Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Optisch systeem voor de beoordeling van atriale en ventriculaire mechanica in Langendorff-geperfundeerde muizenharten

143 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/72264

⸱

14 augustus 2026

 , 
1Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN, Unidad Monterrey

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de procedure voor de extractie en canulatie van een muizenhart, alsook de voorbereiding en configuratie van het Langendorff retrograde perfusiesysteem. De experimentele opstelling is gekoppeld aan een optisch systeem met een hoge resolutie, ontworpen om de mechanische reacties van de atria en ventricels te evalueren terwijl hun natuurlijke dynamiek behouden blijft.

Samenvatting

Het muizenhart dient als een veelgebruikt model in cardiovasculair onderzoek, gefaciliteerd door vorderingen in engineeringtechnologieën. De beoordeling van de atriale en ventriculaire contractiliteit blijft echter een uitdaging vanwege de geringe omvang van het muizenhart. Deze studie introduceert een nieuwe methodologie voor het evalueren van de contractiliteit en hartslag in een intact, geïsoleerd hart. Door gebruik te maken van een Langendorff-geperfuseerd muizenhart in combinatie met een optisch systeem met hoge resolutie, is evaluatie van de atriale en ventriculaire contractiliteit mogelijk. De experimentele opstelling pakt de uitdagingen aan die gepaard gaan met de kleine hartomvang en snelle contractiesnelheden, terwijl er signalen met een hoge resolutie worden verkregen. De synchronisatie tussen de stimulusfrequentie en de hartcontractiefrequentie in het bereik van 420 tot 660 slagen per minuut (bpm) was consistent met de resultaten van de auxotone methode. Daarnaast maken metingen van ventriculaire verkorting en atriale dynamische signalen de bepaling van atrioventriculaire contractie mogelijk. Deze methode is geschikt voor het beoordelen van de contractiliteit en hartslag in een intact, geïsoleerd hart zonder farmacologische of systemische invloeden. Deze resultaten tonen aan dat het optische systeem de meting van ventriculaire en atriale verkortingsresponsen mogelijk maakt.

Inleiding

Er valt veel te ontdekken in de hartfysiologie; sleutelprocessen, zoals de pacemakerfunctie van het hart en de excitatie-contractiekoppeling, zijn centrale principes die voortdurend worden onderzocht1. Hoewel de effecten van biologische ruis op de cardiac contractiliteit2 en de pacemakeractiviteit nog onvoldoende begrepen worden1, hebben nieuwe optische imagingmethoden de presentatie van nieuwe paradigma's mogelijk gemaakt3,4.

Twee experimentele methodologieën met gebruik van het Langendorff-systeem hebben een onschatbare bijdrage geleverd aan het meten van de hartfunctie. Ten eerste de isovolumetrische contractiemethode, waarbij een signaal wordt verkregen van een kleine ballon die in de linker ventrikel is geplaatst5,6,7. Ten tweede de auxotonische registratiemethode, waarbij een signaal wordt verkregen door één uiteinde van een draad aan de apex van het hart te hechten en het andere uiteinde aan een mechanisch registratieapparaat om auxotonische contracties langs de as van het hart te meten2,8. Desondanks is het evalueren van de atriale en ventriculaire contractiliteit in het muizenhart uitdagend vanwege de geringe omvang ervan. Bovendien vereist de preparatie een zekere mate van voorzichtigheid, aangezien het hart vatbaar is voor beschadiging9,10,11,12,13.

Het optische systeem voor het beoordelen van de mechanische dynamiek van muizenharten beschikt over verschillende nieuwe kenmerken en voordelen. Ten eerste is deze methode geschikt voor het beoordelen van de contractiliteit en hartslag in een intact, geïsoleerd hart in afwezigheid van farmacologische of systemische invloeden. Het protocol kan ook effectief worden ingezet bij experimenten ter beoordeling van ischemie-reperfusieschade bij het onderzoeken van farmacologische behandelingen, celregeneratie of behandelingen op basis van zuurstoftherapie.

In dit artikel presenteren we een protocol voor het registreren van biofysische parameters van de contractiele functie van het muizenhart met behulp van een optisch systeem met hoge resolutie. Deze methode helpt bij het beoordelen van de contractiliteit en de hartslag in een intact, geïsoleerd hart. Bovendien maakt het een evaluatie van de contractiliteit van het atrium en het ventrikel mogelijk. De Langendorff-preparaat van het muizenhart bevat een verfijning die een kleine aanpassing omvat om het verlies van perfusaattemperatuur en bewegingsartefacten te minimaliseren zonder de spiercontracties te remmen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierprocedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de federale regelgeving voor dierexperimenten en -zorg en werden goedgekeurd door de commissie voor dierenzorg van CINVESTAV (CINVESTAV Zacatenco, D.F., Mexico). In deze studie worden mannelijke C57BL/6J-muizen gebruikt, met een gewicht van 28–34 g en een leeftijd van 8–14 weken. Alle materialen en apparatuur die in het protocol worden gebruikt, staan vermeld in de Tabel met Materialen. Aanvullende Bestanden 1–11 bevatten ondersteunende diagrammen, softwarehandleidingen, analyseprogramma's, pacinggegevens en applicatiebestanden voor het protocol.

