Onderzoeksartikel
Met behulp van bio-informatica, machine learning en qPCR-validatie identificeerde deze studie vijf kandidaat-biomarkers die geassocieerd zijn met SUMOylatie en mitochondriale disfunctie bij hartfalen. Deze bevindingen verbeteren het begrip van de mechanismen van hartfalen en suggereren mogelijke richtingen voor toekomstig diagnostisch onderzoek.
Hartfalen (HF) vormt een aanhoudende klinische uitdaging. Hoewel SUMOylatie en mitochondriale functie essentieel zijn voor de gezondheid van cardiomyocyten, blijft hun gezamenlijke invloed op HF ongrijpbaar. Twee HF-gerelateerde datasets werden gedownload van GEO. De overlappende genen werden verkregen uit alle genen in de trainingsset, SUMO-gerelateerde genen en mitochondriale genen. Drie machine learning-algoritmen werden toegepast om diagnostische sleutelgenen te identificeren. Vervolgens werden diagnostische modellen opgebouwd en geëvalueerd op basis van deze genen. Daarnaast werd de immuunmicro-omgeving in HF versus gezonde controles beoordeeld met behulp van CIBERSORT, MCP-counter en ssGSEA. De verschillen in immuuninfiltratie tussen HF en gezonde controles werden geanalyseerd. Geneesmiddelvoorspelling en moleculaire koppeling werden uitgevoerd om potentiële geneesmiddelkandidaten te identificeren die zich op deze genen richten. Ten slotte werd qPCR gebruikt om genexpressieniveaus in klinische monsters te valideren. In totaal werden 113 gemeenschappelijke genen geïdentificeerd met een aanzienlijke verrijking in mitochondriale regulatie. Vijf belangrijke genen, namelijk NFKB1, MYEF2, NSUN2, SQSTM1 en FKBP4, werden geïdentificeerd door drie machine learning-algoritmen. Functionele verrijkingsanalyses koppelden deze genen aan de immuunrespons, RNA-verwerking en celcyclusregulatie. Bovendien toonde immunoinfiltratieprofilering aan dat neutrofieleninfiltratie bijdraagt aan gestoorde immuunresponsen bij HF. Moleculaire koppeling toonde aan dat het kleinmolecuulmedicijn IMX-942 een gunstige bindingsaffiniteit heeft met SQSTM1 (-5,8 kcal/mol). qPCR-validatie ondersteunde de bio-informatica-resultaten. NFKB1, MYEF2, NSUN2, SQSTM1 en FKBP4 werden geïdentificeerd als sleutelgenen die SUMOylatie en mitochondriale functie in HF verbinden. Deze bevindingen bieden nieuwe inzichten in de pathofysiologie van het harteweefsel en kunnen bijdragen aan de ontwikkeling van nieuwe diagnostische en therapeutische strategieën.
Hartfalen (HF), het eindstadium van verschillende hart- en vaatziekten, wordt gekenmerkt door een verminderde hartfunctie die niet voldoet aan de metabole behoeften van het lichaam1. Deze slopende aandoening vormt aanzienlijke bedreigingen voor de gezondheid van patiënten, wat leidt tot een verminderde levenskwaliteit en verhoogde sterftecijfers2. Huidige diagnostische methoden voor HF omvatten voornamelijk biochemische markerdetectie 3,4, echocardiografie en radiologische beeldvorming5. Hoewel beschikbare behandelingen farmacologische middelen, apparaatgebaseerde interventies en chirurgische procedures omvatten, blijven klinische uitkomsten onbevredigend6. Beperkingen zoals bijwerkingen van medicijnen, beperkte toepasbaarheid van apparaten, immuunafstoting en andere complicaties belemmeren vaak de therapeutische werkzaamheid 7,8,9,10,11. Daarom is er dringend behoefte om de onderliggende mechanismen van HF te verduidelijken, vroege en precieze diagnostische biomarkers te identificeren en effectievere en veiligere therapeutische strategieën te ontwikkelen.
