Methodenartikel

Functionele reconstitutie van mitochondriale respiratoire supercomplexen

72 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/72243

⸱

21 augustus 2026

 ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of California, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Biomedicine Discovery Institute, Monash University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Wij presenteren een eenvoudig protocol voor het reconstitueren van functionele mitochondriale respiratoire supercomplexen in goed gedefinieerde proteoliposomen voor gecorreleerde structurele en functionele karakterisering.

Samenvatting

Mitochondriën zijn centrale knooppunten in het bioenergetisch metabolisme en vormen de primaire bron van ATP. Het binnenste mitochondriale membraan bevat het oxidatieve fosforyleringssysteem, dat elektronentransportketencomplexen omvat (CI, CII, CIII2en CIV) en de ATP-synthase (CV). Bij zoogdieren zijn CI, CIII2, en CIV vormen hogere-orde structuren genaamd supercomplexen (SC's), zoals SC I+III2+IV, SC I+III2, en SC III2+IV. Hoewel de fysiologische factoren die de vorming van SC's bevorderen onduidelijk blijven, is voorgesteld dat SC-vorming de elektronenoverdrachtssnelheden tussen complexen kan verhogen, de productie van reactieve zuurstofcomponenten kan verminderen of aspecifieke eiwitaggregatie binnen het dichtgepakte binnenmembraan van de mitochondriën kan voorkomen. Structurele en functionele studies naar respiratoire SC's hebben sterk geleund op met detergentten geëxtraheerde complexen. Hoewel deze studies ons begrip van de elektronentransportketen hebben verbeterd, beperkt het ontbreken van een gesloten membraandubbellaag de mogelijkheid om de functionele voordelen van supercomplex-assemblage te onderzoeken. Recente vorderingen hebben echter aangetoond dat membraaneiwitten structureel gekarakteriseerd kunnen worden in gereconstitueerde, natuurgetrouwe membraanomgevingen, wat een meer fysiologische context biedt voor deze onderzoeken. Hier presenteren wij een eenvoudig, snel en reproduceerbaar protocol voor het reconstitueren van respiratoire SC's in liposomen. Deze methode maakt het mogelijk om de effecten van variërende lipidsamenstellingen, eiwitconcentraties en membraanpotentiaal op de functie van respiratoire SC's te testen, wat een waardevol instrument biedt voor toekomstige mechanistische studies.

Inleiding

Mitochondriën zijn centraal voor de eukaryote respiratie. Het binnenste mitochondriale membraan (IMM) herbergt het oxidatieve fosforyleringssysteem, bestaande uit de complexen van de elektronentransportketen (CI–CIV) en ATP-synthase (CV)1. CI en CII dragen elektronen over van gereduceerde substraten naar ubiquinon (CoQ), waarbij ubiquinol (CoQH2) wordt gevormd; dit geeft elektronen door via CIII2 en via cytochroom c naar CIV, waar zuurstof wordt gereduceerd tot water. Protonpomping door CI, CIII2 en CIV vestigt de protonmotieve kracht (PMF), die door CV wordt gebruikt om ATP te synthetiseren uit ADP en anorganisch fosfaat (P)1.

Naast het onafhankelijk functioneren kunnen CI, CIII2 en CIV zich assembleren tot hoger-orde supercomplex (SC) structuren met gedefinieerde stoichiometrieën, zoals SC I+III2+IV (ook bekend als het respirasoom), SC I+III2 en SC III2+IV2,3,4,5. De functionele voordelen van deze assemblage's blijven onduidelijk6. Hypotheses over hun functie variëren van rollen bij assemblage en substraatchanneling tot het zijn van een bijproduct van de hoge eiwitdichtheid in het binnenste mitochondriale membraan (IMM)3,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Recente studies suggereren dat membraaneigenschappen, waaronder membraanspanning geïnduceerd door hydrofobe mismatch, eiwit-eiwitinteracties en eiwit-lipide-interacties, bijdragen aan de vorming en stabiliteit van SC16.

Structurele en functionele studies van membraaneiwitten waren traditioneel afhankelijk van met detergent gesolubiliseerde complexen, die de natuurlijke membraanomgeving verstoren en het onderzoek naar processen die afhankelijk zijn van membraanpotentiaal en iongradiënten beperken. In tegenstelling hiermee tonen recente vorderingen aan dat membraaneiwitten structureel gekarakteriseerd kunnen worden in gereconstitueerde17,18,19 of natuurlijke membranen20,21,22,23, wat ons vermogen om de functionele mechanismen van membraaneiwitten die afhankelijk zijn van membraanpotentiaal en iongradiënten te onderzoeken aanzienlijk verbetert.

Dit protocol beschrijft een eenvoudige en reproduceerbare methode voor het reconstitueren van mitochondriale respiratoire supercomplexen (SCs) in gedefinieerde proteoliposomen. Het resulterende systeem biedt een krachtig platform voor het onderzoeken van fundamentele vragen met betrekking tot de vorming, stabiliteit en functie van respiratoire SCs in een gecontroleerde, natuurgetrouwe membraanomgeving. Door CoQ10 en cytochroom c toe te voegen tijdens de reconstitutie, tonen we aan dat de in proteoliposomen gereconstitueerde SCs NADH-gestuurde zuurstofconsumptie ondersteunen, wat aangeeft dat de complexen functioneel competent blijven binnen de lipide dubbellaag. We tonen verder aan dat SCs in proteoliposomen gemakkelijk gevisualiseerd kunnen worden met cryogene elektronenmicroscopie (cryo-EM), waardoor een directe correlatie mogelijk is tussen de structurele organisatie en de biochemische activiteit.

Hoewel de methode robuust en gemakkelijk reproduceerbaar is, hangt een succesvolle reconstitutie af van zorgvuldige optimalisatie van de lipidensamenstelling, de detergentconcentratie, de proteïne-lipideverhouding en een efficiënte membransealing om de stabiliteit en activiteit van supercomplexen te behouden.

Het algemene doel van deze methode is om geïntegreerde structurele en functionele analyse van respiratoire SC's mogelijk te maken onder gedefinieerde membraanomstandigheden. Deze aanpak pakt belangrijke beperkingen van detergent-gebaseerde systemen aan door SC's te herstellen in een afgesloten lipide dubbellaag die de vorming van een membraanpotentiaal en fysiologisch relevante eiwit-lipide-interacties kan ondersteunen. Bovendien maakt het systeem een nauwkeurige controle over de lipidecompositie, cofactoren en eiwitgehalte mogelijk, waardoor het zeer geschikt is voor systematisch testen van hoe membraaneigenschappen de stabiliteit en activiteit van SC's beïnvloeden. In vergelijking met detergent-gesolubiliseerde preparaten of in situ benaderingen biedt deze methode het duidelijke voordeel dat functionele assays, zoals NADH-gestuurde zuurstofconsumptie, kunnen worden gecombineerd met cryo-EM-gebaseerde structurele analyse, waardoor structuur-functiecorrelaties mogelijk worden die met andere systemen moeilijk te bereiken zijn.

Protocol

Mitochondriale membranen uit varkenshart werden geïsoleerd uit commercieel aangeschaft hart weefsel, geoogst van dieren die waren geslacht voor menselijke consumptie. Er zijn geen levende dieren specifiek voor dit protocol gebruikt. Het gebruik van dit materiaal werd bepaald als vrijgesteld van ethische goedkeuring voor dierproeven, omdat het weefsel werd verkregen als bijproduct van dieren die waren geslacht voor menselijke consumptie.

