Vrijwillige groepshuisvesting van compatibele ontlastingsmonsters bij muizen met behulp van een op maat gemaakt kooisysteem

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een aangepast kooisysteem voor vrijwillige, welzijnsvriendelijke, gelijktijdige en individuele ontlastingsmonsters van groepsmuizen.

Samenvatting

Betrouwbare meting van fecale corticosteronmetabolieten vereist fecale monsters die aan individuele dieren kunnen worden toegewezen en binnen een vastgesteld tijdsbestek kunnen worden verzameld. Dit is lastig bij groepsmuizen, waar samengevoegde huiskooimonsters geen individuele toewijzing toestaan en tijdelijke verwijdering het dierenwelzijn en de studieresultaten kan verstoren. Het doel van dit protocol is het presenteren van een eenvoudig, goedkoop kooisysteem dat vrijwillige, gelijktijdige en individuele ontlastingsmonsters uit groepsmuizen mogelijk maakt. Het systeem bestaat uit een met draad bedekte, polycarbonaat woonkooi die is verbonden met drie afzonderlijke verzameldozen. Na gewenning en training betreden muizen vrijwillig de dozen om toegang te krijgen tot een kleine voedselbeloning. De deuren kunnen dan worden gesloten zonder achtervolging, behandeling of gedwongen overplaatsing. Fecale pellets worden apart uit elke doos verzameld, waardoor monsters aan individuele dieren kunnen worden toegewezen terwijl sociale huisvesting buiten de bemonsteringsperiode behouden blijft. Dit protocol ondersteunt niet-invasieve longitudinale bemonstering en is geschikt voor studies die fecale corticosteronmetabolieten of andere fecale biomarkers meten. Het ontwerp is eenvoudig te bouwen uit standaard kooimateriaal en acrylglas, kan uit elkaar gehaald worden voor schoonmaak, en maakt het mogelijk om meerdere kooien parallel te bemonsteren. Door verstoring door de behandeling te verminderen en de standaardisatie van het bemonsteringsvenster te verbeteren, biedt de methode een praktische verfijning voor endocriene monitoring bij muizen in groepen.

Inleiding

Een grote uitdaging bij het beoordelen van plasmacorticosteronconcentraties is dat de bemonsteringsprocedure zelf een acute corticosteronverhoging kan veroorzaken, waardoor de meting wordt verstoord en mogelijk de interpretatie van de studieresultaten ^1,2,3 beïnvloedt. Het meten van fecale corticosteronmetabolieten (FCM's) biedt een niet-invasief alternatief, aangezien FCM-concentraties de circulerende glucocorticoïdenniveaus enkele uren voor de bemonstering weerspiegelen, afhankelijk van soort, stam, geslacht en darmdoorgang ^4,5. Betrouwbare FCM-analyse bij muizen in groepen blijft echter uitdagend. Gepoolde ontlastingsmonsters die uit de thuiskooi zijn verzameld, kunnen niet aan individuele dieren worden toegewezen en kunnen een hoge variabiliteit vertonen door interindividuele verschillen in glucocorticoïde secretie en onzekerheid in het exacte bemonsteringsvenster. Het langdurig scheiden van dieren kan de onderzoeksdoelstellingen verstoren, terwijl kortdurende scheiding voor individuele monsterverzameling arbeidsintensief is, de doorvoer beperkt en zelf stress² kan veroorzaken.

Om individuele ontlastingsmonsters van groepsmuizen met minimale behandeling mogelijk te maken, werd een op maat gemaakte ontlastingskooi ontwikkeld (Figuur 1A-E). Het ontwerp is aangepast van een eerder beschreven uitwerpselkooi voor stekelmuizen⁶ en aangepast voor gebruik bij laboratoriummuizen. Het systeem bestaat uit een standaard polycarbonaat type III kooi die is verbonden met drie afzonderlijke verzamelboxen, die de dieren vrijwillig kunnen betreden en sluiten via schuifdeuren. Deze opstelling maakt het mogelijk om ontlastingsmonsters van individuele muizen te verzamelen zonder directe behandeling tijdens de bemonsteringsperiode en maakt gelijktijdige bemonstering van meerdere dieren mogelijk. De kooi biedt daarom een praktische aanpak voor niet-invasieve, individueel toeschrijfbare FCM-bemonstering bij groepsmuizen.

Het volgende protocol beschrijft een fecale bemonsteringssysteem dat het mogelijk maakt het verzamelen en identificeren van fecale monsters van individuele muizen, terwijl een groepshuisvestingsomgeving wordt gehandhaafd, waarbij op maat gemaakte kooien worden gebruikt voor contactloze ontlasting.

