Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Onderzoeksartikel

Liuwei Dihuang Wan remt osteoclastogenese en door ovariectomie veroorzaakte botverlies door NF-κB signalering te onderdrukken

116 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/72270

⸱

28 juli 2026

 ,  ,  ,  , 
1School of Medicine, Nankai University, 2School of Basic Medical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, 3Emergency Medical Center, Ningbo Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, 4The Second People's Hospital of Changzhou, the Third Affiliated Hospital of Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie toonde aan dat Liuwei Dihuang Wan (LWDHW) osteoclastdifferentiatie en door ovariectomie veroorzaakte botverlies onderdrukt door het remmen van de NF-κB-signaalroute, zoals blijkt uit LC-MS/MS-analyse, netwerkfarmacologie en in vivo en in vitro validatie.

Samenvatting

Liuwei Dihuang Wan (LWDHW), een klassieke traditionele Chinese medicijnformule, wordt veel gebruikt voor de behandeling van diverse ziekten die samenhangen met niertekort en heeft een bevredigende klinische werkzaamheid aangetoond bij postmenopauzale osteoporose (PMOP). De farmacologische mechanismen blijven echter onduidelijk. Om dit aan te pakken, analyseerden we eerst de chemische componenten van LWDHW met LC-MS/MS, waarbij 1.615 componenten werden geïdentificeerd. Netwerkfarmacologie voorspelde vervolgens dat ontsteking en de NF-κB-signaalroute potentiële therapeutische mechanismen zijn die ten grondslag liggen aan de effecten van LWDHW op PMOP. Vervolgens werden 27 vrouwelijke C57BL/6J-muizen willekeurig toegewezen aan de Sham-, Model- en LWDHW-groepen. Muizen in de laatste twee groepen ondergingen een bilaterale ovariectomie (OVX), en die in de LWDHW-groep kregen orale LWDHW met 9,75 g/kg/dag gedurende 8 weken. Serum- en femurmonsters werden verzameld voor Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), Micro-Computed Tomography (μCT), histologisch onderzoek en immunohistochemie (IHC). Primaire macrofagen (BMM's) uit het beenmerg zijn afgeleid werden behandeld met LWDHW en vervolgens onderworpen aan TRAP-kleuring en qRT-PCR. Bij OVX-muizen verlichtte LWDHW significant botverlies en achteruitgang van de botmicroarchitectuur, vergezeld van verlaagde serumniveaus β-CTX en een verlaagd aantal osteoclasten in femorale weefsels. IHC-kleuring toonde een aanzienlijk lagere expressie van TNF-α, IL-1β en p-P65 aan in femorale weefsels van met LWDHW behandelde muizen vergeleken met de modelgroep. In vitro toonde TRAP-kleuring aan dat LWDHW de differentiëring van BMM's door RANKL/M-CSF geïnduceerde osteoclastdifferentiatie van BMM's remde en de expressie van Ctsk, MMP9 en Nfatc1 verlaagde. Western blot-analyse toonde verder aan dat eiwitniveaus van P65, p-P65, IκBα en p-IκBα significant daalden in BMM na LWDHW-behandeling. Gezamenlijk verlicht LWDHW postmenopauzale osteoporose, mogelijk door het onderdrukken van door NF-κB signalerende osteoclastogenese te onderdrukken.

Inleiding

Postmenopauzale osteoporose (PMOP) is een veelvoorkomende metabole botziekte die wordt gekenmerkt door verlies van botmassa en achteruitgang van de botmicroarchitectuur1. Met de groeiende vergrijzing van de bevolking is de toenemende incidentie van PMOP een wereldwijd volksgezondheidsprobleem geworden dat de gezondheid van postmenopauzale vrouwen ernstig bedreigt2. In China is de totale prevalentie van PMOP zo hoog als 32,1%. Getroffen personen zijn vatbaarder voor ernstige complicaties zoals chronische rugpijn, wervelkolomafwijkingen en fragibiliteitsfracturen 4,5. Momenteel zijn door de FDA goedgekeurde medicijnen voor osteoporose bisfosfonaten6, parathyroïdehormoon67 en denosumab8, die veel worden gebruikt in de klinische praktijk. Hun langdurige toepassing wordt echter vaak beperkt door verschillende bijwerkingen9. Daarom is er een dringende behoefte om veiligere en effectievere therapeutische middelen voor PMOP te ontwikkelen. Onder de mogelijke alternatieven krijgen Chinese kruidengeneesmiddelen steeds meer aandacht vanwege hun erkende effectiviteit en gunstige veiligheidsprofiel10.

