Methodenartikel

Een muizenmodel voor leverlaceratie ter vereenvoudiging van de kwantificering van trauma-geïnduceerde hemorragische coagulopathie, inflammatie en overleving

0 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/72215

⸱

25 september 2026

 ,  ,  , 
1Division of Hematology and Cellular Therapy, Department of Medicine, University of California San Diego

In dit artikel

Samenvatting

Wij presenteren een reproduceerbaar muizenmodel voor leverlaceratie met ernstige bloedingen, waarbij bloedverlies, trauma-geïnduceerde coagulopathie en overlevingsuitkomsten worden geïntegreerd. Het model maakt evaluatie van hemostatische interventies mogelijk, waaronder recombinant factor VIIa en tranexaminezuur, samen met beoordelingen van de stolling, fibrinolyse en mortaliteit, wat een kosteneffectief en schaalbaar platform biedt voor mechanistisch en translationeel onderzoek naar bloedingen.

Samenvatting

Ongecontroleerde bloedingen blijven een belangrijke oorzaak van vermijdbare sterfgevallen bij traumapatiënten, en trauma-geïnduceerde coagulopathie (TIC) is een belangrijke determinant voor vroege mortaliteit. Experimentele modellen die bloedingen en de daarmee gepaard gaande coagulopathische reacties betrouwbaar nabootsen, zijn essentieel voor mechanistische studies en de evaluatie van gerichte interventies. Hier beschrijven we een gestandaardiseerd muismodel van ernstige bloedingen door middel van reproduceerbare leverlaceratie (LL) die bloedingen veroorzaakt, welke nauwkeurig gekwantificeerd kunnen worden, terwijl gelijktijdig systemische coagulopathie, ontstekingsmarkers en mortaliteit worden gevolgd.

Muizen ondergaan een gestandaardiseerde midline laparotomie gevolgd door LL, waarbij het bloedverlies wordt gekwantificeerd met bloedverzadigde sponsjes. Systemische markers voor stolling, fibrinolyse en inflammatie worden verzameld via een retro-orbitale bloedafname voorafgaand aan en op vooraf gespecificeerde, seriële intervallen na de procedure. LL met bloedverlies induceert betrouwbaar TIC (gekenmerkt door verlenging van de geactiveerde partiële tromboplastinetijd (aPTT), toename van het trombine-antitrombine (TAT) complex, selectieve uitputting van stollingsfactoren (F) V en VIII met activatie van de fibrinolyse). Parallel hieraan wordt inflammatoire activatie aangetoond door een verhoogde concentratie interleukine-6 (IL-6). Bovendien maakt het model overlevingsanalyses mogelijk na herstel van de midline incisie.

Als translationele toepassing worden rhFVIIa en TXA gebruikt om aan te tonen dat het model gevoelig is voor het stoppen van bloedingen door farmacologische modulatie van stollings- en fibrinolytische parameters. In vergelijking met modellen met grote dieren biedt dit muizenmodel een economische, veelzijdige en eenvoudig schaalbare mogelijkheid om innovatieve, gerichte interventies voor traumatische bloedingen te bestuderen.

Inleiding

Trauma is een van de belangrijkste doodsoorzaken en oorzaken van invaliditeit bij jonge volwassenen (leeftijd < 45 jaar)1,2, waarbij ongecontroleerde bloedingen een grote rol spelen bij vroege mortaliteit3. Een kritieke factor voor slechte uitkomsten bij ernstig gewonde patiënten is de ontwikkeling van trauma-geïnduceerde coagulopathie (TIC)4,5. TIC is een complexe, multifactoriële ontregeling van de hemostase, gekenmerkt door uitputting van stollingsfactoren V en VIII6,7, ontregelde fibrinolyse7,8,9 en systemische inflammatoire activatie10. TIC draagt bij aan aanhoudende bloedingen en is geassocieerd met een toename van de behoefte aan transfusies11, orgaanfalen5 en mortaliteit, ondanks vorderingen in damage-control resuscitatie en therapeutische interventies5.

Experimentele modellen die hemorragische shock met geassocieerde coagulopathische veranderingen betrouwbaar reproduceren, zijn daarom essentieel voor mechanistisch onderzoek en de evaluatie van gerichte hemostatische interventies. Modellen voor gecontroleerde bloeding maken gebruik van gestandaardiseerde bloedafname, wat mogelijk geen weefselbeschadiging veroorzaakt, wat bijdraagt aan de systemische coagulopathische respons die bij klinisch trauma wordt waargenomen12. Daarom zouden bloedingsmodellen waarin letsel aan solide organen is opgenomen een grotere klinische relevantie moeten bieden, mits aanhoudende bloedingen en systemische responsen kwantitatief kunnen worden beoordeeld13,14,15,16. Complexere TIC-modellen bevatten combinaties van traumatisch hersenletsel, fracturen van lange beenderen of ledematen, weke delen letsel, laparotomie en gecontroleerde hemorragische shock om meerdere componenten van ernstig trauma te reproduceren17,18. Hoewel deze benaderingen een completere weergave van polytrauma bieden, kunnen de meervoudige letselprocedures en fysiologische manipulaties de technische complexiteit en experimentele variabiliteit verhogen.