Protocol

De verantwoordelijke dierenethische commissie van de Medische Universiteit van Wenen werd geraadpleegd voordat het onderzoek werd uitgevoerd en adviseerde dat er geen formele dierproevenvergunning nodig was; Daarom is er geen goedkeuring of protocolnummer beschikbaar. De studie omvatte uitsluitend gevestigde fok- en veehouderijpraktijken, samen met het verzamelen van niet-invasieve ontlastingsmonsters. Er werden geen invasieve ingrepen uitgevoerd. Overeenkomstig Richtlijn 2010/63/EU werd de verwachte last voor de dieren beoordeeld op minder dan de drempel van pijn, lijden, stress of blijvende schade die gelijk is aan of hoger dan die veroorzaakt door het inbrengen van een naald volgens goede veterinaire praktijk. Alle dieren werden gehuisvest en verzorgd volgens de institutionele dierenwelzijnsnormen.

1. Bouwen van de kooien (zie materiaallijst)

1. Snijd onderdelen 1-4 uit 5 mm plexiglas/acrylglas volgens de sjablonen in Figuur 2A-C.
   OPMERKING: Sjablonen met exacte afmetingen kunnen worden gedrukt in DIN A3-formaat (Aanvullende Figuur 1 en Aanvullende Figuur 2).
2. Snijd de onderkant van de polycarbonaat type II (PTII) kooi af zoals aangegeven in Figuur 2D. Dit deel zal later dienen als de bovenkant van de ontlastingsbakken.
3. Boor de gaten en sleuven in de voormalige bodem van de PTII-kooi zoals aangegeven in Figuur 2D.
   OPMERKING: Exacte afmetingen zijn weergegeven in aanvullende figuur 3.
4. Boor gaten in de voorzijde en korte zijde van de PTIII-kooi zoals aangegeven in Figuur 2E.
   OPMERKING: Exacte afmetingen zijn weergegeven in aanvullende figuur 4.
5. Gebruik deel 2 als sjabloon om de bijbehorende boorgaten aan de korte zijde van de PTIII-kooi en aan de lange zijde van de PTII-kooi te markeren.
6. Boor de gemarkeerde gaten en bevestig de PTIII-kooi, de PTII-kooi en deel 2 met de schroefdraad, zoals te zien is in Figuur 2F.
7. Plaats deel 1 als onderkant van de PTII-kooi. Plaats delen 4a en 4b zodat ze deel 1 op zijn plaats houden en verdeel de bemonsteringskooi in aparte verzamelboxen. Gebruik het lijmpistool om ze vast te zetten.
8. Schuif de onderste uitstulpingen van delen 4a en 4b in de sleuven van deel 1. Deze uitsteeksels vormen de poten van de verzameldozen.
9. Schuid de bovenste uitstulpingen van onderdelen 4a en 4b door de bovenste afdekking, de voormalige onderkant van de PTII-kooi, om deze op zijn plaats te houden.
10. Rijg de houten eetstokjes of staven door de gaten in de uitsteeksels, met één staaf bovenaan en twee staven onderaan, om de constructie te stabiliseren en te fixeren.
    OPMERKING: Houten materialen mogen alleen in het vivarium worden gebruikt als ze wegwerpbaar zijn, omdat ze niet schoon te maken zijn. Als dit niet het geval is, moeten staven van alternatieve samenstelling worden gebruikt.
11. Dicht de resterende openingen of kleine onnauwkeurigheden met een lijmpistool. Gebruik onderdelen 3a, 3b en 3c (Figuur 2B) als schuifdeuren tussen de kooi van het huis en de verzamelboxen.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen scherpe randen, lijmresten of uitstekend materiaal toegankelijk blijven voor de dieren. De acrylglas/plexiglascomponenten die in dit prototype worden gebruikt, zijn niet geschikt voor stoomautoclaafsterilisatie. Daarom, als het systeem wordt gebruikt in SPF-faciliteiten die gesteriliseerd kooi-gerelateerd materiaal vereisen, moet ofwel een institutioneel goedgekeurde niet-autoclave-desinfectieprocedure worden toegepast, of moeten de acrylcomponenten worden vervangen door autoclavabel materiaal terwijl dezelfde afmetingen behouden blijven.

2. Dierenvoorbereiding en huisvesting

1. Verkrijg het vereiste aantal muizen van de juiste stam(s) voor het onderzoek.
   OPMERKING: De representatieve gegevens zijn verkregen van 30 acht weken oude C57BL/6J-muizen, bestaande uit 20 vrouwtjes en 10 mannetjes. De muizen waren volgens de FELASA-normen vrij van specifieke ziekteverwekkers en werden verkregen bij Charles River Laboratories, Sulzfeld, Duitsland.
2. Huisdieren onder conventionele omstandigheden in aangepaste polycarbonaat type III kooien met maximaal drie volwassen muizen per kooi.
   OPMERKING: Gescheiden mannetjes werden voor deze studie in standaard polycarbonaat type II kooien gehouden.
3. Houd de dierenkamer op 22 ± 2 °C en 55 ± 10% relatieve luchtvochtigheid onder een licht/donker cyclus van 12 uur met licht aan om 6:00 uur.
4. Geef een standaard onderhoudsdieet en water ad libitum.
5. Voeg espenhouten beddengoed, een papieren toiletrol, een rood transparant plastic huis en keukenpapier als nestmateriaal toe aan elke kooi.
6. Identificeer muizen vooral aan de hand van natuurlijke staartmarkeringen. Breng tijdelijk penmarkeringen aan op dieren met vergelijkbare staartmarkeringen tijdens het wegen, indien nodig.