1. Zuivering van mitochondriaal supercomplex SC I+III2/SC I+III2+IV uit gewassen membranen van mitochondriën uit varkenshart

  1. Ontdooi 40 mg (4 mL) gewassen mitochondriale membranen als aliquots van 10 mg/mL (de gewassen membranen zijn voorbereid zoals eerder beschreven24,25).
  2. Verdun de membranen in 4 mL Buffer MX (30 mM HEPES, pH 7,7, 150 mM kaliumacetaat, 10% glycerol, 1 mM EDTA, 0,002% (w/v) fenylmethylsulfonylfluoride, 0,1% (w/v) CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonaat), 1 mM kaliumferricyanide). Voeg 8 mL 2% (w/v) digitonine in Buffer MX toe (160 mg digitonine in 8 mL; uiteindelijke ratio 4:1, (mg digitonine: mg totaal membraaneiwit). Het uiteindelijke volume is 16 mL.
  3. Homogeniseer handmatig in een Dounce-homogenisator (50 slagen), waarbij u voorzichtig voorkomt dat er bellen ontstaan. Incubeer (rol) gedurende 1 u bij 4 °C.
  4. Centrifugeer het homogenaat bij 16.000 × g, 4 °C gedurende 30 min. Verzamel het supernatant.
  5. Concentreer het supernatant tot 1 mL met een centrifugeerfilter-concentrator met een 100 kDa cut-off bij 3000 × g, 4 °C. Concentreer in cycli van 10 min, waarbij tussen de centrifugatiestappen goed wordt gemengd, totdat het gewenste volume is bereikt (monsters hebben de neiging te aggregeren als ze niet tussen de spin-cycli worden geresuspendeerd vanwege de verhoogde lokale concentratie van het detergent nabij het filter).
  6. Verdeel het geconcentreerde monster in vier aliquots van 250 µL. 
  7. Equilibreer de size-exclusion chromatografiekolom (kolumvolume: 24 mL) met size-exclusion chromatografiebuffer (SEC-buffer; 30 mM HEPES pH 7,8, 150 mM kaliumacetaat, 1 mM EDTA, 0,005% glycosidedetergent) gedurende 48 mL (2 kolumvolumes).
  8. Stel het chromatografieprogramma zo in dat er fracties van 1 mL worden verzameld, beginnend bij een elutievolume van 6 mL en doorgaand tot een elutievolume van 24 mL. Injecteer een aliquot van 250 µL (uit stap 1.6) op een 24 mL size-exclusion chromatografie-hars. Gebruik de kolom die is vooraf geëquilibreerd met size-exclusion chromatografiebuffer (uit stap 1.7). Verzamel de fracties uit de fractioneerder voordat u de volgende run start.
  9. Herhaal stappen 1.7 en 1.8 voor de overige geconcentreerde aliquots uit stap 1.6.
  10. Run 10 µL van elke fractie uit de SEC-runs, gemengd met 5 µL blue-native polyacrylamidegelelektroforese (BN-PAGE) laadkleurstof, op een 3%–12% acrylamidegradiënt en voer een NADH/Nitro tetrazoliumbluechloride CI in-gel activiteitsassay uit26  om de fracties op CI-activiteit te controleren. 
    OPMERKING: Respiratoire SC's elueren uit het 24 mL cross-linked agarose gelfiltratiemedium bij een elutievolume van ongeveer 11,5 mL.
  11. Voeg de fracties samen die de maximale hoge MW CI-activiteit vertonen in de CI in-gel activiteitsassay. Concentreer het monster zoals beschreven in 1.5 hierboven.
    OPMERKING: De geconcentreerde SC's in een glycosidedetergent glyco-diosgenine GDN kunnen worden bewaard met 30% (v/v) glycerol bij een uiteindelijke concentratie van ongeveer 10 mg/mL in vloeibare N2. 40 mg gewassen mitochondriaal complex leverde 3,4 mg totaal eiwit op op basis van een BCA-assay.

2. Bereiding van het lipidemengsel

OPMERKING: Gewijzigd ten opzichte van eerder beschreven protocollen27,28. Chloroform is toxisch, vluchtig en een vermoedelijk carcinogeen. Hanteer dit uitsluitend in een gecertificeerde chemische zuurkast met geschikte PBM. Pentaan is zeer brandbaar. Houd dit uit de buurt van ontstekingsbronnen. Hanteer dit uitsluitend in een gecertificeerde chemische zuurkast met geschikte PBM. Voer organisch oplosmiddelafval af in goedgekeurde gehalogeneerde/niet-gehalogeneerde oplosmiddelafvalcontainers volgens de institutionele EH&S-richtlijnen.

  1. Bereid in een zuurkast afzonderlijk stockoplossingen van 25 mg/mL van POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine), POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine) en CL (cardiolipine: 1,3-bis(sn-3’-fosfatidyl)-sn-glycerol; uit rundenhartweefsel) in chloroform. 
  2. Bereid 10 mM CoQ10 in chloroform. Voeg voor 25 mg totale lipidemix 0,4 mL (10 mg) POPC, 0,4 mL (10 mg) POPE, 0,2 mL (5 mg) CL en 50 µL van 10 mM CoQ10 (eindconcentratie 500 nmol CoQ10 (20 nmol CoQ10/mg lipide) vanuit de stockoplossingen) toe aan een glazen reageerbuis van 13 mL. De uiteindelijke gewichtsverhouding van POPC:POPE:CL is 2:2:1.
  3. Droog het mengsel onder een stroom inert gas (argon of stikstof) om de chloroform te verwijderen, terwijl de buis voorzichtig wordt gedraaid om een dunne laag van het lipidemengsel langs de wanden van de buis te vormen. Droog gedurende 10 min met een constante stroom inert gas.
  4. Los de gedroogde lipidelaag opnieuw op in 1 mL pentaan en herhaal stap 2.3 om de verwijdering van resterende chloroform te vergemakkelijken.
  5. Incubeer de buis met gedroogde lipiden in een vacuümdesiccator bij kamertemperatuur gedurende de nacht om de oplosmiddelen volledig te verwijderen. 
  6. Voeg 5 mL Proteoliposoom Buffer (PLB; 10 mM MOPS pH 7.4, 150 mM KCl) toe om de lipidemix te rehydrateren, sluit de buis stevig af om morsen te voorkomen en vortex voorzichtig totdat de lipiden volledig zijn gesolubiliseerd (gedroogde lipiden zijn niet langer zichtbaar op het oppervlak van de buis).
  7. Verwijder de afsluiting, vul de buis met inert gas (argon of stikstof), sluit de buis opnieuw en incubeer gedurende 1 h bij kamertemperatuur. Maak na 1 h incubatie aliquoten van 300 µL van de lipidemix en bewaar deze bij −20 °C. 
    OPMERKING: Het POPC:POPE:cardiolipine (2:2:1) mengsel is gekozen op basis van empirische optimalisatie en omdat PE en cardiolipine belangrijke bestanddelen zijn van het binnenmembraan van de mitochondriën; het protocol kan echter eenvoudig worden aangepast om alternatieve lipidensamenstellingen te testen.

3. Reconstitutie van mitochondriale SC's in liposomen

  1. Ontdooi SC-aliquots die bewaard zijn in vloeibare N 2  (stap 1.12) op ijs. Voer een bufferuitwisseling uit om glycerol uit het monster te verwijderen door het monster opnieuw op te lossen in SEC-buffer. Concentreer het monster met behulp van centrifugale filters met een cut-off van 100 kDa bij 3000 × g bij 4 °C. Voer tussen de concentratie-spins (~elke 5 min) opnieuw een bufferuitwisseling uit door het monster opnieuw op te lossen in SEC-buffer.
  2. Controleer de uiteindige concentratie van de SC met behulp van een BCA-assay (een bicinchoninezuur-eiwitassaykit).
  3. Ontdooi een aliquot van 300 µL van de lipidemix die is voorbereid in stap 2.7 en extrudeer deze door een extruder die is uitgerust met een polycarbonaatmembraan van 100 nm gedurende zes cycli bij kamertemperatuur (één cyclus bestaat uit het passeren van het lipidemengsel van de linker naar de rechterspuit en terug). Verzamel na voltooiing van de extrusiecycli de resulterende 100 nm liposomen uit de spuit tegenover de startzijde. Alternatief kunnen liposomen worden gegenereerd door sonicatie. 
  4. Voeg 9 µL van 20% (w/v) detergent (uiteindelijke concentratie 0,6% w/v) toe aan 250 µL van de geëxtrudeerde lipidemix in een aparte buis.
    OPMERKING: Men kan verschillende detergenten proberen. Natriumcholaat, een anionisch galzoutdetergent, werkte het beste voor deze experimenten.
  5. Meng door omkering en incubeer bij 4 °C gedurende 30 min. 
  6. Voeg 120 µg (of meer) mitochondriële SC en 3 µL van 10 mM cytochroom c (uiteindelijke concentratie van 100 µM) toe aan het mengsel. Vul het volume aan tot 300 µL met PLB. De uiteindelijke lipide:eiwit-ratio is ongeveer 10:1 (w:w). Genereer als aanvullende controle parallelle lege liposomen door SEC-buffer (30 mM HEPES, pH 7,8, 150 mM kaliumacetaat, 1 mM EDTA, 0,005% van een glycosidedetergent) toe te voegen aan het lipide-detergentmengsel in plaats van mitochondriële SC's en cytochroom c. 
  7. Meng door omkering en incubeer bij 4 °C gedurende 30 min. 
  8. Was een voorgevulde desalting spin-kolom die G-25 hars bevat vier keer met PLB-buffer middels gravitatiestroom. Centrifugeer de kolom vervolgens kort bij 1.000 × g gedurende 2 min om te wassen.
  9. Voeg het proteoliposoommonster toe aan de gewassen, voorgevulde G-25 hars desalting spin-kolom en centrifugeer de kolom bij 1.000 × g bij 4 °C gedurende 2 min om het detergent te verwijderen. Verzamel het eluaat.
    OPMERKING: Liposomen voorbereid door extrusie vertoonden een uniformere grootteverdeling dan die gegenereerd door sonicatie. Centrifugeer de voorgevulde desalting spin-kolom niet langer dan de fabrikant aanbeveelt, om detergentcontaminatie van het monster te voorkomen. Proteoliposomen werden bewaard bij 4 °C en doorgaans binnen 36 u gebruikt om potentieel verlies van activiteit te minimaliseren en de integriteit van de supercomplexen te behouden.