Ondanks decennia van onderzoek blijven klinisch relevante en reproduceerbare experimentele modellen van TIC beperkt en heterogeen. Overzichtsartikelen hebben de noodzaak benadrukt van robuuste modellen die de klinische sequentie van weefselbeschadiging en hemorragische shock nauwkeuriger reproduceren en de evaluatie van therapeutische interventies ondersteunen17,19. Complexe modellen die uitgebreide instrumentatie vereisen, waaronder hartcatheterisatie en continue hemodynamische monitoring, kunnen gedetailleerde fysiologische informatie verschaffen, maar vereisen ook gespecialiseerde apparatuur en aanvullende procedurele manipulatie. Om barrières voor trauma-onderzoek weg te nemen, lijkt het essentieel om de experimentele aanpak te vereenvoudigen terwijl de belangrijkste kenmerken van TIC behouden blijven. Hier beschrijven we een gestandaardiseerd muismodel dat leidt tot ongecontroleerde hemorragische shock14 door middel van reproduceerbare LL, wat ernstige bloedingen induceert en de belangrijkste kenmerken van TIC recapituleert. Dit model maakt de beoordeling van stollings- en ontstekingsreacties mogelijk, waaronder algemene stollingsmetingen (aPTT en thrombinegeneratie), selectieve uitputting van stollingsfactoren (FV en FVIII) als kenmerk van TIC, markers van fibrinolyse en cytokineprofilering. Om de gevoeligheid en relevantie van dit model voor menselijk trauma aan te tonen, evalueren we de effecten van rhFVIIa (prohemostatisch middel) en TXA (antifibrinolytisch middel), gebruikt bij trauma-reanimatie, op de ernst van de bloeding, de progressie van de coagulopathie en de overlevingsuitkomsten.

Het model ondersteunt daarnaast seriële en terminale bloedafname, wat longitudinale beoordeling van coagulatie- en inflammatoire trajecten mogelijk maakt in relatie tot de ernst van het letsel en therapeutische interventies. Samen biedt het model een reproduceerbaar en schaalbaar muizenmodel voor het bestuderen van TIC in een context van ernstige bloedingen en voor het evalueren van hemostatische en gerichte farmacologische interventies met behulp van klinisch relevante eindpunten, waaronder bloedverlies, coagulopathie, fibrinolyse, inflammatie en overleving.

In vergelijking met eerder gepubliceerde modellen van leverlaceratie bij muizen, waaronder het protocol beschreven door Dyer et al.13, introduceert deze methode verschillende belangrijke methodologische verbeteringen. Deze omvatten de kwantitatieve gravimetrische meting van bloedverlies, standaardisatie van de ernst van het letsel door normalisatie van de gemacerateerde levermassa ten opzichte van het lichaamsgewicht, en uitgebreide profilering van TIC, fibrinolyse en inflammatie. Bovendien maakt het model seriële bemonstering, farmacologische modulatie en overlevingsanalyses mogelijk, waarbij abdominale sluitingstechnieken worden gedetailleerd die fysiek herstel in plaats van terminatie mogelijk maken. Alle procedures kunnen binnen één experimentele benadering worden uitgevoerd, wat een schaalbaar en translationeel platform biedt voor het bestuderen van hemorragie en gerichte hemostatische interventies.

Protocol

Alle dierprotocollen zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de University of California San Diego (UCSD). C57BL/6J muizen zijn gefokt en gehouden in de interne fokfaciliteit van de UCSD. In de experimenten zijn zowel mannelijke als vrouwelijke muizen gebruikt in de leeftijd van 8 tot 10 weken. Een schematisch overzicht van de experimentele workflow en tijdlijn is weergegeven in Aanvullende Figuur 1.

OPMERKING: Steekproefgroottes werden bepaald op basis van voorlopige experimenten, de verwachte variabiliteit van individuele eindpunten en eerdere ervaring met het muizenmodel voor leverlaceratie. De uiteindelijke steekproefgroottes voor individuele experimentele eindpunten en experimentele groepen zijn vermeld in de bijbehorende figuurlegenda's. Voor levergewichtmetingen werden gegevens van meerdere onafhankelijke experimenten samengevoegd om de consistentie tussen experimentele cohorten te beoordelen. Voor stollingsonderzoeken die in afzonderlijke experimentele runs zijn uitgevoerd, werden eerder geanalyseerde monsters in elke run opgenomen om de consistentie en reproduceerbaarheid tussen de analyses te bewaken.

1. Pre-experimentele voorbereiding

  1. Collectie van nulmetingsmonsters (Dag -1)
    1. Neem ~200 µL bloed af via retro-orbitale toegang van elke muis (8–10 weken oud) 24 u voor het experiment om de basisparameters vast te stellen.
    2. Dien na de bloedafname ~200 µL steriele fysiologische zoutoplossing (injectiekwaliteit) subcutaan toe.
    3. Huis de muizen in schone kooien onder standaard laboratoriumcondities, met een gecontroleerde temperatuur van 20–24 °C, een relatieve vochtigheid van 30%–70% en een cyclus van 12 u licht/12 u donker, met ad libitum toegang tot voedsel en water tot de dag van het experiment.
  2. Voorbereiding van de kooi (Dag 0)
    1. Verplaats de muis op de dag van het experiment naar een schone kooi bekleed met verse papieren handdoeken.
    2. Verwijder voedsel en water 15 min voor het experiment en houd deze weg tot de absorptiesponzen na de operatie zijn verwijderd.

2. Voorbereiding van instrumenten en het operatieveld

  1. Sterilisatie van instrumenten
    1. Steriliseer chirurgische instrumenten, watten, applicators en filterpapieren door middel van autoclaveren.
    2. Desinfecteer het chirurgische oppervlak met 70% ethanol.
  2. Inrichting van de operatietafel
    1. Plaats de steriele instrumenten op een steriel afdekdoek.
    2. Bereid een roestvrijstalen bak voor met 70% ethanol en steriele watten voor het tussentijds reinigen van de instrumenten.
    3. Activeer een microbead-sterilisator en laat deze 150 °C bereiken voor sterilisatie tussen de dieren door.

3. Voorbereiding voor temperatuurbehoud

  1. Voorbereiding van het isotherme kussen
    1. Activeer het isotherme verwarmingskussen direct vóór de operatie volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Stel het isotherme verwarmingskussen zo in dat de lichaamstemperatuur van de muis gedurende de gehele anesthesie en operatie binnen een doelberek van 36–37 °C blijft.
    3. Bevestig dat de warmte gelijkmatig over het oppervlak van het kussen is verdeeld.
    4. Plaats het kussen op het operatieplatform en dek het af met een steriel doek.
    5. Sluit de operatietafel aan op het isofluraan-anesthesiesysteem.

