Deze studie presenteert een geïntegreerde visualisatieworkflow die gestandaardiseerde collectie en verwerking van bronchoalveolaire lavagevloeistof combineert met een flowcytometrie-panel met zeven markers, een multiplex cytokine-assay met 13 analyten en een uniforme analysepijplijn.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Onderzoeksartikel
Geïntegreerde visualisatie van neutrofielenrekrutering en inflammatoir cytokinenprofiel in bronchoalveolaire lavagevloeistof
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Bronchoalveolaire lavagevloeistof (BALF) is de meest direct toegankelijke bemonsteringsmatrix voor het bestuderen van ontsteking van de onderste luchtwegen, maar conventionele analyses vertrouwen op flowcytometrie met een enkele marker gecombineerd met analyte-voor-analyte enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), een aanpak die de informatiedichtheid beperkt en de koppeling tussen cellen en factoren maskeert. Deze studie presenteert een geïntegreerde visualisatieworkflow die gestandaardiseerde collectie en pre-processing koppelt aan een flowcytometrie-panel voor neutrofielen en monocyten met zeven markers, een multiplex cytokine-assay met 13 analyten en een uniforme analysepijplijn gebaseerd op uniform manifold approximation and projection (UMAP), FlowSOM-metaclustering, hiërarchische clustering, Spearman-correlatienetwerken en principale componentenanalyse (PCA).
De workflow werd toegepast op een prospectieve cohortstudie in één centrum met 12 volwassenen die een bronchoscopie ondergingen, bestaande uit 64 patiënten met een microbiologisch bevestigde longinfectie en 48 niet-infectieuze controles. Cytologische en flowcytometrische resultaten onthulden een uitgesproken verschuiving van een macrofaag-dominant naar een neutrofiel-dominant alveolair profiel tijdens infectie, waarbij het percentage neutrofielen steeg van een mediaan van 3,2% naar 68,4% en de absolute neutrofielenconcentratie ongeveer 50-voudig toenam. Multiplex profiling bracht een gecoördineerde cytokine-respons van drie modules in kaart, waarbij de chemokine-, pro-inflammatoire en regulatoire modules allemaal waren opgereguleerd; CXCL8/IL-8, IL-1β, IL-6, CXCL1/GRO-α en G-CSF vertoonden de sterkste discriminatie per individuele marker binnen de studiecohort (area under the curve [AUC] 0,89 tot 0,94). Integratieve visualisatie met behulp van PCA, een correlatiematrix en een netwerkgrafiek onthulde een nauw gekoppelde neutrofiel-chemokine-as op deelnemerniveau, waarbij het aantal neutrofielen in het BALF naar voren kwam als de centrale netwerkhub.
De workflow maakt uitsluitend gebruik van materiaal dat routinematig wordt verkregen uit klinisch geïndiceerde BAL, vereist geen aanvullend monstervolume en biedt een informatieintensief kader voor het analyseren van luchtweginflammatie bij respiratoire infecties. Dit kan haalbaar zijn in tertiaire laboratoria die zijn uitgerust met multiparameter flowcytometrie en multiplex bead-array platforms, met mogelijkheden voor longitudinale studies, single-cell analyse en therapeutische evaluatiestudies. Een bredere klinische adoptie van individuele analyten als biomarkers zal prospectieve validatie in onafhankelijke multicenter cohorten vereisen.
Inleiding
Infectieuze sterfgevallen door infecties van de onderste luchtwegen blijven een belangrijke oorzaak van wereldwijde mortaliteit, hoewel er vooruitgang is geboekt in vaccinatiestrategieën en behandelmethoden; dit geldt echter vooral voor de pediatrische populatie en ouderen1. Neutrofielen zijn de primaire cellen die worden gerapporteerd in de vroege stadia van een aangeboren immuunrespons in het aangetaste ademhalingsstelsel, een proces dat essentieel is voor het elimineren van het binnendringende pathogeen; ongecontroleerde neutrofiele ontsteking leidt echter tot de afbraak van de alveolaire capillaire barrière, oxidatieve weefselschade en de ontwikkeling van het acute respiratoire distress syndroom (ARDS)2,3. Neutrofielen in de longruimte vertonen bovendien rekruteringskinetiek, retentiepatronen en effectorgedrag die verschillen van die in andere weefsels, en deze verschillen bepalen of de infectie geneest of voortschrijdt naar ernstige pneumonie4.
Het bronchoalveolaire lavagevloeistof (BALF) is een belangrijke informatiebron over de alveolaire micro-omgeving en biedt de meest accurate weergave van de klinische immuniteit op deze locatie5. Het chemokine CXCL8 speelt een essentiële rol bij het rekruteren van neutrofielen naar de longen via de receptoren CXCR1 en CXCR2, samen met andere chemokines, waaronder CXCL1, CXCL2 en CXCL56. De cytokinen IL-1β, IL-6 en TNF-α versterken dit proces verder, terwijl IL-10 fungeert als een tegenwerkend cytokine. Er is aangetoond dat hun spiegels in BALF correleren met de ernst van longinfecties en de ontwikkeling van longcomplicaties als gevolg van bacteriële, virale en atypische pneumonie7, en multiplex BALF-biomarkerprofielen worden ingevoerd voor een eerdere diagnose en pathogeenonderscheiding bij infecties van de onderste luchtwegen8.
Routine BALF-testen slagen er meestal niet in om de biologie die ten grondslag ligt aan de test volledig te omvatten. Celgetallen kunnen worden geschat door cellen in cytospin-monsters handmatig te differentiëren, terwijl oplosbare mediatoren worden gemeten met behulp van individuele enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA's) en worden gepresenteerd als een staafdiagram. Chemokines, cytokines en elk celtype worden afzonderlijk geëvalueerd, zonder dat er een correlatie wordt vastgesteld tussen een specifieke concentratiegradiënt van chemokines en de celpopulaties die hiermee in het monster worden beïnvloed. De combinatie van cytokinemodules, dosis-responshoudingen tussen chemokines en neutrofielen, en patiëntsubpopulaties met hun eigen ontstekingskenmerken wordt vaak over het hoofd gezien bij afwezigheid van multivariate analyse9.
