glucosetolerantietest (IPGTT) werd een week later uitgevoerd. Reagentia en apparatuur die in deze studie zijn gebruikt, staan vermeld in de Materiaallijst.

De nuchtere bloedglucose (FPG) werd gemeten door bloedafname van de staartpunt van ratten in elke groep na 12 uur vasten zonder waterrestrictie, en 2 uur postprandiale bloedglucose (2hPG) werd gemeten na intraperitoneale injectie van 20% dextrose 2 g/kg. In de normale groep was het FPG-bereik 5,1–6,6 mmol/L, en het 2hPG-glucosebereik was 7,3–9,4 mmol/L, vergeleken met een FPG van ≤7,0 mmol/L en een 2hPG-bereik van 10–16 mmol/L in de modelgroep. Van de 20 ratten die werden toegewezen aan de inductie van het IGT-model, voldeden er 18 aan de vooraf gedefinieerde IGT-criteria na IPGTT en werden opgenomen in het daaropvolgende interventie-experiment. Twee ratten werden uitgesloten omdat hun FPG- of 2hPG-waarden buiten het vooraf gedefinieerde IGT-bereik lagen. De 18 in aanmerking komende ratten werden vervolgens willekeurig toegewezen aan een groep met een hoog vetdieet en een groep met een normaal dieet, met 9 ratten per groep. Elke dieetgroep werd verder onderverdeeld in drie subgroepen: acupunctuurpunttwisting, niet-acupunctuurplaatstwisting en directe acupunctuurpuntinsertie, met drie ratten per subgroep. Dit was een verkennende methode-ontwikkelingsstudie, bedoeld om de haalbaarheid te evalueren van het combineren van acupunctuurinterventie met SERS-gebaseerde ratiometrische tracking in een preklinisch IGT-ratmodel. Er werd geen formele statistische machtsberekening uitgevoerd. De subgroepgrootte van drie ratten werd geselecteerd op basis van haalbaarheid, voorlopige SERS-micronaaldstudies en het principe van dierreductie. Ratten werden willekeurig toegewezen door de onderzoeker; formele toewijzing, verberging en blindering werden niet uitgevoerd.

De acupunctuurbehandelingsprotocollen werden gescreend met verwijzing naar evidence-based klinische richtlijnen voor traditionele Chinese geneeskunde en de haalbaarheid van dierproeven²². De geselecteerde acupunkturen waren Zhongwan (RN12/CV12), Shuifen (RN9/CV9), Yinjiao (RN7/CV7), bilateral Tianshu (ST25), bilateral Shuidao (ST28) en bilateral Zusanli (ST36). RN12, RN9 en RN7 bevonden zich op de voorste middenlijn en werden behandeld als enkele middenlijnpunten, terwijl ST25, ST28 en ST36 bilateraal werden behandeld. De acupunctuurpuntparingen waren gebaseerd op die welke werden gebruikt voor de klinische behandeling van IGT²³. De aanpassing was gebaseerd op literatuur ^24,25, met gebruik van de dichotome methode. Bij ratten werden acupunkturen gelokaliseerd op basis van anatomische herkenningspunten en proportionele conversie van standaard menselijke acupointlocaties. De abdominale RN/CV-punten werden langs de voorste middenlijn geïdentificeerd met behulp van het xiphoïde uitsteeksel, de navel en de pubische symfyse als anatomische herkenningspunten. ST25 was bilateraal gemarkeerd op het navelniveau, en ST28 was bilateraal gemarkeerd in het onderste buikgebied op dezelfde laterale afstand van de voorste middenlijn. ST36 werd geïdentificeerd op het anterolaterale achterbeen in het voorste deel van het tibialis been, lateraal van de tibiale tuberkel. Aangrenzende niet-acupunctuurvergelijkingsplaatsen werden 5 mm lateraal van de overeenkomstige acupunkturen en buiten de erkende meridiaanlijn gemarkeerd, waarbij zichtbare vaten, littekens en eerdere prikplaatsen werden vermeden. Voor het naalden werden ratten verdoofd met isoflurane volgens het goedgekeurde dierprotocol en in rugligging op een verwarmingskussen geplaatst. De buik- en achterpoothuid boven elke doellocatie werd geschoren en gedesinfecteerd met 75% ethanol. SERS-actieve micronaalden werden ongeveer loodrecht op de huid ingebracht tot een diepte van ongeveer 10 mm. Voor de acupunctuurpunt-twistinggroepen werden SERS-actieve micronaalden in de geselecteerde acupunkten ingebracht en zachtjes bidirectioneel gedraaid tijdens de 20 minuten retentieperiode. Voor de groepen zonder acupunctuurplaatsen werd dezelfde procedure uitgevoerd op de 5 mm aangrenzende niet-acupunctuurvergelijkingsplaatsen. Voor de directe inzetgroepen werden SERS-actieve micronaalden in de acupunkturen ingebracht en 20 minuten zonder draaien vastgehouden. Alle needlingprocedures werden uitgevoerd door dezelfde getrainde operator om variatie tussen operators te minimaliseren.

Needling werd twee keer per dag uitgevoerd, om 10:00 en 15:00 uur, gedurende 7 opeenvolgende dagen. Voor elke dagprocedure werd FPG gemeten na 8 uur vasten zonder waterbeperking. Na elke dag van de needling-procedure werden OC- en RP-reacties geregistreerd. Op dag 7, na acupunctuurbehandeling, werd IPGTT uitgevoerd en werden 2hPG-waarden geregistreerd.