4. Anesthesie en preoperatieve procedures

  1. Inductie van anesthesie
    1. Induceer anesthesie door de muis in een inductiekamer te plaatsen met 2% isofluraan in 2 L/min zuurstof.
    2. Bevestig adequate anesthesie via de teenknijpreflex.
    3. Noteer het lichaamsgewicht vóór de operatie.
  2. Toediening van analgesie en behandeling
    1. Dien buprenorfine (3,25 mg/kg, subcutaan) toe voor analgesie.
    2. Bereid hemostatische middelen voor indien nodig.
    3. Dien voor de behandelingsgroepen recombinant menselijke geactiveerde factor VII (rhFVIIa; 3 mg/kg) of tranexaminezuur (10 mg/kg) toe via een retro-orbitale intraveneuze injectie 5 min vóór het letsel.
    4. Dien een equivalent volume (~100 µL) injecteerbare steriele zoutoplossing toe aan de controledieren.

5. Chirurgische voorbereiding

  1. Voorbereiding van de operatielocatie
    1. Verplaats de geanestheseerde muis naar de operatieplaat die op het isotherme kussen is geplaatst.
    2. Houd de anesthesie gedurende de gehele chirurgische procedure in stand via een neusmasker met 1,5%–2% isofluraan in 2 L/min zuurstof.
    3. Positioneer de muis in rugligging en zet alle vier de ledematen vast met tape.
    4. Scheer de buikregio.
    5. Voer een aseptische voorbereiding uit door afwisselend povidonjodium en 70% ethanol te gebruiken (drie cycli).

6. Procedure voor leverlaceratie

  1. Vooraf wegen van materialen
    1. Weeg twee buisjes van 1,5 mL vooraf, waaronder één buisje met 0,5 mL zoutoplossing en één leeg buisje.
    2. Weeg voor elk dier drie primaire en twee secundaire absorptiedriehoeken vooraf en noteer hun gecombineerde massa.
    3. Weeg voor elk dier één weegbakje vooraf voor het daaropvolgende wegen van het uitgesneden leverweefsel.
  2. Inductie van leverletsel
    1. Voer een mediane laparotomie uit van ongeveer 0,5 inch (12,7 mm) lengte om de lever bloot te leggen.
    2. Plaats twee absorptiedriehoeken langs de rechter- en linkerbuikwand, waarbij contact met de lever wordt vermeden.
    3. Exterioriseer de linkerleverkwab en identificeer de kwabranden om de omvang van de weefselverwijdering te standaardiseren. Vermijd onbedoeld weefselletsel.
    4. Maak met een scherpe schaar ongeveer 75% van de kwab open in één gecontroleerde beweging om consistentie tussen de dieren te waarborgen.
    5. Breng het uitgesneden, gelacerate weefsel over naar het vooraf gewogen lege buisje voor de daaropvolgende kwantificering van de ernst van het letsel.
    6. Plaats een derde absorptiedriehoek in de buikholte om een uniforme bloedverzameling tijdens de bloedingsfase te vergemakkelijken.
  3. Snelle abdominale sluiting om interne bloeding te behouden (kritieke stap)
    1. Sluit de buikwand onmiddellijk binnen ~10–15 s met twee chirurgische autoclips.
    2. Zorg voor een nauwkeurige uitlijning van de incisieranden om een volledige sluiting zonder openingen te bereiken. Onvolledige sluiting kan leiden tot extern bloedverlies en onderschatting van het bloedverlies.
    3. Oefen een consistente maar zachte spanning uit tijdens het sluiten, waarbij compressie van de abdominale inhoud wordt vermeden, aangezien dit de bloedingsdynamiek kan beïnvloeden.
    4. Versterk de sluiting met weefsellijm (2–3 druppels) om een volledig afgesloten abdominale compartiment te garanderen.
  4. Monitoring na letsel
    1. Weeg het uitgesneden leverweefsel en normaliseer de meting naar het lichaamsgewicht om de omvang van het leverletsel te kwantificeren en te bevestigen.
    2. Plaats de muis terug in de kooi op het isotherme kussen.
    3. Laat de bloeding 60 min voortduren voor de eindpunt- en overlevingscohort.

7. Bloedafname en kwantificering van bloedverlies

  1. Afname en verwerking van bloedmonsters
    1. Anestheseer de muis voor de eindpuntcohort opnieuw met isofluraan 60 min na de leverlaceratie.
    2. Anestheseer de muis voor de overlevingscohort opnieuw met isofluraan 6 u en 7 dagen na de leverlaceratie voor bloedafname.
    3. Neem bloed af via retro-orbitale punctie in buisjes met natriumcitraatoplossing (verhouding bloed-anticoagulans: 9:1) voor de bereiding van plasma.
    4. Centrifugeer de monsters bij 2.000 × g gedurende 10 min, gevolgd door een tweede centrifugatie bij 12.000 × g gedurende 5 min, om bloedplaatjesarm plasma te verkrijgen voor daaropvolgende stollings- en fibrinolyse-assays.
  2. Meting van het bloedverlies
    1. Open de buikholte na 60 min na de leverlaceratie opnieuw voor zowel de eindpunt- als de overlevingscohort en verwijder de absorptiesponzen die bloed bevatten.
    2. Breng alle met bloed verzadigde sponzen over naar het vooraf gewogen buisje met steriele zoutoplossing.
    3. Gebruik extra vooraf gewogen absorptiesponzen om resterend bloed in de buikholte te verzamelen.
    4. Weeg het opvangbuisje na de bloedafname om het uiteindelijke gewicht van het buisje te bepalen.
    5. Bereken het bloedverlies met de volgende gravimetrische vergelijking:
      Bloedverlies (µL/g) = [(uiteindelijk gewicht buisje − begingewicht buisje – gewicht absorptiespons) / lichaamsgewicht muis] × 1000.
      OPMERKING: Alle gewichten worden uitgedrukt in gram. De factor 1.000 zet grammen bloed om in microliters, uitgaande van een bloeddichtheid van ongeveer 1 g/mL.
  3. Overlevings- en longitudinale uitkomstcohort
    1. Sluit de incisie direct na de meting van het bloedverlies bij 60 min met chirurgische nietjes en weefsellijm om een volledig afgesloten buikcompartiment te waarborgen.
    2. Dien voor het ontwaken 400 µL steriele zoutoplossing subcutaan toe.
    3. Plaats de muis terug in de standaardhuisvesting en monitor deze continu tijdens het herstel van de anesthesie; beoordeel de muis 2 u, 6 u en 24 u na de operatie, gevolgd door dagelijkse monitoring tot dag 7.