1. Bereiding van de voorraadoplossingen

  1. Bereid twee stamoplossingen vooraf en bewaar deze in een koelkast bij 4 °C: (1) Stamoplossing I, 1 L (in gedeïoniseerd water; in g/L: 76,13 NaCl, 4,02 KCl, 1 MgCl2(6H2O), 0,4 NaH2PO4) en (2) Stamoplossing II, 0,1 L (in gedeïoniseerd water; in g/L: 73,5 CaCl2(2H2O)).
    OPMERKING: De oplossingen kunnen tot 30 dagen na bereiding worden gebruikt. Bewaar ze bij 4 °C.

2. Aansluiting en reiniging van het Langendorff-systeem

  1. Sluit het reservoir (1), het thermobad van het reservoir (2), de perfusiepomp (3), de serpentine (4), de serpentine-recirculator (5), het monitorsysteem (6) en het drainagesysteem (8) aan, zoals weergegeven in Figuur 1A.
    OPMERKING: De verbinding tussen het monitorsysteem en het drainagesysteem wordt meer gedetailleerd weergegeven in Aanvullend Bestand 1.
  2. Vul het Langendorff-systeem met 1 L gedeïoniseerd water bij 50 °C, start vervolgens de perfusie- en drainagepompen (Aanvullend Bestand 1, drainagesysteem). Verwijder na ongeveer 20–30 min de vloeistof uit het systeem en ga vervolgens over naar de volgende stap.
    OPMERKING: Controleer of er geen lekken of drukverlies in het systeem zijn. Indien dit wel het geval is, mag het experiment niet worden voortgezet.
  3. Vul het systeem met 1 L 1% azijnzuur (opgelost in gedeïoniseerd water), schakel vervolgens de perfusie- en drainagepompen uit en wacht 60 min, schakel daarna de pompen in om de vloeistof te verwijderen.
  4. Herhaal stap 2.2 twee keer.
  5. Vul het systeem met 70% ethanol (opgelost in gedeïoniseerd water) om adhesie van oplossingcomponenten te voorkomen.
    OPMERKING: Het Langendorff-perfusiesysteem moet elke tien experimenten of maandelijks worden gereinigd. Het reinigingsprotocol vóór het experiment wordt toegelicht in sectie 4. Het reinigingsprotocol na het experiment wordt gedetailleerd beschreven in sectie 8.

3. Bereiding van Tyrode-oplossing tijdens het experiment

  1. Bereid 1 L van de volgende oplossing voor in mM: 130,25 NaCl, 5,4 KCl, 0,53 MgCl2(6H2O), 0,33 NaH2PO4, 1,8 CaCl2(2H2O), 10 D-glucose, 10 HEPES, waarbij de pH is bijgesteld naar 7,35 ± 0,05 met NaOH.
    1. Meng 100 mL Stock I met 700 mL gedeïoniseerd water onder constant roeren en verhoog vervolgens de temperatuur van de oplossing naar 37 °C; houd de oxygenatie van de oplossing in stand door de O2-cilinder aan te sluiten op de luchtsteen, zoals weergegeven in Figuur 1A (1).
    2. Voeg 3,6 mL Stock II en 96,4 mL gedeïoniseerd water toe om 1,8 mM CaCl2(2H2O) te verkrijgen, en voeg vervolgens NaOH toe om de pH bij te stellen naar 7,35 ± 0,05.
    3. Vul aan met gedeïoniseerd water tot een totaalvolume van 1 L Tyrode-oplossing.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om 100 mL van de oplossing in de koelkast bij 4 °C te bewaren; dit volume is later nodig in stap 6.

4. Voorbereiding van het Langendorff-systeem

OPMERKING: Als het Langendorff-systeem op de dag van het experiment niet is gevuld met ethanol, wordt aangeraden om niet met de procedure door te gaan; herhaal in plaats daarvan sectie 2.

