Deze studie presenteert een geïntegreerde visualisatieworkflow die gestandaardiseerde collectie en verwerking van bronchoalveolaire lavagevloeistof combineert met een flowcytometrie-panel met zeven markers, een multiplex cytokine-assay met 13 analyten en een uniforme analysepijplijn.
Onderzoeksartikel
Geïntegreerde visualisatie van neutrofielenrekrutering en inflammatoir cytokinenprofiel in bronchoalveolaire lavagevloeistof
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Bronchoalveolaire lavagevloeistof (BALF) is de meest direct toegankelijke bemonsteringsmatrix voor het bestuderen van ontsteking van de onderste luchtwegen, maar conventionele analyses vertrouwen op flowcytometrie met een enkele marker gecombineerd met analyte-voor-analyte enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), een aanpak die de informatiedichtheid beperkt en de koppeling tussen cellen en factoren maskeert. Deze studie presenteert een geïntegreerde visualisatieworkflow die gestandaardiseerde collectie en pre-processing koppelt aan een flowcytometrie-panel voor neutrofielen en monocyten met zeven markers, een multiplex cytokine-assay met 13 analyten en een uniforme analysepijplijn gebaseerd op uniform manifold approximation and projection (UMAP), FlowSOM-metaclustering, hiërarchische clustering, Spearman-correlatienetwerken en principale componentenanalyse (PCA).
De workflow werd toegepast op een prospectieve cohortstudie in één centrum met 12 volwassenen die een bronchoscopie ondergingen, bestaande uit 64 patiënten met een microbiologisch bevestigde longinfectie en 48 niet-infectieuze controles. Cytologische en flowcytometrische resultaten onthulden een uitgesproken verschuiving van een macrofaag-dominant naar een neutrofiel-dominant alveolair profiel tijdens infectie, waarbij het percentage neutrofielen steeg van een mediaan van 3,2% naar 68,4% en de absolute neutrofielenconcentratie ongeveer 50-voudig toenam. Multiplex profiling bracht een gecoördineerde cytokine-respons van drie modules in kaart, waarbij de chemokine-, pro-inflammatoire en regulatoire modules allemaal waren opgereguleerd; CXCL8/IL-8, IL-1β, IL-6, CXCL1/GRO-α en G-CSF vertoonden de sterkste discriminatie per individuele marker binnen de studiecohort (area under the curve [AUC] 0,89 tot 0,94). Integratieve visualisatie met behulp van PCA, een correlatiematrix en een netwerkgrafiek onthulde een nauw gekoppelde neutrofiel-chemokine-as op deelnemerniveau, waarbij het aantal neutrofielen in het BALF naar voren kwam als de centrale netwerkhub.
De workflow maakt uitsluitend gebruik van materiaal dat routinematig wordt verkregen uit klinisch geïndiceerde BAL, vereist geen aanvullend monstervolume en biedt een informatieintensief kader voor het analyseren van luchtweginflammatie bij respiratoire infecties. Dit kan haalbaar zijn in tertiaire laboratoria die zijn uitgerust met multiparameter flowcytometrie en multiplex bead-array platforms, met mogelijkheden voor longitudinale studies, single-cell analyse en therapeutische evaluatiestudies. Een bredere klinische adoptie van individuele analyten als biomarkers zal prospectieve validatie in onafhankelijke multicenter cohorten vereisen.
Inleiding
Infectieuze sterfgevallen door infecties van de onderste luchtwegen blijven een belangrijke oorzaak van wereldwijde mortaliteit, hoewel er vooruitgang is geboekt in vaccinatiestrategieën en behandelmethoden; dit geldt echter vooral voor de pediatrische populatie en ouderen1. Neutrofielen zijn de primaire cellen die worden gerapporteerd in de vroege stadia van een aangeboren immuunrespons in het aangetaste ademhalingsstelsel, een proces dat essentieel is voor het elimineren van het binnendringende pathogeen; ongecontroleerde neutrofiele ontsteking leidt echter tot de afbraak van de alveolaire capillaire barrière, oxidatieve weefselschade en de ontwikkeling van het acute respiratoire distress syndroom (ARDS)2,3. Neutrofielen in de longruimte vertonen bovendien rekruteringskinetiek, retentiepatronen en effectorgedrag die verschillen van die in andere weefsels, en deze verschillen bepalen of de infectie geneest of voortschrijdt naar ernstige pneumonie4.
Het bronchoalveolaire lavagevloeistof (BALF) is een belangrijke informatiebron over de alveolaire micro-omgeving en biedt de meest accurate weergave van de klinische immuniteit op deze locatie5. Het chemokine CXCL8 speelt een essentiële rol bij het rekruteren van neutrofielen naar de longen via de receptoren CXCR1 en CXCR2, samen met andere chemokines, waaronder CXCL1, CXCL2 en CXCL56. De cytokinen IL-1β, IL-6 en TNF-α versterken dit proces verder, terwijl IL-10 fungeert als een tegenwerkend cytokine. Er is aangetoond dat hun spiegels in BALF correleren met de ernst van longinfecties en de ontwikkeling van longcomplicaties als gevolg van bacteriële, virale en atypische pneumonie7, en multiplex BALF-biomarkerprofielen worden ingevoerd voor een eerdere diagnose en pathogeenonderscheiding bij infecties van de onderste luchtwegen8.
Routine BALF-testen slagen er meestal niet in om de biologie die ten grondslag ligt aan de test volledig te omvatten. Celgetallen kunnen worden geschat door cellen in cytospin-monsters handmatig te differentiëren, terwijl oplosbare mediatoren worden gemeten met behulp van individuele enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA's) en worden gepresenteerd als een staafdiagram. Chemokines, cytokines en elk celtype worden afzonderlijk geëvalueerd, zonder dat er een correlatie wordt vastgesteld tussen een specifieke concentratiegradiënt van chemokines en de celpopulaties die hiermee in het monster worden beïnvloed. De combinatie van cytokinemodules, dosis-responshoudingen tussen chemokines en neutrofielen, en patiëntsubpopulaties met hun eigen ontstekingskenmerken wordt vaak over het hoofd gezien bij afwezigheid van multivariate analyse9.
Vooruitgang in computationele technieken maakt een dergelijke holistische benadering steeds realistischer. De combinatie van multiparameter flowcytometrie en spectrale flowcytometrie met methoden voor dimensionaliteitsreductie, zoals t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) of uniform manifold approximation and projection (UMAP), maakt het mogelijk om hoogdimensionale immuunfenotypes in een tweedimensionale ruimte in kaart te brengen, waarbij UMAP een betere retentie van de globale topologie en reproduceerbaarheid vertoont bij toepassing op cytometriegegevens10. Multi-analyte panels van cytokinen, gevolgd door hiërarchische clustering en correlatienetwerken, helpen bij het identificeren van ernst-gecorreleerde signatures die niet waarneembaar zijn met benaderingen op basis van een enkele cytokine1. Ondanks de vooruitgang in het vakgebied is er nog geen workflow die deze methoden samenbrengt om de rekrutering van neutrofielen en cytokine-signatures uit dezelfde BALF-monsters bij luchtweginfecties te bestuderen. Deze studie beschrijft een geïntegreerde visualisatieworkflow om de rekrutering van neutrofielen te onderzoeken middels cytologie en multiparameter flowcytometrie, gevolgd door UMAP- en cytokine-signature-analyses via multiplex immunoassay, met hiërarchische clustering, correlatiematrices en principale componentenanalyse. De workflow resulteert in een geïntegreerde visualisatie die cellulaire en oplosbare immuunuitkomsten van de luchtwegen in één enkele grafiek omvat, gebruikmakend van BALF-monsters die routinematig worden verkregen tijdens klinisch geïndiceerde bronchoscopie bij infecties van de onderste luchtwegen.
Protocol
Studiepopulatie en ethiek
Dit was een prospectieve observationele studie in één centrum, uitgevoerd in een tertiair academisch ziekenhuis tussen januari 2026 en april 2026. Het protocol werd goedgekeurd onder goedkeuringsnummer 2026HL-038, en van elke deelnemer werd schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen vóór aanvang van elke studieprocedure.
Volwassenen in de leeftijd van 18 tot 75 jaar die een diagnostische flexibele bronchoscopie met bronchoalveolaire lavage (BAL) ondergingen als onderdeel van de routinematige klinische zorg, werden opeenvolgend geworven en toegewezen aan een infectiegroep of een niet-infectie controlegroep op basis van hun definitieve klinische en microbiologische diagnoses. Een overzicht van de geïntegreerde visualisatieworkflow, van de werving van patiënten tot de geïntegreerde visuele resultaten, wordt getoond in Figuur 1.
Figuur 1Overzicht van de geïntegreerde visualisatieworkflow voor BALF-gebaseerde profilering van neutrofielenrekrutering en inflammatoire cytokineresponsen. De vijf fasen vatten van links naar rechts het volgende samen: prospectieve werving van de infectie- en controlegroepen met bronchoscopie en BAL, voorbewerking van BALF tot een celpellet en een supernatantfractie, parallelle cellulaire (Wright–Giemsa-cytologie en multiparameter flowcytometrie) en oplosbare (13-plex bead-based immunoassay) metingen, de uniforme visualisatiepijplijn (UMAP met FlowSOM meta-clustering, hiërarchische heatmap, principale componentanalyse en Spearman-correlatienetwerk) en de geïntegreerde visuele output. Afkortingen: BAL = bronchoalveolaire lavage; BALF = BAL-vloeistof; UMAP = uniform manifold approximation and projection. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De inclusiecriteria voor de infectiegroep waren als volgt: (1) patiënten gediagnosticeerd met respectievelijk community-acquired pneumonia (CAP), hospital-acquired pneumonia (HAP) of ventilator-associated pneumonia (VAP) volgens de richtlijnen van de Infectious Diseases Society of America (IDSA) en de American Thoracic Society (ATS); (2) detectie van één of meer pathogenen via BALF-kweek ≥104 colony-forming units (CFU)/mL, respiratoire multiplex polymerase kettingreactie (PCR), metagenomic next-generation sequencing van BALF, of specifieke antigeen/antilichaamtests van gepaarde respiratoire/serummonsters.