Vooruitgang in computationele technieken maakt een dergelijke holistische benadering steeds realistischer. De combinatie van multiparameter flowcytometrie en spectrale flowcytometrie met methoden voor dimensionaliteitsreductie, zoals t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) of uniform manifold approximation and projection (UMAP), maakt het mogelijk om hoogdimensionale immuunfenotypes in een tweedimensionale ruimte in kaart te brengen, waarbij UMAP een betere retentie van de globale topologie en reproduceerbaarheid vertoont bij toepassing op cytometriegegevens10. Multi-analyte panels van cytokinen, gevolgd door hiërarchische clustering en correlatienetwerken, helpen bij het identificeren van ernst-gecorreleerde signatures die niet waarneembaar zijn met benaderingen op basis van een enkele cytokine1. Ondanks de vooruitgang in het vakgebied is er nog geen workflow die deze methoden samenbrengt om de rekrutering van neutrofielen en cytokine-signatures uit dezelfde BALF-monsters bij luchtweginfecties te bestuderen. Deze studie beschrijft een geïntegreerde visualisatieworkflow om de rekrutering van neutrofielen te onderzoeken middels cytologie en multiparameter flowcytometrie, gevolgd door UMAP- en cytokine-signature-analyses via multiplex immunoassay, met hiërarchische clustering, correlatiematrices en principale componentenanalyse. De workflow resulteert in een geïntegreerde visualisatie die cellulaire en oplosbare immuunuitkomsten van de luchtwegen in één enkele grafiek omvat, gebruikmakend van BALF-monsters die routinematig worden verkregen tijdens klinisch geïndiceerde bronchoscopie bij infecties van de onderste luchtwegen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Studiepopulatie en ethiek
Dit was een prospectieve observationele monocentrische studie die werd uitgevoerd in een tertiair opleidingsziekenhuis tussen januari 2026 en april 2026. Het protocol werd goedgekeurd onder goedkeuringsnummer 2026HL-038, en van elke deelnemer werd schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen voorafgaand aan elke studieprocedure.
Volwassenen in de leeftijd van 18 tot 75 jaar die een diagnostische flexibele bronchoscopie met bronchoalveolaire lavage (BAL) ondergingen als onderdeel van de routinematige klinische zorg, werden opeenvolgend gerekruteerd en toegewezen aan een infectiegroep of een niet-infectie controlegroep op basis van hun definitieve klinische en microbiologische diagnoses. Een overzicht van de geïntegreerde visualisatieworkflow, van patiëntenwerving tot de geïntegreerde visuele output, wordt getoond in Figuur 1.
Figuur 1: Overzicht van de geïntegreerde visualisatieworkflow voor BALF-gebaseerde profilering van neutrofielwerving en inflammatoire cytokinerespons. De vijf fasen vatten van links naar rechts samen: prospectieve werving van de infectie- en controlegroepen met bronchoscopie en BAL, BALF-preprocessen tot een celpellet en een supernatantfractie, parallelle cellulaire (Wright-Giemsa-cytologie en multiparameter flowcytometrie) en oplosbare (13-plex bead-gebaseerde immunoassay) metingen, de uniforme visualisatiepijplijn (UMAP met FlowSOM-meta-clustering, hiërarchische heatmap, principale componentanalyse en Spearman-correlatienetwerk), en de geïntegreerde visuele output. Afkortingen: BAL = bronchoalveolaire lavage; BALF = BAL-vloeistof; UMAP = uniform manifold approximation and projection. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De inclusiecriteria voor de infectiegroep waren als volgt: (1) patiënten gediagnosticeerd met respectievelijk community-acquired pneumonia (CAP), hospital-acquired pneumonia (HAP) of ventilator-associated pneumonia (VAP) volgens de richtlijnen van de Infectious Diseases Society of America (IDSA) en de American Thoracic Society (ATS); (2) detectie van één of meer pathogenen via BALF-kweek ≥104 colony-forming units (CFU)/mL, respiratoire multiplex polymerasekettingreactie (PCR), metagenomische next-generation sequencing van BALF, of specifieke antigeen-/antilichaamtesten van gepaarde respiratoire/serummonsters.
De criteria voor de controlegroep waren als volgt: (1) niet-infectieuze redenen voor bronchoscopie, bestaande uit de beoordeling van een onbepaald longnodulus, abnormale radiologische resultaten die niet wezen op een infectie, of onderzoek naar chronische hoest; (2) geen acute pulmonale infectie, aangetoond door negatieve resultaten van microbiologisch onderzoek en de afwezigheid van tekenen van ontsteking of systemische infectie op het moment van de bronchoscopie; en (3) geen gebruik van antibiotica in de 30 dagen voorafgaand aan deelname. De controles werden geworven uit patiënten die een bronchoscopie ondergingen vanwege andere klinisch geïndiceerde pulmonale aandoeningen in plaats van uit gezonde vrijwilligers, om zo de populatie te weerspiegelen waaruit klinisch geïndiceerde BAL routinematig wordt verkregen in het studiecentrum.
De exclusiecriteria waren: (1) maligniteit en/of cytotoxische chemotherapie in de voorafgaande zes maanden; (2) HIV-seropositiviteit; (3) transplantatie van een solide orgaan of hematopoëtische stamcellen; (4) aanhoudende immunosuppressieve therapie met een dagelijkse equivalente dosis prednisolon > 0,3 mg/kg gedurende meer dan 3 weken; (5) zwangere/lacterende vrouwen; (6) voorgeschiedenis van bloedingsdiathese of enige contra-indicaties voor flexibele bronchoscopie; (7) reeds bestaande ernstige chronische respiratoire ziekte (chronisch obstructieve longziekte [COPD] Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease [GOLD] stadium III/IV, idiopathische pulmonale fibrose, ernstig persisterend astma of klinisch significante bronchiectasieën); (8) actieve tuberculose; (9) deelname aan een andere interventiestudie binnen de laatste 30 dagen. BAL werd uitgevoerd tijdens de eerste bronchoscopie, binnen 72 u na opname bij infecties en binnen 48 u na intubatie bij mechanisch beademde patiënten met infecties.