8. Postoperatieve zorg

  1. Postoperatieve monitoring
    1. Houd de dieren tijdens het vroege herstel van de anesthesie continu in de gaten op tekenen van stress of morbiditeit.
    2. Noteer de overlevingsstatus en klinische observaties bij elke geplande beoordeling.
  2. Ondersteunende zorg
    1. Dien gedurende 3 dagen dagelijks 400 µL steriele zoutoplossing subcutaan toe.
    2. Bied analgesie (buprenorfine, 3,25 mg/kg, subcutaan) elke 72 u toe volgens het goedgekeurde protocol voor dierenwelzijn.
    3. Houd de muizen in standaardhuisvesting met ad libitum toegang tot voedsel en water.
  3. Humane eindpunten
    1. Controleer de dieren op vooraf gedefinieerde humane eindpunten, waaronder ernstige of aanhoudende lethargie, onvermogen om zich te bewegen of voedsel of water op te nemen, ernstige ademhalingsproblemen, unresponsive status of andere tekenen van ernstige stress zoals gespecificeerd in het goedgekeurde institutionele protocol voor dierenwelzijn.
    2. Euthanaseer dieren die voldoen aan de vooraf gedefinieerde humane eindpunten in overeenstemming met de institutionele richtlijnen.
    3. Zet de monitoring van de overleving voort tot dag 7 of totdat een humaan eindpunt is bereikt.

9. Eindprocedures en weefselverzameling

  1. Anestheseer de muizen op vooraf gedefinieerde experimentele eindpunten en neem bloed af via een retro-orbitale punctie.
  2. Euthanaseer de dieren middels CO₂-inhalatie in overeenstemming met de institutionele richtlijnen.
  3. Ontneem de organen en bewerk de weefsels voor histologische analyse volgens de gespecificeerde downstream-procedures.

10. Coagulatie-, fibrinolyse- en cytokïne-assays

OPMERKING: Reagentia, assaykits en apparatuur die voor deze procedures worden gebruikt, staan vermeld in de Tabel met Materialen.

  1. Meting van aPTT
    1. Registreer alle stollingstijden met de coagulometer die vermeld staat in de Tabel met materialen.
    2. Meng 25 µL muizenplasma met 25 µL aPTT-reagens en incubeer dit gedurende 3 min bij 37 °C. Start de stolling door 25 µL CaCl₂ (25 mM) toe te voegen, bereid in HBS (20 mM HEPES, 147 mM NaCl, 3 mM KCl, pH 7.4), en registreer de stollingstijd.
  2. Meting van FV-, FII- en FX-activiteit
    1. Meng 5 µL muizenplasma met 20 µL van het overeenkomstige factor-deficiënte plasma en 25 µL HBS met 0,5% bovien serumalbumine.
    2. Incubeer gedurende 1 min bij 37 °C en start de stolling door het Innovin-reagens toe te voegen dat vermeld staat in de Tabel met materialen.
    3. Bepaal de factoractiviteit ten opzichte van het overeenkomstige kalibratie-/referentiesysteem.
  3. Meting van FVIII
    1. Bepaal FVIII met een chromogene FVIII-assay volgens de instructies van de fabrikant.
  4. Meting van fibrinogeen
    1. Bepaal de fibrinogeenconcentratie met de Clauss-methode. Voeg 10 µL muizenplasma toe aan 40 µL HEPES-gebufferde zoutoplossing met 0,01% bovien serumalbumine en incubeer gedurende 3 min bij 37 °C.
    2. Start de stolselvorming door 25 µL trombine (25 U/mL) toe te voegen en bepaal de fibrinogeenconcentratie aan de hand van de assay-kalibratie.
  5. Meting van plasmabiomarkers
    1. Meet plasma TAT-complexen, PAP-complexen en D-dimeer met de commercieel verkrijgbare assaykits die vermeld staan in de Tabel met materialen. Voer elke assay uit volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Gebruik assay-specifieke standaarden, kalibratoren en controles zoals gespecificeerd door de fabrikanten, en bereken de analytconcentraties aan de hand van de overeenkomstige standaardcurven.
  6. Meting van plasma IL-6
    1. Meet de plasma IL-6 concentraties bij de nulmeting en na 60 min en 6 u na leverlaceratie met de multiplex cytokine-assay die vermeld staat in de Tabel met materialen.
    2. Voer de assay uit volgens de instructies van de fabrikant en analyseer de gegevens met de Q-View software van de fabrikant.

Resultaten

Het LL-model resulteert in een reproduceerbare en gestandaardiseerde ernst van het letsel bij muizen. Figuur 1A demonstreert de consistentie van het gewicht van de gelacerate lever wanneer dit wordt genormaliseerd naar het lichaamsgewicht (%BW), met een mediaan letsel van 1,4% BW over de experimentele groepen. Deze consistentie bevestigt een betrouwbare chirurgische inductie en maakt reproduceerbaarheid tussen dieren en over verschillende experimentele condities mogelijk. Het vermogen om de ernst van het letsel te standaardiseren is essentieel voor het evalueren van downstream fysiologische responsen onafhankelijk van variabiliteit in weefselschade.

De validatie van de bloedingsrespons en therapeutische modulatie binnen het model wordt aangetoond in Figuur 1B. Muizen werden voorbehandeld met saline, het prehemostatische middel rhFVIIa of het antifibrinolytische middel TXA, waarna het bloedverlies werd gekwantificeerd en genormaliseerd naar het lichaamsgewicht (µL/g). Saline-behandelde muizen vertoonden aanzienlijke bloedingen na LL, terwijl rhFVIIa- of TXA-behandelde muizen een verminderd bloedverlies vertoonden. Deze bevindingen tonen het vermogen van dit model aan om farmacologische modulatie van bloedingen te detecteren en hemostatische interventies te evalueren onder omstandigheden van ongecontroleerde bloedingen.

