Vrijwillige groepshuisvesting van compatibele ontlastingsmonsters bij muizen met behulp van een op maat gemaakt kooisysteem

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een aangepast kooisysteem voor vrijwillige, welzijnsvriendelijke, gelijktijdige en individuele ontlastingsmonsters van groepsmuizen.

Samenvatting

Betrouwbare meting van fecale corticosteronmetabolieten vereist fecale monsters die aan individuele dieren kunnen worden toegewezen en binnen een vastgesteld tijdsbestek kunnen worden verzameld. Dit is lastig bij groepsmuizen, waar samengevoegde huiskooimonsters geen individuele toewijzing toestaan en tijdelijke verwijdering het dierenwelzijn en de studieresultaten kan verstoren. Het doel van dit protocol is het presenteren van een eenvoudig, goedkoop kooisysteem dat vrijwillige, gelijktijdige en individuele ontlastingsmonsters uit groepsmuizen mogelijk maakt. Het systeem bestaat uit een met draad bedekte, polycarbonaat woonkooi die is verbonden met drie afzonderlijke verzameldozen. Na gewenning en training betreden muizen vrijwillig de dozen om toegang te krijgen tot een kleine voedselbeloning. De deuren kunnen dan worden gesloten zonder achtervolging, behandeling of gedwongen overplaatsing. Fecale pellets worden apart uit elke doos verzameld, waardoor monsters aan individuele dieren kunnen worden toegewezen terwijl sociale huisvesting buiten de bemonsteringsperiode behouden blijft. Dit protocol ondersteunt niet-invasieve longitudinale bemonstering en is geschikt voor studies die fecale corticosteronmetabolieten of andere fecale biomarkers meten. Het ontwerp is eenvoudig te bouwen uit standaard kooimateriaal en acrylglas, kan uit elkaar gehaald worden voor schoonmaak, en maakt het mogelijk om meerdere kooien parallel te bemonsteren. Door verstoring door de behandeling te verminderen en de standaardisatie van het bemonsteringsvenster te verbeteren, biedt de methode een praktische verfijning voor endocriene monitoring bij muizen in groepen.

Inleiding

Een grote uitdaging bij het beoordelen van plasmacorticosteronconcentraties is dat de bemonsteringsprocedure zelf een acute corticosteronverhoging kan veroorzaken, waardoor de meting wordt verstoord en mogelijk de interpretatie van de studieresultaten ^1,2,3 beïnvloedt. Het meten van fecale corticosteronmetabolieten (FCM's) biedt een niet-invasief alternatief, aangezien FCM-concentraties de circulerende glucocorticoïdenniveaus enkele uren voor de bemonstering weerspiegelen, afhankelijk van soort, stam, geslacht en darmdoorgang ^4,5. Betrouwbare FCM-analyse bij muizen in groepen blijft echter uitdagend. Gepoolde ontlastingsmonsters die uit de thuiskooi zijn verzameld, kunnen niet aan individuele dieren worden toegewezen en kunnen een hoge variabiliteit vertonen door interindividuele verschillen in glucocorticoïde secretie en onzekerheid in het exacte bemonsteringsvenster. Het langdurig scheiden van dieren kan de onderzoeksdoelstellingen verstoren, terwijl kortdurende scheiding voor individuele monsterverzameling arbeidsintensief is, de doorvoer beperkt en zelf stress² kan veroorzaken.

Om individuele ontlastingsmonsters van groepsmuizen met minimale behandeling mogelijk te maken, werd een op maat gemaakte ontlastingskooi ontwikkeld (Figuur 1A-E). Het ontwerp is aangepast van een eerder beschreven uitwerpselkooi voor stekelmuizen⁶ en aangepast voor gebruik bij laboratoriummuizen. Het systeem bestaat uit een standaard polycarbonaat type III kooi die is verbonden met drie afzonderlijke verzamelboxen, die de dieren vrijwillig kunnen betreden en sluiten via schuifdeuren. Deze opstelling maakt het mogelijk om ontlastingsmonsters van individuele muizen te verzamelen zonder directe behandeling tijdens de bemonsteringsperiode en maakt gelijktijdige bemonstering van meerdere dieren mogelijk. De kooi biedt daarom een praktische aanpak voor niet-invasieve, individueel toeschrijfbare FCM-bemonstering bij groepsmuizen.

Het volgende protocol beschrijft een fecale bemonsteringssysteem dat het mogelijk maakt het verzamelen en identificeren van fecale monsters van individuele muizen, terwijl een groepshuisvestingsomgeving wordt gehandhaafd, waarbij op maat gemaakte kooien worden gebruikt voor contactloze ontlasting.