Steekproefgrootteberekeningen waren gericht op de primaire cellulaire uitkomst: het aantal neutrofielen in BALF tussen de groepen. Gezien de verwachte effectgrootte van 0,6 SD tussen geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde luchtwegen, en rekening houdend met een uitvalpercentage van 15%, was een minimale steekproefgrootte van 45 proefpersonen per groep nodig voor een tweezijdige α = 0,05 met een statistische power van 80%. Van de 156 geschikte kandidaten voldeden er 27 niet aan de geschiktheidseisen (18 voldeden niet aan de inclusiecriteria, voornamelijk door het onvermogen om binnen de gestelde periode een pathogeen agens te identificeren dat verantwoordelijk was voor hun ziekte of door een gebrek aan instemming met de procedure zelf; 9 overtraden de exclusiecriteria, hoofdzakelijk vanwege een actieve maligniteit of een voorgeschiedenis van chemotherapie, chronisch gebruik van corticosteroïden, ernstige pre-existent chronische longziekte of een bloedingsdiathese). De resterende 129 deelnemers ondergingen een bronchoscopie. Vervolgens werden 17 proefpersonen uit de studie verwijderd (7 vanwege een onvoldoende BALF-opbrengst < 40%; 4 vanwege het intrekken van de toestemming tijdens opname in het ziekenhuis; en 6 vanwege herclassificatie van proefpersonen na de definitieve microbiologische evaluatie – 4 controlekandidaten die op basis van cultuurresultaten werden gediagnosticeerd met een occulte infectie; en 2 infectiekandidaten bij wie na cultuuranalyse geen bewijs van infectie was). De uiteindelijke groep studieproefpersonen bestond uit 112 deelnemers: 64 met infectie en 48 zonder.
BALF-verzameling en voorbewerking
Bronchoscopie werd uitgevoerd door ervaren operators volgens het standaard institutionele protocol, in overeenstemming met gepubliceerde technische aanbevelingen voor bronchoalveolaire lavage12. Lidocaïne werd topisch gebruikt en patiënten ontvingen matige intraveneuze sedatie, terwijl supplementaire zuurstof werd toegediend om de zuurstofverzadiging (SpO₂) >92% te houden. De flexibele bronchoscoop werd ingebracht en gepositioneerd in het bronchopulmonale segment met radiologische afwijkingen. In gevallen waarin de radiologische afwijkingen diffuus of niet lokaliseerbaar waren, werden de rechter middenkwab of de linker lingulaire segmenten gekozen. Na elke instillatie werd een zachte handmatige aspiratie uitgevoerd met een negatieve druk < 100 mmHg. In totaal werden drie tot vijf instillaties van steriele zoutoplossing bij 37 °C, telkens 20–40 mL, voor een totaalvolume van 100–150 mL, toegediend. De herstelratio werd geschat als het teruggewonnen volume ten opzichte van het geïnstilleerde volume, en alleen monsters met een herstel van ≥40% werden meegenomen voor analyse.
De verzamelde monsters van de tweede en volgende spoelingen werden samengevoegd om bronchiale contaminatie te verminderen en een alveolair-verrijkt monster te verkrijgen. De pool van bronchoalveolaire lavagevloeistof (BALF) werd op ijs bewaard en binnen 2 u na collectie verwerkt, rekening houdend met recente bevindingen over veranderingen in de cellulaire samenstelling en differentiële tellingen na langdurige bewaring en opwarming van menselijke BALF-monsters13. Na filtratie met een steriel nylon gaas met een poriegrootte van 70 microns om het slijm te verwijderen, uitgevoerd door enkel mechanische passage zonder toevoeging van een mucolyticum of antiklontmiddel zoals dithiothreitol, aangezien pilotonderzoek uitwees dat dit voldoende was om slijmklonters te verwijderen zonder meetbaar verlies van de integriteit van oppervlakte-epitopen, werd de vloeistof gecentrifugeerd bij 400 × g gedurende 10 min bij 4 °C. Het supernatant werd afgeschonken en verdeeld in cryovials met een lage eiwitbinding voor cytokinenanalyse, en de cellen werden gesuspendeerd in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,5% runder-serumalbumine en 2 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), waarbij een deel werd bewaard voor cytologie en flowcytometrie. Cytokine-monsters werden ingevroren in vloeibare stikstof, bewaard bij –80 °C en vóór gebruik onderworpen aan maximaal één vries-dooi-cyclus.
Neutrofielcytologie en flowcytometrische kwantificering
Wat betreft de cytopathologie werd 100 µL van de BALF-cel-suspensie met een cytocentrifuge (zie Materialentabel) op een glazen objectglas aangebracht bij 300 × g gedurende 5 min, aan de lucht gedroogd en gekleurd met Wright-Giemsa. Differentiële tellingen werden uitgevoerd door een hematologie-technoloog zonder kennis van de medische achtergrond van de patiënt, die minimaal 400 cellen per objectglas telde en de percentages macrofagen, lymfocyten, neutrofielen en eosinofielen berekende. BALF-neutrofielenpercentages werden beschouwd als de primaire uitkomstmaat voor de cytopathologie, gezien het huidige bewijs dat suggereert dat deze nuttig zijn bij het onderscheid tussen infectieuze en niet-infectieuze longziekten bij patiënten met pulmonale infiltraten14.