4. Lipid-floatatieassay29

  1. Maak sucrose-oplossingen van 27% en 7% (w/v) in PLB. Bereid een stapsgewijze gradiënt door 1,5 mL 27% sucrose en 0,9 mL 7% sucrose in een centrifugebuis van 3,5 mL te laagjes op elkaar te plaatsen.
  2. Plaats voorzichtig 300 µL proteoliposomen (uit stap 3.9) die SC bevatten bovenop de sucrosegradiënt. Centrifugeer de gradiënten bij 100.000 × g in een fixed-angle rotor gedurende 2 u bij 4 °C.
  3. Verzamel voorzichtig (probeer menging te vermijden) negen fracties van 300 µL (of 10 fracties van 270 µL) van boven naar beneden. Resuspendeer het pellet, indien aanwezig, in de laatste fractie en verzamel dit als fractie 9 of 10. Eventueel niet-gereconstitueerd SC zal zich ophopen in fractie 9 of 10.
    OPMERKING: De flotatie-assay helpt om gereconstitueerde proteoliposomen te scheiden van lege liposomen en niet-gereconstitueerde proteïnecomplexen. Deze wordt gebruikt om de reconstitutie te optimaliseren.

5. Spectroscopische ferricyanide-activiteitsanalyse van CI en in-gel activiteitsanalyse van CI

  1. Bereid de benodigde hoeveelheid ferricyanidereactiebuffer voor (FRB; 20 mM Tris HCl, pH 7,4, 50 mM NaCl, 0,1% w/v 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonaat (CHAPS), 1 mM kaliumferricyanide).
  2. Pipetteer 990 µL reactiebuffer in een cuvette van 1 mL. Voeg 5 µL van het monster (uit elke gradiëntfractie) toe aan de cuvette en voeg vervolgens 5 µL 20 mM NADH (eindconcentratie 100 µM) toe aan de reactie. Sluit de cuvette af met transparante folie en meng door te keren.
  3. Monitor de snelheid van de afname van de absorptie bij 340 nm bij 25 °C in een spectrometer. De afname van de absorptie bij 340 nm duidt op NADH-oxidatie. Herhaal dit voor alle fracties in triplo. Gebruik 5 µL PLB in plaats van het monster om de blanco te registreren.
  4. Bereken de NADH-oxidatiesnelheid na aftrek van de blanco en zet de totale activiteit van elk van de fracties uit in een grafiek.
    OPMERKING: Alternatief kan het experiment worden uitgevoerd in een 96-well plaat.
  5. Combineer de fracties met de maximale totale activiteit (vermijd fracties onderin de buis die activiteit bevatten, aangezien deze overeenkomen met niet-gereconstitueerd eiwit). Vul de gecombineerde fracties aan tot een totaalvolume van 20 mL met PLB om sucrose te verdunnen.
  6. Centrifugeer de monsters bij 150.000 × g, 4 °C gedurende 1 u in een fixed-angle rotor. Verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet in 200 µL PLB.
  7. Meng 25 µL van het geresuspendeerde pellet uit de vorige stap met 25 µL 2% w/v digitonine in PLB en incubeer (rol) bij 4 °C gedurende 1 u.
  8. Centrifugeer de niet-geëxtraheerde eiwitten bij 16.000 × g gedurende 20 min. Verzamel het supernatant.
  9. Voeg 10 µL BN-PAGE-laadkleurstof toe aan 30 µL van het supernatant en breng dit aan op een 3%–12% gradiënt BN-PAGE. Draai twee gels om CI- en CIV-in-gel activiteitsassays uit te voeren26.
  10. Draai de gel bij 150 V gedurende 30 min met donkere BN-PAGE-buffer (25 mM Tris, 0,192 g glycine, 200 mg Coomassie blauw). Vervang de donkerblauwe buffer door een lichtblauwe buffer (25 mM Tris, pH 8,3, 0,192 g glycine, 20 mg Coomassie blauw) en draai nogmaals 2 u bij 200 V.
  11. Breng na afloop de gels over naar een geschikte houder en voer de CI- en CIV-in-gel activiteitsassays uit26.
    OPMERKING: Voor structurele en functionele studies van complexen die zijn gereconstitueerd in liposomen, kunnen de overgebleven geresuspendeerde proteoliposomen uit stap 5.6 worden gebruikt. Zodra de reconstitutie volledig is geoptimaliseerd, kunnen stappen 4 en 5 worden overgeslagen en kunnen de gereconstitueerde proteoliposomen direct uit stap 3 worden gebruikt.

6. ACMA-fluorescentie-quenching assay om de membraanintegriteit van de gereconstitueerde proteoliposomen te meten29

  1. Bereid de benodigde hoeveelheid ACMA (9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine) reactiebuffer voor (10 mM MOPS pH 7.4, 15 mM KCl, 4 µM ACMA, 0,5 mg/mL runderserumalbumine (BSA), 2 mM 2-mercaptoethanol). 
  2. Pipetteer 930 µL reactiebuffer in een cuvette van 1 mL. Voeg 50 µL van de gereconstitueerde proteoliposomen toe aan de cuvette, sluit de cuvette af en meng door omkering. Incubeer 8 min buiten het licht.
  3. Stel de parameters van de spectrometer in op: excitatiegolflengte 410 nm, emissiegolflengte 490 nm. 
  4. Meng na de incubatie de cuvette opnieuw door omkering en meet de fluorescentie met de spectrometer gedurende 8 min bij kamertemperatuur.
  5. Voeg 4 µL van 20 µM valinomycine (eindconcentratie 80 nM) toe aan de cuvette, meng door omkering en meet gedurende 8 min.
  6. Voeg 6 µL van 1 mM CCCP (carbonylcyanide m-chloorfenylhydrazon) (eindconcentratie 6 µM) toe aan de cuvette, meng door omkering en meet gedurende 8 min.
  7. Om een controle met lege vesicles vast te stellen, worden stappen 6.2–6.6 herhaald, maar worden de gereconstitueerde proteoliposomen vervangen door "lege liposomen". Lege liposomen worden op dezelfde wijze gegenereerd als de gereconstitueerde proteoliposomen, maar waarbij tijdens de reconstitutie SEC-buffer wordt gebruikt in plaats van de toevoeging van SC's (stap 3.6).
  8. Voer de meting in triplikaat uit voor zowel de gereconstitueerde proteoliposomen als de lege liposomen en zet hun relatieve fluorescentie uit tegen de tijd.
    OPMERKING: Gegevens van zowel de gereconstitueerde proteoliposomen als de lege liposomen worden geschaald volgens (Fi − Fmin)/(Fmax−Fmin), waarbij Fmax de beginwaarde van de baseline-fluorescentie van die monster is en Fmin de laagste baseline-waarde van dat monster is na toevoeging van CCCP.
    WAARSCHUWING: CCCP is een toxische mitochondriale ontkoppelaar en dient met handschoenen in een zuurkast te worden gehanteerd.

7. Respirometriemetingen van het zuurstofverbruik om de functie van gereconstitueerde SC's te beoordelen30.

OPMERKING: De zuurstofconsumptiesnelheid wordt gemeten met behulp van een zuurstofelektrodesysteem van het Clark-type. De functionele assays van de gereconstitueerde SC's worden direct uitgevoerd op het eluaat van de ontzoutingskolom (stap 3.9).

