MiR-93-5p richt zich direct op Toll-like receptor 4 (TLR4) bij pediatrische Mycoplasma pneumoniae-pneumonie (MPP). De downregulatie ervan kan bijdragen aan de progressie van de ziekte en het daarmee gepaard gaande letsel aan het spijsverteringsstelsel. Deze bevindingen suggereren dat miR-93-5p kan dienen als een potentiële diagnostische biomarker voor MPP en MPP met letsel aan het spijsverteringsstelsel.
Onderzoeksartikel
Het evalueren van de rol van miR-93-5p bij kinderen geïnfecteerd met Mycoplasma pneumoniae met letsel aan het spijsverteringsstelsel
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
MiR-93-5p is betrokken bij het moduleren van acuut longletsel, maar de rol en diagnostische waarde ervan bij pediatrische Mycoplasma pneumoniae-pneumonie (MPP) met letsel aan het spijsverteringsstelsel blijven onduidelijk. Deze studie evalueerde de rol van miR-93-5p als potentiële diagnostische biomarker voor MPP en bijbehorende digestive complicaties bij kinderen. Klinische monsters werden verzameld van pediatrische patiënten met MPP en gezonde controles. De expressie van miR-93-5p werd gekwantificeerd via reverse transcriptie kwantitatieve PCR. Met Mycoplasma pneumoniae (MP)-geïnfecteerde A549-cellen werd een cellulair MPP-model opgezet om veranderingen in celviabiliteit en pro-inflammatoire cytokinen te evalueren. De targeting van Toll-like receptor 4 (TLR4) door miR-93-5p werd beoordeeld met een luciferase-reporterassay. De diagnostische prestaties werden geëvalueerd met behulp van receiver operating characteristic (ROC)-curveanalyse. De miR-93-5p-spiegels waren significant verlaagd bij patiënten met MPP vergeleken met gezonde controles (P < 0,001) en waren verder verlaagd bij patiënten met MPP met letsel aan het spijsverteringsstelsel vergeleken met patiënten met alleen MPP. MP-infectie verminderde de celviabiliteit en verhoogde de IL-6- en TNF-α-spiegels, terwijl overexpressie van miR-93-5p deze effecten verzachtte. De TLR4-expressie was verhoogd na MP-infectie en werd negatief gereguleerd door miR-93-5p. Klinisch was letsel aan het spijsverteringsstelsel bij patiënten met MPP geassocieerd met lagere miR-93-5p-spiegels. ROC-curveanalyses toonden een gunstige diagnostische prestatie bij het onderscheiden van patiënten met MPP van gezonde controles en patiënten met MPP met letsel aan het spijsverteringsstelsel van patiënten met alleen MPP. MiR-93-5p target TLR4 direct bij pediatrische MPP, en de downregulatie hiervan kan bijdragen aan de ziekteprogressie en het bijbehorende letsel aan het spijsverteringsstelsel. Deze bevindingen suggereren dat miR-93-5p kan dienen als een potentiële diagnostische biomarker voor MPP en MPP met letsel aan het spijsverteringsstelsel.
Inleiding
Mycoplasma pneumoniae (MP) is een belangrijke pathogeen die verantwoordelijk is voor longontsteking bij kinderen1, wat wereldwijd vaak leidt tot aanzienlijke respiratoire morbiditeit. Hoewel MP primair longinfecties veroorzaakt, kan het ook extrapulmonale complicaties veroorzaken waarbij meerdere orgaansystemen betrokken zijn2. Tijdens een M. pneumoniae-infectie behoren misselijkheid, braken, diarree en buikpijn tot de meest gerapporteerde gastro-intestinale symptomen3. Een verscheidenheid aan gastro-intestinale aandoeningen en manifestaties is eveneens geïdentificeerd als onderdeel van aan M. pneumoniae gerelateerde extrapulmonale ziekten (MPEPDs)2. Kinderpatiënten met M. pneumoniae-pneumonie (MPP) gecompliceerd door letsel aan het spijsverteringsstelsel vormen klinische uitdagingen die de ernst van de ziekte kunnen verergeren en het beheer kunnen bemoeilijken4. Opkomend bewijs wijst op een interactie tussen de longinfectie en intestinale dysfunctie, wat ten grondslag kan liggen aan deze associatie5,6. Dysregulatie van immuunresponsen tijdens een MP-infectie kan mogelijk ook geassocieerd zijn met letsel aan het spijsverteringsstelsel7.
Ondanks vorderingen in diagnostische modaliteiten8 blijft de vroege en accurate identificatie van MPP uitdagend vanwege overlappende klinische manifestaties met andere respiratoire infecties en variabele extrapulmonale betrokkenheid9. De longen en de darmen zijn sleutelcomponenten van het gemeenschappelijke mucosale immuunsysteem, en deze organen kunnen elkaars functie beïnvloeden, wat blijkt uit intestinale stoornissen tijdens longziekten en reciproque effecten, een fenomeen dat bekend staat als long-darm-crosstalk10. Bovendien richt de pediatrische verpleegkundige zorg zich primair op het management van respiratoire symptomen11, terwijl gastro-intestinale manifestaties mogelijk onder herkend worden of worden toegeschreven aan bijwerkingen van de behandeling. Deze kloof onderstreept de noodzaak voor een uitgebreide beoordeling waarin zowel pulmonale als gastro-intestinale evaluaties zijn geïntegreerd om ondersteunende verpleegkundige interventies te optimaliseren12. Recente moleculaire studies hebben regulatoren van inflammatoire signaleringspaden gehighlight die betrokken zijn bij zowel longpathologie als intestinale inflammatie bij MPP12,13.
MiR-93-5p is betrokken bij de pathogenese van acute longinsufficiëntie, waarbij de downregulatie ervan correleert met een verminderde longfunctie en verergerde ontstekingsreacties14,15. Op basis van deze bevindingen werd verondersteld dat miR-93-5p op vergelijkbare wijze downgereguleerd zou zijn in het serum van kinderen met MPP. Bioinformatische analyse met behulp van de TargetScan-database identificeerde Toll-like receptor 4 (TLR4) als een potentieel direct doelwit van miR-93-5p. Er is gerapporteerd dat TLR4 een belangrijke rol speelt bij het moduleren van de long-darmaas16,17 en werd daarom beschouwd als potentieel geassocieerd met gastro-intestinale complicaties bij MPP. Bijgevolg onderzocht deze studie de betrokkenheid van miR-93-5p bij pediatrische patiënten met MPP gecompliceerd door letsel aan het spijsverteringsstelsel.