Het protocol voor flowcytometrische kwantificering was gebaseerd op een recente validatie van het protocol voor vierkleurige leukocytendifferentiatie in bronchoalveolair spoelvocht (BALF)15 en bevatte aanvullende markers om neutrofielen te identificeren. Specifiek werden ongeveer 5 × 105 cellen geïsoleerd uit BALF gedurende 10 min bij 4 °C geblokkeerd met een human Fc receptor-blocking reagent (zie Tabel met materialen>) en vervolgens gedurende 20 min bij 4 °C gekleurd met antilichamen tegen CD45 (kloon HI30), CD66b (kloon G10F5), CD15 (kloon HI98), CD16 (kloon 3G8), CD11b (kloon ICRF44), CD14 (kloon M5E2) en HLA-DR (kloon L243), naast een fixeerbare viabiliteitskleurstof (zie Tabel met materialen>). Voor erytrocytlyse werd een commerciële erytrocyt-lyseoplossing (zie Tabel met materialen>) gedurende 10 min bij kamertemperatuur gebruikt. Na erytrocytlyse werden de cellen twee keer gewassen met PBS aangevuld met 2% foetaal kalfserum en geresuspendeerd in flowbuffer, waarna ze werden geanalyseerd met een multicolor flowcytometer (zie Tabel met materialen>). Compensatie werd uitgevoerd met gebruik van enkelvoudig gekleurde compensatiekraaltjes (zie Tabel met materialen>), en fluorescence-minus-one en ongekleurde buisjes werden voor elk paneel meegenomen.
Voor elk monster werden ten minste 1 × 105 CD45⁺ events verzameld. Eerst werden singlets op de FSC-A/FSC-H plot gegated, gevolgd door levende (viability dye⁻) CD45⁺ leukocyten, waarna uitsluiting van CD14⁺HLA-DR⁺ monocyten-macrofagen werd uitgevoerd om high-side scatter CD66b⁺ granulocyten te selecteren. Neutrofielen werden vervolgens binnen de granulocytenpopulatie gedefinieerd als CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ events. Deze primaire CD66b⁺ granulocyten-gate werd breed getrokken rond alle high-side-scatter events in plaats van te worden beperkt tot de CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ grens, zodat CD16-dim, CD11b-high geactiveerde neutrofielen en andere minder volwassen granulocytenvormen binnen de totale geautomatiseerde neutrofielentelling bleven; de striktere CD15⁺CD16⁺CD11b⁺ definitie werd alleen toegepast om de subset volwassen neutrofielen te karakteriseren die afzonderlijk werd gerapporteerd in de daaropvolgende clusteringanalyses. De neutrofielentelling in BALF (cellen/µL) werd geschat op basis van het percentage neutrofielen en het totale aantal kernhoudende cellen bepaald met een geautomatiseerde hematologie-analyzer (zie Table of Materials). Compensatiematrices, de gating-strategie en individuele kwaliteitscontolerapporten per monster werden gearchiveerd, en analisten bleven gedurende de acquisitie en analyse blind voor de toewijzing van de deelnemersgroepen.
Multiplex profiling van inflammatoire cytokinen
BALF-supernatanten werden één keer ontdooid op nat ijs, gevolgd door kort vortexen en klaring door centrifugatie bij 10.000 × g gedurende 5 min bij 4 °C direct voorafgaand aan de assay. De meting van 13 analyten in drie functionele categorieën werd uitgevoerd met een multiplex bead-gebaseerd immunoassay-platform met een aangepast magnetisch bead-panel (zie Tabel met materialen). De pro-inflammatoire groep bestond uit IL-1β, IL-6, IL-17A en TNF-α; de chemokinegroep bestond uit CXCL8/IL-8, CXCL1/GRO-α, CXCL10/IP-10, CCL2/MCP-1 en CCL3/MIP-1α; en de regulatoire groep bestond uit IL-10, IFN-γ, IL-1RA en G-CSF. De keuze voor de analyten was gebaseerd op diegenen die het vaakst als informatief werden gerapporteerd in multiplex-analyses van BALF- of serumcytokinen in studies naar pneumonie/ernstige respiratoire infecties7,11. De verdunningsfactor (1:2 in assaybuffer) werd bepaald op basis van een pilotexperiment uitgevoerd op een representatieve deelset van zowel geïnfecteerde als controlemonsters om ervoor te zorgen dat >90% van de metingen binnen de standaardcurve viel.
De standaardcurves werden bepaald met behulp van zevenpunts seriële verdunningen van de recombinante standaarden van de fabrikant, die in dubblo replicates op elke plaat werden klaargemaakt, inclusief één blanco put om de achtergrond af te trekken. De curvefitting werd uitgevoerd via een vijfparameter logistieke (5PL) regressie door de eigen acquisitie- en analysesoftware van het instrument (zie Tabel met materialenDe onderste kwantificeringsgrens (LLOQ) werd berekend als de kleinste hoeveelheid standaard die een back-fit recovery tussen 80% en 120% en een intra-run variatiecoëfficiënt (CV) van ≤ 20% opleverde. Waarden die onder de LLOQ vielen, werden vervangen door LLOQ/√2. Twee gepoolde kwaliteitscontrolemonsters van bronchoalveolaire lavagevloeistof (BALF), telkens afkomstig van een representatieve geïnfecteerde patiënt en een niet-aangetast subject, werden in aliquoten verdeeld en aan elke plaat toegevoegd om de prestaties op lange termijn te volgen. De kwaliteitsborgingsnormen waren gebaseerd op best-practice-aanbevelingen afgeleid van een 12-jarig multisite-bekwaamheidsprogramma voor multiplex bead-based assays.16inclusief eisen voor een intra-assay CV ≤ 10% in duplex wells, een inter-plate CV ≤ 20% voor kwaliteitscontrole en een minimaal aantal beads van ≥ 50 per analyt per well. Platen die niet aan de bovenstaande criteria voldeden, werden opnieuw uitgevoerd. De analyse werd in één batch binnen vier weken uitgevoerd, met gebruik van één kit-lot, waarbij de infectie- en controlesamples willekeurig werden afgewisseld.