Liuwei Dihuang Wan (LWDHW) is een klassieke formule in de traditionele Chinese geneeskunde (TCM), voor het eerst gedocumenteerd in de oude tekst Key to Therapeutics of Children's Diseases tijdens de Song-dynastie. Al duizenden jaren wordt LWDHW veelvuldig gebruikt in de klinische praktijk om verschillende ziekten te behandelen die worden toegeschreven aan niertekort 11,12,13,14. Volgens de TCM-theorie van "nier-bevelende botten" worden verlies van botmassa en botdegradatie bij PMOP-patiënten voornamelijk veroorzaakt door onvoldoende voeding uit nieressentie15. Daarom wordt LWDHW vaak toegepast in de klinische behandeling van PMOP en heeft het een duidelijke therapeutische werkzaamheid aangetoond16,17. Hoewel dier- en klinische studies hebben aangetoond dat LWDHW meerdere farmacologische effecten heeft, waaronder antioxidatieve18, ontstekingsremmende19 en antifibrotische activiteiten14, blijft het onderliggende mechanisme tegen PMOP grotendeels onbekend.

Bothomeostase is afhankelijk van het evenwicht tussen botresorptie door osteoclasten en botvorming door osteoblasten20. Dit evenwicht wordt verstoord doordat osteoclastdifferentiatie en activiteit worden versterkt onder ontstekingstoestanden, wat leidt tot versnelde botresorptie21. In dit proces fungeert de NF-κB-route als kernregulator. Ontstekingsfactoren zoals TNF-α en IL-1β kunnen fosforylering en afbraak van IκBα induceren, wat de kerntranslocatie van gefosforyleerd p65 (p-P65)22 in gang zet. Daardoor worden downstream osteoclast-specifieke genen, waaronder Ctsk, Mmp9 en Nfatc1, geactiveerd om osteoclastogenese23,24 te bevorderen.

Netwerkfarmacologie is een interdisciplinair vakgebied dat informatica, farmacologie en bio-informatica integreert25. Het vertoont duidelijke voordelen bij het grondig onderzoeken van de farmacologische mechanismen die ten grondslag liggen aan de therapeutische effecten van Chinese kruiden26. In deze studie werd netwerkfarmacologie gebruikt om de potentiële biologische processen en signaalroutes te voorspellen die betrokken zijn bij de anti-osteoporotische effecten van LWDHW. Tegelijkertijd werden de chemische componenten van LWDHW geanalyseerd met LC-MS/MS. Bovendien werden in vivo validatie uitgevoerd met een OVX-muismodel en in vitro-experimenten met primaire beenmerg-afgeleide macrofagen (BMM's) om het farmacologische mechanisme van LWDHW tegenover PMOP verder te onderzoeken. De workflow wordt weergegeven in Figuur 1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van de Zhejiang Chinese Medical University (IACUC-202402-07).

Voorbereiding en LC-MS/MS-analyse van LWDHW

De LWDHW-formule bestaat uit zes Chinese kruiden: Rehmannia glutinosa (Gaertn.), Cornus officinalis (Sieb.), Paeonia suffruticosa (Andr.), Dioscoreae opposite (Thunb.), Poria cocos (Schw.) en Alisma orientale (Sam.). Gedetailleerde informatie over deze kruiden staat in Tabel 1. Alle rauwe kruiden werden geleverd door het Eerste Geaffilieerde Ziekenhuis van de Zhejiang Chinese Medische Universiteit (Hangzhou, China) en gekookt in gezuiverd water met een kruiden-waterverhouding van 0,1 kg/L. Het resulterende waterige extract werd gefilterd en geconcentreerd tot een werkoplossing bij 0,5 g/mL voor latere LC-MS/MS-analyse en dierproeven. Bovendien werd de werkoplossing verwerkt tot gevriesdroogd poeder voor celexperimenten.

In LC-MS/MS-analyse waren de vloeistofchromatografiecondities als volgt: mobiele fase A (waterig) en mobiele fase B (organisch) bestonden respectievelijk uit 0,1% mierenzuur in water en acetonitril voor positieve ionenmodus, of respectievelijk 5 mM ammoniumformiet in water en acetonitril voor negatieve ionenmodus. De totale looptijd was 8 minuten, met een debiet van 0,3 mL/min, een kolomtemperatuur van 40 °C en een injectievolume van 2 μL. Voor massaspectrometrie werden gegevens verkregen in Full MS-ddMS2-modus, met sprayspanningen ingesteld op +3,50 kV (positief) en –2,50 kV (negatief).

Bioactieve ingrediënten en doelwitten voorspelling van LWDHW

De individuele namen van zes bestanddelende kruiden werden ingevoerd in de Traditional Chinese Medicine System Pharmacology (TCMSP) database om de volledige ingrediëntenlijst voor LWDHW te verkrijgen. Bioactieve ingrediënten werden vervolgens gescreend met behulp van de farmacokinetische parameters orale biobeschikbaarheid (OB) ≥ 30% en geneesmiddelgelijkheid (DL) ≥ 0,18 27,28,29,30. De bijbehorende eiwitten van de bioactieve ingrediënten werden geïdentificeerd en ingediend bij UniProt om hun gestandaardiseerde gennamen terug te krijgen, die werden gedefinieerd als de uiteindelijke gendoelen van LWDHW.