Kleine ubiquitine-achtige modificatoreiwitten (SUMO) worden covalent geconjugeerd aan de lysineresiduen van substraateiwitten via een dynamisch en omkeerbaar proces, waarbij de structuur en functie van substraateiwitten worden gereguleerd12. SUMOylatie, een cruciale posttranslationele modificatie, dient als een belangrijke regelaar van verschillende cellulaire processen13,14. Mitochondriën, als het energie-metabolismecentrum van cellen, zijn cruciaal betrokken bij de pathogenese van HF. In het pathologische proces van HF draagt mitochondriale disfunctie, zoals onvoldoende ATP-productie, een barstte reactieve zuurstofstof (ROS) en een Ca2+ homeostase-onevenwicht, aanzienlijk bij aan progressie 15,16,17,18. Opvallend is dat opkomend bewijs wijst op een mogelijke wisselwerking tussen SUMOylatie en mitochondriale functie. Mitochondriale stress kan SUMOylatie-gerelateerde routes activeren, terwijl SAMO-eiwitten en hun specifieke proteasen essentieel zijn voor het handhaven van mitochondriale homeostase 19,20,21. Recente studies hebben verder het belang van mitochondriale kwaliteitscontrole en mitochondriale dynamiek bij hart- en vaatziekten en HF-progressiebenadrukt 22,23. Het synergetische effect van SUMOylatie en mitochondriale regulatie op de ontwikkeling van HF blijft echter onduidelijk, vooral op genniveau.
In deze studie onderzochten we systematisch genen op het stippunt van SUMOylatie en mitochondriale disfunctie in HF, twee belangrijke biologische processen die individueel in verband zijn gebracht met HF maar nog niet volledig geïntegreerd. Overlappende genen werden geïdentificeerd door elkaar te kruisen tussen HF-gerelateerde differentieel expressieve genen, SUMOylatie-gerelateerde genen en mitochondriën-gerelateerde genen. Belangrijke genen werden vervolgens gescreend met behulp van machine learning-algoritmen en gebruikt om een diagnostisch model te construeren. Functionele verrijking en immuuninfiltratieanalyses werden verder uitgevoerd om hun potentiële biologische rol bij HF te onderzoeken. Deze geïntegreerde benadering kan een systematisch kader bieden om de overloop tussen SUMOylatie en mitochondriale disfunctie bij HF te onderzoeken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki en het protocol werd in november 2024 goedgekeurd door de Ethische Commissie van het Derde Ziekenhuis van de Hebei Medische Universiteit (W2025-065-1). Geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle betrokken proefpersonen.
Gegevensbron en preprocessing
RNA-seq-gegevens die met HF geassocieerd zijn, werden verkregen, waaronder twee microarray-datasets uit de Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Twee perifere bloedmicroarray-datasets werden geselecteerd: GSE59867 (34 HF-monsters en 30 controles) werd gebruikt als trainingsdataset; GSE57338 (177 HF-monsters en 136 controles) werd gebruikt als validatiedataset. Klinische informatie beschikbaar voor GSE57338, waaronder leeftijd, geslacht en ziektestatus, is opgehaald uit GEO en is samengevat in Aanvullende Tabel 1. Daarnaast werden in totaal 3.893 SUMOylatie-gerelateerde genen (SRG's) verkregen uit de dbPTM-database (https://awi.cuhk.edu.cn/dbPTM/index.php) (Aanvullende Tabel 2), terwijl 2.030 mitochondriën-gerelateerde genen (MRG's) werden verzameld op basis van een eerdere studie24 (Aanvullende Tabel 3). Vervolgens werd het R-pakket GEOquery (v 2.72.0)25 gebruikt om datasets uit de GEO-database te downloaden, de expressiematrix te extraheren en de voorbeeldfenotype-informatie te verkrijgen. Annotatie werd uitgevoerd door het annotatiebestand in kaart te brengen en de gen-ID's te matchen. Ongeldige gen-ID's werden verwijderd en de meest uitgedrukte probes werden behouden.
Sleutelgenselectie via machine learning
Er werd een meerstapsbenadering gebruikt om de genen te selecteren die gerelateerd zijn aan de HF, SUMOylatie en mitochondriën. Ten eerste werden de gemeenschappelijke genen tussen de trainingsdataset, de SRG's en de MRG's geïdentificeerd met behulp van intersectieanalyse. De potentiële functie van gemeenschappelijke genen werd vastgesteld door Gene Ontology (GO) en Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) verrijkingsanalyse met behulp van het R-pakket ClusterProfiler (v 4.12.6)26. Vervolgens werden drie machine learning-benaderingen gebruikt, namelijk LASSO-regressie, XGBoost en random forest (RF), om de genen verder te filteren. Bij LASSO-regressie werd de optimale regularisatieparameter λ via kruisvalidatie geselecteerd om de genetische kenmerken met de grootste voorspellende waarde te identificeren. De niet-nul coëfficiëntengenen werden geselecteerd voor latere analyse. Vervolgens werden XGBoost- en RF-algoritmen gebruikt om de feature-importance scores te berekenen en de top 20 genen te screenen.