Protocol
Deze studie is beoordeeld en goedgekeurd door de ethische commissie van het Affiliated Hospital of Yangzhou University (goedkeuringsnummer 2023-YKL01-(16); 17 januari 2023). Bij elke deelnemer werden perifere veneuze bloedmonsters afgenomen voor de relevante laboratoriumanalyses. Voorafgaand aan deelname is geïnformeerde toestemming verkregen van de wettelijke vertegenwoordigers van alle deelnemers. De reagentia, apparatuur en hulpmiddelen die in dit protocol worden gebruikt, staan vermeld in de Tabel met materialen.
1. Collectie van klinische monsters
In totaal werden 108 kinderen in de leeftijd van 2–14 jaar opgenomen in het Affiliated Hospital of Yangzhou University tussen februari 2023 en december 2024. Alle 108 kinderen waren gediagnosticeerd met MPP, bevestigd door thoraxbeeldvorming en polymerasekettereductie (PCR)-testen op MP DNA in nasofaryngeale monsters. MP DNA in nasofaryngeale swabs werd gedetecteerd via kwantitatieve real-time PCR gericht op het MP-specifieke P1-adhesinegen.
De patiënten werden op basis van de ziektestatus ingedeeld in twee groepen: MPP zonder DSI (n = 60) en MPP met DSI (n = 48). DSI werd gedefinieerd door de aanwezigheid van ten minste één gastro-intestinaal symptoom, waaronder diarree (≥3 lossige of waterige ontlastingstussentijden per dag gedurende >24 u), misselijkheid, braken of aanhoudende abdominale pijn met of zonder loslaatpijn, vergezeld door ten minste één abnormale laboratoriumparameter en/of een bevestigend resultaat van abdominale beeldvorming. Abnormale laboratoriumparameters omvatten verhoogde serumtransaminases, amylase of lipase en/of verhoogde markers voor intestinale permeabiliteit, zoals D-lactaat en endotoxine. Bevestigende resultaten van abdominale beeldvorming omvatten verdikking van de darmwand, vergrote mesenteriële lymfeklieren of peritoneale effusie gedetecteerd via echografie of computed tomography. Daarnaast dienden 60 gezonde kinderen die routinematige onderzoeken ondergingen als controles.
- Inclusiecriteria
Patiënten met gastro-intestinale symptomen in combinatie met laboratorium- of beeldvormingsafwijkingen werden ingedeeld in de DSI-groep. - Exclusiecriteria
De exclusiecriteria omvatten virale of bacteriële pneumonie, tuberculose, een voorgeschiedenis van drugallergie voor de bestudeerde medicatie, immuunstoornissen, malnutritie, nierdysfunctie, gastro-intestinale misvormingen en eerdere antibioticabehandelingen voorafgaand aan opname.
2. Celkweek en MPP-model
Mycoplasma pneumoniae standaardstam ATCC 15531 werd gekweekt in PPLO-bouillon. Humane alveolaire epitheelcellen A549 werden gekweekt in RPMI-1640-medium bevatten 10% foetaal runderserum onder bevochtigde omstandigheden bij 37 °C met 5% CO₂.
Om een in vitro-model van MPP te vestigen, werden A549-cellen geïnfecteerd met M. pneumoniae-suspensies bij een multiplicity of infection (MOI) van 1:10018. Na de infectie werden ongebonden bacteriën verwijderd door het kweekmedium te vervangen. De infectie-efficiëntie werd bevestigd door qPCR-detectie van MP-DNA in de kweeksupernatanten na de infectie.
3. Plasmidconstructie en transfectie
MiR-93-5p-mimics, TLR4-overexpressie (oe-TLR4)-plasmiden en de bijbehorende negatieve controles werden commercieel gesynthetiseerd. MP-geïnfecteerde A549-cellen werden getransfecteerd met behulp van een lipide-gebaseerd transfectiereagens. De transfectie-efficiëntie werd 48 u na transfectie beoordeeld via reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR).
4. RT-qPCR-analyse
Totaal RNA werd geëxtraheerd uit A549-cellen die aan het einde van de experimenten werden geoogst. Cellen werden gelyseerd en gehomogeniseerd met behulp van fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Totaal RNA werd gezuiverd met een fenolgebaseerd RNA-extractiereagens. Een reverse transcriptiekit werd gebruikt voor de reverse transcriptie van miR-93-5p, terwijl complementair DNA voor mRNA-analyse werd gesynthetiseerd met behulp van een commercieel verkrijgbaar reverse transcriptiereagens. RT-qPCR-analyse werd uitgevoerd met behulp van SYBR Green-chemie.
5. MTT-assay
Getransfecteerde A549-cellen van elke experimentele groep werden geoogst en gezaaid in 96-wells platen met een dichtheid van 2 × 103 cellen per well. Vervolgens werd er 20 µL methylthiazolyldifenyl-tetrazoliumbromide (MTT)-reagens aan elke well toegevoegd. Na een verdere incubatie van 2 h bij 37 °C werden de supernatanten voorzichtig verwijderd. De resulterende formazankristallen, gevormd door metabool actieve cellen, werden gesolubiliseerd volgens de instructies van de assay. De celviabiliteit werd indirect gekwantificeerd door de optische dichtheid (OD) bij 490 nm te meten met een microplate reader.
6. Enzyme-linked immunosorbent assay
Commerciële enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits werden gebruikt om de spiegels van interleukine-6 (IL-6) en tumornecrosefactor-α (TNF-α) te meten. De assays werden uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. Metingen werden in triplo uitgevoerd over twee onafhankelijke experimentele replica's om de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid te waarborgen.