Protocol

De verantwoordelijke dierenethische commissie van de Medische Universiteit van Wenen werd geraadpleegd voordat het onderzoek werd uitgevoerd en adviseerde dat er geen formele dierproevenvergunning nodig was; Daarom is er geen goedkeuring of protocolnummer beschikbaar. De studie omvatte uitsluitend gevestigde fok- en veehouderijpraktijken, samen met het verzamelen van niet-invasieve ontlastingsmonsters. Er werden geen invasieve ingrepen uitgevoerd. Overeenkomstig Richtlijn 2010/63/EU werd de verwachte last voor de dieren beoordeeld op minder dan de drempel van pijn, lijden, stress of blijvende schade die gelijk is aan of hoger dan die veroorzaakt door het inbrengen van een naald volgens goede veterinaire praktijk. Alle dieren werden gehuisvest en verzorgd volgens de institutionele dierenwelzijnsnormen.

1. Bouwen van de kooien (zie materiaallijst)

1. Snijd onderdelen 1-4 uit 5 mm plexiglas/acrylglas volgens de sjablonen in Figuur 2A-C.
   OPMERKING: Sjablonen met exacte afmetingen kunnen worden gedrukt in DIN A3-formaat (Aanvullende Figuur 1 en Aanvullende Figuur 2).
2. Snijd de onderkant van de polycarbonaat type II (PTII) kooi af zoals aangegeven in Figuur 2D. Dit deel zal later dienen als de bovenkant van de ontlastingsbakken.
3. Boor de gaten en sleuven in de voormalige bodem van de PTII-kooi zoals aangegeven in Figuur 2D.
   OPMERKING: Exacte afmetingen zijn weergegeven in aanvullende figuur 3.
4. Boor gaten in de voorzijde en korte zijde van de PTIII-kooi zoals aangegeven in Figuur 2E.
   OPMERKING: Exacte afmetingen zijn weergegeven in aanvullende figuur 4.
5. Gebruik deel 2 als sjabloon om de bijbehorende boorgaten aan de korte zijde van de PTIII-kooi en aan de lange zijde van de PTII-kooi te markeren.
6. Boor de gemarkeerde gaten en bevestig de PTIII-kooi, de PTII-kooi en deel 2 met de schroefdraad, zoals te zien is in Figuur 2F.
7. Plaats deel 1 als onderkant van de PTII-kooi. Plaats delen 4a en 4b zodat ze deel 1 op zijn plaats houden en verdeel de bemonsteringskooi in aparte verzamelboxen. Gebruik het lijmpistool om ze vast te zetten.
8. Schuif de onderste uitstulpingen van delen 4a en 4b in de sleuven van deel 1. Deze uitsteeksels vormen de poten van de verzameldozen.
9. Schuid de bovenste uitstulpingen van onderdelen 4a en 4b door de bovenste afdekking, de voormalige onderkant van de PTII-kooi, om deze op zijn plaats te houden.
10. Rijg de houten eetstokjes of staven door de gaten in de uitsteeksels, met één staaf bovenaan en twee staven onderaan, om de constructie te stabiliseren en te fixeren.
    OPMERKING: Houten materialen mogen alleen in het vivarium worden gebruikt als ze wegwerpbaar zijn, omdat ze niet schoon te maken zijn. Als dit niet het geval is, moeten staven van alternatieve samenstelling worden gebruikt.
11. Dicht de resterende openingen of kleine onnauwkeurigheden met een lijmpistool. Gebruik onderdelen 3a, 3b en 3c (Figuur 2B) als schuifdeuren tussen de kooi van het huis en de verzamelboxen.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen scherpe randen, lijmresten of uitstekend materiaal toegankelijk blijven voor de dieren. De acrylglas/plexiglascomponenten die in dit prototype worden gebruikt, zijn niet geschikt voor stoomautoclaafsterilisatie. Daarom, als het systeem wordt gebruikt in SPF-faciliteiten die gesteriliseerd kooi-gerelateerd materiaal vereisen, moet ofwel een institutioneel goedgekeurde niet-autoclave-desinfectieprocedure worden toegepast, of moeten de acrylcomponenten worden vervangen door autoclavabel materiaal terwijl dezelfde afmetingen behouden blijven.

