Veertig volwassen mannelijke Specific Pathogen-Free (SPF) Sprague–Dawley (SD) ratten, met een gewicht van 240–280 g, werden gekocht bij Beijing Vital River Laboratory Animal Technology [Licentienr.: SCXK (Jing) 2021-0011]. Alle ratten werden onder gecontroleerde omstandigheden gehuisvest in het Laboratorium Dierencentrum van de Beijing University of Chinese Medicine, met een kamertemperatuur van 23°C ± 1°C, een relatieve luchtvochtigheid van 50% ± 5% en een 12 uur licht/12 uur donkercyclus, met vrije toegang tot voedsel en water. De ratten werden 5 dagen geacclimatiseerd, waarbij tegelijkertijd de training van de acklimatisatie op de loopband werd uitgevoerd. Dieren ondergingen dagelijks een loopband-aanpassing met een snelheid van 10 m/min gedurende 15 minuten per sessie zonder elektrische stimulatie om de stress van het hanteren te verminderen.
Op basis van onze eerdere studie is het slagingspercentage van PSS-inductie via de middle cerebral artery occlusion (MCAO) methode ongeveer 60%. Met behulp van een willekeurige getallettabel werden 9 ratten vooraf willekeurig geselecteerd als de door schijn bediende groep; De resterende 31 ratten werden gebruikt voor het opzetten van modellen. Na succesvolle modellering werden deze ratten willekeurig verdeeld in de modelgroep en de MSSA-groep. Uiteindelijk werden er negen ratten in elke groep opgenomen. Dit experiment werd uitgevoerd volgens de 3R-principes van laboratoriumdierenwelzijn en goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van de Beijing University of Chinese Medicine (BUCM 20250915-008).
Modeloprichting
Het MCAO-model werd bij ratten ontwikkeld met behulp van een aangepaste intraluminale filamenttechniek. De ratten werden verdoofd met 3% isoflurane voor inleiding, en de anesthesie werd gehandhaafd met 1,5% isoflurane toegediend in zuurstof met een constante doorstroming van 1 L/min gedurende de operatie. Er werd een middenlijn-cervicale incisie gemaakt, gevolgd door een stomp dissectie om de rechter arteria common carotis (CCA), externe halsslagader (ECA) en interne halsslagader (ICA) bloot te leggen. Een nylon monofilament hechting (diameter, 0,36 ± 0,02 mm) werd via de ECA in de ICA gebracht en ongeveer 18–20 mm naar de oorsprong van de middenarteria cerebrale arterie (MCA) gebracht om arteriële occlusie te bereiken. De vaten werden geligeerd en de incisie werd gesloten. Ratten werden vervolgens op een verwarmingskussen gelegd tot herstel van de narcose. Ratten in de schijngeopereerde groep ondergingen identieke chirurgische blootstelling aan de CCA, ICA en ECA zonder het inbrengen van de intraluminale filament.
Na de operatie kregen alle MCAO-ratten gestandaardiseerde postoperatieve zorg. De dieren werden de eerste 12 uur op een verwarmingskussen van 37°C gehouden om onderkoeling te voorkomen. Chirurgische incisies werden drie dagen lang dagelijks schoongemaakt, ampicilline (100 mg/kg) werd toegediend via intraperitoneale injectie voor infectieprofylaxe, en er werd verzacht voedsel gegeven om voldoende voeding te behouden. Algemene activiteit, voedselinname, wondtoestand en motorische functies van ledematen werden dagelijks gemonitord van postoperatieve dag 1 tot 10.
Neurologische tekorten werden geëvalueerd door onderzoekers die blind waren voor groepstoewijzing met behulp van de Zea Longa neurologische tekortscore, en de spiertonus werd beoordeeld met behulp van de Modified Ashworth Scale (MAS). De beoordelingen werden 1 dag voor de operatie uitgevoerd (dag −1), op de dag van de operatie vóór MCAO (dag 0), en op postoperatieve dagen 1, 3, 5, 7 en 10. Ratten met Zea Longa- en MAS-scores ≥1 op postoperatieve dag 3 werden beschouwd als het hebben opgebouwd van een succesvol PSS-model.
MSSA-behandeling
De interventies begonnen op postoperatieve dag 3. De stimulatieplaats voor acupunctuur op de hoofdhuid was de ipsilesionele MS 6-lijn (anterieure parietotemporale schuine opulsuurlijn). In overeenstemming met de Nationale Standaard voor Gestandaardiseerde Manipulaties van Hoofdacupunctuur (GB/T 21709.2-2021) strekt de MS 6-lijn zich uit van GV 21 (Qianding) tot GB 6 (Xuanli).