  1. Zet de perfusie- en drainagepompen aan. Stel de stroomsnelheid van de perfusiepomp in op 3 mL/min en die van de drainagepomp op 10 mL/min. Laat het systeem leeglopen.
  2. Vul het systeem met 1 L gedeïoniseerd water bij 37 °C en laat het water vervolgens weglopen.
  3. Vul het systeem met de Tyrode-oplossing die is bereid in stap 3 en houd de oplossing op fysiologische temperatuur en onder constante oxygenatie.
  4. Zet de thermische baden van het reservoir en de slangrecirculator aan. Stel de temperatuur van het reservoir (Figuur 1A (2)) in op 38 °C om de oplossing onder fysiologische omstandigheden te houden. Stel de temperatuur van de slang (Figuur 1A (5)) in op 40 °C. Dit compenseert het temperatuurverlies in de oplossing van het Langendorff-systeem.
    OPMERKING: Als de temperatuur van de Tyrode-oplossing bij de uitlaat van het systeem niet fysiologisch is (37 ± 0.5 °C), pas dan de temperatuur van de slangrecirculator aan. Het wordt niet aanbevolen om door te gaan naar stap 6 totdat de temperatuur is gestabiliseerd op de juiste waarde.
  5. Zet de drukmonitor aan (Aanvullend Bestand 1, monitoringsysteem) en kalibreer deze in het bereik van 0–200 mmHg. De applicatie voor monitoring en pacing is beschikbaar om te helpen bij het kalibreren van het systeem (Aanvullend Bestand 3 en Aanvullend Bestand 11).
    OPMERKING: Het is essentieel om te verifiëren dat er geen drukverlies en geen luchtbellen in het systeem aanwezig zijn. Als het systeem bellen bevat, blokkeer dan tijdelijk de onderste uitlaat van de slang en open het bovenste ventiel; hierdoor vult de kolom zich, waardoor de bellen naar buiten kunnen ontsnappen. Het wordt niet aanbevolen om door te gaan met het experiment totdat deze conditie is geverifieerd.

5. Optisch systeem14

  1. Assembleer de CMOS-camera (Figuur 1A, 10), de instelbare cameralens (LC) en het verlichtingssysteem.
    OPMERKING: Het verlichtingssysteem bestaat uit twee LED's (Figuur 1A, 9), twee plano-convexe verlichtingslenzen (LI), een verlichtingsregelaar (Figuur 1A, 11), een acquisitiekaart (Aanvullend Bestand 1, monitoringsysteem) en 3D-ontworpen ondersteuningsstukken (Aanvullend Bestand 1).
  2. Plaats een referentieobject met een volume van ongeveer 1.000 mm3 op 100–200 mm afstand van de cameralens (midden van Figuur 1A).
    OPMERKING: Het object moet worden geplaatst op de hartpositie in het Langendorff-systeem. Deze positie is te zien in Figuur 1B, specifiek in het centrum van de afbeelding waar de lichtstralen samenkomen.
  3. Start de camera-acquisitiesoftware en stel de camera vervolgens in op een subsampling van 4x (4 pixels = 1 subpixel). Stel een region of interest (ROI) in van 200 x 200 subpixels (Aanvullend Bestand 2).
    OPMERKING: Met deze configuratie is een temporele resolutie van 750 frames per seconde (fps) mogelijk.
  4. Zet het verlichtingssysteem aan (Aanvullend Bestand 1), stel de lichtstralen zo af dat ze op het referentieobject zijn gefocust, en zorg voor een homogene verlichting (Figuur 1B).
  5. Pas de lichtintensiteit op het referentieobject aan om overbelichting van de afbeelding te voorkomen.
    OPMERKING: De afbeelding moet eruitzien als in Figuur 2A (of Figuur 1C, Controller PC). Reflecties op het oppervlak van het object (hart) moeten zo veel mogelijk worden verminderd zonder de definitie van de contour te verliezen. Dit kan worden gedaan door het vermogen van de verlichtingsregelaar aan te passen of door de belichtingstijd in de camera-instellingen te verkorten.
  6. Focus de cameralens om een helder beeld van het referentieobject te verkrijgen (Figuur 1C, controller PC). Zorg ervoor dat het referentieobject 80% van het gezichtsveld beslaat (Figuur 2A) om een conversieschaal van ongeveer 61 µm per subpixel te verkrijgen.
    OPMERKING: Het optische systeem activeert automatisch het verlichtingssysteem wanneer de camera in acquisitiemodus wordt gezet (Figuur 1A en Aanvullend Bestand 2). Het wordt aanbevolen om de camera in stand-bymodus te houden zodat het verlichtingssysteem uit blijft en alleen tijdens de perioden van experimentele gegevensverzameling wordt geactiveerd om oververhitting te voorkomen.