Pipeline voor visualisatieanalyse
De Flow Cytometry Standard (FCS)-bestanden werden eerst geanalyseerd met commerciële flowcytometrie-software (zie Tabel met Materialen) om levende CD45⁺ singlets te compenseren en te gaten, en werden vervolgens geëxporteerd voor onbevooroordeelde analyse in R v4.4. Voor elk monster werden 10.000 CD45⁺ events gedownsampled en geconcateneerd, en de signaalintensiteiten werden getransformeerd met de arcsinh-functie met een cofactor van 150. Dimensiereductie en UMAP-projecties werden uitgevoerd met het uwot-pakket bij 15 dichtstbijzijnde buren en een minimale afstand van 0,1, samen met parallelle t-SNE-embeddings met het Rtsne-pakket met een perplexiteit van 3010. Fenotypeclusters werden geïdentificeerd met FlowSOM met 100 self-organizing map-nodes en verder onderverdeeld in 12–15 clusters via meta-clustering, waarbij gebruik werd gemaakt van een optimalisatiegebaseerde benadering die onlangs is gevalideerd voor hoogdimensionale cytometriegegevens17. Elk cluster werd geannoteerd op basis van de mediane expressie van lineage- en activatiemarkers en gecontroleerd aan de hand van de handmatige gates.
Voor de analyse van multiplex cytokine-gegevens werden de ruwe waarden eerst log₁₀-getransformeerd en vervolgens gestandaardiseerd tussen analyten via z-scoring voorafgaand aan aanvullende analyses. Zowel analyten als patiënten werden onderworpen aan hiërarchische clustering met behulp van Euclidische afstand en Ward.D2-koppeling; de resultaten werden weergegeven in een heatmap met clustering van rijen en kolommen. Een dergelijke benadering werd gebruikt om co-expressie-modules van cytokines te detecteren en patiëntsubsets in multiplex inflammatoire cohorten te classificeren9. Correlatiematrices werden gegenereerd voor alle cellulaire en oplosbare biomarkers met behulp van paarsgewijze Spearman-rangcorrelaties. Heatmaps van de correlatiematrices werden uitgezet naast een netwerk waarin knooppunten overeenkomen met biomarkers en randen wijzen op correlaties die de correctie voor meervoudig testen via de Benjamini–Hochberg (BH)-methode hebben doorstaan. De breedte van de randen werd geschaald volgens de grootte van de correlatiecoëfficiënt |ρ|, en randen werden alleen opgenomen als |ρ| ≥ 0,30 en p < 0,05 na correctie. Principaalcomponentanalyse (PCA) werd uitgevoerd op de gestandaardiseerde matrix met cellen en cytokines met behulp van de prcomp()-functie met unit variance scaling. De deelnemers werden geprojecteerd op de eerste twee hoofdcomponenten, waarbij infectie- en controlegroepen werden overgelegd. Consistente downsampling en standaardisatie van alle analyses waarborgden de vergelijkbaarheid tussen cellulaire en oplosbare biomarker-uitlezingen in alle visualisaties.
Statistische analyse
Continue variabelen werden beschreven met behulp van de mediaan (interkwartielafstand, IQR) bij een niet-normale verdeling volgens de Shapiro–Wilk-toetsen, en anders met het gemiddelde (standaarddeviatie, SD). Categorische variabelen werden beschreven aan de hand van frequenties en proporties. Vergelijkingen tussen groepen werden uitgevoerd met de Mann–Whitney U-toets wanneer continue variabelen een niet-normale verdeling hadden, de Welch t-toets wanneer continue variabelen normaal verdeeld waren, en de chi-kwadraattoets/Fisher's exact test wanneer dit van toepassing was voor categorische variabelen. De associaties tussen continue variabelen werden beoordeeld via de rangcorrelatiecoëfficiënt van Spearman. Om rekening te houden met de false discovery rate (FDR) bij multiplex cytokine- en correlatieanalyses, werden p-waarden gecorrigeerd met de Benjamini–Hochberg-methode met een afkapwaarde van q < 0,05. Tweezijdige p < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant in alle primaire analyses. Waar mogelijk werden gevallen met ontbrekende gegevens over individuele variabelen behouden en geanalyseerd via complete-case-analyse voor de betreffende variabele, terwijl meerdere imputaties met behulp van chained equations (m = 20) werden uitgevoerd om sensitiviteitsanalyses door te voeren. Receiver operating characteristic-curven en de bijbehorende area under the curve (AUC) werden gegenereerd voor individuele cytokines met behulp van het pROC-pakket binnen de volledige onderzoekscohort; er werd geen aparte externe validatiecohort gebruikt. Vooraf gespecificeerde sensitiviteitsanalyses herhaalden de primaire groepvergelijkingen na uitsluiting van deelnemers die binnen 72 h vóór de bronchoscopie antibiotica hadden ontvangen, en na stratificatie van de infectiegroep naar status van mechanische ventilatie en naar pneumoniesubtype (community-acquired, hospital-acquired of ventilator-associated). Analyses werden uitgevoerd met de pakketten rstatix, FlowSOM, uwot, ComplexHeatmap, igraph, pROC en mice in R v4.4. Figuren werden gegenereerd met commerciële wetenschappelijke grafieksoftware (zie Table of Materials).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Studiepopulatie en monsterkenmerken
Er waren 112 proefpersonen in de uiteindelijke analysecohort, met 64 proefpersonen in de infectiegroep en 48 proefpersonen in de niet-infectie controlegroep. De baseline demografie was vergelijkbaar tussen de groepen, terwijl laboratoriumparameters gerelateerd aan infectie hoger waren in de infectiegroep, zoals weergegeven in Tabel 1. Infecties werden primair veroorzaakt door Gram-negatieve bacteriën, waarbij de belangrijkst...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De robuustheid van dit protocol hangt af van enkele beslissingen die vóór en tijdens de analyse zijn genomen. Het vaststellen van de ondergrens voor het herstelpercentage op 40% en het combineren van de tweede en volgende aliquots was een bewuste keuze, aangezien de eerste aliquot een hogere verrijking van bronchiale luchtwegmaterialen bevat, terwijl het herstelpercentage systematisch varieert met leeftijd, geslacht, rookgeschiedenis en de doellocatie van de bronchus18. Het blokkeren van Fc-recept...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren.
Dankbetuigingen
Wij danken alle patiënten en vrijwilligers die aan deze studie hebben deelgenomen hartelijk voor hun waardevolle medewerking. Wij betuigen onze dank aan de Ethische Commissie voor de ethische goedkeuring (Goedkeuringsnr. 2026HL-038) en de normatieve begeleiding gedurende het gehele onderzoeksproces.