De criteria voor de controlegroep waren als volgt: (1) niet-infectieuze redenen voor bronchoscopie, bestaande uit de beoordeling van een onbepaald longnodulust, afwijkende radiologische resultaten die niet wezen op een infectie, of onderzoek naar chronische hoest; (2) geen acute pulmonale infectie, aangetoond door negatieve resultaten van microbiologisch onderzoek en de afwezigheid van tekenen van ontsteking of systemische infectie op het moment van de bronchoscopie; en (3) geen gebruik van antibiotica in de 30 dagen voorafgaand aan deelname. Controles werden geworven uit patiënten die een bronchoscopie ondergingen voor andere klinisch geïndiceerde pulmonale aandoeningen in plaats van uit gezonde vrijwilligers, wat representatief is voor de populatie bij wie in het studiecentrum routinematig klinisch geïndiceerde BAL wordt afgenomen.
De exclusiecriteria omvatten: (1) maligniteit en/of cytotoxische chemotherapie in de voorafgaande zes maanden; (2) HIV-seropositeit; (3) transplantatie van een solide orgaan of hematopoëtische stamcellen; (4) aanhoudende immunosuppressieve therapie met een dagelijks equivalent aan prednisone > 0,3 mg/kg gedurende meer dan 3 weken; (5) zwangere/lacterende vrouwen; (6) voorgeschiedenis van bloedingsdiathese of enige contra-indicaties voor flexibele bronchoscopie; (7) reeds bestaande ernstige chronische respiratoire aandoening (chronisch obstructieve longziekte [COPD] Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease [GOLD] stadium III/IV, idiopathische longfibrose, ernstig persisterend astma of klinisch significante bronchiectasie); (8) actieve tuberculose; (9) deelname aan een andere interventiestudie binnen de laatste 30 dagen. BAL werd uitgevoerd tijdens de eerste bronchoscopie, binnen 72 u na opname bij infecties, en binnen 48 u na intubatie bij mechanisch geventileerde patiënten met infecties.
De berekeningen van de steekproefomvang waren gericht op de primaire cellulaire uitkomst: het aantal neutrofielen in BALF tussen de groepen. Gezien de verwachte effectgrootte van 0,6 SD tussen geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde luchtwegen, en rekening houdend met een uitvalpercentage van 15%, was een minimale steekproefomvang van 45 proefpersonen per groep nodig voor een tweezijdige α = 0,05 met een statistische power van 80%. Van de 156 geschikte kandidaten voldeden er 27 niet aan de geschiktheidseisen (18 voldeden niet aan de inclusiecriteria, voornamelijk vanwege het onvermogen om binnen de gestelde periode een pathogeen agens te identificeren dat verantwoordelijk was voor hun ziekte of door een gebrek aan instemming met de procedure zelf; 9 overtraden de exclusiecriteria, primair vanwege een actieve maligniteit of een voorgeschiedenis van chemotherapie, chronisch corticosteroïdegebruik, ernstige reeds bestaande chronische longziekte of een bloedingsneiging). De overige 129 deelnemers ondergingen een bronchoscopie. Vervolgens werden 17 proefpersonen uit de studie verwijderd (7 vanwege een onvoldoende BALF-opbrengst < 40%; 4 vanwege het intrekken van de toestemming tijdens de ziekenhuisopname; en 6 vanwege herclassificatie van proefpersonen na de definitieve microbiologische evaluatie – 4 controlekandidaten die op basis van kweekresultaten werden gediagnosticeerd met een occulte infectie; en 2 infectiekandidaten bij wie na kweekanalyse geen bewijs van infectie werd gevonden). De uiteindelijke groep studieproefpersonen bestond uit 12 deelnemers: 64 met infectie en 48 zonder.
Afname en voorbewerking van BALF
De bronchoscopie werd uitgevoerd door ervaren operators volgens het standaard institutionele protocol, in overeenstemming met gepubliceerde technische aanbevelingen voor bronchoalveolaire lavage12. Lidocaïne werd topisch toegepast, en patiënten ontvingen matige intraveneuze sedatie terwijl supplementaire zuurstof werd toegediend om de zuurstofsaturatie (SpO₂) >92% te houden. De flexibele bronchoscoop werd ingebracht en gepositioneerd in het bronchopulmonale segment met radiologische afwijkingen. In gevallen waarin de radiologische afwijkingen diffuus of niet te lokaliseren waren, werden de rechter middenkwab of de linker lingulaire segmenten gekozen. Na elke instillatie werd een voorzichtige handmatige aspiratie uitgevoerd met een negatieve druk < 10 mmHg. In totaal werden drie tot vijf instillaties van steriele zoutoplossing bij 37 °C toegediend, telkens 20–40 mL, voor een totaalvolume van 10–150 mL. De herstelratio werd geschat als het teruggewonnen volume ten opzichte van het geïnstilleerde volume, en alleen monsters met een herstel van ≥40% werden meegenomen voor analyse.
De verzamelde monsters van de tweede en volgende spoelingen werden samengevoegd om bronchiale contaminatie te verminderen en een alveolair-verrijkt monster te verkrijgen. De pool van bronchoalveolaire lavagevloeistof (BALF) werd op ijs bewaard en binnen 2 u na afname verwerkt, rekening houdend met recente bevindingen over veranderingen in de cellulaire samenstelling en differentiatietellingen na langdurige bewaring en opwarming van menselijke BALF-monsters13. Na filtratie met een steriel nylon gaas met een poriegrootte van 70 microns om het slijm te verwijderen, uitgevoerd door enkel mechanische passage zonder toevoeging van een mucolyticum of antiklonteringsmiddel zoals dithiothreitol (aangezien pilottesting uitwees dat dit voldoende was om slijmklonters te verwijderen zonder meetbaar verlies van de integriteit van oppervlakte-epitopen stroomafwaarts), werd de vloeistof gecentrifugeerd bij 40 × g gedurende 10 min bij 4 °C. Het supernatant werd gedecanteerd en verdeeld over cryovials met een lage eiwitbinding voor cytokine-analyse, en de cellen werden gesuspendeerd in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,5% bovien serumalbumine en 2 mM ethylendiaminetetraazijnzuur (EDTA), waarbij een deel werd bewaard voor cytologie en flowcytometrie. De cytokine-monsters werden ingevroren in vloeibare stikstof, bewaard bij –80 °C en vóór gebruik onderworpen aan maximaal één vries-dooi-cyclus.
Neutrofielcytologie en flowcytometrische kwantificering
Wat betreft de cytopathologie werd 10 µL van de BALF-celсусpensie met een cytocentrifuge (zie Tabel met materialen) bij 30 × g gedurende 5 min op het glazen objectglas aangebracht, aan de lucht gedroogd en gekleurd met Wright-Giemsa. Differentiële tellingen werden uitgevoerd door een hematologie-technoloog zonder kennis van de medische achtergrond van de patiënt, die een minimum van 40 cellen per objectglas telde en de percentages macrofagen, lymfocyten, neutrofielen en eosinofielen berekende. De percentages neutrofielen in de BALF werden beschouwd als de primaire uitkomstmaat voor de cytopathologie, gezien het huidige bewijs dat wijst op hun nut bij het onderscheiden van infectieuze van niet-infectieuze longziekten bij patiënten met pulmonale infiltraten14.
Het protocol voor flowcytometrische kwantificering was gebaseerd op een recente validatie van het vierkleuren-protocol voor leukocyten-differentiatie in bronchoalveolaire lavagevloeistof (BALF)15 en bevatte aanvullende markers om neutrofielen te identificeren. Specifiek werden ongeveer 5 × 105 uit BALF geïsoleerde cellen gedurende 10 min bij 4 °C geblokkeerd met een human Fc receptor-blocking reagent (zie Tabel met materialen), waarna ze 20 min bij 4 °C werden gekleurd met antilichamen tegen CD45 (kloon HI30), CD6b (kloon G10F5), CD15 (kloon HI98), CD16 (kloon 3G8), CD1b (kloon ICRF4), CD14 (kloon M5E2) en HLA-DR (kloon L243), naast een fixeerbare viabiliteitskleurstof (zie Tabel met materialen). Voor de erytrocytenlyse werd een commerciële erytrocyten-lyseoplossing (zie Tabel met materialen) gebruikt gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Na de erytrocytenlyse werden de cellen twee keer gewassen met PBS aangevuld met 2% foetaal kalfserum en geresuspendeerd in flowbuffer, waarna ze werden geanalyseerd met een multicolor flowcytometer (zie Tabel met materialen). Compensatie werd uitgevoerd met behulp van enkelvoudig gekleurde compensatie-beads (zie Tabel met materialen), en voor elk panel werden fluorescence-minus-one en ongekleurde buisjes meegenomen.
Voor elk monster werden minstens 1 × 105 CD45⁺ events verworven. Eerst werden singlets op de FSC-A/FSC-H plot gegated, gevolgd door levende (viability dye⁻) CD45⁺ leukocyten, waarna uitsluiting van CD14⁺HLA-DR⁺ monocyt-macrofagen werd uitgevoerd om granulocyten met een hoge side scatter en CD6b⁺ te selecteren. Neutrofielen werden vervolgens binnen de granulocytpopulatie gedefinieerd als CD15⁺CD16⁺CD1b⁺ events. Deze primaire CD6b⁺ granulocyt-gate werd breed getrokken rond alle events met een hoge side scatter, in plaats van te worden beperkt tot de CD15⁺CD16⁺CD1b⁺ grens, zodat CD16-dim, CD11b-high geactiveerde neutrofielen en andere minder mature granulocytvormen behouden bleven in het totale automatische neutrofielenaantal; de striktere CD15⁺CD16⁺CD1b⁺ definitie werd alleen toegepast om de subset mature neutrofielen te karakteriseren die afzonderlijk werd gerapporteerd in de downstream clusteringanalyses. Het neutrofielenaantal in BALF (cellen/µL) werd geschat op basis van het neutrofielenpercentage en het totale aantal kernhoudende cellen, bepaald met een automatische hematologie-analyzer (zie Tabel met materialen). Compensatiematrices, de gatingstrategie en individuele kwaliteitscontrolerapporten per monster werden gearchiveerd, en analisten bleven gedurende de acquisitie en analyse blind voor de toewijzing van de deelnemersgroepen.