Overlappende doelen tussen LWDHW en PMOP

Gendoelen die met PMOP geassocieerd zijn, werden gevonden door op 2 oktober 2024 te zoeken op het trefwoord "postmenopausale osteoporose" in zowel de GeneCards- als de DisGeNET-databases. Doelen werden gefilterd met scoredrempels van >0,1 in DisGeNET en >10 in GeneCards, en dubbele vermeldingen werden verwijderd om een niet-redundante set PMOP-gerelateerde genen te verkrijgen. Vervolgens werden de kruidenafgeleide doelen van LWDHW en de aan PMOP geassocieerde doelen geïmporteerd in de Venny online tool om een Venn-diagram te genereren dat de overlappende doelen tussen LWDHW en PMOP toont.

Analyse van genontologie (GO) en verrijking van signaalpaden

De overlappende doelen tussen LWDHW en PMOP werden onderworpen aan GO-verrijkingsanalyse met behulp van de DAVID-database. De teruggevonden GO-termen werden ingedeeld in drie categorieën, waaronder cellulaire component, moleculaire functie en biologisch proces (BP). Na het filteren van FDR < 0,01 werden de top 30 BP-termen in een bubbeldiagram vermeld in aflopende volgorde van vouwverrijking.

Vervolgens werden de overlappende doelen ingevoerd in de Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) en Metascape-databases voor de verrijking van signaalpaden. De verrijkte paden uit de KEGG- en Metascape-databases werden gerangschikt op het aantal overeenkomstige doelen in aflopende volgorde, en de top 25 paden uit elke database werden weergegeven als staafdiagrammen.

Netwerkconstructie

De netwerken "Formula-Herbs-Ingredients-Targets-Disease" en "Targets-Pathways" zijn in Cytoscape geconstrueerd om de onderlinge relaties tussen componenten te visualiseren. Een eiwit-eiwit interactie (PPI) netwerk werd gegenereerd door de overlappende doelen in de STRING-database in te voeren. Knooppuntdoelen binnen het netwerk werden geïdentificeerd door screening op basis van topologische kenmerken, waaronder graadcentraliteit (DC), betweenness-centraliteit (BC) en closeness-centraliteit (CC).

Diergroepering, OVX-geïnduceerde osteoporosemodel en geneesmiddelinterventie

In totaal werden 27 vrouwelijke C57BL/6J muizen (2 maanden oud, 22 ± 2 g) geleverd door het Animal Experiment Center van de Chinese Medische Universiteit Zhejiang (Hangzhou, Zhejiang). Alle dieren werden gehuisvest onder specifieke ziekteverwekkervrije (SPF) omstandigheden met een 12 uur licht/donker cyclus, een omgevingstemperatuur van 25 °C en een luchtvochtigheid tussen 40% en 60%, met vrije toegang tot voedsel en water. Na 1 week adaptief voeden werden de muizen willekeurig toegewezen aan drie groepen (n = 9 per groep) met behulp van een willekeurige getalletabel: Sham, Model en LWDHW. Muizen in de model- en LWDHW-groepen ondergingen een bilaterale ovariectomie (OVX) om het PMOP-model vast te stellen, terwijl de Sham-groep een schijnprocedure onderging waarbij een equivalent volume periovariaal vetweefsel werd verwijderd. Vanaf twee dagen na de operatie kregen muizen in de LWDHW-groep dagelijks orale gavage van LWDHW-werkoplossing in een dosis van 9,75 g/kg/dag (omgezet van de menselijke equivalente dosis op basis van het lichaamsoppervlak), terwijl de Model- en Sham-groepen een gelijk volume zoutoplossing kregen. Biologische monsters, waaronder serum- en femorale weefsels, werden 8 weken na toediening verzameld voor verdere analyse. Er kwam geen onverwachte dood of sterfte op in een van de groepen gedurende de experimentele periode.

Serumenzym-gekoppelde immunosorbentassay (ELISA)

Volbloed werd afgenomen uit de retro-orbitale plexus en gecentrifugeerd op 1000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C om serum te verkrijgen. Serumconcentraties van osteocalcine (OCN) en β-C-terminale telopeptide van type I collageen (β-CTX) werden gemeten met de bijbehorende ELISA-kits volgens de protocollen van de fabrikant.

μCT en biomechanische analyse

Femorale monsters werden gescand met behulp van een hoogresolutie micro-computertomografie (μCT) apparatuur met een isotrope resolutie van 10 μm. De driedimensionale (3D) microstructuur van het distale dijbeen werd gereconstrueerd uit de verkregen beelden met behulp van NRecon-software. Vervolgens werden de volgende botmicroarchitectuurparameters, waaronder botmineraaldichtheid (BMD, g/mm3), botvolumefractie (BV/TV, %), trabeculaire dikte (Tb.Th, mm) en trabeculair aantal (Tb.N, 1/mm), gekwantificeerd binnen het interessegebied (ROI) van het distale dijbeen.

De biomechanische eigenschappen van femorale monsters (n = 3 per groep) werden geëvalueerd via een driepuntsbuigingstest met een Axial-Torsion Vermoeidheidstestsysteem. Er werd een drukbelasting op de middendiafyse uitgeoefend met een constante verplaatsingssnelheid van 2 mm/min tot structureel falen. De maximale belasting (N) werd automatisch geregistreerd door de software van het systeem.