Wegwerpsteriele acupunctuurnaalden (0,25 × 13 mm) werden onder de galea aponeurotica ingebracht bij GV 21 onder een schuine hoek van ongeveer 15° ten opzichte van het hoofdhuidoppervlak en bewogen, richting GB 6 langs de voorste parietotemporale schuine oculuslijn tot een diepte van ongeveer 10 mm. Snelle draaimanipulatie (200 omwentelingen/min) werd continu toegepast gedurende 1 minuut. Na 15 minuten naaldretentie werd dezelfde draaiende manipulatie één keer herhaald, wat resulteerde in een totale naaldretentietijd van 30 minuten. Gedurende de hele naaldretentieperiode ondergingen ratten tegelijkertijd een loopbandoefening met een constante snelheid van 10 m/min.
Ratten in de schijn-bediende en modelgroepen kregen noch acupunctuur noch loopbandoefening. Om te voorkomen dat er geen specifieke vasthoudings- en vastzettingsstress plaatsvinden, werden ze voorzichtig vastgehouden en vastgebonden in niet-compressieve houders gedurende 30 minuten per dag, wat overeenkwam met de totale dagelijkse interventieduur van de MSSA-groep.
Gedragsbeoordelingen
Zea Longa-score voor neurologische tekorten:
Neurologische tekorten bij ratten werden beoordeeld met behulp van het Zea Longa-scoresysteem16. De volgende criteria werden toegepast: een score van 0 gaf geen neurologische beperking aan en normale onbeperkte beweging; een score van 1 duidde op onvolledige extensie van de voor- of achterpoot contralateraal aan de getroffen zijde; een score van 2 gaf aan dat hij tijdens voortbeweging naar de contralaterale zijde cirkelde; een score van 3 gaf aan dat je tijdens het lopen naar de contralaterale kant viel; en een score van 4 duidde op bewustzijnsverlies zonder spontane loopbeweging.
MAS voor spiertonus:
De spiertonus werd beoordeeld met behulp van MAS17. De criteria werden als volgt gedefinieerd: graad 0, geen toename van spiertonus; graad 1, lichte toename van spiertonus, met een tijdelijke vang of minimale weerstand aan het einde van passieve buiging en extensie; graad 1+, duidelijke toename van spiertonus, met een tijdelijke hapering in het middenbewegingsbereik en aanhoudende weerstand tijdens de tweede helft van de beweging; graad 2, een duidelijke toename van spiertonus, met weerstand zichtbaar gedurende het grootste deel van het bewegingsbereik, hoewel het ledemaat gemakkelijk beweegbaar bleef; graad 3, een aanzienlijke toename van spiertonus waardoor passieve buiging en extensie moeilijk werden; en graad 4, beperkte passieve beweging door gewrichtsstijfheid. Klas 1+ kreeg een score van 2 punten, wat een maximale MAS-score van 5 punten opleverde in deze studie10.
T2WI Neuroimaging voor kwantificering van het volume van cerebrale infarcten
Alle T2WI-scans werden verkregen met een PharmaScan MRI-scanner die werd bediend met ParaVision 360-software (versie 3.5). Een T2-gewogen turbo rapid acquisition met relaxatieversterking (T2_TurboRARE, ook wel RARE/fast spin echo [FSE]) genoemd) pulssequentie werd toegepast op MCAO-ratten voor de kwantificering van het volume van cerebrale infarcten. De beeldparameters waren als volgt geconfigureerd: herhalingstijd (TR) = 3000,0 ms, echotijd (TE) = 33,0 ms, gezichtsveld (FOV) = 35,00 × 35,00 mm2, matrixgrootte = 250 × 250, slicedikte = 0,80 mm, aantal sneden = 35, aantal excitaties (NEX) = 3,0, en flip angle (FA) = 180,0°. Cerebrale infarctgebieden werden handmatig per slice afgebakend in ITK-SNAP-software (versie 4.4.0) door een enkele onderzoeker die blind was voor groepstoewijzing op basis van veranderingen in signaalintensiteit en morfologische kenmerken die overeenkomen met ischemisch infarct. Het volume van herseninfarct werd vervolgens automatisch berekend door de software.
DTI Neuroimaging voor Evaluatie van de microstructurele integriteit van witte stof
MRI-gegevens werden verkregen met een 7,0 T PharmaScan magnetische resonantiescanner. Anesthesie werd geïnduceerd met 3% isoflurane toegediend in perslucht (0,4–0,6 L/min) en gehandhaafd met 1% isoflurane gedurende de DTI-verwerving. De kerntemperatuur van het lichaam werd gedurende de hele beeldvorming gehandhaafd met behulp van een thermostatisch geregeld waterbad.