  1. Stel het zuurstofelektrode-systeem in volgens de instructies van de fabrikant en open de software voor instrumentbesturing. Voeg 2 mL ultrapuur water toe aan de meetkamer.
  2. Stel de roersnelheid in totdat de grafiek van de zuurstofconcentratie ongewijzigd blijft naarmate de roersnelheid wordt verhoogd (begin bij 10, verhoog in stappen van 10). Verwijder het MQ-water en voeg zuurstofrijk water toe (MQ-water in een fles die krachtig is geschud).
  3. Klik op Calibrate > Liquid-phase calibration > Air-saturated water en wacht tot de kalibratie stabiliseert (snelheid 0 nmol per min). Voeg met een kleine spatel enkele (4–6) kristallen natriumdithioniet toe aan het reactievat om een nulwaarde voor zuurstof in de kamer vast te stellen.
  4. Wacht tot het signaal een plateau bereikt voordat u verdergaat. Sla de kalibratie op en reinig de reactiekamer met 5 × 1 mL 70% ethanol, 5 x 1 mL 0,1 mM EDTA, 5 × 1 mL MQ-water en 5 × 1 mL oxygraph-reactiebuffer (ORB; 150 mM KCl, 50 mM MOPS pH 7,4, 5 mM MgCl2, 5 mM KH2PO4, 0,02 mM EGTA, 0,5 mg/mL BSA).
  5. Voeg 2 mL ORB toe, klik op de knop "start read" in de software en wacht tot de grafiek stabiliseert. Label de grafiek in de software om de toevoeging van de monsters aan te geven terwijl de proteoliposomen (monster) in de reactiekamer worden toegevoegd.
    OPMERKING: De proteïneconcentratie in het proteoliposomenmonster wordt geschat op basis van de totale hoeveelheid proteïne die aan de liposomen is toegevoegd. Een proteïne:lipide-verhouding van 1:12 en een uiteindelijke concentratie van 50 µg/mL proteïne in de kamer van het zuurstofelektrode-systeem (2 mL) werkten het best. De exacte opbrengst van de proteoliposomen is niet gemeten.
  6. Nadat de aflezing van het zuurstofelektrode-systeem is gestabiliseerd, voegt u NADH toe aan de reactiekamer en labelt u gelijktijdig de grafiek in de software om de toevoeging van NADH aan te geven. Ga door met meten gedurende 5 min.
  7. Voeg CCCP toe, label de toevoeging in de software en ga door met meten gedurende 5 min.
  8. Voeg een inhibitor toe (bijv. CI-inhibitor (Piericidine A) of CIII2-inhibitor (Myxothiazool) of CIV-inhibitor (NaN3)), label de grafiek in de software, meet gedurende 2 min en stop vervolgens de meting. 
  9. Sla de grafiek op en reinig de reactiekamer met 5 x 1 mL 70% ethanol, 5 × 1 mL 0,1 mM EDTA, 7 × 1 mL MQ-water en 5 × 1 mL ORB voordat u een volgende meting uitvoert.
  10. Om de gegevens te corrigeren voor de backgroundsnelheid, berekent u de backgroundsnelheid, d.w.z. de helling van de aflezing voorafgaand aan de toevoeging van NADH, en extrapoleert u deze snelheid lineair over het tijdsverloop van de meting door voor elk tijdstip een verwachte background [O2] te berekenen. Trek vervolgens de geëxtrapoleerde background [O2] af van de gemeten [O2]-waarde voor elk tijdstip.
  11. Bereken de zuurstofconsumptiesnelheden (OCR's) als de helling van de background-gecorrigeerde [O2]-concentratiemetingen na de toevoeging van elk reagens.
  12. Om de snelheden te berekenen relatief aan de OCR na toevoeging van NADH, an u voor elke individuele trace elke gemeten OCR (bijv. OCR na toevoeging van NADH, CCCP en inhibitor, respectievelijk) delen door de OCR gemeten na toevoeging van NADH.     
    OPMERKING: WAARSCHUWING: Natriumdithioniet is een sterk reductiemiddel en kan heftig reageren met oxidanten of vocht. Hanteer met handschoenen. Voer inhibitor-bevattend afval af als gevaarlijk chemisch afval volgens de institutionele richtlijnen.

8. Schatting van de grootte van de gereconstitueerde liposomen met behulp van dynamische lichtverstrooiing

  1. Zet het instrument voor dynamische lichtverstrooiing (DLS) aan en wacht ongeveer 30 min voor laserstabilisatie.
  2. Start de acquisitie-software van het instrument op en sluit alle voorgaande bestanden.
  3. Filter de proteoliposomen (0,2 μm) om eventuele partikels te verwijderen.
  4. Breng 70 µL van de proteoliposomen over in een schone cuvette; voorkom vingerafdrukken of vlekken.
  5. Plaats de cuvette in het instrument en sluit het deksel stevig.
  6. Maak een nieuw bestand aan en selecteer Handmatige Meting > Grootte.
  7. Stel de temperatuur in op 25 °C en laat de attenuatie-index op automatisch staan.
  8. Definieer de eigenschappen van het dispergeermiddel (viscositeit en brekingsindex; bijv. RI = 1,330 voor water/buffer).
  9. Stel de acquisitieparameters in (automatische duur, ~3 metingen, General Purpose-verwerking).
  10. Start de meting en monitor de grootte, de polydispersiteitsindex (PDI) en de teltijd (streefwaarde ~100–500 kcps).
  11. Analyseer de resultaten: controleer de grootteverdeling (intensiteit/volume), de PDI (<0,3 acceptabel) en de kwaliteit van de autocorrelatie (vloeiend verval, stabiele basislijn); sla de gegevens op.

9. Voorbereiding en screening van grids voor cryogene elektronenmicroscopie

  1. Gebruik het proteoliposoommonster uit stap 5.11 (of stap 3.9 indien stappen 4 en 5 worden overgeslagen) voor het klaarmaken van EM-roosters. Concentreer de proteoliposomen indien nodig door stap 5.6 te herhalen en opnieuw op te lossen in een kleiner volume PLB.
  2. Voer een glow-discharge uit op met gaatjes voorzien, met koolstof gecoate 300-mesh koperroosters gedurende 90 s bij 20 mA met lucht in een glow-discharge reinigingssysteem.
  3. Stel een geautomatiseerd plunge-freezer systeem in voor plunge-freezing bij 95% luchtvochtigheid en 15 °C met de volgende parameters: blot-tijd 10 s, blot-kracht −8, wachttijd 10 s en drain-tijd 0.
  4. Bevestig de pincet met het glow-discharged rooster aan het plunge-freezer systeem.
  5. Voeg 4,0 µL van het proteoliposoommonster toe aan het glow-discharged rooster op een automatische plunger.
  6. Incubeer de roosters 10 s voordat deze 10 s worden geblotted en via plunge-freezing in vloeibaar ethaan worden bevroren. Breng de roosters zorgvuldig over naar de roosterdoos in de vloeibare N2-kamer, en vervolgens naar de vloeibare N2-opslag-dewar.
  7. Laad de bevroren roosters en screen deze op een transmissie-elektronenmicroscoop met een cryogene monsterlader. Er werd een transmissie-elektronenmicroscoop met een directe elektrondetector gebruikt.
  8. Stel de microscoop in volgens de instructies van de fabrikant en screen de roosters op gereconstitueerde proteoliposomen. Sla de beelden op.
    OPMERKING: VOORZICHTIG: Vloeibaar ethaan is zeer brandbaar en cryogeen; hanteer dit met passende PBM en uit de buurt van ontstekingsbronnen om brand en koudebrand te voorkomen. Vloeibare stikstof is cryogeen en kan ernstige koudebranden en zuurstofverdringing veroorzaken. Hanteer dit met passende cryogene PBM en gebruik het uitsluitend in goed geventileerde ruimten.