7. Dual-luciferase reporter assay
MiR-93-5p bindingsplaatsen binnen de 3′ onvertaalde regio (UTR) van TLR4 werden voorspeld met behulp van de TargetScan-database. Fragmenten die de wild-type (WT) of gemuteerde (MUT) sequenties bevatten, werden gekloond in een luciferase-reportervector. A549-cellen werden co-getransfecteerd met 500 ng van het WT- of MUT-construct, samen met miR-93-5p mimics of controles, met behulp van een lipidengebaseerd transfectiereagens. Na 48 u werd de luciferase-activiteit gemeten met een dual-luciferase reporterassay. De firefly luciferase-activiteit werd genormaliseerd ten opzichte van de Renilla luciferase-activiteit om te corrigeren voor de transfectie-efficiëntie.
8. Western blot-analyse
Voor Western blotting werden cellysaten gemengd met loadingbuffer en gecentrifugeerd bij 10,000 × g gedurende 3 min. De supernatanten werden onderworpen aan natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese, waarna de eiwitten werden overgebracht op polyvinylideenfluoride-membranen. Membranen werden geblokkeerd met 5% runder-serumalbumine (BSA) gedurende 1 u bij kamertemperatuur en vervolgens overnacht bij 4 °C geïncubeerd met primaire antilichamen tegen glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH) en inhibitor kappa B alpha (IκBα) in een verdunning van 1:1000 in Tris-gebufferde zoutoplossing met Tween 20 en 5% BSA. Na drie wasstappen werden de membranen gedurende 1 u bij kamertemperatuur geïncubeerd met HRP-geconjugeerde geit anti-konijn IgG (1:500). Na aanvullende wasstappen werden de eiwitbanden gevisualiseerd met een enhanced chemiluminescence-substraat en vastgelegd met een chemiluminescentie-beeldvormingssysteem. De bandintensiteiten van de doeleiwitten en GAPDH werden gekwantificeerd uit drie onafhankelijke experimenten met behulp van beeldanalyse-software.
9. Statistische analyse
Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van software voor statistische analyse. De normaliteit van de meetgegevens werd beoordeeld met de Shapiro-Wilk-test. Normaal verdeelde gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± standaarddeviatie en werden vergeleken met t-toetsen voor onafhankelijke steekproeven voor twee groepen of een eenweg-variantieanalyse (ANOVA) voor meerdere groepen. Wanneer de ANOVA wees op een significant algemeen verschil, werd de post hoc-test van Tukey gebruikt voor paarsgewijze vergelijkingen. Niet-normaal verdeelde gegevens werden geanalyseerd met de Mann-Whitney U-test. Categorische variabelen werden uitgedrukt als aantallen en percentages en vergeleken met chi-kwadraattoetsen. Receiver operating characteristic (ROC)-curve-analyse werd gebruikt om het diagnostisch potentieel van miR-93-5p te evalueren voor het voorspellen van MPP of MPP met DSI. Om voorspellende factoren te identificeren die geassocieerd zijn met MPP met DSI, werd multivariabele logistieke regressie uitgevoerd. Variabelen die in het model werden opgenomen, waren leeftijd, geslacht, duur van de koorts, duur van het antibioticagebruik en miR-93-5p-expressie gedichotomiseerd op de mediaan. Een tweezijdige P-waarde <0,05 werd beschouwd als statistisch significant.
Resultaten
MiR-93-5p is verlaagd bij pediatrische MPP
De diagnostische prestatie van miR-93-5p werd geëvalueerd om de potentie ervan als biomarker bij pediatrische MPP te onderzoeken. Zoals getoond in Figuur 1A, was de expressie van miR-93-5p significant verlaagd bij pediatrische patiënten met MPP in vergelijking met gezonde controles. De demografische en hematologische kenmerken van de twee groepen zijn samengevat in Tabel 1. Er werden geen statistisch significante verschillen waargenomen in de verdeling van leeftijd of geslacht tussen de groepen (P > 0,05). Echter, het aantal witte bloedcellen (WBC) in perifeer bloed, het percentage neutrofielen (Net%) en de spiegels van C-reactief proteïne (CRP) waren significant verhoogd in de MPP-groep in vergelijking met gezonde controles (P < 0,001).
Een analyse van de receiver operating characteristic (ROC)-curve werd uitgevoerd om de diagnostische prestaties van miR-93-5p bij het onderscheiden van patiënten met MPP van gezonde kinderen verder te beoordelen (Figuur 1B). De oppervlakte onder de curve (AUC) was 0,9009 [95% betrouwbaarheidsinterval (BI): 0,8537–0,9482], met een sensitiviteit van 80,56% en een specificiteit van 88,33%. Deze resultaten geven aan dat verlaagde serum miR-93-5p-niveaus geassocieerd waren met pediatrische MPP.
Effect van miR-93-5p op MPP-celmodellen
Er werd een reeks in vitro experimenten uitgevoerd om het effect van miR-93-5p in het MPP-celmodel te evalueren. Vergeleken met controlecellen was de expressie van miR-93-5p verlaagd in het MPP-celmodel (Figuur 2A). MP-infectie was ook geassocieerd met een verminderde levensvatbaarheid van A549-cellen (Figuur 2B). Daarnaast waren de spiegels van de pro-inflammatoire cytokinen IL-6 en TNF-α verhoogd in het MPP-model vergeleken met de controles (Figuur 2C).
Om het functionele effect van miR-93-5p verder te evalueren, werd een miR-93-5p-overexpressiemodel established in MP-geïnfecteerde A549-cellen (Figuur 2D). Overexpressie van miR-93-5p verhoogde de celviabiliteit significant in vergelijking met het MPP-model zonder miR-93-5p-overexpressie (Figuur 2E). In overeenstemming met deze bevindingen ging een verhoogde miR-93-5p-expressie gepaard met een verminderde productie van IL-6 en TNF-α (Figuur 2F). Deze resultaten geven aan dat een verminderde miR-93-5p-expressie geassocieerd was met een afgenomen celviabiliteit en verhoogde ontstekingsreacties tijdens MP-infectie, terwijl overexpressie van miR-93-5p deze veranderingen attenuationeerde.