Wij danken het medisch personeel van de afdeling Respiratoire Aandoeningen, het bronchoscopiecentrum en het klinisch laboratorium voor hun ondersteuning bij de verzameling van klinische monsters, de verwerking van bronchoalveolaire lavagevloeistof en de microbiologische detectie. We waarderen daarnaast de ondersteuning van het technische platform van het centrale laboratorium van het ziekenhuis voor de experimenten met hoogdimensionale flowcytometrie en multiplex cytokineprofilering.
Dit onderzoek heeft geen specifieke subsidies ontvangen van financieringsinstanties uit de publieke, commerciële of non-profitsector.
Wij danken alle onderzoekers, technici en verpleegkundig personeel die betrokken waren bij dit project voor hun inspanningen bij de screening van patiënten, het beheer van monsters, de experimentele uitvoering en de dataverwerking.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Anti-human CD1b-antilichaam, Brilliant Violet 421, kloon ICRF4 | BioLegend | Cat. Nr. 301323 | Neutrofielactivatiemarker; violet laserkanaal Geen tekst beschikbaar om te vertalen. Voer a.u.b. de brontekst in. https://www.biolegend.com |
| Anti-human CD14-antilichaam, APC/Cyanine7, kloon M5E2 | BioLegend | Cat. nr. 301820 | Exclusiemarker voor monocyten-macrofagen; rood laserkanaal Geen tekst beschikbaar voor vertaling. Voer a.u.b. de brontekst in. https://www.biolegend.com |
| Anti-human CD15-antilichaam, PE, kloon HI98 | BioLegend | Cat. nr. 301906 | Neutrofielenlijnmarker; blauwe laserkanaal Geen tekst beschikbaar om te vertalen. Voer a.u.b. de brontekst in. https://www.biolegend.com |
| Anti-human CD16-antilichaam, Brilliant Violet 510, kloon 3G8 | BioLegend | Cat. nr. 302048 | Neutrofielrijping en NK-celmarker; violet laserkanaal Geen tekst beschikbaar voor vertaling. Voer a.u.b. de brontekst in. https://www.biolegend.com |
| Anti-human CD45-antilichaam, PerCP, kloon HI30 | BioLegend | Cat. No. 304026 / RRID: AB_8938 | Pan-leukocytenmarker; blauwe laserkanaal Het is niet mogelijk om de vertaling uit te voeren omdat er geen brontekst is verstrekt. Voer a.u.b. de tekst in die vertaald moet worden. https://antibodyregistry.org/AB_89338 |
| Anti-human CD6b-antilichaam, FITC, kloon G10F5 | BioLegend | Cat. nr. 305103 | Granulocytenmarker; blauw laserkanaal U heeft geen tekst verstrekt om te vertalen. Voer aub de brontekst in die u naar het Nederlands vertaald wilt hebben. https://www.biolegend.com |
| Anti-humaan HLA-DR antilichaam, PerCP/Cyanine5.5, kloon L243 | BioLegend | Cat. nr. 307629 | Marker voor antigeenpresenterende cellen; blauwe laserkanaal U heeft geen brontekst opgegeven om te vertalen. Voer a.u.b. de tekst in die u naar het Nederlands vertaald wilt hebben. https://www.biolegend.com |
| Geautomatiseerde hematologie-analyser (Sysmex XN-10) | Sysmex Corporation | Instrument (model XN-10) | Wordt gebruikt om het totale aantal kernhoudende cellen te bepalen voor de berekening van het absolute aantal neutrofielen Geen tekst verstrekt voor vertaling. https://www.sysmex.com |
| Runder serumalbumine | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Cat. Nr. A7906 | Gebruikt in flowcytometrie-kleuringsbuffer (0,5% w/v in PBS met 2 mM EDTA) Geen URL verstrekt. Voer a.u.b. de brontekst in die vertaald moet worden. https://www.sigmaaldrich.com/US/nl/product/sigma/a7906 |
| ComplexHeatmap-pakket (R/Bioconductor) | Bioconductor-project | v2.20 (open-source) | Gebruikt voor hiërarchische clustering-heatmaps van multiplex cytokine-data Geen URL verstrekt. Voer a.u.b. de brontekst in die vertaald moet worden. https://bioconductor.org/packages/ComplexHeatmap |
| Cytocentrifuge (Cytospin 4) | Thermo Fisher Scientific | Cat. nr. A78303 | Wordt gebruikt voor het vervaardigen van cytologische preparaten vanuit een BALF-cel-suspensie Geen tekst verstrekt. Voer a.u.b. de brontekst in die vertaald moet worden. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A78303 |
| Erytrocyten-lyse-oplossing (BD FACS Lysing Solution, 10X concentraat) | BD Biosciences | Cat. nr. 349202 | Gebruikt voor erytrocytenlyse na oppervlaktekleuring Geen tekst opgegeven voor vertaling. Voer a.u.b. de brontekst in. https://www.bdbiosciences.com |
| Ethylenediaminetetraazijnzuur (EDTA), 0,5 M pH 8,0 | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Cat. nr. AM9260G | Gebruikt in flowcytometrie-kleuringsbuffer bij 2 mM U heeft geen brontekst opgegeven om te vertalen. Voer aub de tekst of de URL in die u vertaald wilt hebben naar het Nederlands. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM9260G |
| Fixeerbare levensvatbaarheidsverf (Zombie NIR Fixable Viability Kit) | BioLegend | Cat.nr. 423105 | Live-dead exclusie voorafgaand aan gating; rood laserkanaal Geen tekst verstrekt voor vertaling. Voer a.u.b. de brontekst in. https://www.biolegend.com |
| Flexibel videobronchoscoop | Olympus Corporation (BF-1TQ290) | Instrument (model BF-1TQ290) | Gebruikt voor BAL onder matige sedatie Geen tekst beschikbaar voor vertaling. Voer a.u.b. de brontekst in. https://www.olympus-global.com |
| Flowcytometer, meerkleurig (CytoFLEX LX) | Beckman Coulter Life Sciences | Instrument (model CytoFLEX LX, zes-laserconfiguratie) | Gebruikt voor de acquisitie van het flowcytometrie-panel met zeven markers voor neutrofielen/monocyten U heeft geen brontekst opgegeven om te vertalen. Voer aub de tekst in die u vertaald wilt hebben. https://www.beckman.com |