Resultaten

Met dit protocol hebben we de optimale reconstitutiecondities bepaald voor mitochondriële supercomplexen (SCs) geïsoleerd uit mitochondriën van varkenshart (Figuur 1A,B). Het sucrose stapgradiëntprotocol scheidt gereconstitueerde proteoliposomen effectief van lege vesicles en niet-ingebouwde eiwitten, waardoor snelle tests en optimalisatie van condities mogelijk zijn. De representatieve resultaten in Figuur 2 tonen een gradiënt met het aangebrachte monster vóór en na centrifugatie. Daarnaast hebben we het detergent geoptimaliseerd dat werd gebruikt om respiratoire SC's in liposomen te reconstitueren. Vier verschillende detergentia — een anionisch galzout-detergens, CHAPS, digitonine en een glycoside-detergens — werden afzonderlijk gebruikt voor reconstitutie met de SC's. De totale CI-activiteit in de fracties werd voor elk getest detergens gemeten met de NADH-ferricyanide oxidoreductie-assay (Figuur 3A–D). Bij succesvolle reconstituties werd de maximale activiteit voor CI waargenomen in fracties op de interface van de twee sucroseconcentraties (27% w/v sucrose en 7% w/v sucrose). Opmerkelijk is dat er minimale activiteit wordt gedetecteerd in fractie #10 voor het anionische galzout-detergens en CHAPS, terwijl fractie #10 voor zowel digitonine als het glycoside-detergens aanzienlijke activiteit vertoont, wat erop wijst dat digitonine en een glycoside-detergens de supercomplexen niet effectief in de liposomen reconstitueren. Een anionisch galzout-detergens werd gebruikt voor alle daaropvolgende reconstituties.

Een in-gel activiteitsassay voor CI en CIV, uitgevoerd op een blue-native polyacrylamidegelelektroforesegel van digitonine-geëxtraheerde POPC:POPE:CL (2:2:1) proteoliposomen, demonstreert de relatieve hoeveelheden SC en individuele ETC-complexen na reconstitutie (Figuur 4). De resultaten geven aan dat de interactie tussen CI en CIII2 grotendeels behouden blijft in de proteoliposomen na re-extractie met digitonine en BN-PAGE. Hoewel er enige CIV-activiteit aanwezig is in de supercomplexband, wordt er ook een sterk signaal waargenomen bij een lager moleculair gewicht dat consistent is met CIV alleen, wat duidt op dissociatie. De membraanlekkage van de gereconstitueerde liposomen werd gemeten met de ACMA-fluorescentie-quenching assay, waaruit bleek dat de proteoliposomen niet significant lek waren voor protonen (Figuur 5A,B). De grootte van de gereconstitueerde liposomen werd geschat met DLS, waaruit bleek dat extrusie voorafgaand aan de reconstitutie leidt tot een uiteindelijke proteoliposoom-grootteverdeling van 82,9 ± 0,8 nm diameter voor lege vesicles en 110,6 ± 0,4 nm voor gereconstitueerde supercomplex proteoliposoom RSPs (Figuur 6). Zuurstofconsumptie door de proteoliposomen werd gebruikt om de SC-functie te beoordelen, wat een duidelijke inhibitor-gevoelige NADH-gestuurde zuurstofconsumptie onthulde (Figuur 7A). Het uitzetten van de OCRs ten opzichte van de OCR na toevoeging van NADH geeft direct inzicht in de mate van koppeling binnen de RSPs, d.w.z. de OCR neemt met een factor van ~1,5 toe na toevoeging van CCCP ten opzichte van de toevoeging van NADH alleen (Figuur 7B). De gescreende Cryo-EM-grids maakten visualisatie van de SC's in het proteoliposoommembraan mogelijk, wat de succesvolle reconstitutie bevestigde (Figuur 8A–I).

Chromatografieproces, UV-absorptiegrafiek, BN-PAGE-gel, proteïnepurificatie, assayresultaten.
Figuur 1: Isolatie en karakterisering van detergent-gesolubiliseerde supercomplexen uit mitochondriën van varkenshart. (A) Representatief chromatogram van size-exclusion chromatografie (SEC) purificatie van met digitonine geëxtraheerde mitochondriale membraancomplexen van varkens. (B) Blue-native PAGE (BN-PAGE) van fracties uit A, gevisualiseerd door CI in-gel activiteitskleuring. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Dichtheidsgradiëntcentrifugatie, diagram van proteoliposoomscheiding; analyse van blaasjes- en eiwitlagen.
Figuur 2: Sucrose-stapsgradiënten met proteoliposomen. Vóór centrifugatie (links), na centrifugatie (rechts) bij 100,000 × g gedurende 2 h in een ultracentrifuge. Het op de gradiënt geladen proteoliposoommonster wordt gescheiden in lege blaasjes, proteoliposomen en geaggregeerd eiwit aan de onderzijde. Deze gradiënt wordt vervolgens gefractioneerd voor verdere karakterisering zoals beschreven. De geschatte omvang van elke fractie is aangegeven en gelabeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Staafdiagram dat de enzymactiviteit laat zien met detergentia: Natriumcholaat, CHAPS, GDN, Digitonine.
Figuur 3: Flotatie-assay om de reconstitutie-efficiëntie in verschillende detergentia te beoordelen. CI NADH-ferricyanide-activiteit in de fracties van de sucrose stapgradiënt na reconstitutie met (A) anionisch galzout-detergens, (B) 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propaansulfonaat (CHAPS) (0,6% (w/v)), (C) digitonine (0,6% w/v), (D) glycoside detergent (GDN) (0,6% (w/v)). Fractie #10 wordt verkregen door eventuele pellets in de laatste fractie te resuspenderen. Activiteit in fractie #10 geeft aan dat de eiwitten niet zijn gereconstitueerd. n = 3 en de foutenbalken tonen SD = standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Diagram van elektroforesegel waarin eiwitscheidingsresultaten worden getoond; gelabelde banden geven eiwittypen aan.
Figuur 4: In-gel activiteitsassay op met digitonine geëxtraheerde proteoliposomen uitgelaten op 3%–12% BN-PAGE. In-gel activiteitsassay voor CI (links) en CIV (rechts). R = respirasoom (SC I+III2+IV), SC1,3 (SC I+III2), IGA CI = (CI in-gel activiteitsassay); IGA CIV = (CIV in-gel activiteitsassay). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Fluorescentie-quenching grafiek, lege liposomen versus proteoliposomen, behandeling met Valinomycine en CCCP.
Figuur 5: ACMA-fluorescentie-quenching assay om protonlekkage in gereconstitueerde proteoliposomen te detecteren. Met een pH-gevoelige kleurstof (ACMA) werd de interne pH van gereconstitueerde proteoliposomen (cyaan) vergeleken met lege liposomen (oranje) na opeenvolgende toevoeging van Valinomycine en CCCP. Getoond zijn representatieve ACMA-fluorescentiecurven verkregen uit verschillende proteoliposoompreparaties ter vergelijking. (A) Gereconstitueerde liposomen met een aangetast membraan (lekkend). (B) Gereconstitueerde liposomen met een intact membraan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Grafiek van de grootteverdeling waarin proteoliposomen en lege liposomen worden vergeleken; analyse van volume versus grootte.
Figuur 6: Dynamic light scattering-metingen van lege liposomen en gereconstitueerde SC-proteoliposomen. De gemiddelde volumegewogen grootteverdelingen van geëxtrudeerde lege liposomen (oranje) en SC-gereconstitueerde proteoliposomen (cyaan) worden weergegeven. De metingen werden uitgevoerd als drie technische herhalingen. Lege liposomen hebben een gemiddelde hydrodynamische diameter van 82,9 ± 0,8 nm, terwijl RSPs een gemiddelde hydrodynamische diameter hebben van 110,6 ± 0,4 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Cellulaire respiratie, zuurstofverbruiksdiagram en staafdiagram ter analyse van de effecten van NADH, CCCP en piericidine A.
Figuur 7: Zuurstofconsumptie-assays voor de beoordeling van de koppeling van gereconstitueerde SC's in liposomenHet zuurstofverbruik werd gemeten om de respiratoire activiteit en de koppeling van ETC-complexen te evalueren na reconstitutie in liposomen die door extrusie waren gegenereerd. (A) Representatieve, voor achtergrond gecorrigeerde zuurstofelektrode-meting die veranderingen in de zuurstofconcentratie laat zien na opeenvolgende toevoeging van NADH om CI-gestuurde respiratie te initiëren, CCCP om de protonengradiënt te dissiperen en de maximale ontkoppelde zuurstofconsumptiesnelheid (OCR) te meten, piericidine A om CI te remmen en antimycine A om CIII te remmen2, of NaN3 (Azid) om CIV te inhiberen. (B) Kwantificering van de OCR onder de aangegeven condities en gecorrigeerd volgens stap 7.10. De datapunten relatief aan de OCR na toevoeging van NADH worden voor elke trace weergegeven, samen met het gemiddelde ± SD (foutenbalken). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Cryo-EM-analyse van lipidevesikelvorming; pijlen markeren vesikelstructuren; schaalbalk 10-50 nm.
Figuur 8: Cryo-EM-visualisatie van gereconstitueerde SC's in proteoliposoommembranen. (A–C) Representatieve elektronenmicrografieën van gescreende grids die gereconstitueerde SC's tonen geassocieerd met proteoliposoommembranen. Gereconstitueerde SC's zijn aangegeven met gele pijlen. Schaalbalken = 50 nm. (D–I) Representatieve SC-partikels bekeken met een hogere vergroting op de proteoliposoommembranen. Schaalbalken = 10 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Er wordt een eenvoudige en reproduceerbare methode gepresenteerd voor het reconstitueren van mitochondriale respiratoire SC's in gedefinieerde proteoliposomen, wat gecontroleerd onderzoek naar hun structuur en functie mogelijk maakt. Verschillende stappen in dit protocol zijn cruciaal voor een succesvolle reconstitutie. In onze ervaring hebben liposomen die door extrusie zijn gegenereerd een uniformere grootteverdeling (beoordeeld via dynamic light scattering) dan liposomen geproduceerd door sonicatie. Efficiënte verwijdering van detergent met behulp van een voorgevulde desalting spin column is essentieel om membraansluiting en een juiste incorporatie van SC's in een lipide dubbellaag te bevorderen; onvolledige verwijdering kan leiden tot lekkende of instabiele proteoliposomen. Optimalisatie van de lipidesamenstelling, proteïne-lipideverhoudingen en de keuze van het detergent is even belangrijk, aangezien deze parameters de reconstitutie-efficiëntie en SC-stabiliteit sterk beïnvloeden. De sucrosegradiënt-floatatie-assay is nuttig voor de initiële optimalisatie; zodra de condities echter zijn vastgesteld, geniet het de voorkeur om proteoliposomen direct na de voorgevulde desalting spin column te gebruiken voor downstream structurele en functionele analyses, om zo monsterverlies en verstoring tijdens gradiëntfractionering te vermijden. Het volume van de fractie dat nodig is om activiteit waar te nemen, varieert per preparatie. Pas het volume aan dat aan het reactiemengsel wordt toegevoegd voor verschillende preparaties. De oriëntatie van de respiratoire SC binnen het proteoliposoommembraan kan de respiratoire metingen aanzienlijk beïnvloeden. De reconstitutieprocedure is niet geoptimaliseerd om een enkele topologie af te dwingen; hoewel dus een gemengde populatie van oriëntaties wordt verwacht, wijzen CI-ferricyanide-toegankelijkheidstests op een sterke bias naar buitenwaarts gerichte CI-perifere armen.