2. Dierenvoorbereiding en huisvesting

1. Verkrijg het vereiste aantal muizen van de juiste stam(s) voor het onderzoek.
   OPMERKING: De representatieve gegevens zijn verkregen van 30 acht weken oude C57BL/6J-muizen, bestaande uit 20 vrouwtjes en 10 mannetjes. De muizen waren volgens de FELASA-normen vrij van specifieke ziekteverwekkers en werden verkregen bij Charles River Laboratories, Sulzfeld, Duitsland.
2. Huisdieren onder conventionele omstandigheden in aangepaste polycarbonaat type III kooien met maximaal drie volwassen muizen per kooi.
   OPMERKING: Gescheiden mannetjes werden voor deze studie in standaard polycarbonaat type II kooien gehouden.
3. Houd de dierenkamer op 22 ± 2 °C en 55 ± 10% relatieve luchtvochtigheid onder een licht/donker cyclus van 12 uur met licht aan om 6:00 uur.
4. Geef een standaard onderhoudsdieet en water ad libitum.
5. Voeg espenhouten beddengoed, een papieren toiletrol, een rood transparant plastic huis en keukenpapier als nestmateriaal toe aan elke kooi.
6. Identificeer muizen vooral aan de hand van natuurlijke staartmarkeringen. Breng tijdelijk penmarkeringen aan op dieren met vergelijkbare staartmarkeringen tijdens het wegen, indien nodig.

3. Habituatie en training van de dieren

OPMERKING: De voltooide kooi bestaat uit een thuiskooi, PTIII, verbonden met een bemonsteringskooi met drie aparte verzameldozen, PTII. De huiskooien kunnen worden gebruikt als conventionele kooien, met bodembedekking, kooiverrijking, een draaddeksel zonder externe bevestigingen, en voorzien van voedsel en water. Het systeem kan uit elkaar gehaald worden voor het wassen en kan alleen tijdens de bemonsteringsweken worden gebruikt. Tijdens weken zonder monsters kunnen dieren in standaard PTIII-kooien worden gehouden.

1. Plaats de dieren minstens twee weken voor de eerste geplande bemonsteringssessie in het kooisysteem.
2. Laat de dieren wennen aan de verzameldozen door de schuifdeuren voor één nacht te verwijderen, zodat de dieren de dozen vrij kunnen verkennen.
3. Voer drie trainingssessies uit vóór de eerste bemonsteringssessie. Voer training uit onder dezelfde lichtomstandigheden en op hetzelfde tijdstip van de dag, gepland voor latere bemonstering, bij voorkeur onder rood licht kort na het begin van de donkere fase.
4. Breng een kleine hoeveelheid beloning aan, zoals hazelnootroom, pindakaas, moutpasta of een vergelijkbaar smakelijk voedsel, op de muur tegenover de ingang van elke verzameldoos.
5. Op de eerste trainingsdag laat je de deuren open en laat je de dieren de beloning vrijwillig ontdekken en consumeren.
6. Op de tweede trainingsdag wacht je tot een dier een collectebak binnenkomt en begint met likken aan de beloning. Sluit voorzichtig de schuifdeur achter het dier en laat hem na 10 minuten los.
7. Op de derde trainingsdag herhaal je de procedure en verleng je geleidelijk de tijd dat de dieren in de verzamelboxen blijven.
   OPMERKING: Training moet rustig en consistent zijn. Vermijd het achtervolgen van de dieren in de bakken, want dit kan stress verhogen en de vrijwillige deelname aan latere bemonsteringssessies verminderen.