Het model reproduceert ook belangrijke kenmerken van trauma-geïnduceerde coagulopathie. Zoals getoond in Figuur 1C, leidde LL tot een verlenging van de aPTT, wat wijst op een verminderde stolling na letsel. Behandeling met rhFVIIa of TXA verminderde deze verlenging, wat suggereert dat de stollingsfunctie werd hersteld. Op dezelfde manier was de thrombinegeneratie, bepaald aan de hand van TAT-complexen, verhoogd na LL en verlaagd na behandeling met TXA, terwijl rhFVIIa de TAT-spiegels niet verlaagt (Figuur 1D), wat wijst op een modulatie van de stollingsactivatie.

Verdere karakterisering van de coagulopathie wordt getoond in Figuur 2. LL leidde tot selectieve uitputting van stollingsfactoren V en VIII, wat consistent is met TIC, en deze veranderingen werden hersteld met behandeling met rhFVIIa of TXA (Figuur 2A,B). In tegenstelling hiermee waren factoren II en X niet significant veranderd (Figuur 2C,D), wat aangeeft dat deze veranderingen plaatsvinden in de context van behouden factoren II en X, wat wijst op een TIC-predominant fenotype in plaats van een fenotype dat lijkt op diffuse intravasculaire stolling (DIC).

De ontwikkeling van fibrinolyse na LL wordt weergegeven in Figuur 3. Fibrinogeenspiegels waren verlaagd na het letsel, wat duidt op consumptie, en werden niet volledig hersteld met rhFVIIa of TXA (Figuur 3A). In tegenstelling hiermee waren fibrinolytische markers, waaronder plasmine-antiplasmine (PAP)-complexen en D-dimeer, verhoogd na LL. rhFVIIa verlaagde de spiegels van PAP-complexen, maar veranderde de D-dimeerspiegels niet significant. TXA verlaagde zowel de PAP-complex- als de D-dimeerspiegels na LL (Figuur 3B,C).

Ten slotte worden de systemische inflammatoire respons en de overlevingsuitkomsten beoordeeld in Figuur 4. De plasmaspiegels van interleukine-6 (IL-6) worden gemeten op 60 min en 6 u na LL in alle behandelingsgroepen. De IL-6-spiegels zijn op vroege tijdstippen verhoogd in alle groepen (Figuur 4A). De overleving over een periode van 7 dagen wordt beoordeeld met behulp van een Kaplan-Meier-analyse. De overleving na zeven dagen is 75% in de zoutoplossingsgroep, 55% in de rhFVIIa-groep en 80% in de TXA-behandelde groep. Er is geen significant verschil waargenomen tussen de zoutoplossings- en TXA-groepen, terwijl de overleving significant lager is in de rhFVIIa-groep vergeleken met de zoutoplossings- en TXA-groepen (Figuur 4B).