Waarschuwingen

Streptozotocine is gevaarlijk en moet worden behandeld als een giftige chemische stof. Bereid de streptozotocineoplossing voor in een chemische dampkap of een gecertificeerde bioveiligheidskast, terwijl je een laboratoriumjas, nitrilhandschoenen, beschermende bril en een mondkapje draagt. Streptozotocine-besmette spuiten, naalden, doekjes, beddengoed, kooien en dierlijk afval moeten worden behandeld volgens institutionele procedures voor gevaarlijk biologisch en chemisch afval. Gebruikte naalden en spuiten moeten onmiddellijk in prikbestendige scherpe containers worden gegooid zonder het deksel opnieuw te zetten.

Fabricage van SERS-actieve micronaalden voor de detectie van OC en RP

Acupunctuurnaalden werden voorbereid zoals eerder gemeld²⁶. SERS-actieve micronaalden werden gedurende het hele onderzoek vervaardigd met hetzelfde type commerciële roestvrijstalen acupunctuurnaalden (0,25 mm × 26 mm). De naalden werden ongeveer loodrecht op de huid geplaatst tot een diepte van 10 mm. Voor draaiende groepen werd handmatige bidirectionele rotatie zachtjes en consistent toegepast gedurende 20 minuten gedurende de retentieperiode door dezelfde getrainde operator. De manipulatie was niet instrumentgestuurd; daarom werden de exacte rotatiefrequentie en amplitude niet gekwantificeerd. Deze beperking is erkend in de Discussie.

Aanvankelijk werden de naalden in MMA geweekt in een 20% (met v/v) PMMA-oplossing, gevolgd door het drogen op kamertemperatuur (25 °C) gedurende één dag. Vervolgens werden twee parallelle inkepingen van uniforme grootte en vergelijkbare vorm en diepte in de PMMA-beschermlaag (5 mm uit elkaar) gemaakt met een klein ambachtelijk mesblad dat met ethanol was schoongemaakt; vervolgens werden de naalden ondergedompeld in 0,5 M zwavelzuur, waarmee ze 10 seconden als elektrolyt dienden om elektrochemisch geëtst te worden bij een spanning van 12 V, waardoor twee bijna cirkelvormige groeven op de scoreplaatsen ontstonden. Ten derde, na drie keer spoelen, werden de naalden 24 uur op kamertemperatuur ondergedompeld in een ethanoloplossing met 0,1 mol L⁻¹ MPTES en 0,3 mol L⁻¹ APTES, waardoor sulfhydrylfunctionaliteit aan de gegroefde oppervlakken werd gegeven. Ten vierde werd de coating verwijderd door de naald in MMA te dopen. Redoxpotentieel-responsieve SERS-actieve micronaalden werden voorbereid op basis van een eerder gerapporteerde methode²⁷. Het SERS-substraat werd adsorberd op een van de geëtste groeven van elke acupunctuurnaald, waarna de resulterende SERS-actieve micronaalden werden ondergedompeld in een waterige p-PDA-oplossing bij een concentratie van 1 × ^10-4 mol/L gedurende 60 minuten bij 37 °C, wat resulteerde in oxidatie-gevoelige SERS-actieve micronaalden. SERS-substraten gebaseerd op gouden nanoschalen werden gesynthetiseerd zoals eerder beschreven²⁸. In het huidige werk werden deze micronaalden in de andere groef van elke acupunctuurnaald gedruppeld, waarna ze natuurlijk werden laten drogen. Dit leverde SERS-actieve micronaalden op met OC- en RP-respons.

Ex vivo evaluatie van OC- en RP-respons op SERS-actieve micronaalden

De responsen van de OC- en RP-probes werden geëvalueerd door de SERS-actieve micronaalden in ex vivo weefsel in te brengen. Om de responsiviteit van de OC-sonde op oxidatieve veranderingen te verifiëren, werden SERS-spectra van p-PDA voor en na oxidatie geregistreerd. Spectra van de redox SERS-probes werden ook verkregen in een sterk reducerende NaBH_4-oplossing en een sterk oxiderende HAuCl_4-oplossing . De selectiviteit van de OC-probe werd geëvalueerd met reducerende middelen, waaronder 1 × ^10-4 M FeSO₄, 1 × ^10-4 M Na₂SO₄ en 1 × ^10-4 M ascorbinezuur en oxiderende middelen, waaronder 1 × ^10-4 M CuSO₄, 1 × ^10-4 M H₂O₂, 1 × ^10-4 M FeCl₃, en 1 × ^10-4 M HAuCl₄. Alle oplossingen werden bereid in 20 mM PBS (pH 7,4), en de sondes werden 20 minuten bij 37 °C met elke oplossing geïncubeerd. De robuustheid van de SERS-actieve micronaalden werd beoordeeld door OC-responsen voor en na de reactie te registreren met 1 × ^10-4 mol/L FeCl₃ bij kamertemperatuur. Deze ex vivo - en oplossingstests werden gebruikt om de responsiviteit van de probe onder gecontroleerde omstandigheden te bevestigen. Ze reproduceren echter niet volledig de complexiteit van de in vivo weefselmicro-omgeving, waar lokale pH-variatie, eiwitadsorptie, extracellulaire matrixcomponenten en andere biologische stoffen de SERS-signalen kunnen beïnvloeden. Daarom werden de in vivo OC- en RP-uitlezingen geïnterpreteerd als relatieve, redox-geassocieerde SERS-indices in plaats van als matrixonafhankelijke biochemische metingen.

OC- en RP-detectie op acupunctuur- en niet-acupunctuurlocaties

Om de prestaties van de OC- en RP-probes op acupunctuurpunten en niet-acupunctuurpunten te evalueren, werden de SERS-actieve micronaalden ingebracht in gezonde ratten op de ST36- en RN12-acupunctuurpunten, en 5 mm aangrenzend aan elk van deze punten, op een diepte van ongeveer 10 mm, gedurende dezelfde tijd.

Effecten van naalddraaiing op OC- en RP-detectie

Om de responsiviteit van de OC- en RP-probes onder verschillende needling-technieken te beoordelen, werden SERS-actieve micronaalden in de ST36- en RN12-acupunctuurpunten en 5 mm aangrenzend aan deze punten bij gezonde ratten tot een diepte van ongeveer 10 mm ingebracht. Bij elk acupunctuurpunt werd één naald gedraaid, terwijl de overeenkomstige naald naast het punt dat niet was, en omgekeerd (een naald op het acupunctuurpunt was gedraaid, terwijl de tegenhanger op het acupunctuurpunt dat niet was). SERS-signalen van de sondes werden op hetzelfde inzetmoment voor elke naald verzameld.

Veranderingen in OC en RP bij ratten met IGT met betrekking tot acupunctuurpunten, naalddraaien en dieetcondities

Om de effecten van acupunctuurpunten, naalddraaien en dieetcondities op OC en RP bij ratten met IGT te beoordelen, werden ratten in de vetrijke dieetgroep willekeurig toegewezen aan drie groepen (A1, A2 en A3; drie ratten in elke groep), evenals die in de normale dieetgroep (groepen B1, B2 en B3; drie ratten in elke groep). Bij ratten in groepen A1 en B1 werden SERS-actieve micronaalden na sedatie in acupunctuurpunten gebracht en 20 minuten gedraaid; dezelfde procedure werd uitgevoerd bij ratten in groepen A2 en B2, behalve dat de micronaalden 5 mm naast de acupunctuurpunten werden ingebracht. Bij ratten in A3 en B3 werden de SERS-actieve micronaalden zonder draaien in de acupunctuurpunten van ratten geplaatst; De naalden bleven 20 minuten zitten. Needling werd twee keer per dag uitgevoerd, om 10:00 en 15:00 uur, gedurende 7 dagen. Voor elke dagprocedure werd een glucosemeter gebruikt om FPG-waarden voor elke groep ratten te registreren (na vasten maar zonder waterbeperking gedurende 8 uur). Na elke dag naaldwerk werden OC- en RP-responsen gemeten en geregistreerd. Op dag 7, na acupunctuur, werd IPGTT uitgevoerd op elke groep ratten en werden 2hPG-waarden geregistreerd.

Karakterisering en meting

De morfologie van SERS-actieve micronaalden werd onderzocht met scanning-elektronenmicroscopie (SEM). SERS-spectra werden verkregen bij 25 °C, met een Raman-spectrometer uitgerust met een 50× lange werkafstand (NA: 0,5) en een 785 nm laser. Voor alle metingen was de verwervingstijd 10 seconden, en het Raman-systeem werd bediend op een nominale laservermogensinstelling van 600 μW onder dezelfde optische configuratie. De daadwerkelijke laserkracht die aan het weefseloppervlak wordt geleverd, werd in deze studie niet direct gemeten. Daarom werden de SERS-spectra gebruikt voor relatieve vergelijkingen tussen groepen onder identieke acquisitie-instellingen, en werden er geen conclusies getrokken over absolute fotothermische veiligheid van weefsel. De intensiteitsverhoudingen van twee SERS-probes werden berekend met de volgende methode: de verhouding van intensiteitswaarden bij 1450 cm⁻¹ tot die bij 1500 cm⁻¹ werd aangewezen als indicator voor OC (I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹), nadat de intensiteit bij 1700 cm⁻¹ (als achtergrond) van elk van de twee toppen was afgetrokken, respectievelijk, zoals in eerdere rapporten ¹⁷; en met I₁₆₀₆ cm⁻¹/I₁₆₆₆ cm⁻¹ als indicator van RP werd de intensiteit bij 1700 cm⁻¹ (als achtergrond) respectievelijk van elk van de twee pieken afgetrokken. De berekende waarden van I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹ en I₁₆₀₆ cm⁻¹/I₁₆₆₆ cm⁻¹ werden geanalyseerd als relatieve SERS-afgeleide indices van respectievelijk OC- en RP-geassocieerde responsen. Deze verhoudingen werden gebruikt om veranderingen tussen groepen en tijdstippen onder identieke acquisitie-instellingen te vergelijken.

In deze studie werd geen externe kalibratiecurve vastgesteld om deze verhoudingen om te zetten in absolute concentraties van oxidatieve stoffen of absolute elektrochemische redoxpotentiaalwaarden. Elk spectrum werd tweemaal opgenomen op vijf verschillende punten op de SERS-probe in drie replicatieve monsters. Origin werd gebruikt om data te verwerken en grafieken te produceren. Om de variabiliteit gerelateerd aan acquisitie te minimaliseren, werden dezelfde lasergolflengte, objectief, verwervingstijd, laservermogensinstelling en spectrale verwerkingsworkflow toegepast op alle groepen. Potentiële fotothermische of fotochemische effecten veroorzaakt door laserbestraling werden niet onafhankelijk gekwantificeerd en worden erkend als een beperking. Statistische gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). De steekproefgrootte en de statistische test die voor elk experiment of figuurpaneel worden gebruikt, worden gespecificeerd in de bijbehorende figuurlegendes. Voor ex vivo probe-validatieexperimenten werd de SERS-probe of onafhankelijk voorbereide micronaald gebruikt als analyse-eenheid. Voor in vivo bloedglucose- en SERS-indexanalyses werd de rat gebruikt als biologische analyse-eenheid. Spectra verzameld van meerdere punten op dezelfde probe werden behandeld als technische metingen en gemiddeld vóór groepsanalyse. Statistische analyses werden uitgevoerd met SPSS-software. Vergelijkingen tussen groepen werden uitgevoerd met behulp van de statistische tests die in de bijbehorende figuurlegendes zijn aangegeven. Seriële nuchtere bloedglucose- en SERS-indexmetingen over de 7-daagse interventieperiode werden geïnterpreteerd als exploratieve longitudinale trends vanwege de kleine subgroepgrootte, en er werd geen formeel herhaald-metingen of gemengd-effecten model toegepast. Statistische significantie werd gedefinieerd als p < 0,05. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Resultaten