Histomorfologie, immunohistochemie (IHC) en immunofluorescentie (IF) kleuring

Na fixatie met 4% paraformaldehyde, ontkalking in 14% EDTA-oplossing en dehydratatie via een gegradueerde ethanolserie, werden femorale monsters verwerkt tot paraffinesecties van 3 μm dik zoals eerder beschreven31. De doorsneden werden gekleurd met Alcian Blue Hematoxylin (ABH)/Orange G voor morfologisch onderzoek. Kwantitatieve analyse van het trabeculaire botgebied in de distale femorale metafyse werd uitgevoerd met behulp van de OsteoMetrics-software.

Lever- en niermonsters werden vastgelegd, ingebed in paraffine en in secties van 4 μm gesneden. Na routinematige deparaffinisatie en rehydratatie werden de secties gekleurd met hematoxyline en eosine. Histologisch onderzoek werd uitgevoerd onder een lichtmicroscoop.

IHC- en IF-assays werden uitgevoerd op paraffine-ingebedde secties volgens vastgestelde procedures. Kort gezegd werd antigeenwinning uitgevoerd door secties te incuberen in een 0,01 M citratbuffer bij 60 °C gedurende 4 uur. Secties werden vervolgens 's nachts geïncubeerd bij 4 °C met primaire antilichamen waaronder ALP (1:300), IL-1β (1:500), TNF-α (1:500) en p-P65 (1:300). Na 20 minuten incubatie met corresponderende secundaire antilichamen werden secties onderworpen aan diaminobenzidine (DAB) oplossing en hematoxyline-tegenkleuring voor IHC of gekleurd met DAPI voor nucleaire labeling bij IF. Voor kwantificatie van positieve kleuring werden vier willekeurig geselecteerde velden vastgelegd uit elk van drie weefselsecties per monster. Bij IHC-kleuring werd de gemiddelde optische dichtheid gedefinieerd als de verhouding van de geïntegreerde optische dichtheid (IOD) tot het bijbehorende holtegebied, zoals bepaald met Image-Pro Plus-software. Bij IF-kleuring werd het positieve kleuringsgebied genormaliseerd tot het veldoppervlak en uitgedrukt als percentage, en de kwantificatie werd uitgevoerd met dezelfde software.

Primaire kweek van beenmergmacrofagen (BMM's) en celtellingsassay

Beenmergcellen werden uit de dijbeen en tibia's van 2 maanden oude C57BL/6 muizen gespoeld met fosfaatgeborrelde zoutoplossing (PBS). De resulterende celsuspensatie werd gefilterd door een 70 μm zeef en 5 minuten gecentrifugeerd op 200 x g . De celpellet werd opnieuw opgehangen in α-MEM complete medium met 10% foetaal rundereserum. Na 24 uur incubatie bij 37 °C in een atmosfeer van 5% CO₂ werden niet-hechtende cellen verwijderd. Om macrofagendifferentiatie te induceren, werden adherente cellen gekweekt in een medium met 50 ng/mL macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) en 40 ng/mL RANKL gedurende 5–7 dagen totdat rijpe BMM's werden waargenomen.

BMM's werden geplateerd op 3 x 104 cellen per put in platen met 96 putjes. Na 24 uur behandeling met gradiëntconcentraties van LWDHW werden BMM's geïncubeerd met 10% Cell Counting Kit-8 (CCK-8) werkoplossing bij 37 °C gedurende 1 uur. De absorptie van elke put werd gemeten op 450 nm met een microplaatlezer.

Kwantitatieve genexpressie-analyse op primaire BMM's

BMM's werden in schalen van 6 cm gezaaid met een dichtheid van 3 x 106 cellen per schaal. Na behandeling met 500 en 1.000 μg/mL LWDHW gedurende 24 uur werd het totale RNA uit BMM's geëxtraheerd met behulp van de RNA-Quick Purification Kit volgens de instructies van de fabrikant. Na kwantificering door spectrofotometrie werd 500 ng totaal RNA omgekeerd getransscribeerd in cDNA. Kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) werd uitgevoerd met genspecifieke primers (Tabel 2), en de PCR-cyclische condities waren als volgt: initiële denaturatie bij 95 °C gedurende 30 seconden, gevolgd door 40 cycli van 95 °C voor 5 seconden en 60 °C voor 30 seconden. Genexpressieniveaus werden geanalyseerd met de 2ΔΔCt-methode , met GAPDH als interne referentiegen.