4. Verzameling van ontlastingsmonsters

1. Timing van monsterafname
   1. Plan de bemonsteringstijd volgens de biologische vraag en de verwachte vertraging tussen de uitscheiding van plasmacorticosteron en fecale corticosteronmetabolieten. Bij muizen weerspiegelen fecale corticosteronmetabolieten doorgaans circulerende glucocorticoïdenniveaus ongeveer 8-10 uur voor de bemonstering.
      OPMERKING: Als precieze timing cruciaal is, voer dan een pilotstudie uit om de tijdslijn van FCM-uitscheiding te bepalen onder de specifieke stam, geslacht en experimentele omstandigheden die worden gebruikt. Deze pilot kan gecombineerd worden met de trainingssessies.
   2. Schema bemonstering tijdens een periode van hoge ontlastingsproductie. Bemonstering is meestal het meest efficiënt aan het begin van de donkere en actieve fase.
   3. Voer alle bemonsteringssessies gedurende het hele onderzoek op hetzelfde tijdstip uit om variatie veroorzaakt door het dagelijkse ritme van FCM-niveaus te verminderen.
      OPMERKING: Uit onze ervaring worden gebeurtenissen rond 10:00 uur 's ochtends goed weerspiegeld wanneer de bemonstering tussen 18:00 en 20:00 uur plaatsvindt, afhankelijk van het lichtschema van de dierenkamer.
2. Bemonsteringsprocedure en praktisch advies
   1. Markeer de dieren individueel voordat je ze bemonstert. Gebruik oorafdrukken of individuele staartmarkeringen.
      OPMERKING: Toemarkeringen en kleurcodes kunnen moeilijk te herkennen zijn binnen de dozen bij rood licht.
   2. Bereid de collecteboxen voor tijdens de lichtfase door de beloning op de achterwand van elke box te plaatsen.
      OPMERKING: Het voorbereiden van de dozen overdag verbetert de zichtbaarheid voor de onderzoeker en stelt de dieren in staat de beloning te ruiken voordat ze monsters nemen.
   3. Op het geplande bemonsteringstijdstip open je de verzameldozen en wacht je tot de dieren vrijwillig binnenkomen.
   4. Zodra een muis een collectebak is binnengekomen, sluit je voorzichtig de schuifdeur erachter.
   5. Nadat alle dieren een doos hebben binnengekomen, noteer je de identiteit en positie van elke muis in een voorbereid bemonsteringsblad.
   6. Als er meer dan 10 kooien in één sessie worden bemonsterd, betrek dan een tweede proefpersoon om dieridentificatie, deurbediening en documentatie te ondersteunen.
   7. Houd de dieren in de verzamelboxen gedurende de geplande bemonsteringsduur, meestal 30 minuten tot 2 uur, afhankelijk van de verwachte ontlasting en het onderzoeksontwerp.
      OPMERKING: Monsters worden uitgesloten als de individuele identiteit niet met zekerheid kan worden vastgesteld, als ontlastingspellets besmet zijn met urine, bodembedekking of ontlasting van een ander dier, als de bemonsteringsduur aanzienlijk afwijkt van het geplande tijdsvenster, of als de hoeveelheid ontlasting onvoldoende is voor FCM-analyse.
      OPMERKING: Het gebruik van 50 mg is ons standaardprotocol, en deze hoeveelheid is gebruikt in alle validaties en alle andere artikelen ^5,7,8. Normaal gesproken is het gemakkelijk te verkrijgen.
   8. Aan het einde van de bemonsteringsperiode open je de schuifdeuren en laat je de muizen terugkeren naar de thuiskooi.
   9. Sluit de verzamelboxen direct nadat de muizen zijn vertrokken om herintreden en kruisbesmetting van monsters te voorkomen.
   10. Verwijder de ontlastingspellets uit elke verzameldoos met lange pincetten en doe ze over in individueel gelabelde verzamelbuizen.
   11. Bewaar monsters bij -20 °C tot verdere voorbereiding van de FCM-assay.
       OPMERKING: Als de dozen stevig gesloten zijn en niet opnieuw kunnen worden binnengegaan door de muizen, kan de ontlastingspelletverzameling worden uitgesteld tot de volgende lichtfase. Dit moet echter consequent binnen een studie gebeuren.
   12. Houd de dieren in het huiskooigedeelte (PTIII) tot de volgende kooiwissel. Daarna kunnen ze uit elkaar gehaald en gewassen worden in een gewone kooiwasser.

Resultaten

Fecale corticosteronmetabolieten (FCM's) werden succesvol gekwantificeerd uit monsters die werden verzameld met de op maat gemaakte fecale bemonsteringskooien in een longitudinale studie waarbij permanent en intermitterend gekweekte muizen werden vergeleken. De representatieve FCM-analyse omvatte 30 dieren: permanent gefokte groep, n = 15 dieren in 5 kooien; Intermitterend gefokte groep, n = 10 dieren in 5 kooien, met 5 mannetjes die één huis waren, behalve bij 3 fokevenementen, waar ze samen met de vrouwtjes werden gehuisvest. Monsters werden verzameld op 19 tijdspunten om de twee weken, zowel op dagen van kooiwisseling als in het weekend. De gemiddelde tijd tot de meeste dieren de doos waren binnengekomen was 7,5 minuten (SD = 3,07), waarbij de meeste dieren gemiddeld 27,6 muizen (SD = 1,44) van in totaal 30 muizen waren. Alle muizen waren na gemiddeld 11,69 minuten (SD = 3,29) de doos binnengekomen. De gemiddelde opsluitingsduur voor alle muizen was 24,56 minuten (SD = 15,51), en de gemiddelde tijd vanaf de eerste muis die de doos binnenkwam tot het begin van de afgifte was 43,14 minuten (SD = 8,51). De gemiddelde releaseduur was 14,86 minuten (SD = 22,82), en de gemiddelde duur van de gehele procedure was 68,00 min (SD = 11,87). Van 19 monsters (3 proevijen + 16 reguliere), met verwachting van 480 monsters, ontbraken er twee monsters omdat muizen tijdens de opsluiting niet poepten, drie monsters konden niet worden verzameld omdat de muizen hoogzwanger waren of kort na de geboorte, en 5 muizen hadden zachte ondersteuning nodig om binnen te komen. Het gemiddelde gewicht van de monsters die uit de eerste drie monsters werden verzameld was 51,16 mg (SD = 25,39). Van alle verzamelde monsters (475) konden er 473 worden geanalyseerd en leverden resultaten op.