Constructie en evaluatie van diagnostische modellen
Er werd een diagnostisch model opgesteld met behulp van logistische regressie op basis van de GSE59867 dataset. Het model werd vervolgens toegepast om de ziektestatus te voorspellen en kansscores te berekenen. Om het model te valideren, werden dezelfde sleutelgenen uit de GSE57338 dataset gehaald, genormaliseerd om overeen te komen met de trainingsdataset en gebruikt voor externe voorspellingen. De modelprestaties werden beoordeeld met behulp van Receiver Operating Characteristic (ROC)-curves, Confusion Matrix, Calibration Curve en Decision Curve Analysis (DCA).
Genensetverrijkingsanalyse (GSEA) en subcellulaire lokalisatie
Spearman-correlatieanalyse werd gebruikt om gecorreleerde genen voor elk sleutelgen te identificeren. GSEA-analyse werd uitgevoerd met het R-pakket ClusterProfiler (v 4.12.6) op de verwante genen van de sleutelgenen. Ondertussen werd hun subcellulaire lokalisatie van de sleutelgenen binnen de cel bepaald met behulp van de GeneCards-database (https://www.genecards.org/).
Gen-ziekte associatie en medicijnvoorspelling
Om de klinische relevantie van de geïdentificeerde sleutelgenen te evalueren, werden systematische ziekte-associatie- en geneesmiddelinteractie-analyses uitgevoerd. Ziekte-genrelaties werden onderzocht met behulp van de Comparative Toxicogenomics Database (CTD; https://ctdbase.org/), waarbij de resultaten werden gerangschikt op zowel inferentiescores als referentietellingen (top 10 gerapporteerde associaties). Gen-geneesmiddelinteractiegegevens voor sleutelgenen werden verkregen uit de Drug-Gene Interactiedatabase (DGIdb), en geneesmiddelen werden uitgesloten op basis van een interactiescore < 0,5. Vervolgens downloadden we de 3D-structuren van eiwitten die overeenkomen met sleutelgenen uit de PDB-database (https://www.rcsb.org/) en de moleculaire structuren van potentiële geneesmiddelen uit PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). Vervolgens werd moleculaire dockinganalyse uitgevoerd met behulp van CB-Dock227 (https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php) om de bindingsscores tussen de potentiële geneesmiddelen en eiwitten te berekenen. Een lagere bindingsvrije energie duidt op een stabielere interactie, wat suggereert dat de verbinding mogelijk een groter doelpotentiaal heeft.
Immuuninfiltratieanalyse
Immuuncelinfiltratie werd beoordeeld met drie complementaire methoden: Microenvironment Cell Populations-counter (MCP-counter)28, celtype-identificatie door het schatten van relatieve subsets van RNA-transcripten (CIBERSORT)29 en single-sample enrichment analysis (ssGSEA)30. MCP-teller en CIBERSORT-analyse werden uitgevoerd met behulp van het R-pakket IOBR (v 0.99.0)31. MCP-teller werd gebruikt om de abundantie van immuun- en stromale cellen te schatten, terwijl CIBERSORT werd gebruikt om de relatieve verhoudingen van 22 immuunceltypen te kwantificeren. ssGSEA werd uitgevoerd met het GSVA-pakket (v1.52.3)32 om de verrijking op monsterniveau van immuuncelsubtypes te evalueren.
Constructie van het concurrerende endogene RNA (ceRNA) regulerende netwerk
Om de potentiële miRNA–lncRNA-regulerende rollen te onderzoeken die geassocieerd zijn met eerder geïdentificeerde sleutelgenen, werd een ceRNA-regulatienetwerk opgebouwd. Het R-pakket multiMiR (v 1.26.0)33 werd gebruikt om potentiële microRNA (miRNA)–mRNA-interacties voor belangrijke genen te voorspellen, waarbij gegevens van PITA (https://omictools.com/pita-tool/) en de miRDB-database (https://mirdb.org/) werden geïntegreerd. miRNA–mRNA-paren met hoge betrouwbaarheid en consistentie werden geselecteerd. Vervolgens werden lncRNA–miRNA-interacties opgehaald uit de StarBase-database (https://rnasysu.com/encori/) en gefilterd op interacties ondersteund door ≥ 10 CLIP-seq-experimenten en gecategoriseerd als lincRNA's. Een ceRNA-netwerk werd opgebouwd door interacties tussen lncRNA-miRNA-mRNA te integreren.