Western blot-analyse op primaire BMM's

Na het opdelen van 3 x 10 ×6 cellen per schaal in schaaltjes van 6 cm, werden BMM's behandeld met verschillende interventies en vervolgens gelyseerd op ijs met een RIPA-lysisbuffer. Het totale eiwit werd verzameld en gekwantificeerd met een BCA Protein Assay Kit. Eiwitmonsters (30 μg per baan) werden gescheiden door SDS-PAGE op 12,5% polyacrylamidegels en overgebracht op 0,2 μm PVDF-membranen. Na 20 minuten blokken werden de membranen een nacht geïncubeerd bij 4 °C met de volgende primaire antilichamen: P65 (1:1000), p-P65 (1:1000), IκBα (1:1000), p-IκBα (1:1000) en β-actine (1:1000). De volgende dag werden membranen 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met secundair antilichaam. Eiwitbanden werden gevisualiseerd met een ECL Chemiluminescence Detection Kit en vastgelegd met een Automatic Chemiluminescence Image Analysis System.

TRAP-kleuring van femorale weefsels en BMM's

Femorale weefselsecties en BMM's, geplateerd in 24-wellplaten op 1 x 10 ×5 cellen per put, werden gekleurd met een Tartrate-Resistant Acid Phosphatase (TRAP) kleuringsset volgens het protocol van de fabrikant. Het met osteoclast bedekte trabeculaire botoppervlak (Oc.S/BS) in weefselsecties en het osteoclastvormingsgebied in BMM-culturen werden gekwantificeerd met behulp van Image-Pro Plus-software.

Statistische analyse

Alle gegevens werden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie. Een eenrichtings-ANOVA, gevolgd door Dunnett's test, werd gebruikt voor statistische analyse in SPSS. *p < 0,05 en **p < 0,01 werden als statistisch significant beschouwd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Chemische componenten van LWDHW geanalyseerd door LC-MS/MS

Het chemische profiel van de LWDHW-waterige oplossing werd gekarakteriseerd door LC-MS/MS-analyse. In totaal werden 1615 componenten geïdentificeerd, bestaande uit 968 gedetecteerd in positieve ionisatiemodus en 647 in negatieve ionisatiemodus (Figuur 2A). De details van de top 10 componenten van elke ionisatiemodus zijn weergegeven in

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Met de veroudering van de wereldbevolking is PMOP een serieuze wereldwijde gezondheidszorg geworden, die jaarlijks miljoenen vrouwen treft op36 jaar. Gezien de bijwerkingen die gepaard gaan met huidige anti-osteoporotische medicijnen, is het van groot belang om veiligere en effectievere therapeutische strategieën te ontwikkelen. LWDHW is een klassieke niertonificerende formule in TCM en dient als alternatieve geneeskunde voor de behandeling van diverse botziekten<...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Alle auteurs geven geen concurrerende financiële of niet-financiële belangen op.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Natuurwetenschappelijke Stichting van de provincie Zhejiang (ZCLQN25H2701).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.01 M citraatbufferSolarbioC1010Voor antigeentretrieval van femursecties voor IHC en IF-kleuring in Protocol Stap 10
0.2 μm PVDF-membranen BioRad1620177Voor elektrotransfer van eiwitten van SDS-PAGE naar membraan in Protocol Stap 13
12,5% polyacrylamide gelsEpizyme BiotechPG113Voor SDS-PAGE-scheiding van eiwitten in Protocol Stap 13
ALP-antilichaam ARIGOARG57422Voor IHC-detectie in femursecties in Protocol Stap 10
Automatisch chemiluminescentie-beeldanalysesysteem Tanon 5200Voor Western blot-bandvisualisatie in Protocol Stap 13
Axiaal-torsiegetrouwheidstestsysteem Instronmodel 5569R1412Voor biomechanisch testen van femurstalen in Protocol Stap 9