MiR-93-5p richt zich op TLR4
Om de regulatoire relatie tussen miR-93-5p en TLR4 te verduidelijken, werd via bioinformatische analyse een voorspelde miR-93-5p bindingsplaats geïdentificeerd binnen de 3′ onvertaalde regio (UTR) van het TLR4 mRNA (Figuur 3A). De expressie van TLR4 was verhoogd in het MP-celmodel in vergelijking met de controles (Figuur 3B). De voorspelde interactie werd vervolgens geëvalueerd met behulp van een luciferase-reporterassay. Co-transfectie met miR-93-5p mimics verminderde de luciferase-activiteit van het wild-type construct, wat duidt op specifieke binding aan de voorspelde locatie (Figuur 3C).
Overexpressie van miR-93-5p in MP-geïnfecteerde cellen verminderde de TLR4-expressie in vergelijking met geïnfecteerde controles zonder mimic-behandeling (Figuur 3D). Om de downstream-effecten die geassocieerd zijn met TLR4-modulatie verder te onderzoeken, werden A549-celmodellen met TLR4-overexpressie opgezet (Figuur 3E). Western blot-analyse toonde verhoogde IκBα-niveaus aan na TLR4-overexpressie (Figuur 3F).
TLR4-overexpressie verminderde de cellevensvatbaarheid na MP-infectie aanzienlijk in vergelijking met controlecellen, terwijl gelijktijdige overexpressie van miR-93-5p deze afname tenietdeed (Figuur 3G). Meting van inflammatoire cytokinen toonde verder aan dat TLR4-overexpressie de spiegels van pro-inflammatoire mediatoren verhoogde, terwijl miR-93-5p-overexpressie deze veranderingen dempte, zelfs in aanwezigheid van TLR4-overexpressie (Figuur 3H). Deze bevindingen geven aan dat miR-93-5p de TLR4-expressie negatief reguleert en cellulaire veranderingen geassocieerd met MP-infectie dempt.
Diagnostische waarde van miR-93-5p bij MPP en MPP met DSI
Eerdere rapporten hebben de betrokkenheid van TLR4 in long- en colonweefsels beschreven16. De potentiële associatie tussen miR-93-5p en letsel aan het spijsverteringsstelsel bij MPP werd daarom klinisch geëvalueerd. Zoals getoond in Figuur 4A, was de expressie van miR-93-5p verlaagd in de MPP+DSI-groep vergeleken met de MPP-groep.
Demografische en hematologische kenmerken zijn samengevat in Tabel 2. Er werden geen significante verschillen in leeftijd of geslacht waargenomen tussen de groepen. Echter, de duur van de koorts en het antibioticagebruik waren significant langer bij patiënten met gelijktijdige DSI (P < 0,05).
De diagnostische waarde van miR-93-5p voor het onderscheid tussen MPP-gevallen met DSI en die zonder DSI werd geëvalueerd met behulp van een ROC-curveanalyse. De AUC was 0,7866 (95% BI: 0,6889–0,8843). (Figuur 4B), met een sensitiviteit van 85,71% en een specificiteit van 57,45%.
Multivariabele logistische regressieanalyse identificeerde een lage expressie van miR-93-5p, een verlengde koortsduur en verlengd antibioticagebruik als factoren die geassocieerd zijn met letsel aan het spijsverteringsstelsel tijdens MP-infectie (Tabel 3; P < 0,05).
Figuur 1: Expressie en diagnostische waarde van miR-93-5p in gezonde controles (n = 60) en patiënten met MPP (n = 108). (A) De miR-93-5p expressie was verlaagd bij patiënten met MPP. (B) ROC-curve analyse van miR-93-5p. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Functionele effecten van miR-93-5p in het MP-geïnfecteerde celmodel. (A) De expressie van miR-93-5p was verlaagd in het MP-geïnfecteerde model. (B) De celviabiliteit was verlaagd in het MP-geïnfecteerde model. (C) De spiegels van TNF-α en IL-6 waren verhoogd in het MP-geïnfecteerde model. (D) Transfectie-efficiëntie van de miR-93-5p mimic. (E) De celviabiliteit was verhoogd na overexpressie van miR-93-5p. (F) De spiegels van TNF-α en IL-6 waren verlaagd na overexpressie van miR-93-5p. n = 3. P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: MiR-93-5p richt zich direct op TLR4. (A) Voorspelde bindingsplaats tussen miR-93-5p en TLR4. (B) TLR4-expressie in het MP-geïnfecteerde model. (C) Dual-luciferase reporter-assay. (D) Negatieve regulatie van TLR4 door miR-93-5p. (E) Efficiëntie van TLR4-overexpressie. (F) Western blot-analyse van IκBα. (G) Cellevensvatbaarheid. (H) TNF-α en IL-6 spiegels. n = 3. P < 0,05, P < 0,01, P < 0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Expressie en diagnostische waarde van miR-93-5p bij patiënten met MPP (n = 60) en patiënten met MPP met DSI (n = 48). (A) miR-93-5p-expressie in de MPP+DSI-groep. (B) ROC-curve-analyse van miR-93-5p. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Variabele | Gezond (n = 60) | MPP (n = 108) | P |
| leeftijd (jaar) | 6.81± 3.14 | 7.12 ± 3.55 | 0.559 |
| geslacht (mannelijk/vrouwelijk) | 28/32 | 49/59 | 0.872 |
| WBC ( × 109/L) | 7.27 ± 0.89 | 9.86 ± 1.36 | <0.001 |
| CRP (mg/L) | 2.35 ± 0.17 | 11.53 ± 2.01 | <0.001 |
| Netto % | 42.55 ± 5.62 | 56.51 ± 15.40 | <0.001 |
Tabel 1: Vergelijking van demografische kenmerken en routinematige bloedparameters tussen gezonde controles en patiënten met MPP.Deze tabel vat de demografische kenmerken en routinematige hematologische parameters van gezonde controles en patiënten met MPP samen, waaronder leeftijd, geslacht, WBC, neutrofielenpercentage, eosinofielenpercentage, basofielenpercentage en CRP. Tussen-groepvergelijkingen en de bijbehorende P-waarden worden weergegeven.