De oriëntatie van de gereconstitueerde supercomplexen werd experimenteel beoordeeld, en de ferricyanide-activiteit van CI werd gemeten in aanwezigheid en afwezigheid van het detergent. In intacte RSP's kan extern toegevoegd NADH alleen toegang krijgen tot CI-moleculen waarvan de perifere arm naar het externe medium is gericht, terwijl permeabilisatie met detergent NADH-toegang tot alle complexen mogelijk maakt. Deze assay schat dus de fractie functioneel toegankelijke CI-perifere armen die naar het externe medium zijn gericht, in plaats van een volledige structurele bepaling van de proteoliposoom-topologie te bieden. Vergelijking van de activiteiten gemeten onder deze condities gaf aan dat 83,1% ± 0,04% van de respirasomen (de SC) georiënteerd waren met de perifere arm van CI naar buiten gericht, wat wijst op een significante oriëntatiebias tijdens de reconstitutie.

Verschillende modificaties en strategieën voor probleemoplossing kunnen de reproduceerbaarheid en stabiliteit verbeteren. In-gel activiteitsassays voor CI en CIV, uitgevoerd op gedigitonine-geëxtraheerde gepoelde fracties uit sucrosegradiënten, vertonen banden voor SC, wat aangeeft dat SC niet volledig dissocieert tijdens reconstitutie. De SC-band is echter sterker op de CI-activiteitsgel vergeleken met de CIV-activiteitsgel, wat erop wijst dat CIV na reconstitutie mogelijk gedeeltelijk dissocieert van CI en CIII2 (Figuur 4). Het aanpassen van de lipidensamenstelling kan de stabiliteit van SC verbeteren. De gedeeltelijke dissociatie van CIV kan ook voortvloeien uit de keuze van het detergent of een te snelle verwijdering van het detergent tijdens de reconstitutie, wat zwakkere eiwit-eiwitinteracties binnen het supercomplex zou kunnen destabiliseren. Verdere optimalisatie van de condities voor detergentuitwisseling kan de retentie van CIV verbeteren. Daarnaast kan het minimaliseren van mechanische stress, het vermijden van onnodige zuiveringsstappen en zorgvuldige behandeling van monsters helpen om de integriteit van proteoliposomen te behouden. Voor functionele assays is het essentieel om volledige afsluiting van de proteoliposomen te waarborgen, aangezien membraanlekkage de koppeling aan de transmembraan protonengradiënt verhindert. Voor de preparatie van cryo-EM grids is het gebruik van grids met een continue koolstofcoating belangrijk, omdat is aangetoond dat dit de partikeldistributie binnen de gridgaten verbetert19.

Ondanks de voordelen kent deze benadering beperkingen. Proteoliposomen bootsen de compositionele en dynamische complexiteit van het oorspronkelijke binnenmembraan van de mitochondriën niet volledig na, en de gedeeltelijke dissociatie van SC-componenten, in het bijzonder CIV, blijft een uitdaging. Functionele resultaten kunnen bovendien worden beïnvloed door onvolledige koppeling of heterogeniteit in de efficiëntie van de reconstitutie. Toch behoudt deze methode, in vergelijking met detergent-gesolubiliseerde systemen, de lipide-proteïne-interacties en ondersteunt deze een membraanomgeving die vergelijkbaar is met de natuurlijke situatie, terwijl er meer experimentele controle mogelijk is dan bij in situ benaderingen. Zo biedt het een waardevol platform voor systematisch onderzoek naar hoe lipidesamenstelling en membraaneigenschappen de stabiliteit en activiteit van SC reguleren.

Het begrijpen van deze relaties is bijzonder belangrijk omdat verstoringen van de organisatie van respiratoire supercomplexen zijn geïmpliceerd bij een breed scala aan mitochondriale en metabole aandoeningen31,32,33,34,35,36,37,38,39,40. Defecten in de assemblage van ETC-complexen, cardiolipine-synthese of lipidremodeling, zoals waargenomen bij aandoeningen zoals het syndroom van Leigh41,42,43,44,45,46,47, het syndroom van Barth48,49,50,51,52,53,54 en het syndroom van Sengers48, kunnen supercomplexen destabiliseren, de elektronentransport stooren, de ATP-productie verminderen en de generatie van reactieve zuurstofsoorten verhogen. Deze bio-energetische defecten beïnvloeden weefsels met een hoge energievraag, zoals het hart, de skeletspieren en de hersenen, onevenredig sterk, wat leidt tot fenotypes waaronder cardiomyopathie, inspanningstolerantie en neurodegeneratie36,37,38. Omgekeerd suggereert opkomend bewijs dat de vorming van supercomplexen compenserende en beschermende rollen kan vervullen onder stress door ETC-complexen te stabiliseren en pathologische ROS-productie te beperken55,56. Het hier beschreven platform van gereconstitueerde proteoliposomen biedt een gecontroleerd systeem om direct te testen hoe ziekte-geassocieerde lipidremodeling, mutaties of farmacologische interventies de assemblage en functie van supercomplexen veranderen, waardoor mechanistische studies naar mitochondriale dysfunctie mogelijk worden en toekomstige therapeutische strategieën kunnen worden onderbouwd.