Fabricage van SERS-actieve micronaalden voor de detectie van OC en RP

Om veranderingen in OC en RP te identificeren, werden SERS-actieve micronaalden met de bijbehorende probes vervaardigd. Representatieve SEM-beelden bevestigden de twee-groefstructuur van de SERS-actieve micronaalden. Figuur 2A toont het acupunctuurnaaldlichaam met twee geëtste groeven, Figuur 2B toont een groef geladen met GNS, en Figuur 2C toont een vergrote weergave van GNS verspreid binnen de groef. Deze beelden bevestigden dat de geëtste groeven konden dienen als lokale laadplaatsen voor de OC- en RP-responsieve SERS-sondes. De verhouding van piekintensiteiten I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹ werd gebruikt om de mate van oxidatie van p-PDA weer te geven. Figuur 3A toont de SERS-spectra van p-PDA voor en na interactie met 1 × 10⁻⁴ M FeCl₃, terwijl Figuur 3B spectra toont voor de redoxprobe in 1 × 10⁻³ M NaBH4 en 1 × 10-4 M HAuCl₄ waterige oplossingen. De RP-proberespons werd uitgedrukt als een piekintensiteitsverhouding (I₁₆₀₆ ^cm-1/I₁₆₆₆ ^cm-1), die afnam bij toenemende RP.

Om de selectiviteit van de oxidatieve capaciteit-responsieve probe te evalueren, werd de verhouding I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹ gemeten na blootstelling aan verschillende reducerende en oxiderende middelen. Onafhankelijke probemetingen werden uitgevoerd met n = 3 per groep, en de SERS-probe of onafhankelijk voorbereide micronaald werd gebruikt als analyse-eenheid (Figuur 3C). Vergeleken met de CK-groep (Kruskal–Wallis-test gevolgd door Dunns meervoudige vergelijkingstest) veranderden de reducerende middelen FeSO₄ en Na₂SO₄ de I₁₄₅₀ cm⁻¹/_{I 1500} cm⁻¹ verhouding (p > 0,05) niet significant. Ascorbinezuur (AA, p < 0,001) produceerde ook een verhoogde verhouding onder de huidige assaycondities, ondanks dat het als reducerend middel werd opgenomen. Daarom werd de AA-respons voorzichtig geïnterpreteerd als een probe-specifieke spectrale respons in deze oplossingsgebaseerde assay, in plaats van als bewijs van oxiderend gedrag. Daarentegen verhoogden oxiderende of oxidatie-gerelateerde reagentia de verhouding in verschillende mate. De verhouding werd verhoogd na blootstelling aan CuSO₄ (p < 0,0001), H₂O₂ (p < 0,0001), FeCl₃ (p < 0,0001) en HAuCl₄ (p < 0,0001). Om de stabiliteit van de OC-probe bij kamertemperatuur te beoordelen, werden SERS-spectra per uur verkregen over een periode van 6 uur voordat de probe reageerde met 1 × 10⁻⁴ M FeCl₃ (Figuur 3D), en de overeenkomstige I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹ verhoudingen werden berekend. Na de adsorptie van de probe bleef de beginwaarde stabiel op ongeveer 0,20 ± 0,02, evenals die voor de reactie met FeCl₃ bij ongeveer 0,9 ± 0,10, over de periode van 6 uur. Deze resultaten suggereren dat p-PDA op GNS stabiel is in de lucht.

OC- en RP-reacties op acupunctuur- en niet-acupunctuurpunten

Eerdere studies²⁹ hebben aangetoond dat de OC-sonde zijn maximale respons bereikt 10 minuten na het inbrengen. Figuren 4A en B illustreren de respons van SERS-actieve micronaalden bij gezonde ratten die in de ST36- en RN12-acupunctuurpunten zijn geplaatst, evenals bij die die 5 mm naast de punten, gedurende 10 minuten. Voor deze experimenten werden n = 3 ratten per groep, en werden spectra verzameld van meerdere punten op dezelfde probe behandeld als technische replica's en gemiddeld vóór groepsanalyse. De SERS-actieve micronaalden reageerden effectief op veranderingen in OC en RP in vivo, zonder significant verschil in OC en RP in de acupunctuurpuntengroep ten opzichte van de niet-acupunctuurpuntengroep (Onafhankelijke steekproeven t-test, p> 0,05).

Om de effecten van naalddraaiing op lokale OC en RP in vivo verder te bepalen, werden SERS-actieve micronaalden ingebracht in gezonde ratten op de ST36- en RN12-acupunctuurpunten, en 5 mm daarvoor, tot een diepte van 10 mm. Tijdens de draaimanoeuvre op elk acupunctuurpunt werd de naald naast het punt losgedraaid, en omgekeerd, en werden veranderingen in OC- en RP-waarden op het puntpunt geregistreerd (Figuren 4C–F). Er waren geen significante veranderingen in de OC en RP afhankelijk van of twisting werd uitgevoerd op acupunctuurpunten of niet-acupunctuurpunten bij gezonde ratten, noch was er enig effect van twisting op een aangrenzend punt (p > 0,05).