BCA-eiwitanalysekitBeyotimeP0010SVoor eiwitkwantificering vóór Western blot in Protocol Stap 13
CCK-8BeyotimeC0039Voor celviabiliteitsmeting van BMM's in Protocol Stap 11
CytoscapeNiet van toepassingNiet van toepassingVersie 3.8.0
DAVID-databaseNiet van toepassingNiet van toepassingVersie 6.8; https://david.ncifcrf.gov/home.jsp
DisGeNET-databaseNiet van toepassingNiet van toepassinghttps://www.disgenet.org/
ECL-chemiluminescentiedetectiekitVazymeE411-04Voor chemiluminescente detectie van Western blot-signalen in Protocol Stap 13
ELISA-kit van OCNMEIMIANMM-0551M1Voor meting van serum-osteocalcineniveaus in Protocol Stap 8
ELISA-kit van β-CTXMEIMIANMM-44858M1Voor meting van serum-β-CTX-niveaus in Protocol Stap 8
GeneCards-databaseNiet van toepassingNiet van toepassinghttps://www.genecards.org/
Green Premix Ex Taq II FASTTakaraCN830AVoor qRT-PCR-amplificatie in Protocol Stap 12
Hoge resolutie micro-computed tomografie (μCT) apparatuurBrukerSkyscan 1176Voor hoge resolutie μCT-beeldvorming van femurbotmicrostructuur in Protocol Stap 9
IL-1β-antilichaam BIOSSbs6319RVoor IHC-detectie in femursecties in Protocol Stap 10
IκBα-antilichaamCST4812Voor Western blot-detectie in Protocol Stap 13
Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)-database Niet van toepassingNiet van toepassinghttps://www.kegg.jp/
M-CSFAMIZONAAMK1001-S1Voor het induceren van BMM's differentiatie in Protocol Stap 11
Metascape-databaseNiet van toepassingNiet van toepassinghttps://metascape.org/
Orbitrap Exploris 120 Thermo Fisher ScientificBRE725531Voor LC-MS/MS-analyse van LWDHW in Protocol Stap 2
P65-antilichaamCST8242Voor Western blot-detectie in Protocol Stap 13
p-IκBα-antilichaamCST2859Voor Western blot-detectie in Protocol Stap 13
p-P65-antilichaamCST3033SVoor Western blot-detectie in Protocol Stap 13
p-P65-antilichaamSuzhou Ruiying RLP0187Voor IHC-detectie in femursecties in Protocol Stap 10
PrimeScript RT Reagent Kit TakaraRR047AVoor reverse transcriptie van totaal RNA in BMM's voor qRT-PCR-analyse in Protocol Stap 12
QuantStudio 5 systeemApplied BiosystemsA28573Voor qRT-PCR-analyse van osteoclast-markergenen in Protocol Stap 12
RANKLAMIZONAAMK1001-S1Voor het induceren van BMM's differentiatie in Protocol Stap 11
RIPA-lysisbufferEpizyme BiotechPC101Voor totale eiwitextractie uit BMM's in Protocol Stap 13
RNA-Quick-zuiveringkit TransGen BiotechER501-01-V2Voor extractie van totaal RNA in BMM's in Protocol Stap 12
SPSS-software IBMversie 26Voor statistische analyse van experimentele gegevens in Protocol Stap 15
STRING-database Niet van toepassingNiet van toepassinghttps://string-db.org/
Tartrate-resistente zure fosfatase (TRAP)-kleuringskitAMIZONAAMK1001-S1Voor TRAP-kleuring om osteoclasten te identificeren en kwantificeren in Protocol Stap 14
Thermo Vanquish UPLC-systeemThermo Fisher ScientificTSLC-002Voor LC-MS/MS-analyse van LWDHW in Protocol Stap 2
TNF-α-antilichaamSuzhou Ruiying RLM3472Voor IHC-detectie in femursecties in Protocol Stap 10
Traditional Chinese Medicine System Pharmacology (TCMSP)-database Niet van toepassingNiet van toepassinghttp://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php
UniProt-database Niet van toepassingNiet van toepassinghttps://www.uniprot.org/
UPLC-kolomWatersACQUITY HSS T3Voor LC-MS/MS-analyse van LWDHW in Protocol Stap 2
Venny online tool Niet van toepassingNiet van toepassinghttps://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html
β-actine-antilichaamAbcamab8227Voor Western blot-detectie in Protocol Stap 13

