Zuogui-pil moduleert de osteoblast-osteoclastkoppeling bij ovariectomeren ratten: een driefactorieel onderzoek naar drie variabelen

Samenvatting

Deze studie evalueert de effecten van Zuogui Pill op postmenopauzale osteoporose bij ovariectomiseerde ratten met behulp van een drie-bij-drie factorieel ontwerp. De resultaten ondersteunen synergetische effecten van Yin- en Yang-componenten op het botmetabolisme en bijbehorende markers van het EphB4/ephrinB2-pad, hoewel het mechanistische bewijs associatief blijft in plaats van causaal.

Samenvatting

Postmenopausale osteoporose wordt aangedreven door een ontkoppeling van botvorming en botresorptie die geassocieerd is met oestrogeentekort. Deze studie kwantificeerde de onafhankelijke en interactieve effecten van Yin-voedende subformuleringen van de Zuogui-pil in een ovariëctomieratmodel en onderzocht de associaties met het EphB4/ephrinB2/RhoA/alkalische fosfatase-pad. In overeenstemming met ARRIVE 2.0 werden 130 specifieke pathogeenvrije vrouwelijke Sprague-Dawley ratten gerandomiseerd over 13 groepen (n=10/groep), waaronder negen groepen in een drie-bij-drie factorieel ontwerp. Eindpunten omvatten P1NP, CTX-1, femorale botmineraaldichtheid gemeten via dual-energy X-ray absorptiometry (DXA), trabeculaire histologie, en de expressie van messenger-ribonuclezuur en eiwitten gemeten door reverse transcription quantitative polymerase chain reaction en Western blotting. De volledige formulering (I2A2) was geassocieerd met een hogere P1NP, lagere CTX-1 en een hogere BMD dan de modelgroep. Factoriele analyse identificeerde een Yin-Yang interactie tussen P1NP en BMD, wat wijst op farmacologische synergie. Moleculaire veranderingen waren geassocieerd met een verhoogde EphB4/ephrinB2/ALP-expressie en een verminderde RhoA-expressie. Deze bevindingen ondersteunen een associatie tussen behandeling met de Zuogui-pil, verbeterde botfenotypen en modulatie van padmarkers; causale afhankelijkheid van het pad vereist validatie via inhibitoren, knockdown en co-cultuur.

Inleiding

Postmenopauzale osteoporose (PMOP) treft een grote populatie vrouwen en wordt gekenmerkt door een verstoring van de balans tussen botvorming en botresorptie als gevolg van oestrogeentekort^1,2. Het EphB4/ephrinB2 receptor-ligandsysteem medieert de communicatie tussen osteoblasten en osteoclasten; EphB4-signalering ondersteunt de differentiatie van osteoblasten en de activiteit van alkalische fosfatase (ALP), terwijl reverse signaling van ephrinB2 de osteoclastogenese kan remmen via RhoA-gerelateerde mechanismen^3,4. De verminderde koppeling in bot bij oestrogeentekort biedt een mechanistische rationale voor het evalueren van interventies die beide cellulaire armen van de remodellering beïnvloeden.

Huidige therapieën tegen osteoporose, waaronder antiresorptieve en anabole middelen, verminderen het risico op fracturen, maar kunnen worden beperkt door therapietrouw, kosten, contra-indicaties, rebound-effecten of bijwerkingen bij langdurig gebruik⁵. Daarom blijven kandidaatbehandelingen die de botvorming verbeteren terwijl overmatige resorptie wordt beperkt, wetenschappelijk relevant.