Veranderingen in OC en RP bij ratten met IGT in verband met acupunctuur, naalddraaien en dieetcondities

Om de succesvolle vestiging van een rattenmodel met IGT te bevestigen, werden FPG- en 2hPG-waarden geregistreerd met een IPGTT-assay in respectievelijk model- en controleratten. De controlegroep omvatte n = 3 ratten, en de modelgroep omvatte n = 18 ratten die voldeden aan de vooraf gedefinieerde criteria voor verminderde glucosetolerantie. De modelratten vertoonden een hogere nuchtere bloedsuikerspiegel dan controleratten (6,92 mmol/L versus 5,54 mmol/L; Mann–Whitney U-test, p < 0,01) en een hogere bloedglucose na 2 uur na het eten dan bij controleratten (11,52 mmol/L versus 7,92 mmol/L; Mann–Whitney U-test, p< 0,001) (Figuur 5), wat een succesvolle inductie van IGT bij de modeldieren aangeeft.

Om de effecten van de combinatie van acupunctuurpunten, naalddraaien en dieetcondities bij IGT-ratten te verifiëren, werd een typische set acupunctuurpuntparen geselecteerd. De 18 in aanmerking komende modelratten werden vervolgens verdeeld in groepen met een hoog vetdieet en een normaal dieet, met n = 9 ratten per dieetgroep. Elke dieetgroep werd verder onderverdeeld in drie interventiesubgroepen: acupunctuurpunttwisting, niet-acupunctuurplaatstwisting en acupunctuurpunt-directe inzet, met n = 3 ratten per subgroep. FPG-waarden werden geregistreerd vóór elke naalddag (Figuren 6A–C), en 2hPG (Figuur 6D) werden gemeten na 7 dagen naalden door een IPGTT-assay in elke groep. In deze verkennende dataset werd geen duidelijk verschil waargenomen in FPG of 2hPG tussen de groepen met hoog vet dieet en normaal dieet na needling op acupunctuurpunten. Vergelijkingen tussen acupunctuurpunt- en niet-acupunctuurplaatsnaalding suggereerden dat acupunctuurpuntverdraaiing geassocieerd was met lagere bloedglucosewaarden onder de huidige experimentele omstandigheden (onafhankelijke t-tests, p < 0,05). Omdat de subgroepgrootte klein was en dieet, acupointlocatie en draaimanipulatie niet volledig statistisch gescheiden konden worden, werden deze bevindingen geïnterpreteerd als voorlopige waarnemingen van diermodellen.

Veranderingen in de oxidatieve capaciteitsgerelateerde en redoxpotentieel-gerelateerde SERS-indices werden gemonitord gedurende één week acupunctuurinterventie bij IGT-ratten. Voor deze analyses werden n = 3 ratten per subgroep opgenomen, en elke rat werd behandeld als de biologische analyse-eenheid. Bij ratten met een hoog vetdieet daalde de oxidatieve capaciteit-gerelateerde SERS-index in de acupunctuurpunt-twisting en acupunctuurpunt-direct-insertie groepen in de acupunctuurpunt-twisting, terwijl deze relatief hoger bleef in de niet-acupunctuur-site twisting groep (Figuur 7A). De redoxpotentiaal-gerelateerde SERS-index nam in de loop van de tijd toe in de acupunctuurpunt-twisting en acupunctuurpunt-direct-insertiegroepen, terwijl de niet-acupunctuur-site twisting-groep een relatief zwakkere toename liet zien (Figuur 7B). Vergelijkbare trends werden waargenomen bij IGT-ratten met normaal dieet. De oxidatieve capaciteit-gerelateerde SERS-index nam na verloop van tijd af in de acupunctuurpunt-twisting en acupunctuurpunt-direct-insertiegroepen, met een kleinere verandering in de niet-acupunctuur-site twisting-groep (Figuur 7C). De REDOS-potentiaal-gerelateerde SERS-index nam in de loop van de tijd toe in de acupunctuurpunt-twisting en acupunctuurpunt-direct-insertiegroepen, terwijl de niet-acupunctuur-site twisting-groep relatief lager bleef (Figuur 7D).

Om de voedingsomstandigheden onder dezelfde acupunctuurmanipulatie verder te vergelijken, werden de acupunctuurpunt-twisting subgroepen uit de vetrijke en normale dieetgroepen vergeleken. In deze vergelijking nam de oxidatieve-capaciteit-gerelateerde SERS-index in beide dieetcondities in de loop van de tijd af, met een grotere afname waargenomen in de normale acupunctuurpunt-twisting subgroep op dag 7 (Figuur 7E). De redoxpotentiaal-gerelateerde SERS-index nam in de loop van de tijd toe in beide dieetcondities, met een hogere waarde op dag 7 in de normale dieet acupunctuurpunt-twisting subgroep (Figuur 7F). Deze bevindingen suggereren dat acupunctuurpunttwisting en dieetnormalisatie geassocieerd waren met veranderingen in lokale redox-geassocieerde SERS-indices bij IGT-ratten. Omdat elke subgroep slechts drie ratten bevatte en er geen onafhankelijke biochemische oxidatieve stress-assays werden uitgevoerd, moeten deze resultaten worden geïnterpreteerd als verkennende waarnemingen van een diermodel in plaats van als definitief biochemisch bewijs van verbetering van oxidatieve stress.

BESCHIKBAARHEID GEGEVENS:

Alle numerieke ruwe gegevens die worden gebruikt voor figuurgeneratie en statistische analyse, inclusief bloedglucosemetingen, door SERS afgeleide verhoudingswaarden en brongegevens voor kwantitatieve figuurpanelen, zijn georganiseerd en geüpload als Aanvullende Tabel 1. Voor continue probemonitoring-experimenten die direct door het analytische instrument worden gegenereerd, zijn de geëxporteerde waarden en representatieve instrument-gegenereerde uitgangen die worden gebruikt om de probe-prestaties te evalueren opgenomen in het Aanvullende Bestand 1.