| Variabele | MPP (n = 60) | MPP+DSI (n = 48) | P |
| leeftijd (jaren) | 6.88 ± 3.87 | 7.42 ± 3.11 | 0.441 |
| geslacht (mannelijk/vrouwelijk) | 31/29 | 28/20 | 0.494 |
| WBC (× 10⁹/L) | 8.9 ± 0.89 | 11.05 ± 0.76 | <0.001 |
| CRP (mg/L) | 10.94 ± 1.62 | 12.27 ± 2.22 | <0.001 |
| Netto % | 55.87 ± 14.75 | 57.32 ± 16.29 | 0.629 |
| Duur van de koorts (dag) | 4.60 ± 1.83 | 7.26 ± 1.04 | <0.001 |
| Duur van antibioticagebruik (dag) | 4.65 ± 1.147 | 6.29 ± 0.771 | <0.001 |
Tabel 2: Vergelijking van demografische kenmerken en routinematige bloedparameters tussen patiënten met MPP en patiënten met MPP+DSI.Deze tabel vergelijkt demografische kenmerken, routinematige hematologische parameters en relevante klinische kenmerken tussen patiënten met alleen MPP en patiënten met MPP gecompliceerd door DSI. Tussengroepvergelijkingen en de overeenkomstige P-waarden worden gepresenteerd.
| Variabele | OF | 95% BI | p-waarde | |
| lager | bovenste | |||
| miR-93-5p (laag vs hoog) | 6.702 | 1.487 | 30.211 | 0.013 |
| leeftijd | 1.126 | 0.286 | 4.437 | 0.866 |
| geslacht | 1.071 | 0.27 | 4.248 | 0.923 |
| Duur van de koorts | 73.416 | 15.018 | 358.895 | <0.001 |
| Tijdstip van antibioticagebruik | 7.921 | 1.877 | 33.421 | 0.005 |
Tabel 3: Logistische regressieanalyse van kinderen met MP-infectie gecompliceerd door letsel aan het spijsverteringsstelsel. Deze tabel presenteert de resultaten van de logistische regressieanalyse waarin factoren worden geëvalueerd die geassocieerd zijn met letsel aan het spijsverteringsstelsel bij kinderen met een MP-infectie. De analyse bevat de OR, het 95% BI en de P-waarde voor elke variabele.
Afkortingen: Baso%, basofielenpercentage; CI, betrouwbaarheidsinterval; CRP, C-reactief proteïne; DSI, beschadiging van het spijsverteringsstelsel; Eos%, eosinofielenpercentage; IκBα, inhibitor kappa B alpha; IL-6, interleukine-6; MP, Mycoplasma pneumoniae; MPP, Mycoplasma pneumoniae pneumonie; NC, negatieve controle; Net%, neutrofielenpercentage; oe-TLR4, TLR4 overexpressie; OR, odds ratio; ROC, receiver operating characteristic; TLR4, Toll-like receptor 4; TNF-α, tumornecrosefactor-α; WBC, aantal witte bloedcellen.
BESCHIKBAARHEID VAN GEGEVENS:
De ruwe numerieke gegevens die ten grondslag liggen aan de figuren en tabellen zijn opgenomen als Aanvullende Tabel 1.
Aanvullende tabel 1: Ruwe numerieke gegevens voor de figuren en tabellen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussie
Hoewel MP-infectie primair als een pulmonaal pathogeen wordt beschouwd, kan het diverse extrapulmonale complicaties veroorzaken die meerdere orgaansystemen buiten de longen beïnvloeden19,20. Opkomend bewijs suggereert een interactie langs de long-darm-as, waarbij inflammatoire mediatoren die tijdens pulmonale pathologie vrijkomen, het evenwicht van de intestinale flora21 en de intestinale functie22 verstoren. Deze bidirectionele wisselwerking benadrukt het belang van een uitgebreide patiëntbeoordeling die zowel respiratoire symptomen als gastro-intestinale gezondheid adresseert. Circulerende serumbiomarkers hebben daarom toenemende aandacht gekregen als minimaal invasieve instrumenten met potentiële diagnostische of prognostische waarde23,24. MiRNA's zijn naar voren gekomen als veelbelovende kandidaten vanwege hun stabiliteit en hun rol bij het reguleren van ontsteking-gerelateerde signaleringspaden die betrokken zijn bij de pathogenese van MP25,26,27. Deze studie onderzocht systematisch de rol en klinische relevantie van miR-93-5p bij pediatrische MPP, in het bijzonder wanneer dit gepaard gaat met letsel aan het spijsverteringsstelsel. De spiegels van miR-93-5p waren verlaagd bij kinderen met MPP in vergelijking met gezonde controles en waren verder gereduceerd bij patiënten met letsel aan het spijsverteringsstelsel. Deze bevindingen wijzen op een potentiële rol voor dysregulatie van miR-93-5p bij pulmonale pathologie en als een mogelijke biomarker voor extrapulmonale manifestaties.
MiRNA's hebben een diagnostische waarde aangetoond bij ernstige longontsteking, met veelbelovende sensitiviteit, specificiteit en algemene diagnostische nauwkeurigheid28,29. Klinisch gezien hadden kinderen met MPP gecompliceerd door DSI een langere koortsduur en een verlengde antibioticabehandeling in vergelijking met kinderen zonder spijsverteringscomplicaties. In een multivariabele logistische regressieanalyse waren lagere miR-93-5p-spiegels, naast deze klinische parameters, onafhankelijk geassocieerd met betrokkenheid van het spijsverteringsstelsel. Bovendien toonde ROC-curve-analyse een gunstige diagnostische prestatie van serum miR-93-5p aan voor het onderscheiden van patiënten met MPP met DSI van patiënten zonder DSI. Daarom kan de meting van miR-93-5p een additionele waarde bieden voor vroege identificatie en risicostratificatie bij pediatrische MP-infecties.