Zuogui Pill (ZGP; Zuo Gui Wan) is een klassiek recept met meerdere componenten dat in de traditionele Chinese geneeskunde wordt gebruikt bij een tekort aan nier-essentie, een theoretisch patroon dat wordt geassocieerd met botzwakte. De Yin-voedende componenten omvatten Rehmannia glutinosa (bereide wortel, Shu Di Huang, 24 g), Dioscorea opposita (wortelstok, Huai Shan Yao, 12 g), Cornus officinalis (vrucht, Shan Zhu Yu, 12 g), Lycium barbarum (vrucht, Gou Qi Zi, 12 g), Chinemys reevesii plastron-gelatine (uit het plastron afgeleide gelatine, Gui Ban Jiao, 12 g) en Cyathula officinalis (wortel, Chuan Niu Xi, 9 g). De Yang-versterkende componenten omvatten Cuscuta australis (zaad, Tu Si Zi, 12 g) en Cervus elaphus gewelgelatine (uit gewei afgeleide gelatine, Lu Jiao Jiao, 12 g). Volgens de klassieke theorie voorspelt het principe van het zoeken naar Yang binnen Yin dat Yang-versterkende kruiden een Yin-voedende basis kunnen potentieren in plaats van enkel als onafhankelijke additieven te fungeren. Klinisch bewijs en preklinische studies hebben anti-osteoporotische activiteit gerapporteerd van ZGP of interventies die ZGP bevatten, inclusief effecten op de BMD, osteogenese en farmacokinetisch gedrag^6,7,8,9,10.

De nieuwheid van deze studie ligt in de formele drie-bij-drie factoriële scheiding van Yin-voedende en Yang-versterkende componenten bij ovariëctomeriseerde (OVX) ratten, met gelijktijdige beoordeling van botfenotypes en markers van het EphB4/ephrinB2/RhoA/ALP-pad. Dit ontwerp test de theorie over formulacompatibiliteit directer dan studies die enkel de volledige voorschriften of een enkele comparator gebruiken, waarbij wordt erkend dat veranderingen in padmarkers associatief blijven tenzij ze mechanistisch worden geblokkeerd of uitgeschakeld¹.

Protocol

Alle procedures in deze studie zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Inner Mongolia Medical University (Goedkeuringsnr. YKD202404105) en zijn uitgevoerd in overeenstemming met ARRIVE 2.0¹².

Studieopzet

De studie werd uitgevoerd op het dierproefplatform van de Inner Mongolia Medical University. Er werd gebruikgemaakt van een drie-bij-drie volledig factorieel ontwerp met twee factoren: een Yin-voedende basisformulering (I; drie doseringsniveaus: 0, 27, 54 g ruw drugsequivalent) en een Yang-versterkende formulering (A; drie doseringsniveaus: 0, 8, 16 g ruw drugsequivalent), wat resulteerde in negen factoriële cellen plus vier referentiegroepen. Het factoriële ontwerp is weergegeven in Tabel 1. I2A2 vertegenwoordigt de volledige ZGP-formule bij de klinisch equivalente dosis. Voor de dosisconversie werd de methode van het lichaamsoppervlak gebruikt (rat: mens factor = 6,25)¹³.

Dieren, randomisatie en blindering

Honderd dertig specifieke pathogeenvrije vrouwelijke Sprague-Dawley ratten (6 maanden oud, 20–250 g) werden toegewezen aan groepen via een door de computer gegenereerde willekeurige getallentabel. Toewijzingscodes werden in opeenvolgend verzegelde enveloppen geplaatst door een onderzoeker die niet betrokken was bij de beoordeling van de uitkomsten. De ratten werden met 3–4 per geventileerde kooi gehuisvest onder een licht-/donkercyclus van 12 h bij 2 ± 2 ^oC en 50–60% luchtvochtigheid, met ad libitum water, standaard knaagdiervoer met gedocumenteerd calcium- en fosforgehalte, kooi-activiteit en omgevingsverrijking. Moleculaire analyses, histologische scoring, beeldkwantificering en densitometrie werden uitgevoerd door onderzoekers die blind waren voor de toewijzing. De steekproefomvang werd bepaald door een a priori poweranalyse, resulterend in n = 10 per groep.

OVX-model en medicamenteuze behandeling

Bilaterale OVX werd uitgevoerd onder inhalatie van isofluraan, toegediend via een precisieverdamper. De anesthesie werd geïnduceerd bij 3–4% in zuurstof en in stand gehouden bij 1,5–2,5% via een neusmasker. De adequate diepte van de anesthesie werd bevestigd door het verlies van de pedaalreflex en de palpebrale reflex bij een stabiele ademhaling. Het succes van de OVX werd geëvalueerd op basis van de afwezigheid van vaginale oestruscycli op dag 5 en een afname van de BMD 12 weken na de operatie. Na validatie van het model werd gedurende 8 weken een behandeling via gavage toegediend (1 mL/10 g/dag). Decocten werden bereid door opeenvolgende waterextractie bij een rollend kookpunt (10 °C, reflux), 10x het volume gedurende 2 u, gevolgd door 8x het volume gedurende 1,5 u, gefilterd door vier lagen medisch gaas en geconcentreerd onder verlaagde druk tot 0,968 g ruw drug/mL. Het geconcentreerde extract werd bewaard bij 4 °C en binnen 7 dagen na bereiding gebruikt. De positieve controles waren Gusukang-granules (1,8 g/kg/dag) en diethylstilbestrol (0,04 mg/kg/dag). Bij beëindiging werden de ratten diep geanestheseerd met 5% isofluraan tot het verlies van de pedaal- en corneale reflexen, waarna ze werden geëxanguineerd en onderworpen aan cervicale dislocatie. De dood werd bevestigd door het staken van de hartslag en de ademhaling. Karkassen en weefsels werden afgevoerd als biologisch afval; chemische residuen werden afgevoerd als gevaarlijk afval; en naalden of mesjes werden geplaatst in goedgekeurde naaldencontainers.

Uitkomstmaten

Serum P1NP en CTX-1 werden gemeten via sandwich ELISA (Jiyinmei)¹⁴. De femorale BMD werd gekwantificeerd met DXA. Trabeculaire histologie werd beoordeeld met hematoxyline- en eosinekleuring bij 200x. Genexpressie werd bepaald met RT-qPCR volgens de 2^-ΔΔCt methode, genormaliseerd naar glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH). Proteinexpressie werd beoordeeld via Western blot en ImageJ-kwantificatie (zie Tabel met materialen). De waargenomen molecuulgewichten en catalogusinformatie van de antilichamen zijn opgenomen in Aanvullende tabel 1. De primersequenties waren: EphB4 forward/reverse, 5'-CTAGACTCTTTCCTGCGGCT/GGGAACTTGTGTAGGTGGGA-3'; ephrinB2, 5'-CGGACAAGGCCTGGTACTAT/ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT-3'; RhoA, 5'-GTTTATGTGCCCACGGTGTT/ACTATCAGGGCTGTCGATGG-3'; ALP, 5'-CGGACACAAGCATTCCCAGA/TGGTGGAGCTGAACAGGCTT-3'; GAPDH, 5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC/TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'.

Statistische analyse

De normaliteit werd beoordeeld met de Shapiro-Wilk-toets en de homogeniteit van de variantie werd beoordeeld met de Levene-toets voorafgaand aan de parametrische analyse. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD, en alle foutenbalken in de kwantitatieve figuren duiden de SD aan. Een twee-weg factoriële ANOVA werd toegepast op de negen factoriële cellen om de hoofdeffecten en de I by A-interactie te schatten, met de partiële eta-kwadraat (ηp²) als effectgrootte. Paarsgewijze vergelijkingen tussen alle 13 groepen werden uitgevoerd met behulp van een één-weg ANOVA met Bonferroni-correctie. Statistische analyses werden uitgevoerd in GraphPad Prism. Significantiesymbolen zijn consistent als volgt gedefinieerd: *, **, ***, **** duiden p <0.05, p <0.01, p <0.01, p <0.001 aan ten opzichte van het model; #, ##, ###, #### duiden dezelfde drempelwaarden aan ten opzichte van full-formula ZGP.

Resultaten

Modelvalidatie via vaginaal cytologisch onderzoek

Het succes van de OVX werd bevestigd bij alle ovariectomieste dieren, wat bleek uit het wegvallen van de oestruscyclus binnen 5 dagen na de operatie (Figuur 1A), terwijl de sham-geopereerde dieren een cyclus van 4 dagen behielden (Figuur 1B). Na 12 weken toonde DXA een lagere femorale BMD aan in de OVX-modelgroep dan in de sham-controles (0,214 ± 0,020 vs. 0,281 ± 0,01...

Discussie

De factoriële interactieterm ondersteunt een niet-additieve relatie tussen de Yin-voedende en Yang-versterkende componenten van ZGP. Dit resultaat is consistent met het traditionele principe van het zoeken naar Yang binnen Yin, waarbij wordt verwacht dat Yang-versterkende componenten de Yin-voedende basis activeren of potentiëren¹⁵. De bevinding moet worden geïnterpreteerd als farmacologische synergie op formuleringsniveau. Het identificeert niet de individuele actieve bestanddelen die verantwoord...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1% ammoniakwater	N/A	N/A	Blauwingsoplossing na hematoxylinedifferentiatie.
1% zoutzuuralcohol	N/A	N/A	Differentiatieoplossing voor hematoxylinkleuring.
2x qPCR Mix	N/A	N/A	Kwantitatieve PCR mastermix. Bronreactievolume: 12.5 µL per reactie.
4% paraformaldehyde-oplossing	N/A	N/A	Fixatie van linker femur- en tibiasamples voor histologische analyse.
5x laadbuffer	N/A	N/A	Denaturatie van samples voor elektroforese.
ALP primair antilichaam	Affinity Biosciences	N/A	Western blot antilichaam. Bronverdunning: 1:200. RRID en lotnummer vereist voor JoVE.
ALP primerpaar	N/A	N/A	ALP mRNA werd gemeten via qRT-PCR, maar de oorspronkelijke primertabel bevat geen ALP primersequenties. Bevestiging van de auteur is vereist.
Biotine-antilichaamreagens	Supplied with ELISA kit, Jiyinmei	Kit component	Toegevoegd aan sample-wells tijdens de ELISA.
Cervus elaphus gewei-gelatine, Lu Jiao Jiao	Beijing Tongrentang	N/A	Yang-versterkend component. Volledige dosis formule in bron: 12 g, ratio 4. Gelatine werd gesmolten in het decoct.
Chinemys reevesii plastron-gelatine, Gui Ban Jiao	Beijing Tongrentang	N/A	Yin-voedend component. Volledige dosis formule in bron: 12 g, ratio 4. Gelatine werd gesmolten in het decoct.
Chloroform	N/A	N/A	Fasescheiding tijdens RNA-extractie.
Koelplateau	Leica	1150	Cryo- of koelondersteuning voor de coupesnel-workflow.
Cornus officinalis, Shan Zhu Yu	Beijing Tongrentang	N/A	Yin-voedend component. Volledige dosis formule in bron: 12 g, ratio 4.
Cuscuta australis, Tu Si Zi	Beijing Tongrentang	N/A	Yang-versterkend component. Volledige dosis formule in bron: 12 g, ratio 4.
Cyathula officinalis, Chuan Niu Xi	Beijing Tongrentang	N/A	Yin-voedend component. Volledige dosis formule in bron: 9 g, ratio 3.
DEPC-behandelde PBS	N/A	N/A	Afspoelen van L4 tot L5 lumbale wervels vóór vriesdrogen in vloeibare stikstof.
Diethylstilbestrol	N/A	N/A	Positieve controle van de westerse geneeskunde. Brondosis: 0.04 mg/kg/dag, 1 mL/10 g/dag. Het brondocument bevat ook een inconsistentie in de Chinese nomenclatuur die geharmoniseerd moet worden als diethylstilbestrol.
Dioscorea opposita, Huai Shan Yao	Beijing Tongrentang	N/A	Yin-voedend component. Volledige dosis formule in bron: 12 g, ratio 4.
dNTP-mengsel	N/A	N/A	Inbegrepen in de reverse transcriptie-reactie.
ECL chemiluminescentie-reagens	N/A	N/A	Western blot detectiereagens.
ELISA chromogeen reagens A	Supplied with ELISA kit, Jiyinmei	Kit component	Kleurontwikkelingsreagens voor ELISA.
ELISA chromogeen reagens B	Supplied with ELISA kit, Jiyinmei	Kit component	Kleurontwikkelingsreagens voor ELISA.
ELISA stopoplossing	Supplied with ELISA kit, Jiyinmei	Kit component	Gebruikt om de ELISA-kleurreactie te beëindigen.
Enzym-gelabeld ELISA-reagens	Supplied with ELISA kit, Jiyinmei	Kit component	Toegevoegd aan niet-blanke wells in de ELISA.
EphB4 primair antilichaam	Proteintech	N/A	Western blot antilichaam. Bronverdunning: 1:20. RRID en lotnummer vereist voor JoVE.
EphB4 primerpaar	N/A	PCR product 232 bp	Forward CTAGACTCTTTCCTGCGGCT; Reverse GGGAACTTGTGTAGGTGGGA. Typefout in brontabel Rat RphB4 moet Rat EphB4 zijn.
ephrinB2 primair antilichaam	Affinity Biosciences	N/A	Western blot antilichaam. Bronverdunning: 1:200. RRID en lotnummer vereist voor JoVE.
ephrinB2 primerpaar	N/A	PCR product 172 bp	Forward CGGACAAGGCCTGGTACTAT; Reverse ACAGTTGAGCAGTGGGGTAT.
Ethanol, absoluut en gegradeerd 95%, 85%, 75%	N/A	N/A	Gradiënt dehydratie en rehydratie tijdens hematoxyline- en eosinkleuring.
Vrouwelijke Sprague-Dawley ratten	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	Animal certificate and license number not supplied in source article	Specifiek pathogeen-vrij, 6 maanden oud, gezonde niet-drachtige vrouwtjes. Chinese bron vermeldt 230 tot 270 g; eerdere Engelse conceptversie vermeldt 20 tot 250 g. Verifieer het uiteindelijke bereik vóór indiening.
GAPDH primair antilichaam	Servicebio	N/A	Loading-control antilichaam. Bronverdunning: 1:20. RRID en lotnummer vereist voor JoVE.
GAPDH primerpaar	N/A	PCR product 253 bp	Forward ACAGCAACAGGGTGGTGGAC; Reverse TTTGAGGGTGCAGCGAACTT.
GraphPad Prism software	GraphPad Software	Version 9.4.1; RRID:SCR_02798	Statistische analyse en grafieken. Normaliteit, variantie-homogeniteit, ANOVA, Bonferroni-correctie en effectgroottes moeten in de outputbestanden worden behouden.
Gusukang granula	Liaoning Wohua Kangchen Pharmaceutical Co., Ltd.	N/A	Positieve controle van Traditionele Chinese Geneeskunde. Brondosis: 1.8 g/kg/dag of 0.5 mL/10 g/dag.
Hematoxyline-kleuroplossing	Zhuhai Beisuo Biotechnology Co., Ltd.	N/A	Histologische kleuring. Bronprocedure gebruikte 5 min hematoxylinkleuring.
Hogesnelheidsmicrocentrifuge	N/A	TG16W	Centrifugatie voor serum- en nucleïnezuurprocedures.
Hologic dual-energy röntgenabsorptiometer	Hologic	N/A	Analyse van de botmineraaldichtheid. Bron rapporteert in vivo en ex vivo femurscans.
ImageJ software	National Institutes of Health	RRID:SCR_03070	Densitometrische kwantificering voor Western blot banden. Versie niet vermeld in het bronartikel.
Inductiekookplaat	Midea	N/A	Vermeld in de instrumententabel van de Chinese bron.
Isofluraan	N/A	N/A	Anesthesie voor bilaterale ovariectomie en DXA-positionering. Het herziene protocol moet inductie, onderhoud, toedieningsroute en criteria voor anesthesiediepte specificeren.
Isopropanol	N/A	N/A	RNA-precipitatie tijdens extractie.
Vloeibare stikstof	N/A	N/A	Snelbevriezen van lumbale wervelsamples.
Lycium barbarum, Gou Qi Zi	Beijing Tongrentang	N/A	Yin-voedend component. Volledige dosis formule in bron: 12 g, ratio 4.
Microplate-lezer	N/A	AMR-10	ELISA-absorptiedetectie bij 450 nm.
Microplate-wasser	N/A	APW-20	Wasstap voor ELISA-plates.
MMLV reverse transcriptase	N/A	N/A	Reverse transcriptie-enzym.
Neutraal montagemedium	Sinopharm Group	N/A	Montage medium voor met hematoxyline en eosine gekleurde coupes.
Normaal zoutoplossing	N/A	N/A	Voertuig via gavage voor blanco controle, sham-geopereerde en modelgroepen.
Oligo(dT)18 primer	N/A	N/A	Gebruikt voor reverse transcriptie.