Individuele dieren werden beschouwd als de biologische replica's. Herhaalde ontlastingsmonsters die tijdens de acht weken durende studieperiode van dezelfde dieren werden verzameld, werden behandeld als longitudinale herhaalde metingen en niet als onafhankelijke biologische replicata. De analyse werd uitgevoerd met een lineair gemengd-effect model met geslacht, fokgroep, bemonsteringsdag en aantal muizen per kooi als vaste effecten, en kooi als willekeurige interceptie. Interacties tussen geslacht, fokgroep en bemonsteringsdag werden in het model opgenomen. Het aantal muizen per kooi werd als een extra vast effect meegenomen, maar werd niet getest in interactietermen, omdat deze variabele deels werd verward met het experimentele ontwerp, vooral bij intermitterend gefokte mannetjes.

Het model toonde een duidelijk effect van geslacht op FCM-concentraties (Figuur 3A-D). Vrouwtjes hadden hogere FCM-concentraties dan mannetjes over broedomstandigheden en bemonsteringsdagen, schatting = 28,30, SE = 2,58, t = 10,98, P < 0,0001. Post-hoc vergelijkingen bevestigden dit geslachtsverschil binnen beide fokgroepen en op beide steekproefdagen. Bij permanent gefokte dieren hadden vrouwtjes op zondagen hogere FCM-concentraties dan mannetjes, schatting = 53,41, SE = 8,28, P < 0,0001, en op woensdag schatting = 55,27, SE = 8,37, P < 0,0001. Hetzelfde patroon werd waargenomen bij intermitterend gefokte dieren op zondagen, schatting = 58,04, SE = 12,00, P < 0,0001, en op woensdag schatting = 59,68, SE = 9,88, P < 0,0001.

Het model gaf ook een significant hoofdeffect aan van de fokgroep, schatting = 11,59, SE = 4,65, t = 2,49, P = 0,0227. Tukey-gecorrigeerde post-hoc vergelijkingen toonden echter geen significante verschillen aan tussen permanent en intermitterend gefokte dieren binnen de individuele geslacht/dag-combinaties. Bij vrouwtjes verschilden permanent en intermitterend gefokte dieren niet significant op zondagen, schatting = 24,51, SE = 12,20, P = 0,2085, of op woensdag schatting = 17,31, SE = 12,20, P = 0,4950. Evenzo werd bij mannetjes geen significant verschil in de fokgroep vastgesteld op zondagen, schatting = 29,14, SE = 14,00, P = 0,1708, of op woensdag schatting = 21,72, SE = 13,30, P = 0,3682. Het significante hoofdeffect van de fokgroep moet daarom worden geïnterpreteerd als een algemeen modeleffect, terwijl de meer specifieke, door Tukey aangepaste post-hoc vergelijkingen binnen geslacht en steekproefdag geen robuust verschil in paargewijze groep identificeerden.

Het ontbreken van een significant verschil in fokgroepen bij mannetjes is bijzonder belangrijk, aangezien mannetjes altijd op zondag in één huis zaten. De zondagvergelijking bij mannetjes laat dus zien dat de bemonsteringsmethode zelf de FCM-concentraties niet verhoogt, althans niet bij mannelijke muizen. De fecale bemonsteringskooien werden ook gebruikt voor een andere studie die FCM's vergeleek bij muizen met de bevuilde beestbedekking van sentinel met controles⁹.