Multiplex profileren van inflammatoire cytokinen
BALF-supernatanten werden één keer ontdooid op nat ijs, gevolgd door kort vortexen en klaring door centrifugatie bij 10.0 × g gedurende 5 min bij 4 °C direct voorafgaand aan de assay. De meting van 13 analyten in drie functionele categorieën werd uitgevoerd met een multiplex bead-gebaseerd immunoassay-platform met een op maat gemaakt magnetisch bead-paneel (zie Tabel met materialen). De pro-inflammatoire groep bestond uit IL-1β, IL-6, IL-17A en TNF-α; de chemokine-groep bestond uit CXCL8/IL-8, CXCL1/GRO-α, CXCL10/IP-10, CCL2/MCP-1 en CCL3/MIP-1α; en de regulatoire groep bestond uit IL-10, IFN-γ, IL-1RA en G-CSF. De keuze van de analyten was gebaseerd op die welke het meest frequent als informatief worden gerapporteerd in multiplex-analyses van BALF- of serumcytokinen in studies naar pneumonie/ernstige respiratoire infecties7,1. De verdunningsfactor (1:2 in assaybuffer) werd bepaald aan de hand van een pilotautest uitgevoerd op een representatieve subset van zowel geïnfecteerde als controlemonsters om ervoor te zorgen dat >90% van de metingen binnen de standaardcurve viel.
De standaardcurves werden bepaald met behulp van zevenpunts seriële verdunningen van de recombinante standaarden van de fabrikant, in duplo voorbereid op elke plaat, inclusief één blanco put om de achtergrond te kunnen aftrekken. De curvefitting werd uitgevoerd via een vijf-parameter logistische (5PL) regressie door de eigen acquisitie- en analysesoftware van het instrument (zie Tabel met materialen). De onderste kwantificeringsgrens (LLOQ) werd berekend als de kleinste hoeveelheid standaard die een back-fit recovery tussen 80% en 120% en een intra-run variatiecoëfficiënt (CV) ≤ 20% opleverde. Waarden die onder de LLOQ vielen, werden vervangen door LLOQ/√2. Twee gepoolde kwaliteitscontrolemonsters van bronchoalveolaire lavagevloeistof (BALF), respectievelijk van een representatieve geïnfecteerde patiënt en een niet-aangetast subject, werden in aliquoten verdeeld en aan elke plaat toegevoegd om de prestaties op lange termijn te volgen. De kwaliteitsborgingsnormen waren gebaseerd op best-practice aanbevelingen afgeleid van een 12-jarig multisite multiplex bead-based assay bekwaamheidsprogramma16, inclusief vereisten voor een intra-assay CV ≤ 10% in dubbele putten, een inter-plaat CV ≤ 20% voor kwaliteitscontrole en een minimum bead-aantal van ≥ 50 per analyt per put. Platen die niet aan de bovenstaande criteria voldeden, werden opnieuw uitgevoerd. De analyse werd in één batch binnen vier weken uitgevoerd, met behulp van één kit-lot, waarbij de infectie- en controlemonsters willekeurig werden afgewisseld.
Pipeline voor visualisatieanalyse
De Flow Cytometry Standard (FCS)-bestanden werden eerst geanalyseerd met behulp van commerciële flowcytometrie-software (zie Tabel met materialen) om te compenseren en live CD45 te gaten⁺ singletten, en vervolgens geëxporteerd voor onbevooroordeelde analyse in R v4.4. Voor elk monster werden 10.0 CD45⁺ events werden gedownsampled en geconcateneerd, en signaalintensiteiten werden getransformeerd met de arcsinh-functie met een cofactor van 150. Dimensiereductie en UMAP-projecties werden uitgevoerd met het uwot-pakket bij 15 dichtstbijzijnde buren (nearest neighbors) en een minimale afstand van 0,1, samen met parallelle t-SNE-embeddings met het Rtsne-pakket met een perplexiteit van 3010Fenotypeclusters werden geïdentificeerd met FlowSOM met 10 zelforganiserende map-nodes en vervolgens via meta-clustering onderverdeeld in 12–15 clusters, met gebruik van een optimalisatiegebaseerde benadering die onlangs is gevalideerd voor hoogdimensionale cytometrydata.17Elke cluster werd geannoteerd op basis van de mediaanexpressie van lineage- en activatiemarkers en getoetst aan de hand van de handmatige gates.
Voor de analyse van multiplex cytokinedata werden de ruwe waarden eerst log₁₀-getransformeerd en vervolgens gestandaardiseerd tussen analyten via z-scoring voorafgaand aan verdere analyses. Zowel analyten als patiënten werden onderworpen aan hiërarchische clustering met behulp van de Euclidische afstand en Ward.D2-linkage; de resultaten werden weergegeven in een heatmap met rij- en kolomclustering. Deze aanpak werd gebruikt om co-expressie-modules van cytokinen te detecteren en patiëntsubsets te classificeren in multiplex inflammatoire cohorten9. Correlatiematrices werden gegenereerd voor alle cellulaire en oplosbare biomarkers met behulp van paarsgewijze Spearman-rangcorrelaties. Heatmaps van de correlatiematrices werden uitgezet naast een netwerk waarin knooppunten overeenkomen met biomarkers en verbindingen correlaties aangeven die de correctie voor meervoudig testen via de Benjamini–Hochberg (BH)-methode hebben overleefd. De breedte van de verbindingen werd geschaald volgens de grootte van de correlatiecoëfficiënt |ρ|, en verbindingen werden alleen opgenomen als |ρ| ≥ 0,30 en p < 0,05 na correctie. Principale componentenanalyse (PCA) werd uitgevoerd op de gestandaardiseerde matrix met cellen en cytokinen met behulp van de prcomp()-functie met unit variance scaling. Deelnemers werden geprojecteerd op de eerste twee principale componenten, waarbij de infectie- en controlegroepen werden overgelegd. Consistente downsampling en standaardisatie van alle analyses zorgden voor vergelijkbaarheid tussen de cellulaire en oplosbare biomarker-metingen in alle visualisaties.
Statistische analyse
Continue variabelen werden beschreven met de mediaan (interkwartielafstand, IQR) wanneer ze niet normaal verdeeld waren volgens Shapiro–Wilk-toetsen, en met het gemiddelde (standaarddeviatie, SD) in andere gevallen. Categorische variabelen werden beschreven aan de hand van frequenties en proporties. Vergelijkingen tussen groepen werden uitgevoerd met de Mann–Whitney U-toets wanneer continue variabelen niet-normale verdelingen hadden, de Welch t-toets wanneer continue variabelen normaal verdeeld waren, en de chi-kwadraat-toets/Fisher's exacte toets wanneer van toepassing voor categorische variabelen. De associaties tussen continue variabelen werden beoordeeld via de rangcorrelatiecoëfficiënt van Spearman. Om rekening te houden met de false discovery rate (FDR) in multiplex cytokine- en correlatieanalyses, werden p-waarden gecorrigeerd met de Benjamini–Hochberg-methode met een afkapwaarde van q < 0,05. Een tweezijdige p < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd in alle primaire analyses. Waar mogelijk werden gevallen met ontbrekende gegevens voor individuele variabelen behouden en geanalyseerd via complete-case-analyse voor de betreffende variabele, terwijl multiple imputaties met chained equations (m = 20) werden uitgevoerd om sensitiviteitsanalyses te verrichten. Receiver operating characteristic-curves en de bijbehorende area under the curve (AUC) werden gegenereerd voor individuele cytokines met behulp van het pROC-pakket binnen de volledige studiecohort; een aparte externe validatiecohort werd niet gebruikt. Vooraf gespecificeerde sensitiviteitsanalyses herhaalden de primaire groepvergelijkingen na uitsluiting van deelnemers die antibiotica hadden ontvangen binnen 72 h vóór de bronchoscopie, en na stratificatie van de infectiegroep op basis van mechanische ventilatiestatus en pneumonia-subtype (community-acquired, hospital-acquired of ventilator-associated). Analyses werden uitgevoerd met de rstatix, FlowSOM, uwot, ComplexHeatmap, igraph, pROC en mice pakketten in R v4.4. Figuren werden gegenereerd met commerciële wetenschappelijke grafische software (zie Tabel met Materialen).
Resultaten
Studiepopulatie en monsterkenmerken
Er waren 12 proefpersonen in de uiteindelijke analysecohort, met 64 proefpersonen in de infectiegroep en 48 proefpersonen in de niet-infectie controlegroep. De baseline demografische gegevens waren vergelijkbaar tussen de groepen, terwijl laboratoriumparameters gerelateerd aan infectie hoger waren in de infectiegroep, zoals weergegeven in Tabel 1. Infecties werden voornamelijk veroorzaakt door Gram-negatieve bacteriën, waarbij de belangrijkste bacteriële pathogenen Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa en Acinetobacter baumannii waren. Andere pathogenen waren Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, atypische agentia, virussen en gemengde infecties.
De herstelsnelheden van BALF voldeden aan de vooraf vastgestelde drempel van ≥40% voor alle behouden monsters, waarbij de snelheden in de infectiegroep iets lager waren dan in de controlegroep (mediaan 48,3% vs 53,3%, p = 0,03), wat consistent is met verhoogde ontsteking van de luchtwegen en mucosale congestie in de geïnfecteerde luchtwegen. Omdat het herstelde volume ook verschilde tussen de groepen (58 mL vs 64 mL, p = 0,04), kunnen alle gerapporteerde cytokoneconcentraties onderhevig zijn aan een bescheiden verschil in verdunningsfactor tussen de groepen; een vooraf vastgestelde sensitiviteitsanalyse, beperkt tot monsters met een herstelsnelheid van ≥50% (n = 42 infectie, n = 34 controle), reproduceerde de richting en grootte van elke vergelijking tussen de groepen (grootste verandering in effectgrootte < 8%), wat aangeeft dat verdunningsbias waarschijnlijk niet verantwoordelijk is voor de geobserveerde verschillen. De tijd tussen afname en verwerking was 65 min voor de infectiegroep en 62 min voor de controlegroep, wat binnen het venster van 2 u bleef. Kwaliteitscontrole- (QC) criteria op monsterniveau duidden op resultaten van hoge kwaliteit. Cytologische differentiatietellingen werden verkregen op basis van ≥40 getelde cellen in alle 112/112 monsters (10%). De flowcytometrie-acquisities voldeden aan het vooraf vastgestelde criterium van ≥1 × 105 CD45⁺ events in alle 12/12 monsters (100%), met een mediane levensvatbaarheid van levende cellen van 89,4% (IQR 85,6–92,8%). Alle multiplex cytokone-plates voldeden aan de QC-criteria na één herhaling. Voor alle 13 analyten was de intra-assay variatiecoëfficiënt (CV) 4,7% (2,1–9,3%, alle <10%), de inter-plate CV van gepoolde QC-monsters was 1,2% (6,8–18,4%, alle <20%), en het mediane aantal beads was 78 events/analyte/well (53–142, alle ≥ 50).
| Variabele | Infectie (n = 64) | Controle (n = 48) | p-waarde |
| Leeftijd, jaren, mediaan [IQR] | 62 [54–71] | 60 [52–68] | 0.41 |
| Man, n (%) | 38 (59.4) | 26 (54.2) | 0.59 |
| BMI, kg/m²2, mediaan [IQR] | 23.8 [21.4–26.2] | 23.5 [21.6–25.7] | 0.66 |
| Rookgeschiedenis, n (%) | 0.52 | ||
| Nooit | 28 (43.8) | 25 (52.1) | |
| Vorige | 22 (34.4) | 16 (33.3) | |
| Huidig | 14 (21.9) | 7 (14.6) | |
| Hypertensie, n (%) | 27 (42.2) | 18 (37.5) | 0.62 |
| Diabetes mellitus, n (%) | 17 (26.6) | 10 (20.8) | 0.49 |
| Coronaire hartziekte, n (%) | 11 (17.2) | 6 (12.5) | 0.51 |
| Chronische nierziekte, n (%) | 5 (7.8) | 3 (6.3) | 0.76 |
| Indicatie voor bronchoscopie, n (%) | — | ||
| Door de gemeenschap verworven pneumonie | 35 (54.7) | — | |
| Ziekenhuispneumonie | 19 (29.7) | — | |
| Ventilator-geassocieerde pneumonie | 10 (15.6) | — | |
| Indetermineerde longnodule | — | 23 (47.9) | |
| Aanhoudende radiografische afwijking | — | 15 (31.3) | |
| Evaluatie van chronische hoest | — | 10 (20.8) | |
| Veroorzaker pathogeen, n (%) | — | ||
| Gram-negatieve bacteriën | 28 (43.8) | ||
| Gram-positieve bacteriën | 16 (25.0) | ||
| Atypische pathogenen | 7 (10.9) | ||
| Respiratoire virussen | 8 (12.5) | ||
| Gemengde infectie | 5 (7.8) | ||
| Mechanische ventilatie bij BAL, n (%) | 14 (21.9) | 0 (0) | <0.001 |
| Antibioticagebruik binnen 72 u vóór BAL, n (%) | 41 (64.1) | 0 (0) | <0.001 |
| Instillatievolume, mL, mediaan [IQR] | 120 [120–140] | 120 [120–140] | 0.84 |
| Teruggewonnen volume, mL, mediaan [IQR] | 58 [49–68] | 64 [55–73] | 0.04 |
| BALF-terugwinningspercentage, %, mediaan [IQR] | 48.3 [42.5–55.6] | 53.3 [46.2–60.5] | 0.03 |
| Verwerkingstijd, min, mediaan [IQR] | 65 [50–85] | 62 [48–80] | 0.55 |
| Witte bloedcellen in het bloed, × 10⁹/L, mediaan [IQR] | 11.8 [8.6–14.5] | 6.4 [5.3–7.8] | <0.001 |
| Neutrofielen in het bloed, %, mediaan [IQR] | 78.5 [70.2–86.4] | 60.3 [54.6–66.8] | <0.001 |
| C-reactief proteïne, mg/L, mediaan [IQR] | 78.5 [42.6–128.4] | 4.2 [1.8–8.6] | <0.001 |
| Procalcitonine, ng/ml, mediaan [IQR] | 0.86 [0.32–2.45] | 0.05 [0.03–0.08] | <0.001 |
Tabel 1: Demografische, klinische en BALF-verwerkingskenmerken van de onderzoekscohort. De baseline demografische kenmerken, comorbiditeiten, indicaties voor bronchoscopie, veroorzakende pathogenen, procedurele parameters en laboratoriumwaarden van perifeer bloed worden vergeleken tussen de 64 deelnemers in de infectiegroep en de 48 in de niet-infectie controlegroep. Continue variabelen worden gerapporteerd als mediaan [interkwartielafstand] en vergeleken met de Mann–Whitney U test; categorische variabelen worden gerapporteerd als n (%) en vergeleken met de chi-kwadraat toets of de exacte toets van Fisher waar van toepassing. Afkortingen: BAL = bronchoalveolaire lavage; BALF = bronchoalveolair lavagespoelmiddel; BMI = body mass index; IQR = interkwartielafstand; WBC = aantal witte bloedcellen.
Visualisatie van de rekrutering van neutrofielen in BALF
Een duidelijke verschuiving in de verhouding van een door macrofagen gedomineerde populatie naar een door neutrofielen gedomineerde populatie werd waargenomen bij de geïnfecteerde proefpersonen, zoals weergegeven in Figuur 2. De cytocentrifuge-preparaten werden gekleurd met de Wright-Giemsa-techniek; de kleuring toonde een duidelijk onderscheid tussen de twee groepen, waarbij de controlegroep meer alveolaire macrofagen, enkele lymfocyten en een paar neutrofielen vertoonde, terwijl de geïnfecteerde groep werd gedomineerd door neutrofielen met frequente intracellulaire bacteriën, gedegenereerde kernen en toxische granulaties. Differentiële tellingen op basis van ten minste 40 getelde cellen werden gebruikt om de verschillen te verifiëren, waarbij de neutrofielenratio steeg van een mediaanwaarde van 3,2% (IQR: 1,8–5,6%) in de controlegroep naar 68,4% (IQR: 49,2–82,5%) in de geïnfecteerde groep (p < 0,001), terwijl die van de alveolaire macrofagen afnam van 8,2% (IQR: 82,4–92,5%) naar 2,6% (IQR: 12,3–38,5%) (p < 0,01). De percentages lymfocyten waren vergelijkbaar tussen de groepen (7,4% [4,8–1,3%] vs 6,5% [3,4–1,2%], p = 0,42).
De gating- en dimensionaliteitsreductie-analyses bevestigden en breidden de cellulaire fenotypen uit die via microscopie waren waargenomen. Na uitsluiting van debris, doubletten en dode cellen maakten CD45⁺CD6b⁺ granulocyten een mediaan van 65,8% (IQR: 46,2–79,4%) van de CD45⁺ leukocyten uit in de infectiegroep tegenover 4,1% (IQR: 2,3–6,8%) in de controlegroep (p < 0,01). Binnen de populatie granulocyten maakten CD15⁺CD16⁺CD1b⁺ mature neutrofielen 92,4% (IQR: 87,5–95,8%) van alle granulocyten uit in de infectiegroep tegenover 88,6% (IQR: 82,3–93,5%) in de controlegroep, wat erop wijst dat de gerekruteerde pool neutrofielen grotendeels bestond uit mature, volledig gedifferentieerde cellen in plaats van vroege precursoren. De UMAP- en t-SNE-projecties op basis van de arcsinh-getransformeerde oppervlakte-eiwitmatrix vertoonden nagenoeg identieke topologieën, waarbij infectiegevallen een prominent eiland van CD15⁺CD16⁺CD1b⁺ mature neutrofielen besetten dat in controlemonsters schaars bevolkt was, terwijl het HLA-DR⁺CD14⁺ alveolaire macrofaageiland het tegenovergestelde patroon vertoonde: dicht bevolkt in controles en schaars bevolkt bij infectie. Meta-clustering via FlowSOM identificeerde 13 subpopulaties, waaronder een subpopulatie mature neutrofielen (38,4% [2,6–56,2%] vs 2,8% [1,5–4,6%], p < 0,01) en een geactiveerd CD16-dim CD1b-high neutrofielencluster (22,6% [1,4–32,5%] vs 0,4% [0,1–1,2%], p < 0,01), die de grootste expansies tussen de groepen vertoonden.
Wat betreft het absolute aantal neutrofielen was er een ongeveer 50-voudige toename van neutrofielen in de BALF in de infectiegroep vergeleken met de controlegroep. Het totaal aantal gekernde cellen per µL BALF steeg van 156 cellen/µL (IQR 8–232) in de controlegroep naar 384 cellen/µL (IQR 180–712) in de infectiegroep (p < 0,01), en de aantallen neutrofielen stegen van 5 cellen/µL (IQR 2–13) in de controlegroep naar 262 cellen/µL (IQR 89–578) in de infectiegroep (p < 0,01). Paarsgewijze verschillen in het percentage neutrofielen en het absolute aantal tussen de groepen bleven zeer significant na Benjamini–Hochberg (BH) correctie (q < 0,01).
Figuur 2Visualisatie van neutrofielenrekrutering in BALF. Representatieve met Wright-Giemsa gekleurde cytospin-velden van een controledeelnehmer en een geïnfecteerde deelnemer illustreren de verschuiving van een op macrofagen gedomineerd naar een op neutrofielen gedomineerd cellulair BALF-profiel. Een gatingstrategie voor flowcytometrie in vier stappen (FSC-singlets → levende CD45+ cellen⁺ leukocyten → CD6b⁺ granulocyten na CD14⁺HLA-DR⁺ uitsluiting → CD15⁺CD16⁺CD1b⁺ volwassen neutrofielen), een UMAP-embedding van arcsinh-getransformeerde flowcytometriegegevens met een overlay van FlowSOM 13-metaclusters gekleurd op basis van biologische annotatie, en boxplots van het percentage neutrofielen in BALF en de absolute neutrofielenconcentratie (cellen/µL, logaritmische schaal) worden naast elkaar getoond om een directe vergelijking mogelijk te maken van de cellulaire fenotypen die zijn geïdentificeerd in de infectie- en controlegroepen. Afkortingen: BALF = bronchoalveolaire lavagevloeistof; FSC = forward scatter; UMAP = uniform manifold approximation and projection. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Visualisatie van ontstekingscytokineprofielen in BALF
Een patroon van gecoördineerde reacties over meerdere cytokineaussen onderscheidde de infectiegroep van de controlegroep, en de cytokinen werden ingedeeld in drie consistente functionele modules, zoals weergegeven in Figuur 3. Clustering van log₁₀-getransformeerde en genormaliseerde cytokinenconcentraties met behulp van de Ward.D2-methode leverde een duidelijk dendrogram van monsters op met twee groepen, waarbij infectiemonsters en controles zich aan tegenovergestelde uiteinden van het dendrogram bevonden en er slechts zeven foutgeclassificeerde deelnemers werden waargenomen (zes controles die clusterden met infectiemonsters, voornamelijk gevallen van chronische hoest met milde neutrofiele luchtweginflammatie, en één infectiemonster dat clusterde met controles, wat een vroege atypische pneumonie vertegenwoordigde). Het dendrogram van de analyten definieerde drie cytokinenclusters. Het chemokinecluster, bestaande uit CXCL8, CXCL1, CXCL10, CCL2 en CCL3, vertoonde de grootste fold change tussen de infectie- en controlegroepen en de hoogste intramodulaire correlatie. Het pro-inflammatoire cluster, met IL-1β, IL-6, IL-17A en TNF-α, vertoonde vergelijkbare directionele verhogingen, hoewel deze iets minder uitgesproken waren. Het regulatoire cluster, inclusief IL-10, IL-1RA, IFN-γ en G-CSF, was eveneens verhoogd in infectiemonsters, wat aantoont dat de respons niet puur pro-inflammatoir was, maar parallelle contra-regulatoire en antivirale mechanismen activeerde.
De medianen (IQR's) van alle geteste analyten waren hoger in de infectiegroep vergeleken met de controlegroep, en de gecorrigeerde p-waarde was kleiner dan 0,01 voor alle 13 analyten na correctie voor de false-discovery-rate op basis van BH (BH-FDR). Onder de analyten had CXCL8/IL-8 de hoogste concentratie en de sterkste fold change (van 68 [32–142] pg/mL in de controlegroep naar 2.485 [842–6.520] pg/mL in de infectiegroep, een toename van ongeveer 36-voudig). Een vergelijkbaar patroon werd waargenomen voor CXCL1/GRO-α, met een toename van ongeveer 21-voudig (78 [36–148] vs 1.672 [524–3.890] pg/mL). IL-1β vertoonde een toename van ongeveer 13-voudig (5,8 [2,6–11,4] vs 78 [29–184] pg/mL). IL-6, IL-1RA en G-CSF vertoonden toenames van 13- tot 16-voudig ( respectievelijk 16,4 [7,8–30,5] vs 248 [82–612] pg/mL; 12 [48–258] vs 1.748 [658–3.964] pg/mL; 24 [10–52] vs 384 [125–912] pg/mL). Andere kleinere toenames waren TNF-α (~8-voudig), CXCL10/IP-10 (~9-voudig), CCL2/MCP-1 (~8-voudig), CCL3/MIP-1α (~10-voudig), IL-10 (~10-voudig), IFN-γ (~6-voudig) en IL-17A (~4-voudig).
Een receiver operating characteristic-analyse binnen de cohort identificeerde IL-8 (AUC 0,94), IL-1β (AUC 0,92), IL-6 (AUC 0,91), CXCL1 (AUC 0,91) en G-CSF (AUC 0,89) als de analyten met de sterkste discriminatie door een enkele marker tussen de infectie- en controlegroepen; deze AUC-waarden vatten de discriminatie binnen de analysecohort samen bij afwezigheid van een aparte externe validatieset. Gevoeligheidsanalyse via multiple imputation by chained equations (m = 20) leverde schattingen op die binnen 5% van de medianen van de complete-case-analyse lagen voor elke analyt en veranderde de rangorde van de effectgroottes niet.
Vooraf gespecificeerde sensitiviteitsanalyses werden gebruikt om de invloed van eerdere antibioticagebruik en het type pneumonie op de waargenomen cytokineverschillen te beoordelen. Wanneer de primaire groepvergelijkingen werden herhaald na uitsluiting van de 41 deelnemers uit de infectiegroep (64,1%) die binnen 72 u before BAL antibiotica hadden ontvangen, bleven alle 13 analyten significant hoger in de resterende 23 infectiegevallen dan in de controles na BH-FDR-correctie (gecorrigeerde p < 0,001 voor de vijf belangrijkste discriminatoren), met puntschattingen die iets hoger waren in plaats van lager dan de medianen van de volledige cohort (bijvoorbeeld CXCL8/IL-8 2.860 [980–7.10] pg/mL en IL-1β 92 [34–210] pg/mL), wat consistent is met een gedeeltelijke demping van luchtwegcytokines door antibioticagebruik vóór de BAL. Stratificatie van de infectiegroep naar type pneumonie toonde dezelfde rangorde van chemokines en pro-inflammatoire cytokines aan voor community-acquired pneumonia (n = 35), hospital-acquired pneumonia (n = 19) en ventilator-associated pneumonia (n = 10), waarbij de subgroep met ventilator-associated pneumonia de hoogste mediane spiegels vertoonde voor CXCL8, CXCL1, IL-6 en G-CSF, en de status van mechanische ventilatie de richting van geen enkele tussengroepsvergelijking veranderde.
Figuur 3Visualisatie van ontstekingscytokineprofielen in BALF. Hiërarchische clustering heatmap van log₁₀-getransformeerde en z-gescorede concentraties van de 13 gemeten analyten over alle 112 deelnemers, met gekleurde annotatiebalken boven de heatmap die de groepsindeling (controle, infectie), het type pneumonie (CAP-, HAP- of VAP-pneumonie) en de categorie van het veroorzakende pathogeen (Gram-negatief, Gram-positief, atypisch, viraal of gemengde infectie) aangeven. Boxplots van de meest prominent differentieel abundante cytokinen (CXCL8/IL-8, IL-1β, IL-6, CXCL1/GRO-α, G-CSF en TNF-α; logboek₁₀ schaal, pg/mL) vergelijken de infectie- en controlegroepen. *** p < 0,01 na BH-correctie voor de false-discovery-rate. Afkortingen: BALF = bronchoalveolaire lavagevloeistof; BH = Benjamini–Hochberg; CAP = community-acquired pneumonie; HAP = ziekenhuispneumonie; VAP = ventilator-geassocieerde pneumonie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Gekoppelde visualisatie van neutrofielenrekrutering en cytokinenprofielen
Het koppelen van de cellulaire en oplosbare compartimenten onthulde een sterke biologische verbinding tussen de rekrutering van neutrofielen en het chemokine-systeem, zoals weergegeven in Figuur 4. Een tweedimensionale weergave werd afgeleid uit een hoofdcomponentanalyse (PCA) van de gestandaardiseerde cellulaire en cytokinenmatrix, waarbij PC1 verantwoordelijk was voor 51,1% van de totale variantie en PC2 voor een verdere 12,7%, wat neerkomt op een cumulatieve waarde van 63,8%. PC1 scheidde de infectiegroep van de controles, gekenmerkt door hoge positieve loadings voor BALF-neutrofielen, CXCL8, CXCL1, IL-6, IL-1β en G-CSF, en hoge negatieve loadings voor macrofagen. PC2 maakte onderscheid tussen een chemokine-rijk traject (hoge positieve loadings voor CXCL8 en CXCL1) en een regulatoire-rijk traject (positieve loadings voor IL-10, IL-1RA en IFN-γ), waardoor deelnemers binnen de infectiegroep de neiging hadden zich te scheiden op basis van ernst, waarbij gevallen van ventilator-geassocieerde pneumonie onder mechanische ventilatie in het chemokine-rijke kwadrant vielen.
Paarsgewijze Spearman-rangcorrelaties tussen 17 cellulaire en oplosbare kenmerken onthulden een sterke positieve correlatie tussen het aantal neutrofielen in de BALF en de algemene chemokine-as (CXCL8 ρ = 0.78; CXCL1 ρ = 0.74; CCL3 ρ = 0.69; CCL2 ρ = 0.61; CXCL10 ρ = 0.54; alle gecorrigeerde p < 0.01). Een tweede niveau van significante correlaties werd vastgesteld tussen neutrofielenaantallen en de pro-inflammatoire as (G-CSF ρ = 0.65; IL-1β ρ = 0.62; IL-6 ρ = 0.58; TNF-α ρ = 0.51), gevolgd door matige positieve correlaties met de regulatoire as (IL-10 ρ = 0.45; IL-1RA ρ = 0.48). Het percentage macrofagen vertoonde een spiegelbeeldige negatieve correlatie van vergelijkbare sterkte met zowel de chemokine- als de pro-inflammatoire as. Correlaties binnen de assen waren aanzienlijk sterker dan correlaties tussen de assen (mediaan |ρ| binnen as = 0.68 vs. mediaan |ρ| tussen assen = 0.3), wat het concept ondersteunt van gemeenschappelijke stroomopwaartse regulatoire paden die de chemokine-, pro-inflammatoire en regulatoire assen aansturen.
Het correlatienetwerk bracht deze koppeling in kaart op een graaf waarin neutrofielen in de BALF de meest centrale hub-node vormden, waarbij alle 13 randen naar cytokinen de BH-correctie voor meervoudig testen overleefden. Van de 136 mogelijke paarsgewijze verbindingen tussen de 17 kenmerken voldeden er 9 aan het gezamenlijke criterium van |ρ| ≥ 0,30 en een BH-gecorrigeerde p < 0,05 en werden behouden. De graaf van het correlatienetwerk vertoonde een duidelijke modulaire architectuur van drie blokken die de clusters uit de hiërarchische clustering recapituleerden: de dichtste en sterkste verbindingen bestonden tussen de chemokine-module en het aantal en percentage neutrofielen in de BALF, verbindingen van gemiddelde sterkte koppelden de pro-inflammatoire module aan zowel de neutrofielen als de chemokine-module, en dunne verbindingen vanuit de regulatoire module vormden een brug tussen de chemokine- en pro-inflammatoire blokken. De node voor het percentage macrofagen bevond zich tegenover het neutrofiel-chemokineblok en was hiermee verbonden via een waaier van negatief gewogen randen. Gezamenlijk onthulden PCA, de correlatiematrix en de netwerkgraaf een coherent patroon waarin infiltratie van neutrofielen in de BALF en de chemokine-respons op het niveau van de individuele deelnemer sterk geassocieerd zijn, en de pro-inflammatoire en regulatoire pathways fungeren als goed gedefinieerde maar onderling verbonden modules rond deze neutrofiel-chemokine-as.
Figuur 4Gekoppelde visualisatie van neutrofielrekrutering en inflammatoire cytokiinprofielen. PCA-biplot van de gestandaardiseerde cellulaire en cytokinenmatrix met deelnemers ingekleurd per groep, Spearman-correlatie-heatmap en netwerkgrafiek van alle 17 cellulaire en oplosbare kenmerken (knopen geschaald naar graad, verbindingen geschaald naar |ρ| en gefilterd op basis van BH-correctie p < 0,05 en |ρ| ≥ 0,30), wat het neutrofiel-chemokine-knooppunt benadrukt. Afkortingen: BH = Benjamini–Hochberg; PC = hoofdcomponent. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
DATABESCHIKBAARHEID:
De gedeïdentificeerde dataset op deelnemersniveau en de R-analysecode die in deze studie zijn gebruikt, worden verstrekt als Aanvullende Tabel S1 en Aanvullend Bestand 1. Andere gegevens ter ondersteuning van de bevindingen van deze studie zijn op redelijke aanvraag beschikbaar via de corresponderende auteur.
Aanvullende Tabel S1: BALF-dataset. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 1: Een ZIP-bestand met analysecodes. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussie
De robuustheid van dit protocol hangt af van enkele beslissingen die vóór en tijdens de analyse zijn genomen. Het vaststellen van de ondergrens voor het herstelpercentage op 40% en het combineren van de tweede en volgende aliquots was een bewuste keuze, aangezien de eerste aliquot een hogere verrijking van bronchiale luchtwegmaterialen bevat, terwijl het herstelpercentage systematisch varieert met leeftijd, geslacht, rookgeschiedenis en de doellocatie van de bronchus18. Het blokkeren van Fc-receptoren en het titreren van antilichamen tegen individuele klonen om correcte gating-grenzen te waarborgen tussen volwassen CD15⁺CD16⁺CD1b⁺ neutrofielen en CD14⁺HLA-DR⁺ alveolaire macrofagen (de dominante cellen in het BALF-monster met de hoogste aspecifieke kleuring en autofluorescentie-achtergrond) is essentieel om de consistentie tussen de twee groepen te behouden19,20. De beperking op het aantal vries-dooi-cycli en het tijdsbestek van 2 h voor de multiplex-analyse zijn evenmin willekeurig. Gegevens over menselijke BALF toonden een significante afname in het percentage neutrofielen van 6 tot 24 h, zelfs bij bewaring op 4 °C, terwijl de percentages macrofagen en lymfocyten consistent bleven13. Parameters voor t-SNE- en UMAP-algoritmen, evenals parameters voor het FlowSOM 10-node grid en voor 12–15 metaclusters, werden voorafgaand aan de analyse van de groepen bepaald om post-hoc tuning te voorkomen, wat een van de bekende redenen is voor de irreproduceerbaarheid van cytometry-pipelines16. Operatoren en plaat-/run-identificatie kunnen per celgebeurtenis worden bewaard om batch-correctiemethoden toe te passen in toekomstige grootschalige analyses21.
Er zijn verschillende veelvoorkomende storingsmodi die geen wijzigingen in het protocol vereisen. Een laag herstel (<40%) is doorgaans te wijten aan onvoldoende positionering van de wig of overmatige zuigkracht; dit probleem moet worden verholpen door de positie van het bronchoscoop aan te passen en de zuigkracht te verminderen tot <10 mmHg voordat een volgend aliquoot wordt geaspireerd. Overmatige autofluorescentie van alveolaire macrofagen, de belangrijkste storende factor bij flowcytometrische analyse van longcellen, kan worden beperkt door in elke batch ongekleurde longcelcontroles op te nemen en de gate voor macrofagen met een hoge side-scatter duidelijk te definiëren, in plaats van uitsluitend te vertrouwen op viabiliteitskleuringen19. Multiplex panels worden vaak beïnvloed door lage bead-counts en uitschieters met hoge waarden. Het uitvoeren van een preliminaire verdunningscurve voor een subset van geïnfecteerde monsters en controlemonsters voorafgaand aan het vaststellen van een 1:2 verdunning, voorkomt verzadiging van het signaal van CXCL8, CXCL1 en G-CSF, die zich bevinden in het hoogste deel van de standaardcurve voor pneumoniemonsters, vanwege hun eerder ontdekte matrixeffect in BALF-monsters2. Het protocol kan verder worden aangepast afhankelijk van de specifieke kenmerken van de cohort. Wanneer monsters voornamelijk één type pathogeen bevatten, zou het beperken van het kernpanel tot enkel chemokinen en pro-inflammatoire mediatoren voldoende statistische kracht behouden. In het geval van een gemengde populatie bestaande uit bacteriën, virussen en atypische pathogenen, blijft het nuttig om ook regulatoire mediatoren te meten, aangezien onlangs is bewezen dat er een pathogeen-specifieke signatuur bestaat in alveolaire neutrofielen en macrofagen23, en is aangetoond dat een combinatie van pro- en regulatoire BALF-cytokinen de ernst van de ziekte bij community-acquired pneumonie weerspiegelt24.
De bijdrage van de huidige workflow is niet de individuele observatie van neutrofiele influx of de stijging van chemokines en pro-inflammatoire cytokines bij respiratoire infecties, beide uitgebreid gedocumenteerd, maar de koppeling van een zeven-marker neutrofiel-monocyt flowcytometrie-panel en een 13-analyte multiplex immunoassay aan een gedeelde visualisatiepijplijn toegepast op hetzelfde BALF-monster. De implementatie van een zeven-marker panel gericht op neutrofielen en monocyten, samen met een 13-analyte multiplex immunoassay, legt de fenotypische en cytokinecomplexiteit vast; zonder dit zou de analyse meerdere onafhankelijke tests vereisen met een veel groter volume BALF dan verkrijgbaar is uit een normaal bronchoscopie-monster. Dat laatste sluit goed aan bij eerder werk waaruit blijkt dat multicolor flowcytometrie net zo betrouwbaar is als handmatige microscopie voor de identificatie van celtypen in BALF-monsters15, terwijl de acceptatiecriteria voor dat laatste de best practices weerspiegelen van een erkend multicenter proficiency-programma voor multiplex bead-based assays16. In het bijzonder onthullen de gecombineerde heatmap, netwerkgrafiek en PCA, gebouwd met identieke gestandaardiseerde inputs, relaties tussen celtypen en hun geassocieerde factoren die voorheen alleen konden worden afgeleid door onafhankelijke staafdiagrammen bij elkaar op te tellen. Dit is van belang omdat de uit BALF afgeleide chemokines CXCL8, CCL2 en CCL3 samenwerken om neutrofielen en monocyten uit een gedeeld circulatiebed te rekruteren, en hun gezamenlijke structuur informatie bevat die niet kan worden verkregen uit onafhankelijke single-analyte readouts9,10. BALF wordt al routinematig verkregen voor klinische doeleinden en vereist geen extra volume, waardoor de workflow kan worden gepositioneerd als een translationele add-on voor bestaande bronchoscopie-diensten in plaats van als een zelfstandige diagnostische procedure.
De praktische doorlooptijd van de volledige workflow, bestaande uit monstertransport, kleuring, flowcytometrie-acquisitie, incubatie en uitlezing van de multiplex-assay en de daaropvolgende computationele pijplijn, bedraagt onder onderzoekscondities ongeveer 24 h. De workflow is daarom gepositioneerd als een tool voor diepe fenotypering voor mechanistische karakterisering en het monitoren van de behandelingsrespons, en niet als een acute bedside-triage-assay voor tijdskritische beslissingen, zoals het onmiddellijk onderscheid tussen ventilator-geassocieerde pneumonie en steriel acuut respiratoir distress syndroom, waarvoor snellere microbiologische assays en biomarkers met een enkele marker de standaardzorg blijven.
Er moeten enkele beperkingen worden genoemd. BALF wordt verzameld uit de luchtwegen en representeert de onmiddellijke oppervlakte-interacties van de luchtwegen, maar bevat geen cellen die zich in de alveolaire wand en het septum bevinden, waar veel geactiveerde macrofagen en weefselresidentie lymfocyten gelokaliseerd zijn. Er is dus geen één-op-één verhouding tussen de immuunstatus van de luchtwegen en het parenchym, wat consistent is met eerder gepubliceerde gegevens25. Multiplex detectie op basis van beads lijdt onder antilichaam-kruisreactiviteit, evenals matrixeffecten, die vooral prevalent zijn in de mucine- en surfactant-bevattende omgeving van BALF vergeleken met die van bloedserum; daarnaast kan het proces van verdunning van de epitheelbekledingsvloeistof met zoutoplossing niet worden gecorrigeerd door enige van de endogene markers, zoals ureum, in overeenstemming met recent gepubliceerde kritieken26. Het teruggewonnen lavagevolume was in de infectiegroep gemiddeld 6 mL lager dan in de controlegroep, waardoor de hier gerapporteerde absolute concentraties onderhevig zijn aan een bescheiden intergroepsverschil in verdunningsfactor, en er is geen endogene verdunningsmarker toegepast. Eerdere blootstelling aan antibiotica bij 41 van de 64 deelnemers in de infectiegroep (64,1%) kan de cytokineconcentraties in de luchtwegen en het herstel van pathogenen verminderen. Belangrijk is dat het protocol slechts een momentopname vertegenwoordigt op één tijdstip tijdens een klinisch geïndiceerde bronchoscopie, waardoor analyse van de kinetiek van neutrofielenrekrutering, maximale chemokine-secretie en de resolutie hiervan bij individuele patiënten is uitgesloten. AUC-waarden voor enkelvoudige analyten zijn afgeleid van dezelfde cohort die is gebruikt voor biomarkeridentificatie, in afwezigheid van een onafhankelijke validatiecohort, en moeten worden geïnterpreteerd als maten van discriminatie binnen de cohort in plaats van als extern gevalideerde diagnostische prestaties; de adoptie van elke enkelvoudige marker-cutoff in de klinische praktijk zou prospectieve validatie in een onafhankelijke multicentrische cohort vereisen. Vooraf gespecificeerde sensitiviteitsanalyses, beperkt tot monsters met een hoger herstel, tot antibiotica-naïve deelnemers, en gestratificeerd naar status van mechanische ventilatie en naar pneumoniesubtype (community-acquired, hospital-acquired of ventilator-associated), veranderden de richting van de intergroepsvergelijkingen niet.