6. Chirurgische procedures en canulatie

  1. Heparinisatie en anesthesie
    1. Bereid een anesthesiemengsel voor bestaande uit tiletamine-zolazepam (40 mg/kg lichaamsgewicht muis) en xylazine (10 mg/kg lichaamsgewicht muis), en verdun dit vervolgens tot 200 µL met een zoutoplossing.
    2. Injecteer het anesthesiemengsel intraperitoneaal met een 27 G naald. Laat de muis in een diepe anesthesie raken.
      OPMERKING: Verifieer de afwezigheid van een reflex als reactie op een stimulus in de ledematen of de staart (meestal is 10 min voldoende).
    3. Injecteer 200 UI ongefractioneerde heparine intraperitoneaal met een 27 G naald en wacht ongeveer 5 min voordat u verdergaat met het experiment.
  2. Extractie en canulatie
    1. Plaats de muis in rugligging en verwijder de vacht en de huid van het borstgebied met een chirurgische schaar.
    2. Maak een abdominale incisie onder het diafragma, waarbij u erop let dat de integriteit ervan behouden blijft.
    3. Zet voort met een transversale incisie in het diafragma en voer snel een bilaterale ascenderende thoracotomie uit door de ribben, waarna de ribwand wordt verwijderd.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat het hart niet beschadigd raakt. Indien het hart tijdens de procedure wordt aangetast of beschadigd, wordt aanbevolen het experiment niet voort te zetten.
    4. Houd de superieure structuren van het hart voorzichtig vast met een fijne pincet, de aortaboog en de aangrenzende vaten. Til deze voorzichtig op om een snede naar boven toe eronder te maken, en verwijder het hart en de longen samen.
    5. Verplaats het hart snel naar een petrischaal met 50 mL Tyrode-oplossing bij 4 °C voor een eerste spoeling.
      OPMERKING: Vanaf het moment dat het diafragma wordt ingesneden, zal het dier ademhalingsproblemen ervaren; vanaf dit punt is er een tijdsbestek van 60 s om stappen 6.2.3–6.2.6 uit te voeren. Het overschrijden van deze tijdslimiet kan ischemische schade veroorzaken.
    6. Verwijder de longen en overtollig vetweefsel om de aortaboog bloot te leggen met behulp van een stereomicroscoop en een fijne schaar.
      OPMERKING: Zorg bij het schoonmaken van het weefsel dat de aortaboog niet beschadigd raakt. Als de aorta onder de arteria brachiocephalica wordt doorgesneden, zal de canulatie moeilijk zijn, wat mogelijk leidt tot lekken onder druk.
    7. Verplaats het hart naar de op maat gemaakte canulatiebasis met 50 mL Tyrode-buffer bij 4 °C en voer het aortieuiteinde in de canule in, die op maat is gemaakt van een 20 G naald (Supplementary File 1).
      OPMERKING: Pas op dat de aortaklep niet beschadigd raakt. Als de klep is aangetast, zwelt het hart op en zal de coronaire circulatie niet correct spoelen.
    8. Knoop twee canulatieknopen met 4/0 zijdehechting: de eerste in de inkeping distaal van de punt van de canule en de tweede vóór de truncus brachiocephalicus (Supplementary File 1).
    9. Dien langzaam Tyrode-oplossing toe met een 1 mL spuit gevuld met buffer op kamertemperatuur. Verifieer dat het coronaire weefsel klaart om een goede canulatie te bevestigen.
    10. Verwijder vetweefsel om toegang te krijgen tot de ventrikels en atria.
      OPMERKING: Vermijd een canulatietijd van meer dan 5 min om de levensvatbaarheid van het hart te behouden.
    11. Verplaats het hart naar een Langendorff-systeem en laat het 30 min stabiliseren.
      OPMERKING: Het hart wordt in het midden van het systeem geplaatst (Figure 1A,B), verticaal opgehangen. Wees uiterst voorzichtig bij het ophangen van het hart om de vorming van luchtbellen te voorkomen. Als dit gebeurt, stijgt de druk boven de 140 mmHg, begint het hart op te zwellen en is het niet langer levensvatbaar.
      OPMERKING: De Langendorff-montage is voltooid wanneer het hart een mechanisch stabiele respons vertoont, een natuurlijke oscillatiefrequentie van ongeveer 360 slagen per minuut (BPM) heeft en een perfusiedruk tussen 60 en 110 mmHg.