figure-results-1
Figuur 1: Validatie van het model voor leverlaceratie (LL): reproduceerbaarheid van de ernst van het letsel, kwantitatief bloedverlies en inductie van coagulopathie. Ernstige interne bloedingen worden geïnduceerd door een mediane laparotomie gevolgd door gestandaardiseerde LL. Muizen worden vóór het letsel voorbehandeld met saline (~100 µL), recombinant humaan geactiveerde factor VII (rhFVIIa; 3 mg/kg) of tranexaminezuur (TXA; 10 mg/kg) om de farmacologische modulatie van bloedingen en coagulopathie te beoordelen. (A) De ernst van het letsel wordt gekwantificeerd als het gewicht van de gelacerate lever genormaliseerd naar het lichaamsgewicht (%BW), wat een reproduceerbare inductie van gestandaardiseerd letsel over de dieren heen aantoont. (B) Bloedverlies wordt gekwantificeerd met een gravimetrische methode en genormaliseerd naar het lichaamsgewicht (µL/g), wat een meetbare bloeding aantoont die wordt verminderd bij behandeling met TXA. (C) De geactiveerde partiële tromboplastinetijd (aPTT) en (D) trombine-antitrombine (TAT) complexen tonen een reproduceerbare inductie van coagulopathie na LL, waarbij modulatie wordt waargenomen na behandeling met rhFVIIa of TXA. Gegevens worden gepresenteerd als individuele waarden met mediaan en interkwartielafstand; vergelijkingen werden uitgevoerd met een non-parametrische Mann-Whitney U-test (n = 5–21). ****P ≤ 0,0001. Aangepast met toestemming van Joseph et al.16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Validatie van door trauma geïnduceerde coagulopathie (TIC) na leverlaceratie (LL): selectieve uitputting van stollingsfactoren. Ernstige interne bloedingen worden geïnduceerd door een midline laparotomie gevolgd door gestandaardiseerde LL. Muizen worden voorafgaand aan het letsel behandeld met saline (~100 µL), recombinant humaan geactiveerd factor VII (rhFVIIa; 3 mg/kg), of tranexaminezuur (TXA; 10 mg/kg) om de farmacologische modulatie van de coagulopathie te beoordelen. Stollingsparameters worden beoordeeld 60 minuten na de LL. (A) Factor V- en (B) Factor VIII-spiegels tonen een reproduceerbare uitputting na LL, wat consistent is met TIC. (C) Factor II en (D) Factor X blijven relatief behouden, wat wijst op selectieve uitputting van stollingsfactoren in plaats van globale consumptie. Gegevens worden weergegeven als individuele waarden met mediaan en interkwartielafstand (n = 7–10). Statistische vergelijkingen zijn uitgevoerd met behulp van een non-parametrische Mann-Whitney U-test. ***P ≤ 0.001; ****P ≤ 0.0001. Aangepast met toestemming van Joseph et al.16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Validatie van fibrinolytische activatie na leverlaceratie (LL). Ernstige interne bloedingen worden geïnduceerd door een midline laparotomie gevolgd door gestandaardiseerde LL. Muizen worden voor het letsel voorbehandeld met saline (~100 µL), recombinant humaan geactiveerd factor VII (rhFVIIa; 3 mg/kg), of tranexaminezuur (TXA; 10 mg/kg) om de farmacologische modulatie van fibrinolyse te beoordelen. Fibrinolytische parameters worden gemeten 60 minuten na de LL. (A) Fibrinogeenwaarden tonen consumptie na het letsel, wat consistent is met de activatie van fibrinolyse en uitputting van stollingsfactoren. (B) Plasmine-antiplasmine (PAP)-complexen en (C) D-dimeerniveaus zijn verhoogd na LL, wat wijst op actieve fibrineafbraak en systemische fibrinolytische activatie. De gegevens worden gepresenteerd als individuele waarden met mediaan en interkwartielafstand (n = 8–13). Statistische vergelijkingen zijn uitgevoerd met een non-parametrische Mann-Whitney U-test. **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001; ****P ≤ 0.0001. Aangepast met toestemming van Joseph et al.16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Validatie van de systemische ontstekingsrespons en overlevingsbeoordeling na leverlaceratie (LL).Er wordt een ernstige interne bloeding opgewekt via een mediane laparotomie gevolgd door een gestandaardiseerde LL. Muizen worden voorafgaand aan de verwonding voorbehandeld met saline (100 µL), recombinant humaan geactiveerde factor VII (rhFVIIa; 3 mg/kg) of tranexamaalzuur (TXA; 10 mg/kg). Na de verwonding wordt de abdominale incisie gesloten met wondclips en weefsellijm, waarna de dieren terugkeren naar hun kooien. Ondersteunende zorg bestaat uit dagelijkse subcutane toediening van saline (400 µL) gedurende de eerste drie dagen na de verwonding. Plasmaproeven worden verzameld op 60 min en 6 u na LL om de systemische ontstekingsactivatie te beoordelen. (A) Interleukine-6 (IL-6) spiegels tonen een aanhoudende systemische ontstekingsrespons na de verwonding. Gegevens worden weergegeven als individuele waarden met mediaan en interkwartielafstand. Statistische vergelijkingen zijn uitgevoerd met een non-parametrische Mann–Whitney U-test (n = 9–13). (B) De overleving na zeven dagen is beoordeeld met Kaplan-Meier-analyse, wat de capaciteit van het model aantoont om longitudinale uitkomstgebaseerde eindpunten te ondersteunen (n = 20). ****P ≤ 0.0001. Aangepast met toestemming van Joseph et al.16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende Figuur 1: Schematisch overzicht van het leverlaceratiemodel en de experimentele tijdlijn. Deze figuur vat de experimentele workflow samen voor het gestandaardiseerde muizenmodel voor leverlaceratie (LL) bij ongecontroleerde bloedingen. Muizen ondergaan een midline laparotomie, gevolgd door een reproduceerbare LL van ongeveer 75% van de linker leverlob. Voorafgaand aan de beschadiging ontvangen de muizen ofwel zoutoplossing (~100 µL, voertuigcontrole), recombinant menselijk geactiveerd factor VII (rhFVIIa; 3 mg/kg), of tranexamaalzuur (TXA; 10 mg/kg), toegediend via een intraveneuze retro-orbitale injectie 5 min voor de LL. De kwantificering van het bloedverlies wordt uitgevoerd met vooraf gewogen abdominale spongen die op het moment van de beschadiging intra-abdominaal worden geplaatst, 60 min na de LL worden verwijderd en gewogen om de totale bloeding te bepalen. Het abdomen wordt vervolgens gesloten met wondclips en weefsellijm. Bloedmonsters worden verzameld via retro-orbitale toegang na 60 min in de eindpuntcohort en na 6 u en 7 d in de overlevingscohort. Plasma wordt geanalyseerd op stollingsparameters, waaronder de geactiveerde partiële tromboplastinetijd (aPTT), stollingsfactoractiviteit, trombine-antitrombine (TAT)-complexen, plasmine-α2-antiplasmine (PAP)-complexen en D-dimeer na 60 min. Cytokineprofilering wordt uitgevoerd na 60 min en 6 u. De overleving wordt gedurende een periode van 7 dagen gemonitord. Aangepast met toestemming van Joseph et al.16. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

In deze studie presenteren wij een reproduceerbaar muismodel van ernstige bloeding met gebruik van gestandaardiseerde LL, waarin kwantitatieve beoordeling van bloedverlies, karakterisering van TIC en inflammatie, en overlevingsanalyse in één enkel experiment zijn geïntegreerd. Het model produceert een consistente ernst van het letsel, aangetoond door vergelijkbare gewichten van de gelacerate lever genormaliseerd naar het lichaamsgewicht, terwijl het een reproduceerbare evaluatie van bloedingen en systemische hemostatische reacties over experimentele groepen mogelijk maakt. Het gebruik van een klein knaagdiermodel met gestandaardiseerd letsel en kwantitatieve uitkomstmaten maakt een efficiënte beoordeling van meerdere experimentele eindpunten binnen één enkel experimenteel kader mogelijk, wat reproduceerbaar en schaalbaar onderzoek naar TIC ondersteunt zonder dat technisch complexe procedures vereist zijn.

Belangrijk is dat dit model belangrijke kenmerken van TIC recapituleert, waaronder verlenging van algemene stollingsparameters (aPTT), verhoogde thrombinegeneratie zoals weerspiegeld door TAT-complexen, selectieve uitputting van stollingsfactoren V en VIII, en activatie van fibrinolyse aangetoond door verhoogde PAP-complexen en D-dimeervorming. Deze veranderingen treden op in de context van behouden factoren II en X, wat wijst op een TIC-dominant fenotype in plaats van gedissemineerde intravasale stolling. De mogelijkheid om deze parameters gelijktijdig te kwantificeren biedt een translationeel relevant kader voor het evalueren van hemostatische dysregulatie na traumatisch letsel.