Figuur 1: Overzicht van de op maat gemaakte kooi voor ontlasting en bemonstering. Het kooisysteem maakt het mogelijk om ontlastingsmonsters te verzamelen van individuele muizen die in een groepskooi worden gehouden, zonder directe behandeling tijdens de bemonstering. (A) Volledig geassembleerd kooisysteem bestaande uit een thuiskooi en een aangesloten ontlasting bemonsteringskooi. (B) Zijaanzicht van de aangebouwde bemonsteringskooi. (C) Bovenaanzicht met de drie afzonderlijke ingangen naar de individuele collecteboxen. (D) Uitzicht vanuit de huiskooi richting de ingangen van de monsterdozen. (E) Een bemonsteringskooi geopend, waardoor toegang tot de verzamelboxen mogelijk is voor het verwijderen en reinigen van ontlastingspellets. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Bouwplan en assemblage van de ontlastingsbemonsteringkooi. (A-C) Acrylglasonderdelen worden gebruikt om de vloer, zijwanden, schuifdeuren en scheidingsdelen van de bemonsteringskooi te bouwen. (D) Aanpassing van de polycarbonaat type II kooi door de onderkant te verwijderen en gaten en sleuven te boren voor de afdekking van de verzameldoos. (E) Aanpassing van de polycarbonaat type III huiskooi door drie ingangsgaten in de voorzijde te boren. (F) Schematische zijaanzicht van het geassembleerde kooisysteem, met de polycarbonaat type III huiskooi die verbonden is met de aangepaste polycarbonaat type II bemonsteringskooi en de plaatsing van onderdelen 1, 2 en 4. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Representatieve FCM-gegevens verkregen na ontlasting met behulp van de op maat gemaakte kooi. Fecale corticosteronmetabolieten (FCM's) werden gemeten in ontlastingsmonsters die individueel werden verzameld van groepsmuizen met behulp van de op maat gemaakte fecale bemonsteringskooi. Waarden worden weergegeven over acht wekelijkse bemonsteringstijden voor permanent en intermitterend gefokte muizen. Monsters werden afgenomen op de dagen van kooiwisseling of in het weekend. Punten en verbindingslijnen vertegenwoordigen groepsgemiddelden op elk tijdspunt. Foutbalken en gearceerde linten geven gemiddelde ± standaarddeviatie (SD) aan. (A) Vrouwtjes bemonsterd op kooiwisseldagen. (B) Vrouwtjes bemonsterd in het weekend. (C) Mannetjes bemonsterd op kooiwisseldagen. (D) Mannetjes bemonsterd in het weekend. De figuur illustreert dat de methode meetbare FCM-concentraties opleverde over alle groepen en tijdstippen. Vrouwtjes vertoonden over het algemeen hogere FCM-concentraties dan mannetjes, terwijl de verschillen tussen fokgroepen minder consistent waren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Sjablonen voor acrylglascomponenten 1-3. Sjablonen voor het snijden van delen 1, 2 en 3a-c uit 5 mm acrylglas/plexiglas voor de constructie van de fecale bemonsteringskooi. Deel 1 dient als de onderste inzet van de aangepaste polycarbonaat type II kooi. Deel 2 wordt gebruikt om de polycarbonaat type III kooi te verbinden met de polycarbonaat type II kooi en om bijbehorende boorgaten te markeren. De delen 3a-c vormen interne verdelers/structurele elementen van het verzamelsysteem. Witte ronde markeringen geven luchtgaten aan, en kleinere markeringen geven schroefgaten aan. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 2: Sjablonen voor acrylglascomponenten 4a en 4b. Sjablonen voor het snijden van delen 4a en 4b uit 5 mm acrylglas/plexiglas. Deze onderdelen worden in Deel 1 geplaatst om de onderste inzet op zijn plaats te houden en om de monsterkooi te verdelen in aparte fecale verzamelboxen. De onderste uitsteeksels vormen de poten van de verzameldozen, terwijl de bovenste uitsteeksels door de bovenste afdekking lopen en met houten stokken of eetstokjes worden bevestigd om de constructie te stabiliseren. Witte cirkels geven openingen voor de staven of luchtgaten aan. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 3: Aanpassing van de polycarbonaat type II kooi. Schematische template voor het aanpassen van de polycarbonaat type II kooi. De onderkant van de kooi wordt zoals aangegeven afgesneden en later gebruikt als bovenste afdekking van de ontlastingsbakken. Gaten en sleuven worden in het verwijderde onderste gedeelte geboord om het plaatsen en vastzetten van de onderdelen 4a en 4b mogelijk te maken. Schroefgaten worden gebruikt om de polycarbonaat type II kooi, de polycarbonaat type III kooi en Deel 2 te bevestigen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 4: Aanpassing van de polycarbonaat type III kooivoorkant. Schematisch sjabloon voor het boren van de voorzijde van de polycarbonaat type III kooi. Drie ronde openingen zijn in de korte zijde van de kooi geboord om toegang te bieden tussen de thuiskooi en de fecale bemonsteringskooi. Extra schroefgaten worden gebruikt voor bevestiging aan Deel 2 en de polycarbonaat type II kooi. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Dit protocol beschrijft een eenvoudig kooisysteem voor het verzamelen van individueel toewijzende ontlastingsmonsters van groepsmuizen. Het belangrijkste voordeel van de methode is dat het individuele monsterattributie combineert met het behoud van belangrijke aspecten van sociale huisvesting, met name visueel en olfactorisch contact met kooigenoten. Dit is relevant omdat groepshuisvesting vaak vereist is voor dierenwelzijn en ook deel kan uitmaken van het experimentele ontwerp¹⁰. In tegenstelling tot gepoolde huiskooimonsters maakt het systeem het mogelijk om FCM-waarden toe te kennen aan individuele dieren, terwijl langdurige individuele huisvesting vóór of tijdens de monsterafname wordt vermeden.