7. Pacingprotocol en video-opname

  1. Hartviabiliteit
    1. Verifieer of de coronaire druk in het bereik van 60–110 mmHg ligt met een perfusiepomp van 3 mL/min. Als de coronaire perfusiedruk onder de 60 mmHg daalt, verhoog dan licht de stroomsnelheid van de perfusiepomp (een lage druk zal ervoor zorgen dat het hart bleek en slap wordt). Omgekeerd, als de druk 110 mmHg overschrijdt, verlaag dan licht de stroomsnelheid van de pomp (overmatige druk zal weefseloedeem en een progressieve drukstijging veroorzaken tot er een hartstilstand optreedt).}
      OPMERKING: Het handhaven van de perfusiedruk buiten het bovengenoemde optimale bereik gedurende een langere periode zal de viabiliteit van het hart onherstelbaar aantasten.
    2. Plaats het hart in een frontale positie zodat een volledig frontaal beeld in de camera wordt verkregen. Pas de positie aan zodat beide atria zichtbaar zijn in de camera (Figuur 2A).
    3. Plaats de platina-elektroden voorzichtig oppervlakkig op de bovenkant van het rechteratrium ter hoogte van de pacemakerknoop. Gebruik de camerabeelden als leidraad om de elektroden in het gezichtsveld te brengen. Positioneer de elektrode zodanig dat deze het rechteratrium niet blokkeert. Terwijl u de live-weergave van de camera monitort, schuift u de elektrode langzaam naar voren totdat deze het atriumweefsel raakt, waarbij u erop let geen overmatige compressie uit te oefenen (wat het rechteratrium in het beeld zou platdrukken).
      OPMERKING: Bij een correcte uitvoering zal het camerabeeld lijken op Figuur 2A.
    4. Start de monitoring- en pacing-applicatie (Aanvullend Bestand 11) en schakel de acquisitiekaart in (Figuur 1A (6)). Stel de stimulusparameterwaarden in: amplitude op 2 V, frequentie op 420, 540 en 720 pulsen per minuut (PPM) met een vierkante puls met een duty-cycle van 7 ms (inzet van Figuur 2A).
    5. Pas de viabiliteitsstimulaties toe, beginnend met de laagste frequentie, met een stimulatieduur van 20 s gevolgd door een herstelperiode (rusttijd) van 20 s tussen de gebeurtenissen.
      OPMERKING: Beoordeel de viabiliteit van het hart via cameramonitoring. Als het orgaan fysiologisch functioneel is, zal een synchronisatie tussen de toegepaste stimulus en de cardiale respons worden waargenomen, vergezeld van een correcte coördinatie tussen de hartkamers. Omgekeerd zal een gebrek aan viabiliteit zich manifesteren door een verlies van de coördinatie van de kamers of door de exclusieve aanwezigheid van geïsoleerde atriumcontracties.
    6. Sluit de deur van de kamer, omdat het experiment gevoelig is voor kamerlicht en thermische fluctuaties (Figuur 1C).
      OPMERKING: De deur van de kamer moet tijdens de experimentele tijd gesloten blijven. Monitor de viabiliteit van het hart met de camera en de perfusiedruk.
  2. Dataregistratie
    1. Pas het pacing-protocol toe, dat bestaat uit vierkante pulstreinen van 30 s duur, gevolgd door 30 s zonder signaal. Stel de stimulusparameterwaarden in voor elke pacing-trein: amplitude op 2 V, duty-cycle van 7 ms en frequentie in het bereik van 360 tot 720 PPM.
      OPMERKING: Het pacing-protocol begint bij 360 PPM en neemt met 60 PPM toe bij elk tijdstip (inzet van Figuur 2A).
    2. Neem continu video's op van de dynamiek van het frontale beeld van het hart in .avi-formaat met behulp van camera-acquisitiesoftware (Aanvullend Bestand 2). Maak een video-opname van 20 s van elke pacing-trein. Neem het segment van 20 s op dat begint 5 s na de pacing. Een representatieve ruwe opname is te vinden in Aanvullende Film 1.
      OPMERKING: Een computer registreert gelijktijdig de toegepaste pacing-trein (.xls, Aanvullend Bestand 9) bij elke opgenomen video (.avi), respectievelijk gegenereerd door de monitoring- en pacing-applicatie en de camera-acquisitiesoftware (Aanvullend Bestand 2 en Aanvullend Bestand 3).
    3. Verifieer de viabiliteit van het hart door de eerste video, opgenomen vóór de start van het stimulatieprotocol, te vergelijken met de tweede video, opgenomen na toepassing van het protocol (Figuur 2B).

8. Reiniging van het Langendorff-perfusiesysteem na het experiment

  1. Verwijder de stimulus en de ECG-platina-elektroden. Verwijder het hart uit het systeem en laat alle resterende Tyrode-oplossingen weglopen.
  2. Schakel het optische systeem uit en sluit het O2-ventiel.
  3. Spoel het systeem met 1 L gedeïoniseerd water bij 37 °C en laat het systeem leeglopen.
  4. Herhaal stappen 2.4 en 2.5.
  5. Schakel alle systemen en apparatuur uit.