Een belangrijk sterk punt van dit model is de opname van overleving als uitkomstmaat in de context van traumatische hemorragie. Om klinisch relevante reddingsstrategieën te testen, hebben we zowel rhFVIIa als TXA geëvalueerd, twee middelen die worden gebruikt of onderzocht voor trauma-reanimatie bij mensen. TXA vertoonde consistente effecten op het verminderen van bloedverlies en het normaliseren van coagulopathie en fibrinolytische activatie, wat resulteerde in een redding van de overleving. Daarentegen leidde rhFVIIa tot aanzienlijke mortaliteit in verband met overcorrectie van hemostatische parameters en onvolledige controle over de fibrinolyse16.

Deze bevindingen benadrukken een belangrijk aspect van het model: overleving wordt gestuurd door een complexe interactie tussen de ernst van de bloeding, coagulopathie en de systemische respons, in plaats van door de geïsoleerde correctie van individuele hemostatische routes. Het lijkt erop dat dit bloedingsmodel gevoelig is voor de integratie van biochemische hemostatische parameters met overleving, waarbij dat laatste een kritieke determinant is voor de uitkomst in de klinische praktijk. Hoewel ernstige traumatische bloeding de primaire letselvorm is die in dit systeem wordt gemodelleerd, kan secundair orgaanletsel mogelijk ook bijdragen aan de uitkomst. In onze vorige studie met dit model werden pulmonale microtrombi en fibrineafzetting waargenomen bij met rhFVIIa behandelde muizen, wat geassocieerd was met een verhoogde mortaliteit; dit suggereert een potentiële bijdrage van thrombo-inflammatoir orgaanletsel aan de uitkomst16.

Hoewel er in de huidige studie geen gelijktijdige schijnoperatiegroep was opgenomen, hebben we eerder aangetoond dat een laparotomie zonder LL niet leidde tot TIC, wat aantoont dat aanvullend snel bloedverlies (shock) noodzakelijk is om de karakteristieke stollingsafwijkingen te produceren die bij TIC worden waargenomen14.

Verschillende technische overwegingen zijn belangrijk voor de reproduceerbaarheid van dit model. De omvang en locatie van de LL moeten worden gestandaardiseerd, aangezien variatie in de hoeveelheid verwijderd leverweefsel de ernst van de bloeding en de resulterende coagulopathische respons aanzienlijk kan beïnvloeden. In ons protocol wordt ~75% van de linkerleverkwab verwijderd, waarbij het gewicht van de gelacerate lever wordt genormaliseerd naar het lichaamsgewicht, wat een objectieve maat geeft voor de consistentie van het letsel. Snelle en veilige abdominale sluiting is tevens cruciaal om extern bloedverlies te voorkomen en een afgesloten intra-abdominale hemorragie-omgeving te behouden tijdens de observatieperiode. Voor een nauwkeurige meting van het bloedverlies moeten vooraf gewogen sponsjes consistent worden teruggevonden, waarbij dezelfde verzamelprocedure en timing voor alle experimentele groepen worden gehanteerd. Deze stappen minimaliseren operator-afhankelijke variatie en zijn bijzonder belangrijk omdat verschillen in het initiële bloedverlies de daaropvolgende coagulopathie en overleving kunnen beïnvloeden. Indien er overmatig bloeden optreedt vóór de sluiting of indien er extern bloedverlies plaatsvindt, moet het dier worden uitgesloten.

Een beperking van dit model is dat het gericht is op orgaanletsel, wat de heterogeniteit van polytrauma niet weerspiegelt, waarbij ook fracturen van lange beenderen, verbrijzelingstrauma van zacht weefsel en andere complexe shocktoestanden kunnen voorkomen. Deze focus op letsel is echter ook een bewuste eigenschap van het model, waardoor de effecten van ernstige bloedingen en TIC bestudeerd kunnen worden zonder de extra procedurele complexiteit en variabiliteit die door meerdere soorten letsel worden geïntroduceerd. Concluderend biedt dit murine LL-model een kosteneffectieve (vergeleken met studies bij grote dieren), robuuste en schaalbare benadering voor het bestuderen van trauma-gerelateerde bloedingen, TIC en mortaliteit. Door een eenvoudig experimenteel platform voor kleine knaagdieren te combineren met gestandaardiseerd letsel, kwantitatieve meting van bloedverlies, uitgebreide hemostatische profilering en overlevingsbeoordeling, biedt het model een praktisch alternatief voor trauma-modellen met uitgebreidere instrumentatie. Het maakt een geïntegreerde beoordeling mogelijk van bloedvolumeverlies, coagulatie (aPTT, FII, FV, FVIII, FX, TAT), fibrinolyse (Fibrinogeen, PAP, D-dimeer) en overlevingsendpunten in een klinisch relevante context, wat zeer geschikt is voor het evalueren van antifibrinolytische en gerichte hemostatische interventies.

Openbaarmakingen

A.v.D. heeft honoraria ontvangen voor deelname aan wetenschappelijke adviesraden, consultancy en spreekbeurten van BioMarin, Regeneron, Pfizer, Bioverativ/Sanofi, CSL Behring, Novo Nordisk, Spark Therapeutics, Genentech en uniQure. A.v.D. is medeoprichter van Hematherix LLC, een biotechbedrijf dat superFVa-therapie ontwikkelt voor bloedingscomplicaties. B.C.J., M.L.C. en R.M. hebben niets te melden.