Veelgebruikte methoden voor ontlasting bij laboratoriummuizen zijn onder andere gepoolde thuiskooimonsters, tijdelijke individuele huisvesting in schone kooien, metabole kooien en directe afname na hantering of overdracht. Gepoolde huiskooimonsters zijn gemakkelijk te verkrijgen, niet-invasief, goedkoop en compatibel met parallelle bemonstering van vele kooien, maar ze staan geen individuele toeschrijving toe bij groepsgehuisde dieren. Tijdelijke individuele huisvesting of het verplaatsen naar schone kooien maakt individuele monstertoewijzing mogelijk, maar verwijdert dieren uit hun sociale groep en kan acute stress veroorzaken door hanteren, nieuwigheid of sociale scheiding. Dit is vooral relevant voor FCM-analyse, omdat corticosteron-gerelateerde metingen gevoelig zijn voor stress veroorzaakt door de steekproefprocedure^{zelf 11}. Metabole kooien bieden gecontroleerde monsterafname en maken scheiding van ontlasting en urine mogelijk, maar vereisen gespecialiseerde apparatuur, zijn minder compatibel met routinematig verzorgen en vereisen meestal individuele huisvesting. Directe afname op basis van behandeling kan ook individueel toeschrijfbare monsters opleveren, maar vereist herhaalde behandeling of manipulatie van de dieren en kan daardoor stressgerelateerde uitlezingen beïnvloeden.

In vergelijking met deze bestaande benaderingen is het huidige systeem ontworpen als een groepshuisvestingscompatibele verfijning voor herhaalde, niet-invasieve individuele ontlastingsmonsters. Na gewenning en training betreden muizen vrijwillig de monsterboxen als reactie op een kleine voedselbeloning. Monsters kunnen daarom worden verzameld zonder achtervolging, hantering of gedwongen overplaatsing naar een aparte kooi. Het systeem moet niet worden geïnterpreteerd als bewezen om het welzijn te verbeteren of stress te verminderen in strikte experimentele zin, omdat directe welzijnsmaatregelen niet in de huidige studie zijn opgenomen. Het is echter ontworpen om de mate van sociale scheiding tijdens het verzamelen van monsters te verminderen en kan daarom minder storend zijn dan conventionele methoden voor individuele verzameling. Daarnaast kunnen meerdere dieren en meerdere kooien parallel worden bemonsterd, wat helpt het monstervenster te standaardiseren, wat belangrijk is omdat FCM-concentraties afhangen van het circadiane ritme en de glucocorticoïde afscheiding enkele uren voor het bemonsteren^{weerspiegelen.}

De representatieve resultaten tonen aan dat het systeem geschikt is voor het verzamelen van fecale monsters die geanalyseerd kunnen worden op FCM-concentraties. Meetbare FCM-concentraties werden verkregen over groepen en tijdstippen, en de methode detecteerde het verwachte duidelijke geslachtsverschil, met hogere FCM-concentraties bij vrouwen dan bij mannen. De studie bevatte ook een interne vergelijking met conventionele eenpersoonswoningen bij mannen. Op zondagen werden mannetjes in de intermitterende fokgroep in één huis geplaatst, terwijl permanent gefokte mannetjes werden bemonsterd met het nieuw ontwikkelde verzamelsysteem. De concentraties FCM verschilden niet significant tussen deze groepen op zondagen. Dit suggereert dat vrijwillige toegang tot de bemonsteringskooi en het korte verblijf in de verzamelbox de FCM-concentraties niet significant verhoogden vergeleken met conventionele eenpersoonsverzameling. Desalniettemin was deze vergelijking beperkt tot mannen en was niet bedoeld als een speciale equivalentie- of crossover-validatiestudie. Verdere studies zouden het systeem daarom moeten vergelijken met gevestigde individuele huisvesting of metabole kooibenaderingen onder evenwichtige experimentele omstandigheden en gedragsindicatoren van acute stress tijdens de bemonstering bevatten.