Figuur 1: Methodologische workflow voor acupunctuurinterventie en lokale ratiometrische SERS-tracking met behulp van een dual-groove SERS-actieve micronaald. Het schema toont het inbrengen van de tweegroeven SERS-actieve micronaald in een acupunctuurpunt of aangrenzende niet-acupunctuurplaats, gevolgd door Raman-spectrale acquisitie. De auteurs hebben deze figuur gemaakt met de WPS-software, en er is geen auteursrechtlicentie vereist. Afkortingen: SERS = oppervlakteversterkte Ramanverstrooiing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Representatieve SEM-beelden van SERS-actieve micronaalden. (A) Acupunctuurnaaldlichaam met twee groeven; schaalbalk = 200 μm; Vergroting = 77×. (B) Een groef geïntegreerd met GNS; schaalbalk = 20 μm; Vergroting = 1.000×. (C) Een vergrote afbeelding van de groef in B; schaalbalk = 2 μm; Vergroting = 30.000×. Afkortingen: SEM = scanning-elektronenmicroscopie; GNS = gouden nanoschillen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Karakterisering van OC-responsieve en RP-responsieve SERS-probes. (A) Genormaliseerde spectra van p-PDA voor en na interactie met FeCl₃. (B) Genormaliseerde SERS-spectra van RP-probes in oplossingen van respectievelijk NaBH₄ en HAuCl₄. (C) I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹ verhoudingen voor OC-probes in diverse oxiderende en reducerende oplossingen. n=3 onafhankelijke probemetingen per groep. Kruskal–Wallis-test gevolgd door Dunns meervoudige vergelijkingstest versus de CK-groep. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). (D) Zes uur durende stabiliteitsbeoordeling van de OC-responsieve probe voor en na de reactie met FeCl₃. Afkortingen: SERS = oppervlakteversterkte Ramanverstrooiing; CK = controlecontrole; p-PDA = p-fenylenediaamine; AA = ascorbinezuur. p < 0,001, ****p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: OC- en RP-gerelateerde SERS-indices gemeten met verschillende needlingmethoden op acupunctuur- en niet-acupunctuurplaatsen bij gezonde ratten. (A) OC-gerelateerde SERS-index na directe invoeging op acupunctuurpunten en aangrenzende niet-acupunctuurplaatsen. (B) RP-gerelateerde SERS-index na directe invoeging op acupunctuurpunten en aangrenzende niet-acupunctuurplaatsen. (C) OC-gerelateerde SERS-index na directe plaatsing op niet-acupunctuurplaatsen en naalddraai op acupunctuurpunten. (D) RP-gerelateerde SERS-index na directe plaatsing op niet-acupunctuurplaatsen en naalddraai op acupunctuurpunten. (E) OC-gerelateerde SERS-index na directe plaatsing op acupunctuurpunten en naalddraai op aangrenzende niet-acupunctuurplaatsen. (F) RP-gerelateerde SERS-index na directe plaatsing op acupunctuurpunten en naalddraaiing op aangrenzende niet-acupunctuurplaatsen. OC werd berekend als I₁₄₅₀ ^cm-1/I₁₅₀₀ ^cm-1, en RP als I₁₆₀₆ ^cm-1/I₁₆₆₆ ^cm-1. n=3 per groep. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. Er werden geen significante verschillen waargenomen tussen de gekoppelde vergelijkingen. Afkortingen: OC = oxidatieve capaciteit; RP = redoxpotentiaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: FPG- en 2hPG-waarden volgens de IPGTT-assay in model and control (CK) ratten. FPG en 2hPG werden gemeten om de vestiging van het rattenmodel met verminderde glucosetolerantie te verifiëren. n = 3 ratten in de controlegroep en n = 18 ratten in de modelgroep. Statistische analyse werd uitgevoerd met de Mann–Whitney U-test, en de resultaten worden gepresenteerd als het gemiddelde ± SEM. **p < 0,01, ***p < 0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: FPG- en 2hPG-waarden voor IGT-ratten tijdens acupunctuurprocedures. (A) FPG-waarden voor de groep die acupunctuur ontvangt met naalddraai op acupunctuurpunten en directe naaldinvoeging op acupunctuurpunten (n = 3 per groep). (B) FPG-waarden voor groepsnaalden die naalden ontvangen met twisting op acupunctuurpunten en niet-acupunctuurpunten (n = 3 per groep). (C) FPG-waarden voor het vetrijke dieet en de normale dieetgroepen (n = 3 per groep). (D) Dag 7 2hPG-waarden bij ratten met een hoog en normaal dieet onder de acupunctuurpunt-twisting, niet-acupunctuur-plaatstwisting en acupunctuurpunt-direct-insertiecondities. (n = 3 per groep). De resultaten worden gepresenteerd als het gemiddelde ± SEM. Geplande paargewijze eindpuntvergelijkingen in paneel D werden geanalyseerd met behulp van een ongepaarde tweezijdige Student's t-test. *p < 0,05. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Veranderingen in OC en RP van ratten in elke groep gedurende 1 week acupunctuur. (A) Veranderingen in OC bij vetrijke IGT-ratten. (B) Veranderingen in RP bij vetrijke IGT-ratten. (C) Veranderingen in OC bij normaal dieet IGT-ratten. (D) Veranderingen in RP bij normaal dieet IGT-ratten. (E) OC-gerelateerde SERS-indexvergelijking tussen de vetrijke en normale dieetcondities binnen de acupunctuurpunt-twisting subgroep; (F) RP-gerelateerde SERS-indexvergelijking tussen de vetrijke en normale dieetcondities binnen de acupunctuurpunt-twisting subgroep. n = 3 ratten per deelgroep. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. Seriële metingen werden geïnterpreteerd als verkennende longitudinale trends. Afkortingen: OC = oxidatieve capaciteit; RP = redoxpotentiaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend Bestand 1: Representatieve instrument-gegenereerde outputs voor probe-response evaluatie. Dit bestand bevat representatieve continue monitoringsoutputs die direct door het analytische instrument worden gegenereerd en worden gebruikt om de probe-responsprestaties te evalueren. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 1: Ruwe datatabel voor kwantitatieve analyses. Dit bestand bevat de numerieke brongegevens die worden gebruikt voor het genereren van figuren en statistische analyse, waaronder bloedsuikermetingen, door SERS afgeleide verhoudingswaarden en kwantitatieve gegevens van het figuurpaneel. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Verminderde glucosetolerantie vormt een omkeerbare overgangsfase vóór type 2 diabetes en is nauw geassocieerd met een metabole disbalans, insulineresistentie en door oxidatieve stress gerelateerde ontregeling. Leefstijlinterventies en andere vroege therapeutische strategieën kunnen het risico op progressie van verminderde glucosetolerantie naar diabetes verminderen, maar hulpmiddelen om lokale biochemische reacties tijdens interventie dynamisch te monitoren blijven^{beperkt tot 30}. Acupunctuur is gerapporteerd als het beïnvloedt van het glucosemetabolisme en de door oxidatieve stress gerelateerde routes in experimentele en klinische studies. De meeste mechanistische studies van acupunctuur vertrouwen echter op eindpuntbloed- of weefselmetingen, en relatief weinig methoden maken minimaal invasieve tracking van lokale redox-gerelateerde responsen tijdens acupunctuurinterventie mogelijk. Eerdere klinische onderzoeken met behandelingen voor IGT hebben bevestigd dat het risico op diabetes aanzienlijk kan worden verminderd door leefstijlinterventies, waaronder dieetaanpassingen, vermindering van lichaamsmassa en verhoogde lichamelijke activiteit³¹. Acupunctuur is effectief gebleken in het verbeteren van de glucose-metabole indexen en het verlagen van nuchtere en 2hPG. Daarom kan het ophelderen van de relatie tussen acupunctuur, redox en IGT benaderingen bieden om IGT om te keren of in te grijpen in de progressie ervan, waardoor de incidentie van diabetes mellitus wordt verminderd, evenals inzicht in de pathologie van IGT en de mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling ervan.