Wat betreft de diagnostische prestaties van circulerend miR-93-5p ten opzichte van routinematige klinische ontstekingsmarkers, suggereren de bevindingen dat miR-93-5p complementaire waarde kan bieden in plaats van conventionele indicatoren te vervangen. CRP en procalcitonine (PCT) blijven veelgebruikte biomarkers in de klinische praktijk voor het beoordelen van de ernst van een infectie en het sturen van de antibioticatherapie, waarbij meta-analyses aantonen dat PCT een iets superieure diagnostische nauwkeurigheid vertoont vergeleken met CRP bij bacteriële pneumonie30. Deze acute-fase-reactanten zijn echter grotendeels aspecifiek, omdat ze reageren op diverse ontstekingsstimuli en niet betrouwbaar onderscheid kunnen maken tussen een MP-infectie en andere respiratoire pathogenen, of specifiek het risico op extrapulmonale complicaties kunnen weerspiegelen. In tegenstelling hiermee kan miR-93-5p, als regulatoir molecuul geassocieerd met TLR4/nuclear factor kappa B (NF-κB)-signalering, distincte pathofysiologische informatie verschaffen die conventionele markers aanvult. De correlatie tussen miR-93-5p en CRP is gerapporteerd als relatief zwak (Pearson r = 0,2698), wat suggereert dat miR-93-5p mogelijk een ander aspect van de ontstekingsrespons weerspiegelt dan de systemische acute-fase-respons.
Opkomend bewijs uit diermodellen heeft aangetoond dat een infectie met Mycoplasma pneumoniae niet alleen respiratoire pathologie kan induceren, maar ook letsel aan het spijsverteringsstelsel via de long-darmas die wordt gemedieerd door de intestinale flora31. Bij muizen geïnfecteerd met MP is pathologisch letsel waargenomen in zowel de longen als het colon, samen met veranderingen in de samenstelling van het darmmicrobioom, waaronder een afgenomen abundantie van gunstige bacteriën zoals Corynebacterium glutamicum en een toegenomen abundantie van potentiële pathogenen zoals de Lachnospiraceae NK4A136 group en Escherichia-Shigella, vergezeld door verhoogde lipopolysaccharide (LPS)-spiegels in de coloneinhoud en het bloed32. Er is ook gerapporteerd dat baicaline pulmonale inflammatie verbetert en de intestinale flora reguleert in MPP-muizen via het TLR4/NF-κB-pad, wat de betrokkenheid van deze signaleringscascade bij de long-darminteractie ondersteunt33. Deze bevindingen zijn consistent met een mogelijke betrokkenheid van NF-κB-signalering in de miR-93-5p/TLR4-as die in de huidige studie is onderzocht.
Op mechanistisch niveau was TLR4, een belangrijke mediator van de aangeboren immuniteit die geassocieerd is met pro-inflammatoire responsen34,35,36,37, upgereguleerd tijdens MP-infectie. De verhoogde TLR4-expressie ging gepaard met verhoogde spiegels van de inflammatoire cytokines IL-6 en TNF-α en een verminderde levensvatbaarheid van epitheelcellen. Overexpressie van miR-93-5p onderdrukte de TLR4-expressie, verminderde de afgifte van inflammatoire cytokines en verbeterde de celoverleving onder infectieuze omstandigheden. Daarom kan de downregulatie van miR-93-5p bij patiënten met MPP, met name bij degenen met letsel aan het spijsverteringsstelsel, geassocieerd zijn met verhoogde TLR4-gemedieerde inflammatoire signalering en bredere systemische inflammatoire responsen. De huidige bevindingen bewijzen geen activatie van de downstream NF-κB-route, aangezien gefosforyleerde IκBα en p65 niet zijn beoordeeld.
Verschillende beperkingen van deze studie moeten worden erkend. Ten eerste was dit een single-center studie met een relatief kleine steekproefomvang, met name voor de DSI-subgroep, wat de statistische power en generaliseerbaarheid kan beperken. Externe validatie in grotere, multicenter cohorten is vereist om deze bevindingen te bevestigen en betrouwbare klinische afkapwaarden vast te stellen. Ten tweede, hoewel IκBα werd gedetecteerd via Western blotting, is er geen uitgebreide validatie uitgevoerd van andere downstream componenten van de TLR4/NF-κB-route, waaronder MyD88, p-IκBα en p65. Validatie op eiwitniveau van deze signaalcomponenten zou de mechanistische interpretatie versterken. Ten derde sluit het observationele ontwerp causale inferentie uit; loss- en gain-of-function experimenten, inclusief miRNA mimics of inhibitoren in vitro of in vivo, zijn nodig om te bepalen of miR-93-5p direct bijdraagt aan MPP-geassocieerd spijsverteringsletsel. Ten vierde werden de in vitro experimenten uitgevoerd in A549 longepitheelcellen. Hoewel dit model geschikt is voor het evalueren van de ontstekingsremmende effecten van miR-93-5p in een pulmonale context, kan het gastro-intestinale pathologie niet direct modelleren. De voorgestelde associatie tussen pulmonale miR-93-5p/TLR4-signalering en spijsverteringsmanifestaties, potentieel gemedieerd via de long-darm-as, vereist directe validatie in intestinale epitheelcelmodellen, zoals Caco-2-cellen, en in vivo diermodellen van MP-infectie. Ten slotte blijven technische uitdagingen verbonden aan miRNA-detectie, waaronder RNA-stabiliteit en normalisatiestrategieën, barrières voor routinematige klinische implementatie. Ondanks deze beperkingen bieden de bevindingen een basis voor toekomstige mechanistische studies en grootschalige validatie-inspanningen.