Penicilline	N/A	N/A	Postoperatieve infectieprofylaxe. Brondosis: 20,0 U/kg intramusculair gedurende 3 dagen.
Snelkookpan	Xinfei	N/A	Vermeld in de instrumententabel van de Chinese bron.
Proteaseremmer	N/A	N/A	Toegevoegd tijdens proteïne-extractie.
Proteïne-lysisbuffer	N/A	N/A	Proteïne-extractie uit botweefsel voor Western blotting.
PVDF-membraan	N/A	N/A	Western blot transfermembraan geactiveerd met methanol.
qRT-PCR instrument	N/A	N/A	Kwantitatieve reverse transcriptie PCR voor EphB4, ephrinB2, RhoA, ALP en GAPDH.
Rat CTX-1 ELISA kit	Jiyinmei	JYM026Ra	Sandwich ELISA voor serum C-terminaal telopeptide van type 1 collageen. Detectie bij 450 nm.
Rat P1NP ELISA kit	Jiyinmei	JYM030Ra	Sandwich ELISA voor serum procollageen type 1 N-terminaal propeptide. Detectie bij 450 nm.
Rehmannia glutinosa, Shu Di Huang	Beijing Tongrentang	N/A	Yin-voedend component. Volledige dosis formule in bron: 24 g, ratio 8.
RhoA primair antilichaam	Proteintech	N/A	Western blot antilichaam. Bronverdunning: 1:20. RRID en lotnummer vereist voor JoVE.
RhoA primerpaar	N/A	PCR product 17 bp	Forward GTTTATGTGCCCACGGTGTT; Reverse ACTATCAGGGCTGTCGATGG. Terminologie geharmoniseerd van RHoA naar RhoA.
RNase-remmer	N/A	N/A	Inbegrepen in de reverse transcriptie-reactie.
RNase-vrij water	N/A	N/A	RNA-oplossing na drogen.
Rotatiemicrotoom	Leica	245	Histologische coupesnijding.
Secundair antilichaam voor Western blotting	N/A	N/A	Bronverdunning: 1:150. Hostreactiviteit en RRID vereist voor JoVE.
Magere melkpoeder, 5%	N/A	N/A	Blokkeringsreagens voor Western blotting, kamertemperatuur gedurende 2 u.
Slide-spreid- en bakmachine	Jinhua Yidi	N/A	Preparatie van coupes voor histologie.
Natrium-pentobarbital, 3%	N/A	N/A	Terminale anesthesie vóór bloedafname uit de abdominale aorta in het Chinese brondocument. De uiteindelijke euthanasieprocedure en bevestigingsmethode moeten worden geverifieerd.
Standaard sample-verdunner	Supplied with ELISA kit, Jiyinmei	Kit component	Gebruikt voor seriële standaardverdunning in de ELISA-procedure.
TBST-buffer	N/A	N/A	Wasbuffer voor Western blotting.
Thermostatische schudincubator	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.	N/A	Laboratoriumincubatie en schudden.
TRIzol reagens	N/A	N/A	RNA-extractie uit 10 mg botweefsel.
Rechtopstaande microscoop	Leica	DM100	Hematoxyline- en eosine-histologische beeldvorming bij 20x.
Watermantel-thermostatische incubator	N/A	GNP-9080	Incubatie voor assay-procedures.
Wateroplosbare eosine-kleuroplossing	Zhuhai Beisuo Biotechnology Co., Ltd.	N/A	Histologische tegenkleuring. Bronprocedure gebruikte 3 min eosinkleuring.
Western blot elektroforesesysteem	N/A	N/A	Proteïnescheiding. Bron-elektroforese: aanvankelijk 80 V, daarna 120 V.
Western blot beeldvormingssysteem	N/A	N/A	Chemiluminescente membraanbeeldvorming. Niet-bijgesneden membranen vereist voor indiening.
Western blot transfersysteem	N/A	N/A	Proteïne-transfer naar PVDF-membraan. Bron-transferconditie: 40 mA, 90 min, ijsbad.
Xyleen	N/A	N/A	Ontparaffineren en weefselklaarmaken tijdens histologie.
Zuogui Pill component kruiden	Beijing Tongrentang	N/A	Formulering van acht kruiden: Rehmannia glutinosa, Dioscorea opposita, Cornus officinalis, Lycium barbarum, Chinemys reevesii plastron-gelatine, Cyathula officinalis, Cuscuta australis en Cervus elaphus gewei-gelatine.