Lage zuurstofconsumptiesnelheden kunnen het gevolg zijn van gebrekkige incorporatie van supercomplexen, partiële dissociatie van CIV, residueel detergent, onvoldoende CoQ10 of cytochroom c, gedegradeerd NADH, of een lage proteïneconcentratie in de oxygraafkamer. Bevestig de reconstitutie via een flotatie-assay of BN-PAGE, verifieer de membraanintegriteit door ACMA-quenching, bereid vers NADH en optimaliseer de proteïne-lipideverhouding, de cofactorconcentratie, de verwijdering van detergent en de monsterconcentratie. Lekkende proteoliposomen kunnen het gevolg zijn van onvolledige verwijdering van detergent, een te hoge detergentconcentratie, ruwe behandeling, herhaalde vries-dooi-cycli of beschadigde lipiden. Indien protonlekkage wordt waargenomen in de ACMA-assay, herhaal dan de verwijdering van detergent met een vers geëquilibreerde ontzoutingskolom, vermijd te hoge centrifugatiesnelheden voor de kolom, bereid verse liposomen, minimaliseer mechanische stress en gebruik de proteoliposomen onmiddellijk na reconstitutie. Aggregatie tijdens de concentratiestappen kan optreden door hoge lokale proteïne- of detergentconcentraties bij het concentratiemembraan. Concentreer monsters in korte (10 min) centrifugatiecycli, resuspendeer het monster voorzichtig tussen de spins, vermijd overconcentratie, bewaar monsters bij 4 °C en verwijder zichtbare aggregaten door klaring bij lage snelheid vóór verder gebruik. Inconsistent flotatiegedrag kan wijzen op variabele liposoomgrootte, onvolledige verwijdering van detergent, aggregatie, onjuiste sucrose-laagvorming of verstoring van de gradiënt tijdens het laden van monsters of het verzamelen van fracties. Bereid verse sucrose-oplossingen, breng gradiënten langzaam aan zonder de interfaces te mengen, gebruik uniform geëxtrudeerde liposomen, houd de centrifugatiecondities constant en verzamel fracties voorzichtig van boven naar beneden. Een slechte particle-distributie bij cryo-EM kan voortkomen uit een lage proteoliposoomconcentratie, aggregatie, preferentiële adsorptie aan koolstof, gebrekkige bevochtiging van het grid, dik ijs of overmatig blotten. Optimaliseer de proteoliposoomconcentratie, verwijder aggregaten vóór de grid-preparatie, pas de glow-discharge-condities aan, test de blot-tijd en blot-kracht, screen verschillende grid-typen of koolstofondersteuning en gebruik indien mogelijk vers bereide monsters.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen belangenverstrengeling is.

Dankbetuigingen

De grids werden gescreend bij de UC Davis BioEM Core-faciliteit. We danken Dr. Fei Guo voor de hulp bij het screenen. Het werk werd gefinancierd door de NIGMS van de NIH onder beurs R35GM137929 (JAL).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (POPC)Avanti Research860320
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine (POPE)Avanti Research850757
1,3-bis(sn-3’-fosfatidyl)-sn-glycerol (cardiolipine, uit rundenhartweefsel)Avanti Research840012
2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethaansulfonzuur --- HEPESSigma-AldrichH23830
3-(N-morpholino)propaansulfonzuur (MOPS)Sigma-AldrichM12545
3,3′-Diaminobenzidine ---- DABBSigma-AldrichD4293
Carbonylcyanide m-chlorofenylhydrazon ---- CCCPSigma-AldrichC2759
CHAPSSigma-Aldrich220201
ChloroformSigma-Aldrich650948
Co-enzym Q10Sigma-AldrichC9538
Cytochroom c uit paardenhartSigma-AldrichC2506
DigitonineSigma-Aldrich300410
Ethyleenglycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraazijnzuur --- EGTASigma-AldrichE3889
Ethyleendiaminetetraazijnzuur -- EDTASigma-AldrichE6758
GlycerolSigma-AldrichG7893
Glyco-diosgenineAnatraceGDN101detergens
Laurylmaltose-neopentylglycol ---- LMNGSigma-AldrichNG310
MagnesiumchlorideSigma-AldrichM8266
MyxothiazoolSigma-AldrichT5580
NADH, dinatriumzoutSigma-Aldrich481913
NitrotetrazoliumblauwchlorideSigma-AldrichN6876
Piericidine ASigma-Aldrich96861
KaliumacetaatSigma-AldrichP5708
KaliumchlorideSigma-AldrichP3911
KaliumferricyanideSigma-Aldrich702587
Kaliumfosfaat monobasisch ---- KH2PO4Sigma-AldrichP0662
NatriumazideSigma-AldrichS2002
NatriumcholaathydraatSigma-AldrichC1254
NatriumchlorideSigma-AldrichS9888
NatriumdithionietSigma-Aldrich71699
SucroseSigma-AldrichS9378
TRISSigma-AldrichT1503
ACMA (9-amino-6-chloor-2-methoxyacridine)Sigma-AldrichSML4162
Apparatuur en kits
Amicon® Ultra centrifugaalfilter, 100 kDa MWCO 0,5 mLMilliporeUFC5100
Amicon® Ultra centrifugaalfilter, 100 kDa MWCO 15 mLMilliporeUFC9100
Beckman Optima TLX ultracentrifugeBeckman Coulter
BN-PAGE gelblue-native polyacrylamide gelelektroforese gel
Beckman Optima XE ultracentrifugeBeckman Coulter
Glow Discharge reinigingssysteemglow discharge reinigingssysteem
Glacios 2 Cryo-TEM met Gatan K3 detectorThermo Fisher Scientificde transmissie-elektronenmicroscoop
KIMBLE Dounce weefselmaler setSigma-AldrichD9188
Leica Automatic GP2 PlungerLeica
Microfuge 16Beckman CoulterA46474
NGC Discover 10 chromatografiesysteemBio-Rad7880009
Oxygraph+het zuurstofelektordesysteem
PD-10 ontzoutingskolomCytiva28918007size exclusion spin kolom
Pierce BCA proteinassaykitThermo Fisher Scientific23225bicinchoninezuur proteinassaykit
Q-125 SonicatorQ-sonicaQ125-110
Sephadex G-25 M kolomvoorgevulde G-25 hars ontzoutings-spin kolom
SpectraMax M2 microplaatlezerMolecular Devices
Superose 6 increase 10/300 GLCytiva29091596cross-linked agarose gelfiltratiemedium
TLA-100.3 Fixed-Angle Rotor pakketBeckman Coulter349490
Type 50.2 Ti Fixed-Angle RotorBeckman Coulter337901
Milli-Q (MQ) waterultrapuur water
Malvern Zetasizer ZS Dynamic Light Scattering (DLS)Malvern Paranytical
Hansatech Oxygraph+ systeemHansatech Instruments
PELCO easiGlow Glow Discharge reinigingssysteemTED PELLA, INC
Vitrobot Mark IV systeemThermo Fisher Scientificde plunge freezer
Quantifoil R 1,2/1,3 300 mesh koper grids met 2 nm koolstofTED PELLA, INC668-300-Cu-100met gaatjes koolstofcoating
Avanti mini-extruderAvanti Lipids610000