3. Habituatie en training van de dieren

OPMERKING: De voltooide kooi bestaat uit een thuiskooi, PTIII, verbonden met een bemonsteringskooi met drie aparte verzameldozen, PTII. De huiskooien kunnen worden gebruikt als conventionele kooien, met bodembedekking, kooiverrijking, een draaddeksel zonder externe bevestigingen, en voorzien van voedsel en water. Het systeem kan uit elkaar gehaald worden voor het wassen en kan alleen tijdens de bemonsteringsweken worden gebruikt. Tijdens weken zonder monsters kunnen dieren in standaard PTIII-kooien worden gehouden.

1. Plaats de dieren minstens twee weken voor de eerste geplande bemonsteringssessie in het kooisysteem.
2. Laat de dieren wennen aan de verzameldozen door de schuifdeuren voor één nacht te verwijderen, zodat de dieren de dozen vrij kunnen verkennen.
3. Voer drie trainingssessies uit vóór de eerste bemonsteringssessie. Voer training uit onder dezelfde lichtomstandigheden en op hetzelfde tijdstip van de dag, gepland voor latere bemonstering, bij voorkeur onder rood licht kort na het begin van de donkere fase.
4. Breng een kleine hoeveelheid beloning aan, zoals hazelnootroom, pindakaas, moutpasta of een vergelijkbaar smakelijk voedsel, op de muur tegenover de ingang van elke verzameldoos.
5. Op de eerste trainingsdag laat je de deuren open en laat je de dieren de beloning vrijwillig ontdekken en consumeren.
6. Op de tweede trainingsdag wacht je tot een dier een collectebak binnenkomt en begint met likken aan de beloning. Sluit voorzichtig de schuifdeur achter het dier en laat hem na 10 minuten los.
7. Op de derde trainingsdag herhaal je de procedure en verleng je geleidelijk de tijd dat de dieren in de verzamelboxen blijven.
   OPMERKING: Training moet rustig en consistent zijn. Vermijd het achtervolgen van de dieren in de bakken, want dit kan stress verhogen en de vrijwillige deelname aan latere bemonsteringssessies verminderen.