De huidige studie stelt een dual-groove redox-gevoelig, oppervlak-versterkt Raman-verstrooiings-actief micronaaldplatform voor om acupunctuurinterventie te combineren met lokale ratiometrische SERS-tracking in een rattenmodel met verminderde glucosetolerantie. In dit systeem werden twee geëtste groeven op een enkele acupunctuurnaald gebruikt om oxidatieve capaciteit responsieve en redoxpotentiaal-responsieve probes te dragen. Dit ontwerp maakte het mogelijk dat de acupunctuurnaald niet alleen functioneerde als interventiehulpmiddel, maar ook als sensordrager voor relatieve lokale redox-geassocieerde optische uitlezingen. De resultaten toonden aan dat naalden op acupunctuurpunten met twisting geassocieerd was met lagere nuchtere bloedglucose- en 2hPG-waarden en met veranderingen in oxidatieve capaciteitsgerelateerde en redoxpotentieel-gerelateerde SERS-indices bij ratten met een verminderde glucosetolerantie. Deze bevindingen ondersteunen de haalbaarheid van het gebruik van SERS-actieve micronaalden om lokale redox-gerelateerde responsen tijdens acupunctuurinterventies te onderzoeken. Over het algemeen suggereren de resultaten dat naalden op acupunctuurpunten met twisting geassocieerd was met lagere FPG- en 2hPG-waarden en met veranderingen in OC- en RP-gerelateerde SERS-indices bij IGT-ratten. Deze bevindingen ondersteunen de haalbaarheid van het gebruik van SERS-actieve micronaalden om lokale redox-geassocieerde optische responsen tijdens acupunctuurinterventie te volgen. Omdat standaard biochemische oxidatieve stressassays, probe-leaching-analyse en weefselbiocompatibiliteitstests echter niet zijn uitgevoerd, mogen de waargenomen veranderingen in de SERS-index niet worden geïnterpreteerd als definitief biochemisch bewijs van verbetering van oxidatieve stress.

Verschillende alternatieve benaderingen zouden kunnen worden gebruikt om dezelfde hypothese verder te onderzoeken. Standaard biochemische oxidatieve stressassays, waaronder metingen van reactieve zuurstofgroepen, malondialdehyde, superoxidedismutase, katalase, glutathionperoxidase en glutathion/glutathiondisulfideverhoudingen, kunnen worden gebruikt om te valideren of veranderingen in SERS-afgeleide indices overeenkomen met conventionele oxidatieve stress-biomarkers^32,33. Elektrochemische redoxprobes, fluorescentie-gebaseerde redoxsensoren, chemiluminescentie-assays, microdialyse gevolgd door biochemische analyse, en weefselgebaseerde immunohistochemische of histologische validatie kunnen ook aanvullende informatie bieden. Het combineren van SERS-actieve micronaaldsensing met deze onafhankelijke benaderingen zou helpen bepalen of de waargenomen optische veranderingen specifieke biochemische redoxveranderingen weerspiegelen of bredere lokale weefselresponsen op needling en metabole status³⁴.