9. Videoverwerking

  1. Begin met het importeren van elke video in computationele software en het toepassen van een videonormalisatiefunctie15.
  2. Selecteer een region of interest (ROI) die het hartgebied omvat. Voer beeldsegmentatie uit om achtergrondruis, elektroden en de canule te verwijderen (Aanvullend bestand 4).
    OPMERKING: Raadpleeg Aanvullend bestand 10 om het te verwijderen beeldgebied correct te selecteren.
  3. Voer een globale mechanische dynamische analyse uit (Aanvullend bestand 5). Ondersteunende variabiliteit en signaalvoorbeelden worden getoond in Aanvullende figuur S1, Aanvullende figuur S2 en Aanvullende figuur S3.
    1. Pas morfologische operatoren toe op elk videoframe om de omtrek van het hart te detecteren, en pas vervolgens een fill frame-algoritme toe om een masker te genereren15.
    2. Tel de pixels binnen het gesegmenteerde gebied in elk frame, en normaliseer dit aantal vervolgens door het totale aantal pixels in het beeld om een dynamisch signaal te produceren (inzet in Figuur 2B en Aanvullende figuur S3).
    3. Pas een bidirectioneel Butterworth-filter van de 5e orde tussen 3 en 100 Hz toe op het verkregen signaal om hoogfrequente ruis en artefacten door perfusiedruppels te onderdrukken15.
    4. Normaliseer de signalen over alle video's met behulp van de geregistreerde maximum- en minimumwaarden.
    5. Bepaal de hartslag door het interval tussen twee maximumamplitudewaarden (IAA (s)) te berekenen voor elk dynamisch signaal en stimulus-signaal.
    6. Bereken de frequentie in BPM met de volgende formule:
      figure-protocol-1
    7. Genereer Poincaré-kaarten vanuit IAA-gegevens om de variabiliteit over korte en lange termijn te illustreren16,17,18 (Aanvullende figuur S1 en Aanvullende figuur S2).
      OPMERKING: Raadpleeg Aanvullend bestand 10 voor meer gedetailleerde informatie.
  4. Voer een segmentale analyse uit van de ventriculaire mechanische dynamiek (Aanvullend bestand 6).
    1. Pas beeldbinarisatie toe. Gebruik morfologische operatoren om het ventriculaire gebied af te bakenen, waarbij dit wordt aangepast naar een elliptische geometrie zonder de ROI in gevaar te brengen15.
    2. Pas een minimale ellips aan op het ventriculaire gebied in elk frame. Extraheer de coördinaten van een set distale punten in een frame. Gebruik een set van 10–20 punten in elk uiteinde langs de Y-as (Figuur 3A). Een representatieve output van de ellips-schatting wordt gegeven in Aanvullende film 2.
    3. Bereken de ventriculaire verkorting als de gemiddelde afstand tussen extreme punten langs de Y-as in elke video19.
    4. Pas een bidirectioneel Butterworth-filter van de 5e orde tussen 3 en 100 Hz toe op het verkregen signaal om hoogfrequente ruis en artefacten door perfusiedruppels te onderdrukken15.
    5. Normaliseer het ventriculaire verkortingssignaal ten opzichte van alle video's die voor elke pacing zijn verkregen, en bereken de hartslag en vertraging zoals in stappen 9.3.5–9.3.6.
      OPMERKING: Parameters, zoals ventriculaire cyclusduur (DVE), relaxatieduur (DVW), interventriculair interval (IVV) en ventriculaire amplitude (VA), worden verkregen (Figuur 3A).
      OPMERKING: Raadpleeg Aanvullend bestand 10 voor meer gedetailleerde informatie.
  5. Voer een segmentale analyse uit van de mechanische dynamiek van de atria (Aanvullend bestand 7).
    1. Gebruik twee ROI's om de atria af te bakenen (Figuur 3C).
    2. Analyseer elk atrium afzonderlijk.
      1. Gebruik morfologische operatoren om de atria te omlijnen, terwijl deze worden aangepast zonder de ROI in gevaar te brengen15. Gebruik een contrastverhogingsalgoritme om elk atrium te omlijnen20,21.
      2. Pas beeldbinarisatie toe en kwantificeer het aantal pixels dat per frame afwijkt van nul om een atriaal dynamisch signaal te verkrijgen.
      3. Pas een bidirectioneel Butterworth-filter van de 5e orde tussen 3 and 100 Hz toe op de verkregen signalen om hoogfrequente ruis en artefacten door perfusiedruppels te onderdrukken15.
      4. Bereken het gemiddelde van twee atriale signalen (Figuur 3D).
    3. Normaliseer het atriale verkortingssignaal ten opzichte van alle video's die voor elke pacing zijn verkregen en bereken de hartslag en vertraging zoals in stappen 9.3.5–9.3.6.
      OPMERKING: Parameters, zoals atriale cyclusduur (DAE), atriaal-atriaal interval (IAT) en atriale amplitude (AA), worden verkregen (Figuur 3D). Raadpleeg voor meer gedetailleerde informatie Aanvullend bestand 10.
  6. Voer een elektromechanische analyse uit13,22 (Aanvullend bestand 8).
    1. Vergelijk de pacinggegevens met de atriale en ventriculaire signalen (Figuur 3D).
    2. Bereken de propagatietijd in het geleidingssysteem van het hart, waarbij de vertraging tussen de atriale en ventriculaire gebeurtenissen (AVD) wordt bepaald, met de toegepaste stimulus als referentie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De experimenten naar de mechanische hartfunctie worden uitgevoerd met behulp van het Langendorff-apparaat, zoals weergegeven in Figuur 1A (Boven)*De monitorerings- en optische systemen maken videoregistratie mogelijk wanneer de verlichtingsregeling wordt geactiveerd, zoals weergegeven in Figuur 1A (Onderzijde). Figuur 1C illustreert het externe aanzicht van de thermostaatgestuurde kast, die is ontwo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het hart van de muis is zeer gevoelig voor temperatuurschommelingen2,9,10,11,22. In dit experiment werd het geperfuseerde hart verticaal gepositioneerd. We hebben een kleine aanpassing doorgevoerd om het temperatuurverlies van het perfusaat en bewegingsartefacten bij de Langendorff-perfusiemethode te minimaliseren. Aan de slangenspoel werd een recirculatiepomp...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten om te verklaren.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de subsidie nr. LN-2025-C-23 van het Secretariaat voor Wetenschap, Geesteswetenschappen, Technologie en Innovatie (SECIHTI).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 mL spuitBD Plastipak302485Chirurgische procedure
20 G naaldNIPROAH-2032Aortacannule
25 mm instelbare lens met 8x-100x vergrotingGenericN/ALens van optisch camerasysteem; generiek geciteerd als instelbare camerelens
27 G naaldBD PrecisionGlide302358Chirurgische procedure
3D-ontworpen ondersteuningsstukkenCINVESTAVN/AOp maat gemaakte 3D-ontworpen ondersteuningsstukken
4-0 zijden hechtdraadAMERICAN SUTURETGSN0901Aortacannule
40-A voedingSTERENPRL-25LED-voeding
LuchtsteenN/AN/AZuurstofvoorziening Tyrode-oplossing
CaCl2 (2H2O)Sigma-AldrichC3306Tyrode-oplossing
D-glucoseJ.T. Baker1916-01Tyrode-oplossing
DrainagepompCINVESTAVN/AOp maat gemaakte drainagepomp; generiek geciteerd als drainagepomp
F = 25,4 mm, plano-convexe lensTHORLABSLA1951-AVerlichtingslens van optisch systeem; generiek geciteerd als plano-convexe verlichtingslens
Geconcentreerd azijnzuurSigma-Aldrich695092Schoonmaak Langendorff-systeem
HeparinePiSA060M91Anticoagulans
HEPESSigma-AldrichH3375Tyrode-oplossing
Hoge-vermogen LED'sLuminiusCBT-90-G-L11-C12LED-lichtbron
VerlichtingssysteemCINVESTAVN/AOp maat gemaakt verlichtingssysteem; generiek geciteerd als verlichtingssysteem
KClCTR SCIENTIFICCTR02196Tyrode-oplossing
LabVIEW-software versie 2018NATIONAL INSTRUMENTSN/ASoftware gebruikt voor de monitorings- en pacing-applicatie; generiek geciteerd als monitorings- en pacing-applicatie
MATLAB-softwareThe MathWorksN/AComputationele software voor videonormalisatie, segmentatie en analyseprogramma's; generiek geciteerd als computationele software
Medische zuurstofGRUPO INFRAN/AZuurstofvoorziening Tyrode-oplossing
MgCl2 (6H2O)CTR SCIENTIFICCTR02104Tyrode-oplossing
Mini-pomp met variabele flowCONTROL COMPANY3385Perfusiepomp
Chirurgische set voor muizenKent ScientificINSMOUSEKITChirurgische procedure
NaClSigma-AldrichS5886Tyrode-oplossing
NaH2PO4DEQDEQF290400250Tyrode-oplossing
NaOHCTR SCIENTIFICCTR03108pH-aanpassing
NI USB-6009NATIONAL INSTRUMENTS779026-01Acquisitiekaart
Platine-elektroden, diam. 0,25 mmSigma-Aldrich349402Elektroden voor elektrische stimulatie
Voeding (12 V, 30 A)KarnickPTA-12V30AVoeding voor recirculator
DrukmeterCINVESTAVN/AOp maat gemaakte drukmeter; generiek geciteerd als drukmeter
DruktransducerLA BOUVETB17295Drukmeter voor Langendorff-systeem
Zuivere ethylalcoholSigma-Aldrich493511Ethanol voor systeemschoonmaak
Recirculerend thermisch bad (LXC)PolyScienceL113A0412Reservoirrecirculator
ZoutoplossingPiSA1118480,9% natriumchloride (NaCl)-oplossing
Serpentine thermisch badCINVESTAVN/AOp maat gemaakte serpentine recirculator/thermisch bad
StereomicroscoopN/AN/AChirurgische procedure
StereomicroscoopverlichtingN/AN/AChirurgische procedure
uEye Cockpit-softwareIDS Imaging Development System GmBHN/ACamera-acquisitiesoftware; generiek geciteerd als camera-acquisitiesoftware
UI-3360CP-NIR-GL Rev.2IDSAB00624Hoge-snelheid CMOS-camera; generiek geciteerd als CMOS-camera
XylazinePiSA4001211Anestheticum
Zoletil 100Virbac83048907Tiletamine-zolazepam anestheticum; generiek geciteerd als anestheticummengsel

Referenties

  1. Guarina L et al. Biological noise is a key determinant of the reproducibility and adaptability of cardiac pacemaking and EC coupling. J Gen Physiol. 2022;154(9):e202012613.
  2. Peña-Romo A et al. Noise enhanced the electrical stimulation-contractile response coupling in isolated mouse heart. Int J Cardiol. 2016;221:155-60.
  3. Bychkov R et al. Synchronized cardiac impulses emerge from heterogeneous local calcium signals within and among cells of pacemaker tissue. JACC Clin Electrophysiol. 2020;6(8):907-31.
  4. Clancy CE, Santana LF. Evolving discovery of the origin of the heartbeat: a new perspective on sinus rhythm. JACC Clin Electrophysiol. 2020;6(8):932-4.
  5. Asamudo EU, Ng YH, Bers DM. Langendorff isolated heart perfusion model for functional studies in mice. In: Chandrasekera DNK, Katare R, editors. Cardiomyocytes: Methods and Protocols. Springer Nature; New York; 2025. p. 111-24.
  6. Louradour J et al. Simultaneous assessment of mechanical and electrical function in Langendorff-perfused ex vivo mouse hearts. Front Cardiovasc Med. 2023;10:1293032.
  7. Noly PE et al. Assessment of ex vivo murine biventricular function in a Langendorff model. J Vis Exp. 2022;(190):e64384.
  8. Beckett PR. The isolated perfused heart preparation: two suggested improvements. J Pharm Pharmacol. 1970;22(11):818-22.
  9. Ihara K et al. Electrophysiological assessment of murine atria with high-resolution optical mapping. J Vis Exp. 2018;(132):e56478.
  10. King DR, Hardin KM, Hoeker GS, Poelzing S. Reevaluating methods reporting practices to improve reproducibility: an analysis of methodological rigor for the Langendorff whole heart technique. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2022;323(3):H363-77.
  11. Lang D, Sulkin M, Lou Q, Efimov IR. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. J Vis Exp. 2011;(55):e3275.
  12. Liao R, Podesser BK, Lim CC. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2012;303(2):H156-67.
  13. Sung YL, Tsai YS, Chang CL, Hu YF. Protocol for high-resolution optical mapping of ex vivo rat heart for electrophysiological studies. STAR Protoc. 2025;6(2):103734.
  14. Lee P et al. Low-cost optical mapping systems for panoramic imaging of complex arrhythmias and drug-action in translational heart models. Sci Rep. 2017;7:43217.
  15. Laughner JI et al. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2012;303(7):H753-65.
  16. Hao X et al. TGF-β1-mediated fibrosis and ion channel remodeling are key mechanisms in producing the sinus node dysfunction associated with SCN5A deficiency and aging. Circ Arrhythm Electrophysiol. 2011;4(3):398-406.
  17. Pizzo E et al. Heart rate variability reveals altered autonomic regulation in response to myocardial infarction in experimental animals. Front Cardiovasc Med. 2022;9:843144.
  18. Tayel MB, AlSaba EI. Poincaré plot for heart rate variability. Int J Biomed Biol Eng. 2015;9(9).
  19. Bazan C, Barba DT, Blomgren P, Paolini P. Image processing techniques for assessing contractility in isolated adult cardiac myocytes. Int J Biomed Imaging. 2009;2009:352954.
  20. Christoph J, Luther S. Marker-free tracking for motion artifact compensation and deformation measurements in optical mapping videos of contracting hearts. Front Physiol. 2018;9:1483.
  21. Lebert J, Ravi N, Kensah G, Christoph J. Real-time optical mapping of contracting cardiac tissues with GPU-accelerated numerical motion tracking. Front Cardiovasc Med. 2022;9:787627.
  22. Larsen TS et al. The isolated working mouse heart: methodological considerations. Pflugers Arch. 1999;437:979-85.
  23. Vornanen M. Basic functional properties of the cardiac muscle of the common shrew (Sorex araneus) and some other small mammals. J Exp Biol. 1989;145:339-51.
  24. VanderBrink BA et al. Assessment of atrioventricular nodal physiology in the mouse. J Interv Card Electrophysiol. 1999;3(3):207-12.
  25. Shansky RM, Murphy AZ. Considering sex as a biological variable will require a global shift in science culture. Nat Neurosci. 2021;24(4):457-64.
  26. Shansky RM. Are hormones a “female problem” for animal research? Science. 2019;364(6443):825-6.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Langendorff-geperfuseerd hartmuizenhartmodeloptische beoordelingatriale contractiliteitventriculaire contractiliteitmeting van de hartslaghoge-resolutiebeeldvormingventriculaire verkortingatriale dynamiekcardiale mechanica
Optisch systeem voor de beoordeling van atriale en ventriculaire mechanica in Langendorff-geperfundeerde muizenharten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.