| Software voor flowcytometrie-analyse (FlowJo) | BD Biosciences (FlowJo LLC) | v10.10 | Gebruikt voor compensatie en handmatige gating van FCS-bestanden De URL is niet opgegeven. Voer a.u.b. de brontekst in die vertaald moet worden. https://www.flowjo.com |
| FlowSOM-pakket (R/Bioconductor) | Bioconductor-project | v2.12 (open-source) | Gebruikt voor self-organising-map-clustering en meta-clustering van flowcytometriegegevens Vul de URL in. https://bioconductor.org/packages/FlowSOM |
| GraphPad Prism (statistische grafieksoftware) | GraphPad Software (Dotmatics) | v10 | Gebruikt voor het genereren van de definitieve figuren Geen tekst verstrekt voor vertaling. https://www.graphpad.com |
| Blokkeerreagens voor humane Fc-receptor (Human TruStain FcX) | BioLegend | Cat. No. 42301 / RRID: AB_2818986 | Fc-receptorblokkade voorafgaand aan antilichaamskleuring Aangezien er geen brontekst is verstrekt na "URL:", kan ik geen vertaling genereren. Voer alstublieft de Engelse tekst in die u vertaald wilt hebben. https://antibodyregistry.org/AB_2818986 |
| igraph-pakket (R) | CRAN | v2.0 (open-source) | Gebruikt voor het construeren en visualiseren van de correlatienetwerkgrafiek URL: https://cran.r-project.org/package=igraph |
| Cryobuisjes met lage eiwitbinding, 2,0 ml | Thermo Fisher Scientific (Nunc) | Cat. nr. 375418 | Gebruikt voor BALF-supernatant-aliquoten voor cytokinenanalyse Er is geen brontekst opgegeven om te vertalen. Voer a.u.b. de tekst in die u vertaald wilt hebben. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/375418 |
| Luminex multiplex bead-gebaseerd immunoassay-platform (MAGPIX) | Luminex Corporation (DiaSorin) | Instrument (model MAGPIX) | Gebruikt voor de acquisitie van de multiplex cytokine-assay Geen tekst opgegeven voor vertaling. https://www.luminexcorp.com |
| May-Grünwaldüleukocyten-Giemsa-kleuringsoplossing | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Cat. No. GS50 | Gebruikt voor differentiële celtelling via cytospin Geen URL verstrekt. https://www.sigmaaldrich.com/US/nl/product/sigma/gs50 |
| mice-pakket (R) | CRAN | v3.16 (open-source) | Gebruikt voor meervoudige imputatie via geketende vergelijkingen in sensitiviteitsanalyses Geen tekst opgegeven om te vertalen. Voer a.u.b. de brontekst in. https://cran.r-project.org/package=mice |
| Multiplex magnetische kraal cytokine/chemokine-panel (13-plex, custom; MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine) | Merck / MilliporeSigma | Cat. nr. HCYTOMAG-60K | Aangepast panel voor de meting van de 13 analyten beschreven in sectie 2.4 Door u geen brontekst te verstrekken, kan ik geen vertaling genereren. Voer a.u.b. de tekst in die u vertaald wilt hebben. https://www.merckmillipore.com |
| Celzeef met nylon gaas, 70 µm | Corning (Falcon) | Cat. nr. 352350 | Gebruikt voor mechanische filtratie van BALF om slijmklonters te verwijderen URL: https://www.corning.com |
| Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4 | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | Cat. nr. 101023 | Basisbuffer voor celresuspensie en kleuring Geen tekst beschikbaar om te vertalen. Voer a.u.b. de brontekst in. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/101023 |
| pROC-pakket (R) | CRAN | v1.18 (open source) | Wordt gebruikt voor het genereren van ROC-curves en AUC-waarden Er is geen brontekst opgegeven om te vertalen. Voer a.u.b. de tekst in die u vertaald wilt hebben. https://cran.r-project.org/package=pROC |
| R (statistische computeromgeving) | R Core Team | v4.4 (open-source) | Platform voor statistische analyses en visualisatie Het is geen tekst beschikbaar om te vertalen. Voer a.u.b. de brontekst in. https://www.r-project.org |
| rstatix-pakket (R) | CRAN | v0.7 (open-source) | Gebruikt voor groepvergelijkingen en correlatiestatistieken Het is geen tekst beschikbaar om te vertalen. Voer a.u.b. de brontekst in. https://cran.r-project.org/package=rstatix |
| Rtsne-pakket (R) | CRAN | v0.17 (open-source) | Gebruikt voor t-SNE-embeddings Geen URL verstrekt. https://cran.r-project.org/package=Rtsne |
| Enkelvoudig gekleurde compensatiebeads (UltraComp eBeads Compensation Beads) | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Cat. nr. 01-2-42 | Gebruikt voor single-colour compensatiecontroles Kopieer en plak hier de tekst die u wilt laten vertalen. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/01-2-42 |
| Natriumchlorideoplossing voor injectie, 0,9% (steriele zoutoplossing) | Baxter International | Cat. nr. 2B1324 | Gebruikt voor BAL-instillatie (10–150 mL, 20–aliquots van 40 mL bij 37 °C) Vanwege het ontbreken van brontekst in uw aanvraag, kan ik geen vertaling genereren. Voer aub de Engelse tekst in die u vertaald wilt hebben naar het Nederlands. https://www.baxter.com |
| uwot-pakket (R) | CRAN | v0.2 (open-source) | Gebruikt voor UMAP-dimensiereductie Geen inhoud opgegeven om te vertalen. Voer a.u.b. de brontekst in. https://cran.r-project.org/package=uwot |
| xPONENT (software voor multiplex-assay-acquisitie en curvefitting) | Luminex Corporation (DiaSorin) | v4.3 | Instrument-specifieke software voor 5PL-standaardcurvefitting U heeft geen brontekst verstrekt om te vertalen. Voer a.u.b. de tekst in die u naar het Nederlands vertaald wilt hebben. https://www.luminexcorp.com |
Referenties
- Yu X, et al. Estimating the global and regional burden of lower respiratory infections attributable to leading pathogens and the protective effectiveness of immunization programs. Int J Infect Dis. 2024;149:107268.