De potentiële toepassingen van deze methode reiken verder dan het huidige model van verminderde glucosetolerantie. Omdat redox-disbalans betrokken is bij metabole ziekten, weefselbeschadiging, ontstekingen en wondherstel, kunnen SERS-actieve micronaalden een nuttig preklinisch hulpmiddel bieden om lokale redox-gerelateerde responsen te monitoren in diabetes-gerelateerde modellen, wondgenezingsstudies, ontstekingsziektemodellen en andere minimaal invasieve interventie-instellingen³⁵. In acupunctuuronderzoek kan het platform nuttig zijn om acupunctuurpunten, niet-acupunctuurlocaties, verschillende needling-manipulaties en verschillende interventieschema's te vergelijken. Deze toepassingen blijven echter verkennend en vereisen verdere technische en biologische validatie.

Er moeten verschillende beperkingen worden genoemd. Ten eerste werden de OC- en RP-uitlezingen berekend als SERS-afgeleide ratiometrische indices en niet gekalibreerd aan standaardconcentraties van oxidatieve stoffen of absolute elektrochemische redoxpotentiaalwaarden. Daarom moeten de huidige resultaten worden geïnterpreteerd als relatieve redox-geassocieerde optische responsen onder identieke verwervingscondities, in plaats van als absolute biochemische metingen. Ten tweede kan de micro-omgeving van biologisch weefsel extra bronnen van signaalvariatie introduceren, waaronder lokale pH-veranderingen, eiwitadsorptie, extracellulaire matrixcomponenten en andere matrixeffecten. Deze factoren zijn niet volledig geëvalueerd in serumhoudende of weefselnabootsende media. Ten derde werden de daadwerkelijke laserkracht die aan het weefseloppervlak werd geleverd en de lokale temperatuurverandering tijdens de Raman-acquisitie niet direct gemeten; daarom kunnen potentiële fotothermische of fotochemische effecten niet volledig worden uitgesloten. Ten vierde werd de batch-niveau reproduceerbaarheid van groefgeometrie en probe-belasting niet kwantitatief geëvalueerd door multi-needle SEM-beeldvorming of belasting-efficiëntieanalyse. Ten slotte werden onafhankelijke biochemische validatie, probe-leaching-analyse en lokale biocompatibiliteitstesten niet uitgevoerd. Toekomstige studies moeten kalibratiecurves vaststellen in biologisch relevante matrices, SERS-indices correleren met standaard oxidatieve stress- en redoxassays, probe leaching kwantificeren, lokale weefselcompatibiliteit evalueren na herhaalde insertie en het apparaat valideren in grotere diercohorten. SERS-actieve micronaalden kunnen een nuttig platform bieden om acupunctuurinterventie te combineren met relatieve ratiometrische SERS-tracking van lokale redox-geassocieerde indexen in een preklinisch IGT-ratmodel. Verdere kalibratie, biochemische validatie, probe-leaching-beoordeling en biocompatibiliteitsstudies zijn vereist voordat absolute kwantitatieve monitoring of translationele toepassing kunnen worden geclaimd.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
3-Aminopropyltriethoxysilaan (APTES, 98%)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	A800524
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilaan (MPTES, 95%)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	M742544
Ascorbinezuur	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	CFAD310554
Bloedglucosemeter	Cofoe Medical Technology Co., Ltd.	Cofoe A03
Bloedglucoseteststrips	Cofoe Medical Technology Co., Ltd.	Cofoe-A03-C
Kopersulfaat (CuSO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	PHR1477
Ethylalcohol (≥99,7%)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	XW00641752
Ferrosulfaat (FeSO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	XW01772078701
Glucose (Glu)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	D9434
Waterstofperoxide (H2O2)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	P-17-0500
IJzerchloride (FeCl3)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	CP81015228
Methylmethacrylaat (MMA)	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.	M109626
Micro-Raman-spectrometer	Renishaw	InVia Raman Microscope
p-Fenyleendiameen (p-PDA)	Shanghai TCI Chemical Industry Development Co., Ltd.	P128784
Polymethylmethacrylaat (PMMA)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	P742581
Scanning elektronenmicroscoop	Zeiss	ULTRA Plus
Natriumborohydride (NaBH4)	Shanghai Adamas-beta Reagents Co., Ltd.	S432207
Natriumsulfiet (Na2SO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	S572396
Roestvrijstalen acupuncturnaalden	Suzhou Tianxie Acupuncture Instruments Co., Ltd.	X-20-03
Statistisch analysesoftware	International Business Machines Corporation	Version 2021
Streptozotocine (STZ)	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.	S408311
Tetrachloroauraat (HAuCl4)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	A124024
SPSS-software	International Business Machines Corporation, Armonk, New York State, USA	version 26.0
ratten	Jiangsu Qinglongshan Biotechnology Co., Ltd.	Specific-pathogen-free male Sprague-Dawley
basale voer	Anuokang Biotech.	SY10001
Reuzel	MCE	HY-W127601
Sucrose	MCE	HY-B1779
Eigeelpoeder	MCE	HY-B2235B
Citroenzuurmonohydraat	Sigma-Aldrich	C1909
Trijnatriumbicarbonaatdihydraat	Sigma-Aldrich	S4641
Citraatbuffer	beyotime	P0086
Fosfaat-gebufferde zoutoplossing	beyotime	ST448-1L
Isofluraan	Bioss	D54468
Kleindier-isofluraanverdovingssysteem	RWD Life Science	R500
Inductiekamer en neuskap	RWD Life Science	R500compatible accessoires
Verwarmingspad	Shanghai Yuyan Life Science	Y69020
75% ethanol	Boyu Bio.	YB60401
CO2 euthanasiekamer	Lab Animal Tec. Co.	LAT-10-0090
WPS	Beijing Kingsoft Office Software	WPS365