Concluderend kan worden gesteld dat upregulatie van miR-93-5p de door MP geïnduceerde ontsteking in longepitheelcellen verminderde via suppressie van TLR4. Klinisch waren verlaagde circulerende miR-93-5p-spiegels geassocieerd met letsel aan het spijsverteringsstelsel bij kinderen met MPP, wat wijst op een potentiële bruikbaarheid als aanvullende biomarker voor het identificeren van patiënten met een risico op gastro-intestinale complicaties.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat er geen belangenverstrengeling is.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| A549 menselijke alveolaire epitheelcellen | ATCC, USA | Cat# CCL-185; RRID: CVCL_0023 | Menselijke alveolaire epitheelcellijn gebruikt voor het in vitro MPP-model |
| Anti-GAPDH antilichaam | Hangzhou XianZhi Biological Technology, China | Cat# AB-P-R001; RRID: AB_3096355 | Primair antilichaam gebruikt voor GAPDH-detectie als ladingscontrole bij Western blotting |
| Anti-IκBα antilichaam | Beyotime, China | Cat# AG2741; RRID: AB_3731391 | Primair antilichaam gebruikt voor IκBα-detectie via Western blotting |
| Bovien serumalbumine (BSA) | Solarbio, China | Cat# A8012 | Blokkeringsreagens gebruikt tijdens Western blotting |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, USA | Multifuge X4 Pro; Cat# 75016066; RRID: SCR_020726 | Centrifuge gebruikt tijdens celkweek en monstervoorbereiding |
| Chemiluminescentie-beeldvormingssysteem | Tanon, China | 5200Multi; RRID: SCR_027114 | Beeldvormingssysteem gebruikt om chemiluminescente Western blot-signalen te visualiseren |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega, USA | Cat# E1910 | Gebruikt om vuurvlieg- en Renilla-luciferaseactiviteiten te meten |
| Foetaal runderserum (FBS) | Gibco, USA | Cat# A5256701 | Serumsupplement voor celkweekmedium |
| Geit anti-konijn IgG, HRP-geconjugeerd | Cell Signaling Technology, USA | Cat# 7074; RRID: AB_2099233 | HRP-geconjugeerd secundair antilichaam gebruikt voor Western blotting |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 10.1.2; URL: https://www.graphpad.com | Software gebruikt voor statistische analyse en grafische presentatie |
| Interleukine-6 (IL-6) ELISA-kit | Elabscience, China | Cat# E-EL-H6156; RRID: AB_3665145 | ELISA-kit gebruikt voor de kwantificering van IL-6 |
| Lipofectamine 3000 Transfectiereagens | Thermo Fisher Scientific | Cat# L3000015 | Lipide-gebaseerd reagens gebruikt voor transfectie van A549-cellen |
| Microplate-lezer | Tecan, Switzerland | Infinite M Plex; RRID: SCR_026522 | Microplate-lezer gebruikt om de optische dichtheid bij 490 nm te meten |
| miR-93-5p mimics | Ribobio, China | Cat# miR10000093-1-5 | Synthetische miR-93-5p mimic gebruikt voor miR-93-5p overexpressie |
| miR-93-5p negatieve controle | Ribobio, China | Cat# miR1N0000001-1-5 | Negatieve controle voor transfectie met miR-93-5p mimic |
| MTT Celproliferatie- en Cytotoxiciteitsassay-kit | Beyotime, China | Cat# C0009S | Gebruikt om de celviabiliteit te beoordelen |
| Mycoplasma pneumoniae standaardstam ATCC 15531 | ATCC, USA | Cat# 15531 | Standaard M. pneumoniae-stam gebruikt om het infectiemodel op te stellen |
| pGL3-Basic Luciferase Reporter Vector | Promega, USA | Cat# E1751 | Reportervector gebruikt voor de dual-luciferase reporter assay |
| Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) | Solarbio, China | Cat# IP9212 | Buffer gebruikt voor het wassen van cellen en monstervoorbereiding |
| Pierce ECL Western substraat | Thermo Scientific, USA | Cat# 32209 | Chemiluminescent substraat gebruikt voor Western blot-detectie |
| Pleuropneumonia-like organism (PPLO) medium | BD, USA | Cat# 255420 | Kweekmedium gebruikt voor M. pneumoniae |
| Polyvinylidefluoride (PVDF) membraan | Bio-Rad | Cat# 1620177 | Membraan gebruikt voor proteïneoverdracht tijdens Western blotting |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | Takara Bio Inc., Japan | Cat# RR036A | Reverse transcriptie master mix gebruikt voor cDNA-synthese |
| PrimeScript RT Reagent Kit | Takara Bio Inc., Japan | Cat# RR037A | Reagenskit gebruikt voor reverse transcriptie |
| Real-time PCR-systeem | Applied Biosystems, USA | QuantStudio 3 Real-Time PCR System; RRID: SCR_020238 | Real-time PCR-instrument gebruikt voor qPCR-analyse |
| RPMI-1640 medium | Gibco, USA | Cat# 11875135 | Celkweekmedium gebruikt voor A549-cellen |
| SPSS | IBM | Version 27.0; RRID: SCR_016479 | Software gebruikt voor statistische analyse |
| TLR4 overexpressie negatieve controle | Ribobio, China | NA | Negatieve controle voor TLR4-overexpressie-experimenten |
| TLR4 overexpressieplasmide (oe-TLR4) | Ribobio, China | NA | Plasmide gebruikt voor TLR4-overexpressie |
| TRIzol Reagens | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Cat# 15596026 | Reagens gebruikt voor totale RNA-extractie |
| Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α) ELISA-kit | Elabscience, China | Cat# E-EL-H0109; RRID: AB_3665144 | ELISA-kit gebruikt voor de kwantificering van TNF-α |
| Universal SYBR qPCR Master Mix | Takara Bio Inc., Japan | Cat# BL697A | Master mix gebruikt voor kwantitatieve PCR |
| Western blot gelelektroforesesysteem | Bio-Rad, USA | Mini-PROTEAN Tetra Cell; Cat# 1658004 | Elektroforesesysteem gebruikt voor proteïnescheiding |
Referenties
- Yan C et al. Current status of Mycoplasma pneumoniae. infection in China. World Journal of Pediatrics. 2024;20(1):1-4.
- Poddighe D. Extra-pulmonary diseases related to Mycoplasma pneumoniae. in children: recent insights into the pathogenesis. Current Opinion in Rheumatology. 2018;30(4). doi:10.1097/BOR.0000000000000494.
- Schildgen O et al. Clinical manifestations in infants and children with Mycoplasma pneumoniae. infection. PLOS ONE. 2018;13(4). doi:10.1371/journal.pone.0195288.
- Li X et al. Intestinal necrosis due to nonocclusive mesenteric ischemia in a child with Mycoplasma pneumoniae. pneumonia: a case report. BMC Infectious Diseases. 2025;25(1):1049.
- Ran B, Yang Z, Li M. METTL3-mediated miR-4534 maturation promotes IVDD progression by targeting the Sirt6-mediated Nrf2/HO-1 pathway. 2024;21(6):2795-2813.