Dankbetuigingen

Wij danken Laurent Mosnier, PhD, voor het technisch advies.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
naald van 25 GBD Diagnostics305124
naald van 30 GBD Diagnostics305106
AnesthesiesysteemPatterson Scientific78915712
aPTT-reagens - STA-C.K. Prest. 5Stago597
AutoclipFine Science Tools12022-19
Autoclip-applicatorFine Science Tools12020-09
Autoclip-verwijderaarFine Science Tools12023-00
RunderserumalbumineSigma Aldrich10735078001
CalciumchlorideFisher ScientificC79-500
Capillaire buis – EenvoudigFisher Scientific22-260943
WattenstaafjeMedique19-090-701
WattenbolletjesFisher Scientific22-456-103
D-dimeer ELISA-kitInvitrogenEEL094
Isothermisch kussen voor de deltafaseBraintree Scientific50-195-4663
EthanolFisher ScientificBP28184
EthiqaFidelisSKU 072117
Factor II-deficiënt plasmaAffinity BiologicalsFII-DP
Factor V-deficiënt plasmaAffinity BiologicalsFV-DP
Factor VIII-deficiënt plasmaAffinity BiologicalsFVIII-DP
Factor X-deficient plasmaAffinity BiologicalsFX-DP
Filterpapier, extra dik, 7 cm × 8,4 cmFisher ScientificPI88605
Graefe-pincetFine Science Tools11049-10
InductiekamerPatterson Scientific78933385
Klaar voor injectie zoutoplossingHospira0409-4888-02
InnovinSiemens Healthineers23-044-778
IsofluraanMed Vet International50-304-2993
K824086 Chromogenix Coatest SP Factor VIIIDiapharma K822585
Liqui Vet Rapid Tissue AdhesiveWorld Precision Instrument50-253-9340
Microbead-sterilisatorFisher Scientific14-955-342
Microcentrifugebuisjes – 1,5 mLFisher ScientificAM12400
Multiplexkit voor muiscytokinenQuansys Biosciences 111049MS-13P
PAP-complex assaykitBiotechneNBP3-06903
povidonjodiumMed Vet International50-283-2277
Recombinant humaan geactiveerde factor VIINovo Nordisk0169-7001
NatriumcitraatFisher ScientificS279-500
Steriele afdekdoekStoelting10-000-695
Chirurgisch platform equaflow muis 5 anesthesiemanifoldPatterson Scientific78919268
Chirurgische scharenFine Science Tools91405-11
PlakbandFisher Scientific15-901-5R
TAT-complex assay kitSiemens Healthineers23-044-704
TrombineInvitrogenPIRP43100
TranexaminezuurAuromedics55150-0188-10
TrimmerStoelting10-000-792
WAG-geactiveerd koolstoffiltratiesysteemPatterson Scientific78909457
WeegschaaltjeFisher Scientific01-549-752

Referenties

  1. Rhee P, et al. Increasing trauma deaths in the United States. Ann Surg. 2014;260(1):13-21.
  2. Kauvar DS, Lefering R, Wade CE. Impact of hemorrhage on trauma outcome: an overview of epidemiology, clinical presentations, and therapeutic considerations. J Trauma. 2006;60(6):S3-S11.
  3. Bernhardt IM, et al. Timing of trauma deaths due to uncontrolled bleeding have not changed in three decades: a multicenter study of patients in hemorrhagic shock. Am J Surg. 2025;250.
  4. Cohen MJ, Christie SA. Coagulopathy of trauma. Crit Care Clin. 2017;33(1):101-18.
  5. Kornblith LZ, Moore HB, Cohen MJ. Trauma-induced coagulopathy: the past, present, and future. J Thromb Haemost. 2019;17(6):852-62.
  6. Brohi K, et al. Acute traumatic coagulopathy: initiated by hypoperfusion: modulated through the protein C pathway? Ann Surg. 2007;245(5):812-8.
  7. Cohen MJ, et al. Early coagulopathy after traumatic brain injury: the role of hypoperfusion and the protein C pathway. J Trauma. 2007;63(6):1254-61; discussion 1261-2.
  8. Davenport RA, et al. Activated protein C drives the hyperfibrinolysis of acute traumatic coagulopathy. Anesthesiology. 2017;126(1):115-27.
  9. Moore HB, et al. Hyperfibrinolysis, physiologic fibrinolysis, and fibrinolysis shutdown: the spectrum of postinjury fibrinolysis and relevance to antifibrinolytic therapy. J Trauma Acute Care Surg. 2014;77(6):811-7; discussion 817.
  10. Johansson PI, et al. Traumatic endotheliopathy: a prospective observational study of 424 severely injured patients. Ann Surg. 2017;265(3):597-603.
  11. Vernon T, Morgan M, Morrison C. Bad blood: a coagulopathy associated with trauma and massive transfusion review. Acute Med Surg. 2019;6(3):215-22.
  12. Lie SL, Rognes IN. Human and animal models for studying hemorrhagic shock. Scand J Trauma Resusc Emerg Med. 2025;33(1):124.
  13. Dyer M, et al. Uncontrolled hemorrhagic shock modeled via liver laceration in mice with real time hemodynamic monitoring. J Vis Exp. 2017;(123).
  14. Joseph BC, et al. An engineered activated factor V for the prevention and treatment of acute traumatic coagulopathy and bleeding in mice. Blood Adv. 2022;6(3):959-69.
  15. Joseph BC, et al. Traumatic bleeding and mortality in mice are intensified by iron deficiency anemia and can be rescued with tranexamic acid. Res Pract Thromb Haemost. 2024;8(6):102543.
  16. Chumappumkal Joseph B, et al. The effects of recombinant human activated factor VII and tranexamic acid on traumatic bleeding and mortality in mice. Res Pract Thromb Haemost. 2026;10(3):103436.
  17. Ask A, et al. Spotlight on animal models of acute traumatic coagulopathy: an update. Transfus Apher Sci. 2022;61(2):103412.
  18. Mayer AR, et al. A systematic review of large animal models of combined traumatic brain injury and hemorrhagic shock. Neurosci Biobehav Rev. 2019;104:160-77.
  19. Frith D, Cohen MJ, Brohi K. Animal models of trauma-induced coagulopathy. Thromb Res. 2012;129(5):551-6.

Herprints en machtigingen

Tags

Trauma-geïnduceerde coagulopathiekwantificering van bloedingenontstekingsmarkersoverlevingsanalysemeting van bloedverliesstollingsfactorenactivatie van fibrinolyseinflammatoire activatiefarmacologische modulatie

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.