Naast de beoordeling van fecale corticosteronmetabolieten kan het systeem ook nuttig zijn voor andere toepassingen die kortdurende afname van individuele fecale monsters vereisen. Potentiële toepassingen zijn onder andere parasitologische onderzoeken, microbiota-analyses, verteringsonderzoeken of andere fecale biomarker-assays. Met kleine technische aanpassingen kan het systeem mogelijk ook worden aangepast voor urineafname, bijvoorbeeld door een geperforeerde vloer en een geschikte verzamelbak onder het dier toe te voegen. Voor deze toepassingen kan de mogelijkheid om tijdens het verzamelen van monsters nabijheid te blijven bij kooigenoten voordelig zijn vergeleken met conventionele individuele huisvesting of metabole kooibenaderingen. De geschiktheid van het systeem moet echter worden gevalideerd voor elk specifiek type monster en downstream analyse, vooral waar verontreiniging, monstervolume, verzameltijd of opslagomstandigheden cruciaal zijn.

Over het algemeen moeten dieren gewend raken aan de dozen vóór de eerste bemonstering, individuele markeringen moeten duidelijk zichtbaar zijn onder de gebruikte lichtomstandigheden, en moet het bemonsteren gedurende een studie op hetzelfde tijdstip van de dag worden uitgevoerd. Monsters moeten worden uitgesloten als de individuele identiteit onzeker is, als pellets besmet zijn, als de bemonsteringsduur aanzienlijk afwijkt van het geplande tijdsvenster, of als het fecale materiaal onvoldoende is voor analyse¹³. Verschillende praktische factoren kunnen de toepasbaarheid van het steekproefsysteem beïnvloeden, waaronder dominantiehiërarchieën, agressieve interacties, variabiliteit in voedselmotivatie, verschillen in belasting en verminderde mobiliteit of veranderd gedrag bij obees, oudere, drachtige, postpartum of anderszins beperkte dieren. In de huidige lichting waren het succes van vrijwillige deelname en steekproefneming echter hoog. Van de 480 verwachte regelmatige monsters ontbraken er twee omdat muizen tijdens de opsluiting niet poepten, en drie konden niet worden verzameld omdat dieren hoogdrachtig waren of kort na de bevalling. Zo werden 475 monsters verzameld, waarvan 473 analyseerbare resultaten opleverden. Deze gegevens geven aan dat weigering om de dozen te betreden en het niet verkrijgen van monsters zeldzaam waren onder de omstandigheden die in deze studie werden gebruikt. Desalniettemin kunnen extra aanpassingen aan habituatie of protocollen nodig zijn voor andere stammen, grotere groepen of dieren met veranderde mobiliteit, lichaamsconditie, gezondheidstoestand of sociaal gedrag. Verdere beperkingen zijn dat de methode training vereist en momenteel is ontworpen voor kleine groepen van drie muizen, en dat acrylglas/plexiglascomponenten niet stoomautoclavabel zijn.

De kooi is goedkoop, eenvoudig te bouwen van standaard kooimateriaal en acrylglas, en vereist geen elektronische componenten. Het ontwerp maakt demontage, schoonmaak en integratie in reguliere kooiwisselroutines mogelijk, waardoor het geschikt is voor herhaald longitudinaal bemonsteren. Al met al vertegenwoordigt het systeem een praktische, groepshuisvestingscompatibele benadering voor niet-invasieve, individueel toewijzende fecale bemonstering bij muizen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Boortje 5 mm	Craftomat	22380487	5mm diameter; Aantal 1
Boortjes 60 mm	Bosch	32064647	60 mm diameter; Aantal 1
Boortjes 7 mm	Craftomat	22380520	7 mm diameter; Aantal 1
Boormachine	Makita	25730054	Standaard draagbare of tafelboormachine; Aantal 1
Hetelijmpistool	Einhell	29051207	Voor kooiassemblage; Aantal 1
Hetelijmpen	Einhell	29049664	Compatibel met hetelijmpistool; Aantal 5-10
Makrolon kooi	Animalab	31200129	Standaard Type II kooi; Aantal 1
Makrolon kooi	Animalab	31200256	Standaard Type III kooi; Aantal 1
Plexiglas / acrylglas	Bauhaus	29122352	Ongeveer 0,25 m² totaal; 5 mm dikte; Aantal  2DIN A3 vellen
Zaag- of freesapparaat	Scheppach	32079641	Kleine lintzaag, decoupeerzaag of CNC-frees; Aantal 1
Gedraaide schroeven	Profi Depot	10807533	20 mm × 3 mm; Aantal 4
Houten eetstokjes / staven	Ikea	903.429.71	Ronde houten staven; Aantal 3