- Du B et al. The lung-gut crosstalk in respiratory and inflammatory bowel disease. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2023;13. doi:10.3389/fcimb.2023.1218565.
- Jiang Y et al. Intestinal bacteria flora changes in patients with Mycoplasma pneumoniae pneumonia. with or without wheezing. Scientific Reports. 2022;12(1):5683.
- Lin L-J et al. The diagnostic value of serological studies in pediatric patients with acute Mycoplasma pneumoniae. infection. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 2020;53(2):351-356.
- Cui J et al. Integrated microfluidic cartridge for rapid and colorimetric detection of Mycoplasma pneumoniae. Microchimica Acta. 2025;192(9):559.
- Wang X, Starodubtseva MN, Kapron CM, et al. Cadmium, von Willebrand factor and vascular aging. NPJ Aging. 2023;9(1):11.
- Chen J. Efficacy of the PDCA cyclic care model in improving lung function and speed of recovery in children with Mycoplasma pneumonia. American Journal of Translational Research. 2025;17(3):1792-1802.
- Li Y et al. Clinical significance of serum miR-98-5p in children with Mycoplasma pneumoniae. infection complicated with digestive system damage. Immunobiology. 2025;230(4):153101.
- Zhang Y, Wu ZM. LINC02605 involved in paediatric pneumonia complicated with diarrhoea via miR-539-5p/CXCL1 axis. European Journal of Clinical Investigation. 2024;54(9). doi:10.1111/eci.14234.
- Gao H et al. Knockdown of lncRNA MEG3 protects against sepsis-induced acute lung injury in mice through miR-93-5p-dependent inhibition of NF-κB signaling pathway. Pathology - Research and Practice. 2022;239:154142.
- Gao H et al. MicroRNA-93 contributes to the suppression of lung inflammatory responses in LPS-induced acute lung injury in mice via the TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway. Int J Mol Med. 2020;46(2):561-570.
- Wedgwood S et al. Intestinal dysbiosis and the developing lung: the role of Toll-like receptor 4 in the gut-lung axis. Frontiers in Immunology. 2020;11. doi:10.3389/fimmu.2020.00357.
- Zou N et al. Transcutaneous auricular vagus nerve stimulation as a novel therapy connecting the central and peripheral systems: a review. Int J Surg. 2024;110(8):4993-5006.
- Chen Y et al. Combination of azithromycin and methylprednisolone alleviates Mycoplasma pneumoniae.-induced pneumonia by regulating miR-499a-5p/STAT3 axis. Exp Ther Med. 2022;24(3):578.
- Poddighe D. Mycoplasma pneumoniae.-related extra-pulmonary diseases and antimicrobial therapy. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 2020;53(1):188-189.
- Meyer Sauteur PM, Ramien ML, Theiler M. Mycoplasma pneumoniae.: extrapulmonary manifestations in children with focus on mucocutaneous disease. The Pediatric Infectious Disease Journal. 9900. doi:10.1097/INF.0000000000004946.
- Liu C et al. Mast cells participate in regulation of lung-gut axis during Staphylococcus aureus pneumonia. Cell Proliferation. 2019;52(2).
- Guo J et al. People are an organic unity: gut-lung axis and pneumonia. Heliyon. 2024;10(6).
- Fan F et al. Clinical characteristics and serum inflammatory markers of community-acquired mycoplasma pneumonia in children. The Clinical Respiratory Journal. 2023;17(7):607-617.
- Ding L, Jiang Y. Biomarkers associated with the diagnosis and prognosis of Mycoplasma pneumoniae. pneumonia in children: a review. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2025;15. doi:10.3389/fcimb.2025.1552144.
- Peng W et al. Comparative analysis of the efficacy and safety of different methods for injecting polidocanol in the treatment of venous malformations. Phlebology. 2024;39(9):629-635.
- Wang J et al. Peripheral blood microR-146a and microR-29c expression in children with Mycoplasma pneumoniae. pneumonia and its clinical value. Italian Journal of Pediatrics. 2023;49(1):119.
- Chu C et al. High expression of miR-222-3p in children with Mycoplasma pneumoniae. pneumonia. Italian Journal of Pediatrics. 2019;45(1):163.
- Powell BH, Witwer KW, Meffert MK. Cellular miRNAs and viruses: trends in miRNA sequestering and target de-repression. J Virol. 2025;99(7).
- Gan T, Yu J, He J. miRNA, lncRNA and circRNA: targeted molecules with therapeutic promises in Mycoplasma pneumoniae. infection. Arch Microbiol. 2023;205(8):293.
- Im PK et al. Hyperuricemia, gout and the associated comorbidities in China: findings from a prospective study of 0.5 million adults. The Lancet Regional Health – Western Pacific. 2025;58. doi:10.1016/j.lanwpc.2025.101572.
- Hu J et al. Insight into the pathogenic mechanism of Mycoplasma pneumoniae. Curr Microbiol. 2022;80(1):14.
- Li B et al. Cecropin AD ameliorates pneumonia and intestinal injury in mice with Mycoplasma pneumoniae. by mediating gut microbiota. BMC Vet Res. 2025;21(1):39.
- Song D et al. The mechanism of baicalin in improving pulmonary inflammatory response and injury and regulating intestinal flora in Mycoplasma pneumoniae pneumoni.a mice. Cellular Signalling. 2025;126:111530.
- Coutinho-Wolino KS et al. Bioactive compounds modulating Toll-like 4 receptor (TLR4)-mediated inflammation: pathways involved and future perspectives. Nutrition Research. 2022;107:96-116.
- Thorburn AN et al. TLR2, TLR4 and MyD88 mediate allergic airway disease (AAD) and Streptococcus pneumoniae-induced suppression of AAD. PLOS ONE. 2016;11(6).
- Tang J et al. Effect of gut microbiota on LPS-induced acute lung injury by regulating the TLR4/NF-kB signaling pathway. International Immunopharmacology. 2021;91:107272.
- Jia H et al. Pulmonary epithelial TLR4 activation leads to lung injury in neonatal necrotizing enterocolitis. The Journal of Immunology. 2016;197(3):859-871.