- Rizo-Téllez SA, Filep JG. Beyond host defense and tissue injury: the emerging role of neutrophils in tissue repair. Am J Physiol Cell Physiol. 2024;326(3):C661-83.
- Zhou X, Jin J, Lv T, Song Y. A narrative review: the role of NETs in acute respiratory distress syndrome/acute lung injury. Int J Mol Sci. 2024;25(3):1464.
- Haynes ME, Sullivan DP, Muller WA. Neutrophil infiltration and function in the pathogenesis of inflammatory airspace disease. Am J Pathol. 2024;194(5):628-36.
- Davidson KR, Ha DM, Schwarz MI, Chan ED. Bronchoalveolar lavage as a diagnostic procedure: a review of known cellular and molecular findings in various lung diseases. J Thorac Dis. 2020;12(9):4991-5019.
- Cambier S, Gouwy M, Proost P. The chemokines CXCL8 and CXCL12: molecular and functional properties, role in disease and efforts towards pharmacological intervention. Cell Mol Immunol. 2023;20(3):217-51.
- Lin J, et al. Local and systemic cytokine profiles in children with pneumonia-associated lung consolidation. Front Immunol. 2025;16:1546730.
- Huang C, et al. Heparin-binding protein in bronchoalveolar lavage fluid as a biomarker for discriminating severe bacterial and viral pneumonia in critically ill children. Mediators Inflamm. 2023;2023:6123911.
- Polley DJ, et al. Identification of novel clusters of co-expressing cytokines in a diagnostic cytokine multiplex test. Front Immunol. 2023;14:1223817.
- Roca CP, et al. A cross entropy test allows quantitative statistical comparison of t-SNE and UMAP representations. Cell Rep Methods. 2023;3(1):100389.
- Hawerkamp HC, et al. Characterisation of the pro-inflammatory cytokine signature in severe COVID-19. Front Immunol. 2023;14:1170012.
- Meyer KC, et al. An official American Thoracic Society clinical practice guideline: the clinical utility of bronchoalveolar lavage cellular analysis in interstitial lung disease. Am J Respir Crit Care Med. 2012;185(9):1004-14.
- Shionoya Y, et al. Impact of storage conditions on bronchoalveolar lavage fluid analysis: a human study. Diagnostics (Basel). 2025;15(11):1386.
- Li J, et al. Diagnostic test accuracy of cellular analysis of bronchoalveolar lavage fluid in distinguishing pulmonary infectious and non-infectious diseases in patients with pulmonary shadow. Front Med (Lausanne). 2024;11:1496088.
- Bratke K, Weise M, Stoll P, Virchow JC, Lommatzsch M. Flow cytometry as an alternative to microscopy for the differentiation of BAL fluid leukocytes. Chest. 2024;166(4):793-801.
- Rountree W, et al. Sources of variability in Luminex bead-based cytokine assays: evidence from twelve years of multi-site proficiency testing. J Immunol Methods. 2024;531:113699.
- Tao W, Sinha A, Raddassi K, Pandit A. Parameter optimization for stable clustering using FlowSOM: a case study from CyTOF. Front Immunol. 2024;15:1414400.
- Shikano K, et al. What are the factors affecting the recovery rate of bronchoalveolar lavage fluid? Clin Respir J. 2022;16(2):142-51.
- Baumann Z, et al. Optimized full-spectrum flow cytometry panel for deep immunophenotyping of murine lungs. Cell Rep Methods. 2024;4(11):100885.
- Bonilla DL, et al. The power of reagent titration in flow cytometry. Cells. 2024;13(20):1677.
- Ogishi M, et al. Multibatch cytometry data integration for optimal immunophenotyping. J Immunol. 2021;206(1):206-13.
- Sudo K, et al. Case study observational research: inflammatory cytokines in the bronchial epithelial lining fluid of COVID-19 patients with acute hypoxemic respiratory failure. Crit Care. 2024;28(1):134.
- Williams JE, et al. Epigenetic regulation of neutrophils in ARDS. Cells. 2025;14(15):1151.
- Zhang Y, et al. Interleukin-6 in blood and bronchoalveolar lavage fluid of hospitalized children with community-acquired pneumonia. Front Pediatr. 2022;10:922143.
- Bailey JI, et al. Profibrotic monocyte-derived alveolar macrophages are expanded in patients with persistent respiratory symptoms and radiographic abnormalities after COVID-19. Nat Immunol. 2024;25(11):2097-109.
- Haeger S, et al. The bronchoalveolar lavage dilution conundrum: an updated view on a long-standing problem. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2024;327(5):L807-13.
- Xiao K, et al. A pan-immune panorama of bacterial pneumonia revealed by a large-scale single-cell transcriptome atlas. Signal Transduct Target Ther. 2025;10(1):5.
- Shen X, et al. Single-cell transcriptome atlas revealed bronchoalveolar immune features related to disease severity in pediatric Mycoplasma pneumoniae pneumonia. MedComm (2020). 2024;5(10):e748.
- Megas S, Wilbrey-Clark A, Maartens A, Teichmann SA, Meyer KB. Spatial transcriptomics of the respiratory system. Annu Rev Physiol. 2025;87(1):447-70.
- Landoni G, et al. A multicenter phase 2 randomized controlled study on the efficacy and safety of reparixin in the treatment of hospitalized patients with COVID-19 pneumonia. Infect Dis Ther. 2022;11(4):1559-74.
- Sellarès-Nadal J, et al. Efficacy of tocilizumab for hospitalized patients with COVID-19 pneumonia and high IL-6 levels: a randomized controlled trial. Infection. 2025;53(5):1851-61.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.