qPCR-validatie
Om de expressie van belangrijke genen te valideren, werden bloedmonsters van patiënten met HF en gezonde controles afgenomen uit de klinische cohort (n = 6 per groep) in het Derde Ziekenhuis van de Hebei Medical University (W2025-065-1) onder goedgekeurde protocollen en geïnformeerde toestemming. Totaal RNA werd geïsoleerd met behulp van het TRIzol-reagens in combinatie met chloroform en isopropanol. Na extractie werd RNA opgelost in met DEPC behandeld water, en werden de concentratie en zuiverheid ervan beoordeeld met een NanoDrop-spectrofotometer. Voor transcriptieanalyse werd RNA omgekeerd getranscribeerd in cDNA met behulp van de Fast First-Strand cDNA Synthesis Mix for RT (met dsDNase). Vervolgens werd kwantitatieve PCR uitgevoerd met behulp van de Fast Taq qPCR SYBR Green Mix. De specifieke primerreeksen worden beschreven in de Materiaaltabel. Relatieve genexpressieniveaus werden berekend met de 2-ΔΔCT-methode , met passende normalisatie.
Statistische analyse
Alle statistische analyses werden uitgevoerd met R-software en GraphPad Prism. Statistische vergelijkingen tussen twee onafhankelijke groepen werden uitgevoerd met behulp van ofwel de Student's t-test of de Mann-Whitney U-test, afhankelijk van de gegevensverdeling. Een p-waarde van minder dan 0,05 werd beschouwd als statistische significantie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Identificatie en functionele verrijking van elkaar kruisende genen
Om genen te identificeren die betrokken zijn bij SUMOylatie en mitochondriale functie bij HF, werd eerst kwaliteitscontrole uitgevoerd op de trainingsset GSE59867 (Aanvullende Figuur 1A). Er werd een drievoudige intersectieanalyse uitgevoerd onder alle genen in de trainingsset, SRG's en MRG's, waarbij 113 overlappende genen werden geïdentificeerd (
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
HF, een progressieve en terminale fase van diverse hart- en vaatziekten, wordt gekenmerkt door zeer complexe en multifactoriele pathofysiologische mechanismen17,34. Hoewel zowel SUMOylatie als mitochondriale disfunctie individueel zijn geïnspecteerd bij HF, blijven hun potentiële synergetische rollen onvoldoende onderzocht, vooral op genniveau. In de huidige studie identificeerden we vijf belangrijke genen—NFKB1, MYEF2, NSUN2, SQ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dit werk werd ondersteund door het Medical Science Research Project van Hebei (subsidienummer: 20250084).
De auteurs hoeven geen belangenconflicten aan te geven.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Chloroform-vervanger | Servicebio | G3014-02 | qPCR-reagens |
| DEPC-behandeld water | Biosharp | BL510A | qPCR-reagens |
| Fast First-Strand cDNA-synthesemix voor RT (met dsDNase) | Albatross Biology | 500-101 | qPCR-reagens |
| Fast Taq qPCR SYBR Green Mix | Albatross Biology | 500-102 | qPCR-reagens |
| FKBP4-primers | Tsingke | N/A | Forward: 5’-GAAGGCGTGCTGAAGGTCAT-3’ Reverse: 5’-TGCCATCTAATAGCCAGCCAG-3’ |
| Isopropanol | Hushi | 80109218 | qPCR-reagens |
| MYEF2-primers | Tsingke | N/A | Forward: 5’-CAGCTCCAATGGCGTTAAAATG-3’ Reverse: 5’-TGGCCTTCTTACTTCCTGTAGAT-3’ |
| NanoDrop-spectrofotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000C | qPCR-reagens |
| NFKB1-primers | Tsingke | N/A | Forward: 5’-AACAGAGAGGATTTCGTTTCCG-3’ Reverse: 5’-TTTGACCTGAGGGTAAGACTTCT-3’ |
| NSUN2-primers | Tsingke | N/A | Forward: 5’-GAACTTGCCTGGCACACAAAT-3’ Reverse: 5’-TGCTAACAGCTTCTTGACGACTA-3’ |
| SQSTM1-primers | Tsingke | N/A | Forward: 5’-GCACCCCAATGTGATCTGC-3’ Reverse: 5’-CGCTACACAAGTCGTAGTCTGG-3’ |
| TRIzol-reagens | Vazyme | R401-01 | qPCR-reagens |
| β-actineprimers | Tsingke | N/A | Forward: 5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’ Reverse: 5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’ |
Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken
Toestemming aanvragen