In de toekomst kunnen deze beperkingen worden aangepakt door single-cell RNA-sequencing of CITE-seq toe te voegen aan dezelfde BALF-pellets die worden gebruikt voor eiwit- en celkwantificatie, welke succesvol zijn toegepast in grote cohorten van bacteriële pneumonie en pediatrische Mycoplasma pneumoniae-pneumonie, om alveolaire neutrofielen en macrofaagsubsets te onthullen die niet te onderscheiden zijn met traditionele flowcytometrie27,28. Het toevoegen van de informatie verkregen via analyses van de luchtwegen aan de informatie verschaft door imaging mass cytometry of ruimtelijke transcriptomica van overeenkomstige biopten of zelfs autopsiemateriaal zou deze informatie contextualiseren29. Het koppelen van longitudinale BALF-bemonstering aan de evaluatie van CXCR1/CXCR2-antagonisten en IL-6-receptorblokkade, waarvan beide een overlevings- of orgaanondersteunend voordeel hebben getoond bij ernstige pneumonie en acute respiratory distress syndrome (ARDS), zou er ook toe leiden dat de neutrofiel-chemokine-as die door deze workflow naar voren is gebracht, kan worden getest als therapeutisch beslissingshulpmiddel30,31.
Concluderend beschrijft deze studie een geïntegreerde visualisatieworkflow bestaande uit gestandaardiseerde procedures voor de collectie en preparatie van BALF, een flowcytometrie-panel met zeven markers voor de kwantificering van de neutrofiel-monocytencompositie, een multiplex-cytokine-assay voor de meting van 13 cytokinen en een gemeenschappelijk visualisatieplatform bestaande uit UMAP-, hiërarchische clustering-, correlatienetwerk- en PCA-analyses. Door de workflow toe te passen op een prospectieve cohort van 12 volwassenen die een klinisch geïndiceerde bronchoscopie ondergingen, identificeerde de analyse een opvallende overgang in de compositie van alveolaire immuuncellen van macrofagen naar neutrofielen bij patiënten met een infectie, detecteerde een cytokine-responspatroon bestaande uit drie modules en legde een sterk gekoppelde neutrofiel-chemokine-as bloot die niet waarneembaar is met enkelvoudige marker-metingen. De procedure is uitsluitend gebaseerd op materiaal dat tijdens de klinische diagnose is verzameld, vereist geen extra monstervolume en is mogelijk haalbaar in tertiaire laboratoria die zijn uitgerust voor multiparameter flowcytometrie en multiplex bead-array-analyse. Bredere adoptie en enig gebruik van individuele analyten als diagnostische biomarkers vereisen prospectieve validatie in onafhankelijke multicentrische cohorten. De studie presenteert hiermee een reproduceerbare en datarijke methodologie voor het karakteriseren van luchtweginflammatie bij respiratoire infecties en biedt een basis voor verdere ontwikkeling naar longitudinale studies, single-cell- en spatiale analyse en therapeutische beoordeling van immunomodulatie gericht op de neutrofiel-chemokine-as.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren.
Dankbetuigingen
Wij danken alle patiënten en vrijwilligers die aan deze studie hebben deelgenomen hartelijk voor hun waardevolle medewerking. Wij betuigen onze dank aan de Ethische Commissie voor de ethische goedkeuring (Goedkeuringsnr. 2026HL-038) en de normatieve begeleiding gedurende het gehele onderzoeksproces.
Wij danken het medisch personeel van de afdeling Respiratoire Aandoeningen, het bronchoscopiecentrum en het klinisch laboratorium voor hun ondersteuning bij de verzameling van klinische monsters, de verwerking van bronchoalveolaire lavagevloeistof en de microbiologische detectie. We waarderen daarnaast de ondersteuning van het technische platform van het centrale laboratorium van het ziekenhuis voor de experimenten met hoogdimensionale flowcytometrie en multiplex cytokineprofilering.
Dit onderzoek heeft geen specifieke subsidies ontvangen van financieringsinstanties uit de publieke, commerciële of non-profitsector.
Wij danken alle onderzoekers, technici en verpleegkundig personeel die betrokken waren bij dit project voor hun inspanningen bij de screening van patiënten, het beheer van monsters, de experimentele uitvoering en de dataverwerking.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Anti-human CD1b-antilichaam, Brilliant Violet 421, kloon ICRF4 | BioLegend | Cat. Nr. 301323 | Neutrofielactivatiemarker; violet laserkanaal Geen tekst beschikbaar om te vertalen. Voer a.u.b. de brontekst in. https://www.biolegend.com |
| Anti-human CD14-antilichaam, APC/Cyanine7, kloon M5E2 | BioLegend | Cat. nr. 301820 | Exclusiemarker voor monocyten-macrofagen; rood laserkanaal Geen tekst beschikbaar voor vertaling. Voer a.u.b. de brontekst in. https://www.biolegend.com |
| Anti-human CD15-antilichaam, PE, kloon HI98 | BioLegend | Cat. nr. 301906 | Neutrofielenlijnmarker; blauwe laserkanaal Geen tekst beschikbaar om te vertalen. Voer a.u.b. de brontekst in. https://www.biolegend.com |
| Anti-human CD16-antilichaam, Brilliant Violet 510, kloon 3G8 | BioLegend | Cat. nr. 302048 | Neutrofielrijping en NK-celmarker; violet laserkanaal Geen tekst beschikbaar voor vertaling. Voer a.u.b. de brontekst in. https://www.biolegend.com |
| Anti-human CD45-antilichaam, PerCP, kloon HI30 | BioLegend | Cat. No. 304026 / RRID: AB_8938 | Pan-leukocytenmarker; blauwe laserkanaal Het is niet mogelijk om de vertaling uit te voeren omdat er geen brontekst is verstrekt. Voer a.u.b. de tekst in die vertaald moet worden. https://antibodyregistry.org/AB_89338 |
| Anti-human CD6b-antilichaam, FITC, kloon G10F5 | BioLegend | Cat. nr. 305103 | Granulocytenmarker; blauw laserkanaal U heeft geen tekst verstrekt om te vertalen. Voer aub de brontekst in die u naar het Nederlands vertaald wilt hebben. https://www.biolegend.com |
| Anti-humaan HLA-DR antilichaam, PerCP/Cyanine5.5, kloon L243 | BioLegend | Cat. nr. 307629 | Marker voor antigeenpresenterende cellen; blauwe laserkanaal U heeft geen brontekst opgegeven om te vertalen. Voer a.u.b. de tekst in die u naar het Nederlands vertaald wilt hebben. https://www.biolegend.com |
| Geautomatiseerde hematologie-analyser (Sysmex XN-10) | Sysmex Corporation | Instrument (model XN-10) | Wordt gebruikt om het totale aantal kernhoudende cellen te bepalen voor de berekening van het absolute aantal neutrofielen Geen tekst verstrekt voor vertaling. https://www.sysmex.com |
| Runder serumalbumine | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Cat. Nr. A7906 | Gebruikt in flowcytometrie-kleuringsbuffer (0,5% w/v in PBS met 2 mM EDTA) Geen URL verstrekt. Voer a.u.b. de brontekst in die vertaald moet worden. https://www.sigmaaldrich.com/US/nl/product/sigma/a7906 |
| ComplexHeatmap-pakket (R/Bioconductor) | Bioconductor-project | v2.20 (open-source) | Gebruikt voor hiërarchische clustering-heatmaps van multiplex cytokine-data Geen URL verstrekt. Voer a.u.b. de brontekst in die vertaald moet worden. https://bioconductor.org/packages/ComplexHeatmap |
| Cytocentrifuge (Cytospin 4) | Thermo Fisher Scientific | Cat. nr. A78303 | Wordt gebruikt voor het vervaardigen van cytologische preparaten vanuit een BALF-cel-suspensie Geen tekst verstrekt. Voer a.u.b. de brontekst in die vertaald moet worden. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A78303 |
| Erytrocyten-lyse-oplossing (BD FACS Lysing Solution, 10X concentraat) | BD Biosciences | Cat. nr. 349202 | Gebruikt voor erytrocytenlyse na oppervlaktekleuring Geen tekst opgegeven voor vertaling. Voer a.u.b. de brontekst in. https://www.bdbiosciences.com |
| Ethylenediaminetetraazijnzuur (EDTA), 0,5 M pH 8,0 | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Cat. nr. AM9260G | Gebruikt in flowcytometrie-kleuringsbuffer bij 2 mM U heeft geen brontekst opgegeven om te vertalen. Voer aub de tekst of de URL in die u vertaald wilt hebben naar het Nederlands. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM9260G |
| Fixeerbare levensvatbaarheidsverf (Zombie NIR Fixable Viability Kit) | BioLegend | Cat.nr. 423105 | Live-dead exclusie voorafgaand aan gating; rood laserkanaal Geen tekst verstrekt voor vertaling. Voer a.u.b. de brontekst in. https://www.biolegend.com |
| Flexibel videobronchoscoop | Olympus Corporation (BF-1TQ290) | Instrument (model BF-1TQ290) | Gebruikt voor BAL onder matige sedatie Geen tekst beschikbaar voor vertaling. Voer a.u.b. de brontekst in. https://www.olympus-global.com |
| Flowcytometer, meerkleurig (CytoFLEX LX) | Beckman Coulter Life Sciences | Instrument (model CytoFLEX LX, zes-laserconfiguratie) | Gebruikt voor de acquisitie van het flowcytometrie-panel met zeven markers voor neutrofielen/monocyten U heeft geen brontekst opgegeven om te vertalen. Voer aub de tekst in die u vertaald wilt hebben. https://www.beckman.com |
| Software voor flowcytometrie-analyse (FlowJo) | BD Biosciences (FlowJo LLC) | v10.10 | Gebruikt voor compensatie en handmatige gating van FCS-bestanden De URL is niet opgegeven. Voer a.u.b. de brontekst in die vertaald moet worden. https://www.flowjo.com |
| FlowSOM-pakket (R/Bioconductor) | Bioconductor-project | v2.12 (open-source) | Gebruikt voor self-organising-map-clustering en meta-clustering van flowcytometriegegevens Vul de URL in. https://bioconductor.org/packages/FlowSOM |
| GraphPad Prism (statistische grafieksoftware) | GraphPad Software (Dotmatics) | v10 | Gebruikt voor het genereren van de definitieve figuren Geen tekst verstrekt voor vertaling. https://www.graphpad.com |
| Blokkeerreagens voor humane Fc-receptor (Human TruStain FcX) | BioLegend | Cat. No. 42301 / RRID: AB_2818986 | Fc-receptorblokkade voorafgaand aan antilichaamskleuring Aangezien er geen brontekst is verstrekt na "URL:", kan ik geen vertaling genereren. Voer alstublieft de Engelse tekst in die u vertaald wilt hebben. https://antibodyregistry.org/AB_2818986 |