Referenties

  1. Liang H, et al. Global epidemiology and burden of osteoporosis among postmenopausal women: insights from the Global Burden of Disease Study 2021. NPJ Aging. 2025;11(1):78.
  2. Yi YT, Zhao HF, Wang WZ, Li X. Osteosarcopenia: epidemiology, molecular mechanisms, and management. Front Endocrinol (Lausanne). 2025;16:1577758.
  3. Wang J, et al. The prevalence of osteoporosis in China, a community based cohort study of osteoporosis. Front Public Health. 2023;11:1084005.
  4. Peris P, et al. Effect of gender on the evolution of pain and quality of life after treatment of symptomatic vertebral fragility fractures. Osteoporos Int. 2024;35(3):515-21.
  5. McClung MR. Sequential and long-term therapy for osteoporosis. Curr Osteoporos Rep. 2025;23(1):15.
  6. Tamechika S, Ohmura S, Maeda S, Naniwa T. Efficacy of denosumab on bisphosphonate-treated osteoporosis and osteopenia in systemic rheumatic disease patients receiving glucocorticoids. J Bone Miner Metab. 2023;41(2):203-11.
  7. Fuggle N, et al. Parathyroid hormone receptor agonists in the management of osteoporosis. Nat Rev Rheumatol. 2025;21(10):599-611.
  8. Curtis JR, et al. Comparative effectiveness of denosumab vs alendronate among postmenopausal women with osteoporosis. J Bone Miner Res. 2024;39(7):826-34.
  9. Thomasius F, et al. Clinical practice guideline: the diagnosis and treatment of osteoporosis. Dtsch Arztebl Int. 2025;122(1):12-18.
  10. Tan M, Li Q, Yang B, Wang S, Chen Z. Insight of Chinese herbal medicine in treating osteoporosis: achievements from 2013 to 2023. Am J Chin Med. 2024;52(5):1303-28.
  11. Qiu Z, et al. Liuwei Dihuang Pills alleviate the polycystic ovary syndrome with improved insulin sensitivity through PI3K/Akt signaling pathway. J Ethnopharmacol. 2020;250:111965.
  12. Zheng W, Wang G, Zhang Z, Wang Z, Ma K. Research progress on classical traditional Chinese medicine formula Liuwei Dihuang pills in the treatment of type 2 diabetes. Biomed Pharmacother. 2020;121:109564.
  13. Song J, et al. Liuwei Dihuang improved cognitive functions in SAMP8 mice by inhibiting COX-2 expression and subsequent neuroinflammation. J Ethnopharmacol. 2022;296:115491.
  14. Wang H, et al. Liu Wei Di Huang Decoction alleviates renal fibrosis by inhibiting endothelial mesenchymal transitions via upregulating Sirt1 expression and inhibiting the Wnt/β-catenin signaling pathway. Drug Des Devel Ther. 2025;19:6587-603.
  15. Zhou Z, et al. Transcriptional sequencing analysis reveals the potential use of deer antler for "tonifying the kidney and strengthening bone". J Orthop Surg Res. 2022;17(1):419.
  16. Liu Y, et al. Liuwei Dihuang Decoction for primary osteoporosis: a protocol for a systematic review and meta-analysis. Medicine (Baltimore). 2019;98(16):e15282.
  17. Long Z, et al. Research on the mechanism of Liuwei Dihuang Decoction for osteoporosis based on systematic biological strategies. Evid Based Complement Alternat Med. 2022;2022:7017610.
  18. Liu B, et al. Liuwei Dihuang Decoction alleviates cognitive dysfunction in mice with D-galactose-induced aging by regulating lipid metabolism and oxidative stress via the microbiota-gut-brain axis. Front Neurosci. 2022;16:949298.
  19. Perry B, Zhang J, Saleh T, Wang Y. Liuwei Dihuang, a traditional Chinese herbal formula, suppresses chronic inflammation and oxidative stress in obese rats. J Integr Med. 2014;12(5):447-54.
  20. Wang L, You X, Zhang L, Zhang C, Zou W. Mechanical regulation of bone remodeling. Bone Res. 2022;10(1):16.
  21. Luo J, et al. Oxidative stress and inflammation: roles in osteoporosis. Front Immunol. 2025;16:1611932.
  22. Jing R, et al. Toll-like receptor 7 promotes periodontal inflammation and alveolar bone resorption through the NF-κB signaling pathway. J Periodontal Res. 2025;60(8):823-34.
  23. Tao H, et al. Urolithin A suppresses RANKL-induced osteoclastogenesis and postmenopausal osteoporosis by suppressing inflammation and downstream NF-κB-activated pyroptosis pathways. Pharmacol Res. 2021;174:105967.
  24. Xue C, et al. Aconine attenuates osteoclast-mediated bone resorption and ferroptosis to improve osteoporosis via inhibiting NF-κB signaling. Front Endocrinol (Lausanne). 2023;14:1234563.
  25. Zhang P, et al. Network pharmacology: towards the artificial intelligence-based precision traditional Chinese medicine. Brief Bioinform. 2023;25(1).
  26. Zhao L, et al. Network pharmacology, a promising approach to reveal the pharmacology mechanism of Chinese medicine formula. J Ethnopharmacol. 2023;309:116306.
  27. Xia C, Zhu H, Li J, Jin H, Fu D. Network pharmacology-based mechanism prediction and pharmacological validation of Bushenhuoxue formula attenuating postmenopausal osteoporosis in ovariectomized mice. J Orthop Surg Res. 2023;18(1):200.
  28. Gu Y, et al. Exploring the efficacious constituents and underlying mechanisms of Sini Decoction for sepsis treatment through network pharmacology and multi-omics. Phytomedicine. 2024;123:155212.
  29. Tian M, Wang K, Chen D. Efficacy and mechanisms of Xiangsha Liujunzi Decoction for gastroesophageal reflux disease: a study integrating meta-analysis, network pharmacology and molecular docking. Phytomedicine. 2026;151:157766.
  30. Ma Y, et al. Multi-omics and experimental validation reveal the mechanism of Danxia Tiaoban Decoction in treating atherosclerosis. Phytomedicine. 2025;147:157216.