Referenties

  1. Mitchell P. Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemi-osmotic type of mechanism. Nature. 1961;191:144-8.
  2. Dudkina NV, Kudryashev M, Stahlberg H, Boekema EJ. Interaction of complexes I, III, and IV within the bovine respirasome by single particle cryoelectron tomography. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011;108:15196-200.
  3. Althoff T, Mills DJ, Popot JL, Kühlbrandt W. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1. EMBO J. 2011;30:4652-64.
  4. Schäfer E, Dencher NA, Vonck J, Parcej DN. Three-dimensional structure of the respiratory chain supercomplex I1III2IV1 from bovine heart mitochondria. Biochemistry. 2007;46:12579-85.
  5. Schägger H, Pfeiffer K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. EMBO J. 2000;19:1777-83.
  6. Milenkovic D, Blaza JN, Larsson NG, Hirst J. The enigma of the respiratory chain supercomplex. Cell Metab. 2017;25:765-76.
  7. Berndtsson J, et al. Respiratory supercomplexes enhance electron transport by decreasing cytochrome c diffusion distance. EMBO Rep. 2020;21. doi:10.15252/embr.202051015.
  8. Moe A, Di Trani J, Rubinstein JL, Brzezinski P. Cryo-EM structure and kinetics reveal electron transfer by 2D diffusion of cytochrome c in the yeast III-IV respiratory supercomplex. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021;118. doi:10.1073/pnas.2021157118.
  9. Blaza JN, et al. Kinetic evidence against partitioning of the ubiquinone pool and the catalytic relevance of respiratory-chain supercomplexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014;111:15735-40.
  10. Diaz F, Enríquez JA, Moraes CT. Cells lacking Rieske iron-sulfur protein have a reactive oxygen species-associated decrease in respiratory complexes I and IV. Mol Cell Biol. 2012;32:415-29.
  11. Maranzana E, et al. Mitochondrial respiratory supercomplex association limits production of reactive oxygen species from complex I. Antioxid Redox Signal. 2013;19:1469-80.
  12. Schägger H, et al. Significance of respirasomes for the assembly/stability of human respiratory chain complex I. J Biol Chem. 2004;279:36349-53.
  13. Acín-Pérez R, et al. Respiratory complex III is required to maintain complex I in mammalian mitochondria. Mol Cell. 2004;13:805-15.
  14. Letts JA, Sazanov LA. Clarifying the supercomplex: the higher-order organization of the mitochondrial electron transport chain. Nat Struct Mol Biol. 2017;24:800-8.
  15. Protasoni M, et al. Respiratory supercomplexes act as a platform for complex III-mediated maturation of human mitochondrial complexes I and IV. EMBO J. 2020;39. doi:10.15252/embj.2019102817.
  16. Pöverlein MC, Jussupow A, Kim H, Kaila VRI. Protein-induced membrane strain drives supercomplex formation. eLife. 2024;13. doi:10.7554/eLife.102104.1.
  17. Mandala VS, MacKinnon R. Voltage-sensor movements in the Eag Kv channel under an applied electric field. Proc Natl Acad Sci U S A. 2022;119. doi:10.1073/pnas.2214151119.
  18. Falzone ME, MacKinnon R. Gβγ activates PIP2 hydrolysis by recruiting and orienting PLCβ on the membrane surface. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023;120. doi:10.1073/pnas.2301121120.
  19. Grba DN, et al. Molecular mechanism of the ischemia-induced regulatory switch in mammalian complex I. Science. 2024;384:1247-53.
  20. Tao X, Zhao C, MacKinnon R. Membrane protein isolation and structure determination in cell-derived membrane vesicles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023;120. doi:10.1073/pnas.2302325120.
  21. Zheng W, Chai P, Zhu J, Zhang K. High-resolution in situ structures of mammalian respiratory supercomplexes. Nature. 2024;631:232-9.
  22. Nakano A, et al. Structures of respiratory supercomplexes and ATP synthase oligomers in mammalian mitochondrial inner membrane. Nat Commun. 2026;17:4075. doi:10.1038/s41467-026-70578-x.
  23. Coupland CE, et al. High-resolution electron cryomicroscopy of V-ATPase in native synaptic vesicles. Science. 2024;385:168-74.
  24. Letts JA, Fiedorczuk K, Sazanov LA. The architecture of respiratory supercomplexes. Nature. 2016;537:644-8.
  25. Letts JA, et al. Structures of respiratory supercomplex I+III2 reveal functional and conformational crosstalk. Mol Cell. 2019;75:1131-46.e6.
  26. Jha P, Wang X, Auwerx J. Analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Curr Protoc Mouse Biol. 2016;6:1-14.
  27. Biner O, Fedor JG, Yin Z, Hirst J. Bottom-up construction of a minimal system for cellular respiration and energy regeneration. ACS Synth Biol. 2020;9:1450-9.
  28. Wright JJ, et al. Reverse electron transfer by respiratory complex I catalyzed in a modular proteoliposome system. J Am Chem Soc. 2022;144:6791-801.
  29. Lee SY, Letts JA, MacKinnon R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. J Mol Biol. 2009;387:1055-60.
  30. Caldeira D de AF, Oliveira DF de, Cavalcanti-de-Albuquerque JP, Nascimento JHM, Zin WA, et al. Isolation of mitochondria from fresh mice lung tissue. Front Physiol. 2021;12:748261. doi:10.3389/fphys.2021.748261.
  31. Shi H, et al. Global burden of ischaemic heart disease from 2022 to 2050: projections of incidence, prevalence, deaths, and disability-adjusted life years. Eur Heart J Qual Care Clin Outcomes. 2025;11:355-66.
  32. Rahman S. Mitochondrial disease in children. J Intern Med. 2020;287:609-33.
  33. Pérez-Albert P, et al. Mitochondrial disease in children: the nephrologist’s perspective. JIMD Rep. 2018;42:61-70.
  34. Gorman GS, et al. Prevalence of nuclear and mitochondrial DNA mutations related to adult mitochondrial disease. Ann Neurol. 2015;77:753-9.
  35. Pitceathly RDS, Rahman S. Mitochondrial DNA-related diseases associated with single large-scale deletions and point mutations. In: Gasparre G, Porcelli AM, editors. The Human Mitochondrial Genome: From Basic Biology to Disease. London: Academic Press; 2020. p. 353-74.
  36. Morán M, et al. Mitochondrial respiratory chain dysfunction: implications in neurodegeneration. Free Radic Biol Med. 2012;53:595-609.
  37. Chinnery PF. Primary mitochondrial disorders overview. In: Adam MP, Feldman J, Mirzaa GM, Pagon RA, Wallace SE, Bean LJH, et al., editors. GeneReviews®. Seattle: University of Washington, Seattle; 1993–2026. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1224/
  38. Ellis CE, et al. Mitochondrial lipid abnormality and electron transport chain impairment in mice lacking α-synuclein. Mol Cell Biol. 2005;25:10190-201.
  39. Hekimi S, Wang Y, Noë A. Mitochondrial ROS and the effectors of the intrinsic apoptotic pathway in aging cells: the discerning killers. Front Genet. 2016;7:161. doi:10.3389/fgene.2016.00161.
  40. Chouchani ET, et al. Ischaemic accumulation of succinate controls reperfusion injury through mitochondrial ROS. Nature. 2014;515:431-5.
  41. Van de Wal MAE, et al. Ndufs4 knockout mouse models of Leigh syndrome: pathophysiology and intervention. Brain. 2022;145:45-63.
  42. Hoefs SJG, et al. NDUFA10 mutations cause complex I deficiency in a patient with Leigh disease. Eur J Hum Genet. 2011;19:270-4.
  43. Ostergaard E, et al. Respiratory chain complex I deficiency due to NDUFA12 mutations as a new cause of Leigh syndrome. J Med Genet. 2011;48:737-40.
  44. Marin SE, et al. Leigh syndrome associated with mitochondrial complex I deficiency due to novel mutations in NDUFV1 and NDUFS2. Gene. 2013;516:162-7.
  45. Adjobo-Hermans MJW, et al. NDUFS4 deletion triggers loss of NDUFA12 in Ndufs4−/− mice and Leigh syndrome patients: a stabilizing role for NDUFAF2. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 2020;1861:148213. doi:10.1016/j.bbabio.2020.148213.
  46. Leshinsky-Silver E, et al. NDUFS4 mutations cause Leigh syndrome with predominant brainstem involvement. Mol Genet Metab. 2009;97:185-9.
  47. Piekutowska-Abramczuk D, et al. NDUFB8 mutations cause mitochondrial complex I deficiency in individuals with Leigh-like encephalomyopathy. Am J Hum Genet. 2018;102:460-7.
  48. Bertero E, Kutschka I, Maack C, Dudek J. Cardiolipin remodeling in Barth syndrome and other hereditary cardiomyopathies. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 2020;1866:165803. doi:10.1016/j.bbadis.2020.165803.
  49. Xu Y, et al. Loss of protein association causes cardiolipin degradation in Barth syndrome. Nat Chem Biol. 2016;12:641-7.
  50. McKenzie M, Lazarou M, Thorburn DR, Ryan MT. Mitochondrial respiratory chain supercomplexes are destabilized in Barth syndrome patients. J Mol Biol. 2006;361:462-9.
  51. Acehan D, Xu Y, Stokes DL, Schlame M. Comparison of lymphoblast mitochondria from normal subjects and patients with Barth syndrome using electron microscopic tomography. Lab Invest. 2007;87:40-8.
  52. Dudek J, et al. Cardiolipin deficiency affects respiratory chain function and organization in an induced pluripotent stem cell model of Barth syndrome. Stem Cell Res. 2013;11:806-19.
  53. Hagen TM, et al. Acetyl-L-carnitine fed to old rats partially restores mitochondrial function and ambulatory activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95:9562-6.
  54. Schlame M, et al. Phospholipid abnormalities in children with Barth syndrome. J Am Coll Cardiol. 2003;42:1994-9.
  55. Ayala-Hernandez MG, et al. Respiratory complex III2 assembles complex I via toxic intermediate in mitochondrial disease. bioRxiv. 2025:doi:10.1101/2025.06.17.660237.
  56. Liang C, et al. Formation of I2+III2 supercomplex rescues respiratory chain defects. Cell Metab. 2025;37:441-59.e11.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

BiochemistryMitochondriaSupercomplexesReconstitutionProteoliposomesRespirationMetabolism
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen