Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Optisch systeem voor de beoordeling van atriale en ventriculaire mechanica in Langendorff-geperfundeerde muizenharten

77 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/72264

⸱

14 augustus 2026

 , 
1Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN, Unidad Monterrey

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de procedure voor de extractie en canulatie van een muizenhart, alsook de voorbereiding en configuratie van het Langendorff retrograde perfusiesysteem. De experimentele opstelling is gekoppeld aan een optisch systeem met een hoge resolutie, ontworpen om de mechanische reacties van de atria en ventricels te evalueren terwijl hun natuurlijke dynamiek behouden blijft.

Samenvatting

Het muizenhart dient als een veelgebruikt model in cardiovasculair onderzoek, gefaciliteerd door vorderingen in engineeringtechnologieën. De beoordeling van de atriale en ventriculaire contractiliteit blijft echter een uitdaging vanwege de geringe omvang van het muizenhart. Deze studie introduceert een nieuwe methodologie voor het evalueren van de contractiliteit en hartslag in een intact, geïsoleerd hart. Door gebruik te maken van een Langendorff-geperfuseerd muizenhart in combinatie met een optisch systeem met hoge resolutie, is evaluatie van de atriale en ventriculaire contractiliteit mogelijk. De experimentele opstelling pakt de uitdagingen aan die gepaard gaan met de kleine hartomvang en snelle contractiesnelheden, terwijl er signalen met een hoge resolutie worden verkregen. De synchronisatie tussen de stimulusfrequentie en de hartcontractiefrequentie in het bereik van 420 tot 660 slagen per minuut (bpm) was consistent met de resultaten van de auxotone methode. Daarnaast maken metingen van ventriculaire verkorting en atriale dynamische signalen de bepaling van atrioventriculaire contractie mogelijk. Deze methode is geschikt voor het beoordelen van de contractiliteit en hartslag in een intact, geïsoleerd hart zonder farmacologische of systemische invloeden. Deze resultaten tonen aan dat het optische systeem de meting van ventriculaire en atriale verkortingsresponsen mogelijk maakt.

Inleiding

Er valt veel te ontdekken in de hartfysiologie; sleutelprocessen, zoals de pacemakerfunctie van het hart en de excitatie-contractiekoppeling, zijn centrale principes die voortdurend worden onderzocht1. Hoewel de effecten van biologische ruis op de cardiac contractiliteit2 en de pacemakeractiviteit nog onvoldoende begrepen worden1, hebben nieuwe optische imagingmethoden de presentatie van nieuwe paradigma's mogelijk gemaakt3,4.

Twee experimentele methodologieën met gebruik van het Langendorff-systeem hebben een onschatbare bijdrage geleverd aan het meten van de hartfunctie. Ten eerste de isovolumetrische contractiemethode, waarbij een signaal wordt verkregen van een kleine ballon die in de linker ventrikel is geplaatst5,6,7. Ten tweede de auxotonische registratiemethode, waarbij een signaal wordt verkregen door één uiteinde van een draad aan de apex van het hart te hechten en het andere uiteinde aan een mechanisch registratieapparaat om auxotonische contracties langs de as van het hart te meten2,8. Desondanks is het evalueren van de atriale en ventriculaire contractiliteit in het muizenhart uitdagend vanwege de geringe omvang ervan. Bovendien vereist de preparatie een zekere mate van voorzichtigheid, aangezien het hart vatbaar is voor beschadiging9,10,11,12,13.

Het optische systeem voor het beoordelen van de mechanische dynamiek van muizenharten beschikt over verschillende nieuwe kenmerken en voordelen. Ten eerste is deze methode geschikt voor het beoordelen van de contractiliteit en hartslag in een intact, geïsoleerd hart in afwezigheid van farmacologische of systemische invloeden. Het protocol kan ook effectief worden ingezet bij experimenten ter beoordeling van ischemie-reperfusieschade bij het onderzoeken van farmacologische behandelingen, celregeneratie of behandelingen op basis van zuurstoftherapie.

In dit artikel presenteren we een protocol voor het registreren van biofysische parameters van de contractiele functie van het muizenhart met behulp van een optisch systeem met hoge resolutie. Deze methode helpt bij het beoordelen van de contractiliteit en de hartslag in een intact, geïsoleerd hart. Bovendien maakt het een evaluatie van de contractiliteit van het atrium en het ventrikel mogelijk. De Langendorff-preparaat van het muizenhart bevat een verfijning die een kleine aanpassing omvat om het verlies van perfusaattemperatuur en bewegingsartefacten te minimaliseren zonder de spiercontracties te remmen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierprocedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de federale regelingen voor dierproeven en -zorg en zijn goedgekeurd door de Commissie voor Dierenzorg van CINVESTAV (CINVESTAV Zacatenco, D.F., Mexico). In deze studie worden mannelijke C57BL/6J-muizen gebruikt, met een gewicht van 28–34 g en een leeftijd van 8–14 weken. Alle materialen en apparatuur die in het protocol worden gebruikt, staan vermeld in de Tabel met Materialen. Aanvullende Bestanden 1–11 bevatten ondersteunende diagrammen, softwarehandleidingen, analyseprogramma's, pacinggegevens en applicatiebestanden voor het protocol.

1. Bereiding van de voorraadoplossingen

  1. Bereid twee stokoplossingen vooraf en bewaar deze in een koelkast bij 4 °C: (1) Stokoplossing I, 1 L (in gedeïoniseerd water; in g/L: 76,13 NaCl, 4,02 KCl, 1 MgCl2(6H2O), 0,4 NaH2PO4) en (2) Stokoplossing II, 0,1 L (in gedeïoniseerd water; in g/L: 73,5 CaCl2(2H2O)).
    OPMERKING: De oplossingen kunnen tot 30 dagen na bereiding worden gebruikt. Bewaar ze bij 4 °C.

2. Aansluiting en reiniging van het Langendorff-systeem

  1. Verbind het reservoir (1), het thermische bad van het reservoir (2), de perfusiepomp (3), de serpentine (4), de serpentine-recirculator (5), het monitoringsysteem (6) en het drainagesysteem (8), zoals weergegeven in Figuur 1A.
    OPMERKING: De verbinding tussen het monitoringsysteem en het drainagesysteem wordt meer gedetailleerd weergegeven in Aanvullend bestand 1.
  2. Vul het Langendorff-systeem met 1 L gedeïoniseerd water bij 50 °Cen start vervolgens de perfusie- en drainagespompen (Aanvullend bestand 1, drainagesysteem)Verwijder na ongeveer 20–30 min de vloeistof uit het systeem en ga vervolgens over naar de volgende stap.
    OPMERKING: Controleer of er geen lekken of drukval in het systeem zijn. Indien dit wel het geval is, mag er niet met het experiment worden voortgegaan.
  3. Vul het systeem met 1 L 1% azijnzuur (opgelost in gedeïoniseerd water), schakel vervolgens de perfusie- en afvoerpompen uit en wacht 60 min, waarna de pompen weer worden ingeschakeld om de vloeistof te verwijderen.
  4. Herhaal stap 2.2 tweemaal.
  5. Vul het systeem met 70% ethanol (opgelost in gedeïoniseerd water) om adhesie van componenten van de oplossing te voorkomen.
    OPMERKING: Het Langendorff-perfusiesysteem moet om de tien experimenten of maandelijks worden gereinigd. Het reinigingsprotocol voorafgaand aan het experiment wordt toegelicht in sectie 4Terwijl het reinigingsprotocol na het experiment in detail is beschreven in sectie 8.

3. Bereiding van Tyrode-oplossing tijdens het experiment

  1. Bereid 1 L oplossing voor in mM: 130,25 NaCl, 5,4 KCl, 0,53 MgCl2(6H2O), 0,33 NaH2PO4, 1,8 CaCl2(2H2O), 10 D-glucose, 10 HEPES, pH bijgesteld op 7,35 ± 0,05 met NaOH.
    1. Meng 100 mL Stock I met 700 mL gedeïoniseerd water onder constant roeren, verhoog vervolgens de temperatuur van de oplossing naar 37 °C; houd de zuurstofvoorziening van de oplossing op peil door de O2-cilinder aan de luchtsteen te verbinden zoals weergegeven in Figuur 1A (1).
    2. Voeg 3,6 mL Stock II en 96,4 mL gedeïoniseerd water toe om 1,8 mM CaCl2(2H2O) te verkrijgen, voeg vervolgens NaOH toe om de pH bij te stellen op 7,35 ± 0,05.
    3. Vul aan met gedeïoniseerd water tot 1 L Tyrode-oplossing.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om 100 mL van de oplossing in de koelkast bij 4 °C te bewaren; dit volume is later nodig in stap 6.

4. Voorbereiding van het Langendorff-systeem

OPMERKING: Als het Langendorff-systeem op de dag van het experiment niet met ethanol is gevuld, wordt aangeraden de procedure niet voort te zetten; herhaal in plaats daarvan sectie 2.

  1. Zet de perfusie- en drainagespompen aan. Stel de stroomsnelheid van de perfusiepomp in op 3 mL/min en die van de drainagespomp op 10 mL/min. Laat het systeem leeglopen.
  2. Vul het systeem met 1 L gedeïoniseerd water bij 37 °C en laat het water vervolgens weglopen.
  3. Vul het system met de Tyrode-oplossing die is bereid in stap 3 en houd de oplossing op fysiologische temperatuur en constante oxygenatie.
  4. Zet de thermische baden van het reservoir en de serpentine-recirculator aan. Stel de temperatuur van het reservoir (Figuur 1A (2)) in op 38 °C om de oplossing onder fysiologische omstandigheden te houden. Stel de temperatuur van de serpentine (Figuur 1A (5)) in op 40 °C. Dit compenseert het temperatuurverlies in de oplossing van het Langendorff-systeem.
    OPMERKING: Als de temperatuur van de Tyrode-oplossing bij de uitlaat van het systeem niet fysiologisch is (37 ± 0.5 °C), pas dan de temperatuur van de serpentine-recirculator aan. Het wordt niet aanbevolen om door te gaan naar stap 6 voordat de temperatuur is gestabiliseerd op de juiste waarde.
  5. Zet de drukmonitor aan (Aanvullend bestand 1, monitoringsysteem) en kalibreer deze in het bereik van 0–200 mmHg. De monitoring- en pacing-applicatie is beschikbaar om te helpen bij het kalibreren van het systeem (Aanvullend bestand 3 en Aanvullend bestand 11).
    OPMERKING: Het is essentieel om te controleren of er geen drukverlies en geen luchtbellen in het systeem aanwezig zijn. Als het systeem luchtbellen bevat, blokkeer dan tijdelijk de onderste uitlaat van de serpentine en open het bovenste ventiel; hierdoor vult de kolom zich, waardoor de bellen naar buiten kunnen ontsnappen. Het wordt niet aanbevolen om door te gaan met het experiment totdat deze conditie is geverifieerd.

5. Optisch systeem14

  1. Assembleer de CMOS-camera (Figuur 1A, 10), de instelbare cameralens (LC) en het verlichtingssysteem.
    OPMERKING: Het verlichtingssysteem bestaat uit twee LED's (Figuur 1A, 9), twee plano-convexe verlichtingslenzen (LI), een verlichtingsregelaar (Figuur 1A, 11), een acquisitiekaart (Aanvullend bestand 1, monitoringsysteem) en 3D-ontworpen steunpunten (Aanvullend bestand 1).
  2. Plaats een referentieobject met een volume van ongeveer 1.000 mm3 op 100–200 mm afstand van de cameralens (centrum van Figuur 1A).
    OPMERKING: Het object moet worden gepositioneerd op de hartpositie in het Langendorff-systeem. Deze positie is te zien in Figuur 1B, specifiek in het centrum van het beeld waar de lichtstralen samenkomen.
  3. Start de software voor camera-acquisitie en stel de camera in op een subsampling van 4x (4 pixels = 1 subpixel). Stel een region of interest (ROI) in van 200 x 200 subpixels (Aanvullend bestand 2).
    OPMERKING: Met deze configuratie is een temporele resolutie van 750 frames per seconde (fps) mogelijk.
  4. Schakel het verlichtingssysteem in (Aanvullend bestand 1), stel de lichtstralen zo in dat ze op het referentieobject zijn gefocust en zorg voor een homogene verlichting (Figuur 1B).
  5. Pas de lichtintensiteit op het referentieobject aan om overbelichting van het beeld te voorkomen.
    OPMERKING: Het beeld moet eruitzien als in Figuur 2A (of Figuur 1C, Controller PC). Reflecties op het oppervlak van het object (hart) moeten zoveel mogelijk worden verminderd zonder de definitie van de contour te verliezen. Dit kan worden gedaan door het vermogen van de verlichtingsregelaar aan te passen of door de belichtingstijd in de camera-instellingen te verkorten.
  6. Focus de cameralens om een helder beeld van het referentieobject te verkrijgen (Figuur 1C, controller PC). Zorg ervoor dat het referentieobject 80% van het gezichtsveld beslaat (Figuur 2A) om een conversieschaal van ongeveer 61 µm per subpixel te verkrijgen.
    OPMERKING: Het optische systeem activeert automatisch het verlichtingssysteem wanneer de camera in acquisitiemodus wordt gezet (Figuur 1A en Aanvullend bestand 2). Het wordt aanbevolen om de camera in stand-bymodus te houden zodat het verlichtingssysteem uit blijft en alleen wordt geactiveerd tijdens de perioden van experimentele gegevensverzameling om oververhitting te voorkomen.

6. Chirurgische en canulatieprocedures

  1. Heparinisatie en anesthesie
    1. Bereid een anesthesiemengsel voor bestaande uit tiletamine-zolazepam (40 mg/kg lichaamsgewicht muis) en xylazine (10 mg/kg lichaamsgewicht muis), en verdun dit vervolgens tot 200 µL met een zoutoplossing.
    2. Injecteer het anesthesiemengsel intraperitoneaal met een 27 G naald. Laat de muis in een diepe anesthesie raken.
      OPMERKING: Controleer op de afwezigheid van een reflex als reactie op een stimulus in de ledematen of staart (meestal is 10 min voldoende).
    3. Injecteer 200 UI niet-gefractioneerde heparine intraperitoneaal met een 27 G naald en wacht ongeveer 5 min voordat u verdergaat met het experiment.
  2. Extractie en canulatie
    1. Plaats de muis in rugligging en verwijder de vacht en huid van het borstgebied met een chirurgische schaar.
    2. Maak een abdominale incisie onder het diafragma, waarbij u er zeker van bent dat de integriteit ervan behouden blijft.
    3. Voer vervolgens een transversale incisie in het diafragma uit en voer snel een bilaterale ascenderende thoracotomie door de ribben uit, en verwijder dan de ribbenwand.
      OPMERKING: Let erop dat het hart niet beschadigd raakt. Als het hart tijdens de procedure wordt aangetast of beschadigd, wordt aanbevolen om het experiment niet voort te zetten.
    4. Houd de superieure structuren van het hart, de aortaboog en aangrenzende vaten voorzichtig vast met een fijne pincet. Til deze voorzichtig op om een snede eronder en naar boven te maken, en verwijder het hart en de longen samen.
    5. Overbreng het hart snel naar een petrischaal met 50 mL Tyrode-oplossing bij 4 °C voor een eerste wasbeurt.
      OPMERKING: Vanaf het moment dat het diafragma wordt ingesneden, zal het dier ademhalingsproblemen beginnen te ervaren; vanaf dit punt is er een venster van 60 s om stappen 6.2.3–6.2.6 uit te voeren. Het overschrijden van deze tijdslimiet kan ischemische schade veroorzaken.
    6. Verwijder de longen en overtollig vetweefsel om de aortaboog vrij te leggen met behulp van een stereomicroscoop en een fijne schaar.
      OPMERKING: Zorg bij het schoonmaken van het weefsel dat de aortaboog niet beschadigd raakt. Als de aorta onder de arteria brachiocephalica wordt doorgesneden, zal canulatie moeilijk zijn, wat mogelijk leidt tot druklekken.
    7. Overbreng het hart naar de op maat gemaakte canulatiebasis met 50 mL Tyrode-buffer bij 4 °C en plaats het aortieuiteinde in de canule, die is gemaakt van een 20 G naald (Supplementary File 1).
      OPMERKING: Pas op dat de aortiaalklep niet beschadigd raakt. Als de klep beschadigd is, zwelt het hart op en zal de coronaire circulatie niet correct worden gespoeld.
    8. Knoop twee canulatieknopen met 4/0 zijdehechtdraad: de eerste in de inkeping distaal van de tip van de canule en de tweede vóór de truncus brachiocephalicus (Supplementary File 1).
    9. Breng langzaam Tyrode-oplossing toe met een 1 mL spuit gevuld met buffer op kamertemperatuur. Controleer of het coronaire weefsel helder wordt om een goede canulatie te bevestigen.
    10. Verwijder vetweefsel om toegang te krijgen tot de ventrikels en atria.
      OPMERKING: Voorkom dat de canulatie langer dan 5 min duurt om de levensvatbaarheid van het hart te behouden.
    11. Overbreng het hart naar een Langendorff-systeem en laat het 30 min stabiliseren.
      OPMERKING: Het hart wordt in het midden van het systeem geplaatst (Figure 1A,B), verticaal opgehangen. Wees uiterst voorzichtig bij het ophangen van het hart om te voorkomen dat er luchtbellen ontstaan. Als dit gebeurt, zal de druk boven 140 mmHg stijgen, zal het hart beginnen op te zwellen en zal het niet langer levensvatbaar zijn.
      OPMERKING: De Langendorff-montage is voltooid wanneer het hart een mechanisch stabiele respons vertoont, een natuurlijke oscillatiefrequentie van ongeveer 360 slagen per minuut (BPM) heeft en een perfusiedruk tussen 60 en 110 mmHg.

7. Pacingprotocol en video-opname

  1. Levensvatbaarheid van het hart
    1. Verifieer of de coronaire druk in het bereik van 60–110 mmHg ligt met een perfusiepomp van 3 mL/min. Als de coronaire perfusiedruk onder de 60 mmHg daalt, verhoog dan licht de stroomsnelheid van de perfusiepomp (een lage druk zal ervoor zorgen dat het hart bleek en slap wordt). Omgekeerd, als de druk de 110 mmHg overschrijdt, verlaag dan licht de stroomsnelheid van de pomp (overmatige druk zal weefseloedeem en een progressieve drukstijging induceren totdat een hartstilstand optreedt).
      OPMERKING: Het handhaven van de perfusiedruk buiten het bovengenoemde optimale bereik gedurende een langere periode zal de levensvatbaarheid van het hart onomkeerbaar compromitteren.
    2. Plaats het hart in een frontale positie zodat een volledig frontaal beeld in de camera wordt verkregen. Pas de positie aan zodat beide atria zichtbaar zijn in de camera (Figuur 2A).
    3. Plaats de platina-elektroden voorzichtig oppervlakkig op de bovenkant van het rechteratrium bij de pacemakerknoop. Gebruik het camerabeeld als leidraad om de elektroden in het gezichtsveld te brengen. Positioneer de elektrode zodanig dat deze het rechteratrium niet blokkeert. Terwijl u het live-beeld van de camera monitort, brengt u de elektrode langzaam verder naar voren totdat deze het atriumweefsel raakt, waarbij u er zorg voor draagt geen overmatige compressie uit te oefenen (wat het rechteratrium in het beeld zou platdrukken).
      OPMERKING: Indien correct uitgevoerd, zal het camerabeeld lijken op Figuur 2A.
    4. Start de applicatie voor monitoring en pacing (Aanvullend Bestand 11) en schakel de acquisitiekaart in (Figuur 1A (6)). Stel de stimulusparameterwaarden in: amplitude op 2 V, frequentie op 420, 540 en 720 pulsen per minuut (PPM) met een vierkante puls met een duty-cycle van 7 ms (inzet van Figuur 2A).
    5. Pas de levensvatbaarheidsstimulaties toe, beginnend bij de laagste frequentie, met een stimulatieduur van 20 s gevolgd door een herstelperiode (rusttijd) van 20 s tussen de gebeurtenissen.
      OPMERKING: Beoordeel de levensvatbaarheid van het hart via cameramonitoring. Als het orgaan fysiologisch functioneel is, zal er een synchronisatie tussen de toegepaste stimulus en de cardiale respons worden waargenomen, vergezeld van een juiste coördinatie tussen de hartkamers. Omgekeerd zal een gebrek aan levensvatbaarheid zich manifesteren door een verlies van de coördinatie van de kamers of door de exclusieve aanwezigheid van geïsoleerde atriumcontracties.
    6. Sluit de deur van de kamer omdat het experiment gevoelig is voor kamerlicht en thermische schommelingen (Figuur 1C).
      OPMERKING: De deur van de kamer moet tijdens de experimentele tijd gesloten blijven. Monitor de levensvatbaarheid van het hart met de camera en de perfusiedruk.
  2. Gegevensregistratie
    1. Pas het pacingprotocol toe, dat bestaat uit vierkantpulstreinen van 30 s duur, gevolgd door 30 s zonder signaal. Stel de stimulusparameterwaarden in voor elke pacingtrein: amplitude op 2 V, duty cycle van 7 ms en frequentie in het bereik van 360 tot 720 PPM.
      OPMERKING: Het pacingprotocol begint bij 360 PPM en neemt toe met 60 PPM bij elk tijdstip (inzet van Figuur 2A).
    2. Neem continu video's op van de dynamiek van het frontale beeld van het hart in .avi-formaat met behulp van camera-acquisitiesoftware (Aanvullend Bestand 2). Maak een video-opname van 20 s van elke pacingtrein. Neem het segment van 20 s op dat begint 5 s na de pacing. Een representatieve ruwe opname is te vinden in Aanvullende Film 1.
      OPMERKING: Een computer registreert gelijktijdig de toegepaste pacingtrein (.xls, Aanvullend Bestand 9) voor elke opgenomen video (.avi), gegenereerd door respectievelijk de monitoring- en pacingapplicatie en de camera-acquisitiesoftware (Aanvullend Bestand 2 en Aanvullend Bestand 3).
    3. Verifieer de levensvatbaarheid van het hart door de eerste video, opgenomen vóór het starten van het stimulatieprotocol, te vergelijken met de tweede video, opgenomen na toepassing van het protocol (Figuur 2B).

8. Schoonmaak van het Langendorff-perfusiesysteem na het experiment

  1. Verwijder de stimulus- en ECG-platina-elektroden. Neem het hart uit het systeem en laat alle resterende Tyrode-oplossingen weglopen.
  2. Schakel het optische systeem uit en sluit de O2 klep
  3. Spoel het systeem door met 1 L gedeïoniseerd water bij 37 °Cen laat het systeem leeglopen.
  4. Herhaal stappen 2.4 en 2.5.
  5. Schakel alle systemen en apparatuur uit.

9. Videoverwerking

  1. Begin met het importeren van elke video in computationele software en het toepassen van een videonormalisatiefunctie15.
  2. Selecteer een regio van interesse (ROI) die het hartgebied omvat. Voer beeldsegmentatie uit om achtergrondruis, elektroden en de canule te verwijderen (Aanvullend bestand 4).
    OPMERKING: Raadpleeg Aanvullend bestand 10 voor het correct selecteren van het te verwijderen beeldgebied.
  3. Voer een globale analyse van de mechanische dynamica uit (Aanvullend bestand 5). Ondersteunende voorbeelden van variabiliteit en signalen worden getoond in Aanvullende figuur S1, Aanvullende figuur S2 en Aanvullende figuur S3.
    1. Pas morfologische operatoren toe op elk videoframe om de omtrek van het hart te detecteren, en pas vervolgens een fill-frame-algoritme toe om een masker te genereren15.
    2. Tel de pixels binnen het gesegmenteerde gebied in elk frame en normaliseer dit aantal vervolgens door het totale aantal pixels in het beeld om een dynamisch signaal te produceren (inzet in Figuur 2B en Aanvullende figuur S3).
    3. Pas een bidirectionaal Butterworth-filter van de 5e orde tussen 3 en 100 Hz toe op het verkregen signaal om hoogfrequente ruis en artefacten door druppelende perfusie te onderdrukken15.
    4. Normaliseer de signalen over alle video's met behulp van de geregistreerde maximum- en minimumwaarden.
    5. Bepaal de hartslag door het interval tussen twee maximum-amplitude-waarden (IAA (s)) te berekenen voor elk dynamisch- en stimulus-signaal.
    6. Bepaal de frequentie in BPM met de volgende formule:
      Vergelijking voor frequentieberekening waarin de hartslag als BPM wordt weergegeven als 60 gedeeld door IAA.
    7. Genereer Poincaré-kaarten vanuit de IAA-gegevens om de variabiliteit over korte en lange termijn te illustreren16,17,18 (Aanvullende figuur S1 en Aanvullende figuur S2).
      OPMERKING: Raadpleeg voor meer gedetailleerde informatie Aanvullend bestand 10.
  4. Voer een segmentale analyse van de ventriculaire mechanische dynamica uit (Aanvullend bestand 6).
    1. Pas beeldbinarisatie toe. Gebruik morfologische operatoren om het ventriculaire gebied af te bakenen, waarbij dit wordt aangepast naar een elliptische geometrie zonder de ROI in gevaar te brengen15.
    2. Pas een minimale ellips aan op het ventriculaire gebied in elk frame. Extraheer de coördinaten van een set distale punten in een frame. Gebruik een set van 10–20 punten in elk uiteinde langs de Y-as (Figuur 3A). Een representatieve output van de ellips-schatting wordt getoond in Aanvullende film 2.
    3. Bereken de ventriculaire verkorting als de gemiddelde afstand tussen de uiterste punten langs de Y-as in elke video19.
    4. Pas een bidirectionaal Butterworth-filter van de 5e orde tussen 3 en 100 Hz toe op het verkregen signaal om hoogfrequente ruis en artefacten door druppelende perfusie te onderdrukken15.
    5. Normaliseer het signaal van de ventriculaire verkorting ten opzichte van alle video's die voor elke pacing zijn verkregen, en bereken de hartslag en vertraging zoals in stappen 9.3.5–9.3.6.
      OPMERKING: Parameters, zoals ventriculaire cyclusduur (DVE), relaxatieduur (DVW), interventriculair interval (IVV) en ventriculaire amplitude (VA), worden bepaald (Figuur 3A).
      OPMERKING: Raadpleeg voor meer gedetailleerde informatie Aanvullend bestand 10.
  5. Voer een segmentale analyse van de mechanische dynamica van de atria uit (Aanvullend bestand 7).
    1. Gebruik twee ROI's om de atria af te bakenen (Figuur 3C).
    2. Analyseer elk atrium individueel.
      1. Gebruik morfologische operatoren om de atria te delineeren terwijl u deze aanpast zonder de ROI in gevaar te brengen15. Gebruik een contrastverhogingsalgoritme om elk atrium te delineeren20,21.
      2. Pas beeldbinarisatie toe en kwantificeer het aantal pixels dat per frame afwijkt van nul om een atriumdynamisch signaal te verkrijgen.
      3. Pas een bidirectionaal Butterworth-filter van de 5e orde tussen 3 en 100 Hz toe op de verkregen signalen om hoogfrequente ruis en artefacten door druppelende perfusie te onderdrukken15.
      4. Bereken het gemiddelde van twee atriumsignalen (Figuur 3D).
    3. Normaliseer het signaal van de atriale verkorting ten opzichte van alle video's die voor elke pacing zijn verkregen en bereken de hartslag en vertraging zoals in stappen 9.3.5–9.3.6.
      OPMERKING: Parameters, zoals atriale cyclusduur (DAE), atriaal-atriaal interval (IAT) en atriale amplitude (AA), worden bepaald (Figuur 3D). Raadpleeg voor meer gedetailleerde informatie Aanvullend bestand 10.
  6. Voer een elektromechanische analyse uit13,22 (Aanvullend bestand 8).
    1. Vergelijk de pacing-gegevens met de atriale en ventriculaire signalen (Figuur 3D).
    2. Bereken de propagatietijd in het geleidingssysteem van het hart om de vertraging tussen de atriale en ventriculaire gebeurtenissen (AVD) te bepalen, waarbij de toegepaste stimulus als referentie dient.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De experimenten naar de mechanische hartfunctie worden uitgevoerd met behulp van het Langendorff-apparaat, zoals weergegeven in Figuur 1A (Bovenzijde)De monitorings- en optische systemen maken videoregistratie mogelijk wanneer de verlichtingscontrole wordt geactiveerd, zoals weergegeven in Figuur 1A (Onderzijde). Figuur 1C illustreert het externe aanzicht van de thermostaatgestuurde kast, ontworpen ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het hart van de muis is zeer gevoelig voor temperatuurschommelingen2,9,10,11,22. In dit experiment werd het geperfuseerde hart verticaal gepositioneerd. We hebben een kleine aanpassing doorgevoerd om het temperatuurverlies van het perfusaat en bewegingsartefacten bij de Langendorff-perfusiemethode te minimaliseren. Aan de slangenspoel werd een recirculatiepomp...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten om te verklaren.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de subsidie nr. LN-2025-C-23 van het Secretariaat voor Wetenschap, Geesteswetenschappen, Technologie en Innovatie (SECIHTI).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 mL spuitBD Plastipak302485Chirurgische procedure
20 G naaldNIPROAH-2032Aortacannule
25 mm instelbare lens met 8x-100x vergrotingGenericN/ALens van optisch camerasysteem; generiek geciteerd als instelbare camerelens
27 G naaldBD PrecisionGlide302358Chirurgische procedure
3D-ontworpen ondersteuningsstukkenCINVESTAVN/AOp maat gemaakte 3D-ontworpen ondersteuningsstukken
4-0 zijden hechtdraadAMERICAN SUTURETGSN0901Aortacannule
40-A voedingSTERENPRL-25LED-voeding
LuchtsteenN/AN/AZuurstofvoorziening Tyrode-oplossing
CaCl2 (2H2O)Sigma-AldrichC3306Tyrode-oplossing
D-glucoseJ.T. Baker1916-01Tyrode-oplossing
DrainagepompCINVESTAVN/AOp maat gemaakte drainagepomp; generiek geciteerd als drainagepomp
F = 25,4 mm, plano-convexe lensTHORLABSLA1951-AVerlichtingslens van optisch systeem; generiek geciteerd als plano-convexe verlichtingslens
Geconcentreerd azijnzuurSigma-Aldrich695092Schoonmaak Langendorff-systeem
HeparinePiSA060M91Anticoagulans
HEPESSigma-AldrichH3375Tyrode-oplossing
Hoge-vermogen LED'sLuminiusCBT-90-G-L11-C12LED-lichtbron
VerlichtingssysteemCINVESTAVN/AOp maat gemaakt verlichtingssysteem; generiek geciteerd als verlichtingssysteem
KClCTR SCIENTIFICCTR02196Tyrode-oplossing
LabVIEW-software versie 2018NATIONAL INSTRUMENTSN/ASoftware gebruikt voor de monitorings- en pacing-applicatie; generiek geciteerd als monitorings- en pacing-applicatie
MATLAB-softwareThe MathWorksN/AComputationele software voor videonormalisatie, segmentatie en analyseprogramma's; generiek geciteerd als computationele software
Medische zuurstofGRUPO INFRAN/AZuurstofvoorziening Tyrode-oplossing
MgCl2 (6H2O)CTR SCIENTIFICCTR02104Tyrode-oplossing
Mini-pomp met variabele flowCONTROL COMPANY3385Perfusiepomp
Chirurgische set voor muizenKent ScientificINSMOUSEKITChirurgische procedure
NaClSigma-AldrichS5886Tyrode-oplossing
NaH2PO4DEQDEQF290400250Tyrode-oplossing
NaOHCTR SCIENTIFICCTR03108pH-aanpassing
NI USB-6009NATIONAL INSTRUMENTS779026-01Acquisitiekaart
Platine-elektroden, diam. 0,25 mmSigma-Aldrich349402Elektroden voor elektrische stimulatie
Voeding (12 V, 30 A)KarnickPTA-12V30AVoeding voor recirculator
DrukmeterCINVESTAVN/AOp maat gemaakte drukmeter; generiek geciteerd als drukmeter
DruktransducerLA BOUVETB17295Drukmeter voor Langendorff-systeem
Zuivere ethylalcoholSigma-Aldrich493511Ethanol voor systeemschoonmaak
Recirculerend thermisch bad (LXC)PolyScienceL113A0412Reservoirrecirculator
ZoutoplossingPiSA1118480,9% natriumchloride (NaCl)-oplossing
Serpentine thermisch badCINVESTAVN/AOp maat gemaakte serpentine recirculator/thermisch bad
StereomicroscoopN/AN/AChirurgische procedure
StereomicroscoopverlichtingN/AN/AChirurgische procedure
uEye Cockpit-softwareIDS Imaging Development System GmBHN/ACamera-acquisitiesoftware; generiek geciteerd als camera-acquisitiesoftware
UI-3360CP-NIR-GL Rev.2IDSAB00624Hoge-snelheid CMOS-camera; generiek geciteerd als CMOS-camera
XylazinePiSA4001211Anestheticum
Zoletil 100Virbac83048907Tiletamine-zolazepam anestheticum; generiek geciteerd als anestheticummengsel

Referenties

  1. Guarina L et al. Biological noise is a key determinant of the reproducibility and adaptability of cardiac pacemaking and EC coupling. J Gen Physiol. 2022;154(9):e202012613.
  2. Peña-Romo A et al. Noise enhanced the electrical stimulation-contractile response coupling in isolated mouse heart. Int J Cardiol. 2016;221:155-60.
  3. Bychkov R et al. Synchronized cardiac impulses emerge from heterogeneous local calcium signals within and among cells of pacemaker tissue. JACC Clin Electrophysiol. 2020;6(8):907-31.
  4. Clancy CE, Santana LF. Evolving discovery of the origin of the heartbeat: a new perspective on sinus rhythm. JACC Clin Electrophysiol. 2020;6(8):932-4.
  5. Asamudo EU, Ng YH, Bers DM. Langendorff isolated heart perfusion model for functional studies in mice. In: Chandrasekera DNK, Katare R, editors. Cardiomyocytes: Methods and Protocols. Springer Nature; New York; 2025. p. 111-24.
  6. Louradour J et al. Simultaneous assessment of mechanical and electrical function in Langendorff-perfused ex vivo mouse hearts. Front Cardiovasc Med. 2023;10:1293032.
  7. Noly PE et al. Assessment of ex vivo murine biventricular function in a Langendorff model. J Vis Exp. 2022;(190):e64384.
  8. Beckett PR. The isolated perfused heart preparation: two suggested improvements. J Pharm Pharmacol. 1970;22(11):818-22.
  9. Ihara K et al. Electrophysiological assessment of murine atria with high-resolution optical mapping. J Vis Exp. 2018;(132):e56478.
  10. King DR, Hardin KM, Hoeker GS, Poelzing S. Reevaluating methods reporting practices to improve reproducibility: an analysis of methodological rigor for the Langendorff whole heart technique. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2022;323(3):H363-77.
  11. Lang D, Sulkin M, Lou Q, Efimov IR. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. J Vis Exp. 2011;(55):e3275.
  12. Liao R, Podesser BK, Lim CC. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2012;303(2):H156-67.
  13. Sung YL, Tsai YS, Chang CL, Hu YF. Protocol for high-resolution optical mapping of ex vivo rat heart for electrophysiological studies. STAR Protoc. 2025;6(2):103734.
  14. Lee P et al. Low-cost optical mapping systems for panoramic imaging of complex arrhythmias and drug-action in translational heart models. Sci Rep. 2017;7:43217.
  15. Laughner JI et al. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2012;303(7):H753-65.
  16. Hao X et al. TGF-β1-mediated fibrosis and ion channel remodeling are key mechanisms in producing the sinus node dysfunction associated with SCN5A deficiency and aging. Circ Arrhythm Electrophysiol. 2011;4(3):398-406.
  17. Pizzo E et al. Heart rate variability reveals altered autonomic regulation in response to myocardial infarction in experimental animals. Front Cardiovasc Med. 2022;9:843144.
  18. Tayel MB, AlSaba EI. Poincaré plot for heart rate variability. Int J Biomed Biol Eng. 2015;9(9).
  19. Bazan C, Barba DT, Blomgren P, Paolini P. Image processing techniques for assessing contractility in isolated adult cardiac myocytes. Int J Biomed Imaging. 2009;2009:352954.
  20. Christoph J, Luther S. Marker-free tracking for motion artifact compensation and deformation measurements in optical mapping videos of contracting hearts. Front Physiol. 2018;9:1483.
  21. Lebert J, Ravi N, Kensah G, Christoph J. Real-time optical mapping of contracting cardiac tissues with GPU-accelerated numerical motion tracking. Front Cardiovasc Med. 2022;9:787627.
  22. Larsen TS et al. The isolated working mouse heart: methodological considerations. Pflugers Arch. 1999;437:979-85.
  23. Vornanen M. Basic functional properties of the cardiac muscle of the common shrew (Sorex araneus) and some other small mammals. J Exp Biol. 1989;145:339-51.
  24. VanderBrink BA et al. Assessment of atrioventricular nodal physiology in the mouse. J Interv Card Electrophysiol. 1999;3(3):207-12.
  25. Shansky RM, Murphy AZ. Considering sex as a biological variable will require a global shift in science culture. Nat Neurosci. 2021;24(4):457-64.
  26. Shansky RM. Are hormones a “female problem” for animal research? Science. 2019;364(6443):825-6.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Langendorff-geperfuseerd hartmuizenhartmodeloptische beoordelingatriale contractiliteitventriculaire contractiliteitmeting van de hartslaghoge-resolutiebeeldvormingventriculaire verkortingatriale dynamiekcardiale mechanica

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.