| igraph-pakket (R) | CRAN | v2.0 (open-source) | Gebruikt voor het construeren en visualiseren van de correlatienetwerkgrafiek URL: https://cran.r-project.org/package=igraph |
| Cryobuisjes met lage eiwitbinding, 2,0 ml | Thermo Fisher Scientific (Nunc) | Cat. nr. 375418 | Gebruikt voor BALF-supernatant-aliquoten voor cytokinenanalyse Er is geen brontekst opgegeven om te vertalen. Voer a.u.b. de tekst in die u vertaald wilt hebben. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/375418 |
| Luminex multiplex bead-gebaseerd immunoassay-platform (MAGPIX) | Luminex Corporation (DiaSorin) | Instrument (model MAGPIX) | Gebruikt voor de acquisitie van de multiplex cytokine-assay Geen tekst opgegeven voor vertaling. https://www.luminexcorp.com |
| May-Grünwaldüleukocyten-Giemsa-kleuringsoplossing | Sigma-Aldrich (MilliporeSigma) | Cat. No. GS50 | Gebruikt voor differentiële celtelling via cytospin Geen URL verstrekt. https://www.sigmaaldrich.com/US/nl/product/sigma/gs50 |
| mice-pakket (R) | CRAN | v3.16 (open-source) | Gebruikt voor meervoudige imputatie via geketende vergelijkingen in sensitiviteitsanalyses Geen tekst opgegeven om te vertalen. Voer a.u.b. de brontekst in. https://cran.r-project.org/package=mice |
| Multiplex magnetische kraal cytokine/chemokine-panel (13-plex, custom; MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine) | Merck / MilliporeSigma | Cat. nr. HCYTOMAG-60K | Aangepast panel voor de meting van de 13 analyten beschreven in sectie 2.4 Door u geen brontekst te verstrekken, kan ik geen vertaling genereren. Voer a.u.b. de tekst in die u vertaald wilt hebben. https://www.merckmillipore.com |
| Celzeef met nylon gaas, 70 µm | Corning (Falcon) | Cat. nr. 352350 | Gebruikt voor mechanische filtratie van BALF om slijmklonters te verwijderen URL: https://www.corning.com |
| Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4 | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | Cat. nr. 101023 | Basisbuffer voor celresuspensie en kleuring Geen tekst beschikbaar om te vertalen. Voer a.u.b. de brontekst in. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/101023 |
| pROC-pakket (R) | CRAN | v1.18 (open source) | Wordt gebruikt voor het genereren van ROC-curves en AUC-waarden Er is geen brontekst opgegeven om te vertalen. Voer a.u.b. de tekst in die u vertaald wilt hebben. https://cran.r-project.org/package=pROC |
| R (statistische computeromgeving) | R Core Team | v4.4 (open-source) | Platform voor statistische analyses en visualisatie Het is geen tekst beschikbaar om te vertalen. Voer a.u.b. de brontekst in. https://www.r-project.org |
| rstatix-pakket (R) | CRAN | v0.7 (open-source) | Gebruikt voor groepvergelijkingen en correlatiestatistieken Het is geen tekst beschikbaar om te vertalen. Voer a.u.b. de brontekst in. https://cran.r-project.org/package=rstatix |
| Rtsne-pakket (R) | CRAN | v0.17 (open-source) | Gebruikt voor t-SNE-embeddings Geen URL verstrekt. https://cran.r-project.org/package=Rtsne |
| Enkelvoudig gekleurde compensatiebeads (UltraComp eBeads Compensation Beads) | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | Cat. nr. 01-2-42 | Gebruikt voor single-colour compensatiecontroles Kopieer en plak hier de tekst die u wilt laten vertalen. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/01-2-42 |
| Natriumchlorideoplossing voor injectie, 0,9% (steriele zoutoplossing) | Baxter International | Cat. nr. 2B1324 | Gebruikt voor BAL-instillatie (10–150 mL, 20–aliquots van 40 mL bij 37 °C) Vanwege het ontbreken van brontekst in uw aanvraag, kan ik geen vertaling genereren. Voer aub de Engelse tekst in die u vertaald wilt hebben naar het Nederlands. https://www.baxter.com |
| uwot-pakket (R) | CRAN | v0.2 (open-source) | Gebruikt voor UMAP-dimensiereductie Geen inhoud opgegeven om te vertalen. Voer a.u.b. de brontekst in. https://cran.r-project.org/package=uwot |
| xPONENT (software voor multiplex-assay-acquisitie en curvefitting) | Luminex Corporation (DiaSorin) | v4.3 | Instrument-specifieke software voor 5PL-standaardcurvefitting U heeft geen brontekst verstrekt om te vertalen. Voer a.u.b. de tekst in die u naar het Nederlands vertaald wilt hebben. https://www.luminexcorp.com |
Referenties
- Yu X, et al. Estimating the global and regional burden of lower respiratory infections attributable to leading pathogens and the protective effectiveness of immunization programs. Int J Infect Dis. 2024;149:107268.
- Rizo-Téllez SA, Filep JG. Beyond host defense and tissue injury: the emerging role of neutrophils in tissue repair. Am J Physiol Cell Physiol. 2024;326(3):C661-83.
- Zhou X, Jin J, Lv T, Song Y. A narrative review: the role of NETs in acute respiratory distress syndrome/acute lung injury. Int J Mol Sci. 2024;25(3):1464.
- Haynes ME, Sullivan DP, Muller WA. Neutrophil infiltration and function in the pathogenesis of inflammatory airspace disease. Am J Pathol. 2024;194(5):628-36.
- Davidson KR, Ha DM, Schwarz MI, Chan ED. Bronchoalveolar lavage as a diagnostic procedure: a review of known cellular and molecular findings in various lung diseases. J Thorac Dis. 2020;12(9):4991-5019.
- Cambier S, Gouwy M, Proost P. The chemokines CXCL8 and CXCL12: molecular and functional properties, role in disease and efforts towards pharmacological intervention. Cell Mol Immunol. 2023;20(3):217-51.
- Lin J, et al. Local and systemic cytokine profiles in children with pneumonia-associated lung consolidation. Front Immunol. 2025;16:1546730.
- Huang C, et al. Heparin-binding protein in bronchoalveolar lavage fluid as a biomarker for discriminating severe bacterial and viral pneumonia in critically ill children. Mediators Inflamm. 2023;2023:6123911.
- Polley DJ, et al. Identification of novel clusters of co-expressing cytokines in a diagnostic cytokine multiplex test. Front Immunol. 2023;14:1223817.
- Roca CP, et al. A cross entropy test allows quantitative statistical comparison of t-SNE and UMAP representations. Cell Rep Methods. 2023;3(1):100389.
- Hawerkamp HC, et al. Characterisation of the pro-inflammatory cytokine signature in severe COVID-19. Front Immunol. 2023;14:1170012.
- Meyer KC, et al. An official American Thoracic Society clinical practice guideline: the clinical utility of bronchoalveolar lavage cellular analysis in interstitial lung disease. Am J Respir Crit Care Med. 2012;185(9):1004-14.
- Shionoya Y, et al. Impact of storage conditions on bronchoalveolar lavage fluid analysis: a human study. Diagnostics (Basel). 2025;15(11):1386.
- Li J, et al. Diagnostic test accuracy of cellular analysis of bronchoalveolar lavage fluid in distinguishing pulmonary infectious and non-infectious diseases in patients with pulmonary shadow. Front Med (Lausanne). 2024;11:1496088.
- Bratke K, Weise M, Stoll P, Virchow JC, Lommatzsch M. Flow cytometry as an alternative to microscopy for the differentiation of BAL fluid leukocytes. Chest. 2024;166(4):793-801.
- Rountree W, et al. Sources of variability in Luminex bead-based cytokine assays: evidence from twelve years of multi-site proficiency testing. J Immunol Methods. 2024;531:113699.
- Tao W, Sinha A, Raddassi K, Pandit A. Parameter optimization for stable clustering using FlowSOM: a case study from CyTOF. Front Immunol. 2024;15:1414400.
- Shikano K, et al. What are the factors affecting the recovery rate of bronchoalveolar lavage fluid? Clin Respir J. 2022;16(2):142-51.
- Baumann Z, et al. Optimized full-spectrum flow cytometry panel for deep immunophenotyping of murine lungs. Cell Rep Methods. 2024;4(11):100885.
- Bonilla DL, et al. The power of reagent titration in flow cytometry. Cells. 2024;13(20):1677.
- Ogishi M, et al. Multibatch cytometry data integration for optimal immunophenotyping. J Immunol. 2021;206(1):206-13.
- Sudo K, et al. Case study observational research: inflammatory cytokines in the bronchial epithelial lining fluid of COVID-19 patients with acute hypoxemic respiratory failure. Crit Care. 2024;28(1):134.
- Williams JE, et al. Epigenetic regulation of neutrophils in ARDS. Cells. 2025;14(15):1151.
- Zhang Y, et al. Interleukin-6 in blood and bronchoalveolar lavage fluid of hospitalized children with community-acquired pneumonia. Front Pediatr. 2022;10:922143.
- Bailey JI, et al. Profibrotic monocyte-derived alveolar macrophages are expanded in patients with persistent respiratory symptoms and radiographic abnormalities after COVID-19. Nat Immunol. 2024;25(11):2097-109.
- Haeger S, et al. The bronchoalveolar lavage dilution conundrum: an updated view on a long-standing problem. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2024;327(5):L807-13.
- Xiao K, et al. A pan-immune panorama of bacterial pneumonia revealed by a large-scale single-cell transcriptome atlas. Signal Transduct Target Ther. 2025;10(1):5.
- Shen X, et al. Single-cell transcriptome atlas revealed bronchoalveolar immune features related to disease severity in pediatric Mycoplasma pneumoniae pneumonia. MedComm (2020). 2024;5(10):e748.
- Megas S, Wilbrey-Clark A, Maartens A, Teichmann SA, Meyer KB. Spatial transcriptomics of the respiratory system. Annu Rev Physiol. 2025;87(1):447-70.
- Landoni G, et al. A multicenter phase 2 randomized controlled study on the efficacy and safety of reparixin in the treatment of hospitalized patients with COVID-19 pneumonia. Infect Dis Ther. 2022;11(4):1559-74.
- Sellarès-Nadal J, et al. Efficacy of tocilizumab for hospitalized patients with COVID-19 pneumonia and high IL-6 levels: a randomized controlled trial. Infection. 2025;53(5):1851-61.