Tijdens de MRI-scan werd eerst een drievlakse lokalisatiesequentie toegepast om het rattenbrein binnen de magneet te positioneren. DTI werd uitgevoerd met behulp van een axiale single-shot spin-echo echo-planaire beeldvormingssequentie met de volgende parameters: TR/TE = 3000/27 ms, matrix = 90 × 75, FOV = 20 × 15 mm2, slicedikte = 0,7 mm, 30 diffusiegradiëntrichtingen en b-waarden van 0 en 1000 s/mm2. Voor DTI-analyse werden interessegebieden getekend in de externe capsule op hersensneden 1,3 mm achter bregma. Parametrische kaarten van fractionele anisotropie (FA), gemiddelde diffusiviteit (MD), axiale diffusiviteit (AD) en radiale diffusiviteit (RD) werden gereconstrueerd met behulp van ParaVision 360-software. De gegevens worden uitgedrukt als de verhouding van de aangedane hersenhelft tot de contralaterale gezonde hersenhelft.
LFB-kleuring voor beoordeling van myelineletsel en remyelinisatie
LFB-kleuring werd uitgevoerd om structurele schade aan gemyeliniseerde axonen in de externe capsule te evalueren. Myelineletsel, gekenmerkt door myeline-verdunning en vacuolatie, werd gekwantificeerd door de geïntegreerde optische dichtheid (IOD) van LFB-gekleurde myelinisatievezels binnen de ROI in de externe capsule te meten met behulp van ImageJ-software (versie 6.0; grijswaardendrempel 35–225). Op basis van de rattenhersenstereotaxische atlas18 werden voor elk dier drie coronale secties geanalyseerd bij bregma +1,0 mm, −1,3 mm en −1,6 mm, wat overeenkomt met de voorste, midden- en midden-posterieure delen van de externe capsule. De gemiddelde IOD over de drie secties werd berekend om elk dier te vertegenwoordigen (n = 4 per groep). Ipsilaterale IOD-waarden werden genormaliseerd naar de contralaterale zijde en uitgedrukt als een percentagevan 19.
Elektrofysiologische opnames voor de beoordeling van de excitabiliteit van spinale reflexen
De spinale monosynaptische H-reflex werd geregistreerd met behulp van een biologisch functie-experimentsysteem. Ratten werden licht verdoofd met α-chloralose (50 mg/kg, intraperitoneaal) om de prikkelbaarheid van de spinale reflex tijdens elektrofysiologische opnames te behouden. De linker ischiaszenuw werd blootgelegd door een stomp dissectie en geplaatst op bipolaire haakelektroden voor elektrische stimulatie. Een olieachtige vitamineoplossing werd af en toe op de blootgestelde zenuw aangebracht om de hydratatie van het weefsel en de neurale levensvatbaarheid te behouden. Een paar roestvrijstalen opname-elektroden werd in de interosseus spieren van de linkerachterpoot geplaatst, en een aardelektrode werd in de staart geplaatst. De H-reflex werd opgewekt met een monopolair-bipolaire pulsstimulator met een pulsduur van 100 μs. De H-reflexdrempel en motorische drempel (MT) werden bepaald met behulp van incrementele elektrische stimulatie, waarbij de stroom in stappen van 0,05 mA werd verhoogd tot een maximale intensiteit van 3,0 mA om onomkeerbare perifere zenuwbeschadiging te voorkomen.
Met dezelfde stimulatieintensiteit die de maximale H-reflex (Hmax) opriep, werden pulsstimuli van verschillende frequenties (0,3, 5 en 10 Hz) geleverd om H-reflexamplitudes bij verschillende stimulatiefrequenties te verkrijgen. Herhaalde pulsstimulatie bij 0,3 Hz werd toegepast om te verifiëren dat de M-golf amplitude binnen 95% van de oorspronkelijke waarde bleef; anders werd de dataset weggegooid. H-reflex frequentie-afhankelijke depressie (FDD) werd berekend als het percentage van de H-golf/M-golf amplitudeverhouding (H/M-verhouding) bij 5 Hz en 10 Hz ten opzichte van die bij 0,3 Hz, waarbij de H/M-verhouding bij 0,3 Hz als basisreferentie10 diende.
Data-analyse
Statistische analyses werden uitgevoerd met SPSS-software (versie 20.0). Continue gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). De normaliteit van de gegevens werd beoordeeld met behulp van de Shapiro–Wilk-test. Eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) werd gebruikt om conventionele beeldvormingsuitkomsten en andere kwantitatieve variabelen tussen groepen te vergelijken. Wanneer aan homogeniteit van variantie werd voldaan, werden Bonferroni post hoc-tests uitgevoerd; anders werd Dunnetts T3-test toegepast. Gedragsgegevens werden geanalyseerd met tweerichtings-ANOVA waarbij de experimentele groep en het postoperatieve tijdstip vaste factoren waren. Spearman-correlatieanalyse werd gebruikt om associaties tussen studievariabelen te evalueren. Een waarde van p < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.