4. Verzameling van ontlastingsmonsters

1. Timing van monsterafname
   1. Plan de bemonsteringstijd volgens de biologische vraag en de verwachte vertraging tussen de uitscheiding van plasmacorticosteron en fecale corticosteronmetabolieten. Bij muizen weerspiegelen fecale corticosteronmetabolieten doorgaans circulerende glucocorticoïdenniveaus ongeveer 8-10 uur voor de bemonstering.
      OPMERKING: Als precieze timing cruciaal is, voer dan een pilotstudie uit om de tijdslijn van FCM-uitscheiding te bepalen onder de specifieke stam, geslacht en experimentele omstandigheden die worden gebruikt. Deze pilot kan gecombineerd worden met de trainingssessies.
   2. Schema bemonstering tijdens een periode van hoge ontlastingsproductie. Bemonstering is meestal het meest efficiënt aan het begin van de donkere en actieve fase.
   3. Voer alle bemonsteringssessies gedurende het hele onderzoek op hetzelfde tijdstip uit om variatie veroorzaakt door het dagelijkse ritme van FCM-niveaus te verminderen.
      OPMERKING: Uit onze ervaring worden gebeurtenissen rond 10:00 uur 's ochtends goed weerspiegeld wanneer de bemonstering tussen 18:00 en 20:00 uur plaatsvindt, afhankelijk van het lichtschema van de dierenkamer.
2. Bemonsteringsprocedure en praktisch advies
   1. Markeer de dieren individueel voordat je ze bemonstert. Gebruik oorafdrukken of individuele staartmarkeringen.
      OPMERKING: Toemarkeringen en kleurcodes kunnen moeilijk te herkennen zijn binnen de dozen bij rood licht.
   2. Bereid de collecteboxen voor tijdens de lichtfase door de beloning op de achterwand van elke box te plaatsen.
      OPMERKING: Het voorbereiden van de dozen overdag verbetert de zichtbaarheid voor de onderzoeker en stelt de dieren in staat de beloning te ruiken voordat ze monsters nemen.
   3. Op het geplande bemonsteringstijdstip open je de verzameldozen en wacht je tot de dieren vrijwillig binnenkomen.
   4. Zodra een muis een collectebak is binnengekomen, sluit je voorzichtig de schuifdeur erachter.
   5. Nadat alle dieren een doos hebben binnengekomen, noteer je de identiteit en positie van elke muis in een voorbereid bemonsteringsblad.
   6. Als er meer dan 10 kooien in één sessie worden bemonsterd, betrek dan een tweede proefpersoon om dieridentificatie, deurbediening en documentatie te ondersteunen.
   7. Houd de dieren in de verzamelboxen gedurende de geplande bemonsteringsduur, meestal 30 minuten tot 2 uur, afhankelijk van de verwachte ontlasting en het onderzoeksontwerp.
      OPMERKING: Monsters worden uitgesloten als de individuele identiteit niet met zekerheid kan worden vastgesteld, als ontlastingspellets besmet zijn met urine, bodembedekking of ontlasting van een ander dier, als de bemonsteringsduur aanzienlijk afwijkt van het geplande tijdsvenster, of als de hoeveelheid ontlasting onvoldoende is voor FCM-analyse.
      OPMERKING: Het gebruik van 50 mg is ons standaardprotocol, en deze hoeveelheid is gebruikt in alle validaties en alle andere artikelen ^5,7,8. Normaal gesproken is het gemakkelijk te verkrijgen.
   8. Aan het einde van de bemonsteringsperiode open je de schuifdeuren en laat je de muizen terugkeren naar de thuiskooi.
   9. Sluit de verzamelboxen direct nadat de muizen zijn vertrokken om herintreden en kruisbesmetting van monsters te voorkomen.
   10. Verwijder de ontlastingspellets uit elke verzameldoos met lange pincetten en doe ze over in individueel gelabelde verzamelbuizen.
   11. Bewaar monsters bij -20 °C tot verdere voorbereiding van de FCM-assay.
       OPMERKING: Als de dozen stevig gesloten zijn en niet opnieuw kunnen worden binnengegaan door de muizen, kan de ontlastingspelletverzameling worden uitgesteld tot de volgende lichtfase. Dit moet echter consequent binnen een studie gebeuren.
   12. Houd de dieren in het huiskooigedeelte (PTIII) tot de volgende kooiwissel. Daarna kunnen ze uit elkaar gehaald en gewassen worden in een gewone kooiwasser.

Resultaten

Fecale corticosteronmetabolieten (FCM's) werden succesvol gekwantificeerd uit monsters die werden verzameld met de op maat gemaakte fecale bemonsteringskooien in een longitudinale studie waarbij permanent en intermitterend gekweekte muizen werden vergeleken. De representatieve FCM-analyse omvatte 30 dieren: permanent gefokte groep, n = 15 dieren in 5 kooien; Intermitterend gefokte groep, n = 10 dieren in 5 kooien, met 5 mannetjes die één huis waren, behalve bij 3 fokevenementen, waar ze ...

Discussie

Dit protocol beschrijft een eenvoudig kooisysteem voor het verzamelen van individueel toewijzende ontlastingsmonsters van groepsmuizen. Het belangrijkste voordeel van de methode is dat het individuele monsterattributie combineert met het behoud van belangrijke aspecten van sociale huisvesting, met name visueel en olfactorisch contact met kooigenoten. Dit is relevant omdat groepshuisvesting vaak vereist is voor dierenwelzijn en ook deel kan uitmaken van het experimentele ontwerp

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Boortje 5 mm	Craftomat	22380487	5mm diameter; Aantal 1
Boortjes 60 mm	Bosch	32064647	60 mm diameter; Aantal 1
Boortjes 7 mm	Craftomat	22380520	7 mm diameter; Aantal 1
Boormachine	Makita	25730054	Standaard draagbare of tafelboormachine; Aantal 1
Hetelijmpistool	Einhell	29051207	Voor kooiassemblage; Aantal 1
Hetelijmpen	Einhell	29049664	Compatibel met hetelijmpistool; Aantal 5-10
Makrolon kooi	Animalab	31200129	Standaard Type II kooi; Aantal 1
Makrolon kooi	Animalab	31200256	Standaard Type III kooi; Aantal 1
Plexiglas / acrylglas	Bauhaus	29122352	Ongeveer 0,25 m² totaal; 5 mm dikte; Aantal  2DIN A3 vellen
Zaag- of freesapparaat	Scheppach	32079641	Kleine lintzaag, decoupeerzaag of CNC-frees; Aantal 1
Gedraaide schroeven	Profi Depot	10807533	20 mm × 3 mm; Aantal 4
Houten eetstokjes / staven	Ikea	903.429.71	Ronde houten staven; Aantal 3