  31. Xia C, et al. β-catenin inhibition disrupts the homeostasis of osteogenic/adipogenic differentiation leading to the development of glucocorticoid-induced osteonecrosis of the femoral head. Elife. 2024;12.
  32. He Q, et al. Amlexanox enforces osteogenic differentiation and bone homeostasis through inhibiting ubiquitin-dependent degradation of β-catenin. Int J Biol Sci. 2024;20(13):5254-71.
  33. Feng X, et al. CX3CL1 promotes M1 macrophage polarization and osteoclast differentiation through NF-κB signaling pathway in ankylosing spondylitis in vitro. J Transl Med. 2023;21(1):573.
  34. Wang X, et al. Isoliquiritigenin alleviates periodontitis by suppressing inflammation via NF-κB signaling pathway of immune cell. J Inflamm Res. 2025;18:6133-48.
  35. Guo Q, et al. NF-κB in biology and targeted therapy: new insights and translational implications. Signal Transduct Target Ther. 2024;9(1):53.
  36. Walker MD, Shane E. Postmenopausal osteoporosis. N Engl J Med. 2023;389(21):1979-91.
  37. Liang B, et al. Liuwei Dihuang pills attenuate ovariectomy-induced bone loss by alleviating bone marrow mesenchymal stem cell senescence via the Yes-associated protein-autophagy axis. Pharm Biol. 2024;62(1):42-52.
  38. Liu MM, et al. Therapeutic potential of Liuwei Dihuang pill against KDM7A and Wnt/β-catenin signaling pathway in diabetic nephropathy-related osteoporosis. Biosci Rep. 2020;40(9).
  39. Xie Y, et al. Clinical practice guideline for postmenopausal osteoporosis with traditional Chinese medicine. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2021;46(22):5992-8.
  40. Li YQ, et al. Astragaloside IV modulates oxidative stress and osteoimmune-Wnt signaling in ovariectomized rats: an integrated study of RNA sequencing, molecular docking, and experimental validation. Front Nutr. 2026;13:1785452.
  41. Zhao J, et al. Yishen Qianggu Mixture formulation suppresses osteometabolic inflammation by modulating the IL-17/NF-κB/MAPK signaling axis. J Ethnopharmacol. 2026;358:121011.
  42. Chen C, et al. Hydrolyzed egg yolk peptide prevented osteoporosis by regulating Wnt/β-catenin signaling pathway in ovariectomized rats. Sci Rep. 2024;14(1):10227.
  43. Yang Y, et al. Nrf2 mitigates RANKL and M-CSF induced osteoclast differentiation via ROS-dependent mechanisms. Antioxidants (Basel). 2023;12(12).
  44. Wang Y, et al. Xian Huang Fang inhibits the PKCδ/MAPK signaling pathway to attenuate renal tubular epithelial cell senescence and thereby delay renal interstitial fibrosis. Drug Des Devel Ther. 2025;19:6991-7004.
  45. Niu MY, et al. Fanlian Huazhuo Formula alleviates high-fat diet-induced non-alcoholic fatty liver disease by modulating autophagy and lipid synthesis signaling pathway. World J Gastroenterol. 2024;30(30):3584-608.
  46. Huang G, et al. Artemisia capillaris Thunb. water extract attenuates adriamycin-induced renal injury by regulating apoptosis through the ROS/MAPK axis. J Food Biochem. 2022;46(2):e14065.
  47. Zhao J, et al. Liuwei Dihuang Pills enhance osteogenic differentiation in MC3T3-E1 cells through the activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway. Pharmaceuticals (Basel). 2024;17(1).
  48. Zhang X, Xu D, Zhang R, Wang H, Yang G. Interaction between diabetes and osteoporosis: imbalance between inflammation and bone remodeling. Osteoporos Int. 2025;36(12):2401-9.
  49. Zhao W, et al. Osteoclast activation and inflammatory bone diseases: focusing on receptors in osteoclasts. J Inflamm Res. 2025;18:3201-13.
  50. Zeng J, et al. Comparison of donepezil, memantine, melatonin, and Liuwei Dihuang Decoction on behavioral and immune endocrine responses of aged senescence-accelerated mouse resistant 1 mice. Front Pharmacol. 2020;11:350.
  51. Wu Y, et al. Effect of Bifidobacterium on osteoclasts: TNF-α/NF-κB inflammatory signal pathway-mediated mechanism. Front Endocrinol (Lausanne). 2023;14:1109296.
  52. Zulfiqar Z, et al. Zn glycine attenuates LPS-induced inflammatory bone loss in geese through suppression of osteoclastogenesis via reducing TLR-4/NFκB signaling. Ecotoxicol Environ Saf. 2026;309:119655.
  53. Kingeter LM, Lin X. C-type lectin receptor-induced NF-κB activation in innate immune and inflammatory responses. Cell Mol Immunol. 2012;9(2):105-12.
  54. Zhao Y, et al. Trimethylamine-N-oxide promotes osteoclast differentiation and oxidative stress by activating NF-κB pathway. Aging (Albany NY). 2024;16(10):9251-63.
  55. Zhang Q, et al. Activation of Nrf2/HO-1 signaling: an important molecular mechanism of herbal medicine in the treatment of atherosclerosis via the protection of vascular endothelial cells from oxidative stress. J Adv Res. 2021;34:43-63.
  56. Tseng YT, Chang FR, Lo YC. The Chinese herbal formula Liuwei Dihuang protects dopaminergic neurons against Parkinson's toxin through enhancing antioxidative defense and preventing apoptotic death. Phytomedicine. 2014;21(5):724-33.
  57. Xu Y, et al. Pharmacology-based molecular docking of 4-methylcatechol and its role in RANKL-mediated ROS/Keap1/Nrf2 signalling axis and osteoclastogenesis. Biomed Pharmacother. 2023;159:114101.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

BiologieEditie 233Postmenopauzale osteoporoseNF-κB-signaleringsrouteontsteking
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.