Methodenartikel

Een excisie-wondmodel bij ratten voor het onderzoeken van therapeutica bij huidwonden met een kritieke omvang

0 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/72315

⸱

25 september 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Hand Surgery, Plastic Surgery and Burns, Linkoping University, 2Center for Biomedical Resources, Linkoping University, 3Basic Medical Sciences Department, College of Medicine, Ajman University, 4Medical Laboratory Science Department, College of Health Sciences, University of Sharjah

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een excisiewondmodel in de huid van ratten waarbij gebruik wordt gemaakt van een vochtige kamer. Het systeem maakt de evaluatie van lokale vloeibare formuleringen, cel-suspensies, biomaterialen en andere wondtherapieën mogelijk.

Samenvatting

Huidwonden vormen een grote wereldwijde uitdaging voor de gezondheidszorg en veroorzaken aanzienlijke morbiditeit en economische lasten. Betrouwbare en klinisch relevante diermodellen zijn essentieel voor het onderzoeken van mechanismen van weefselherstel en het evalueren van nieuwe therapeutische strategieën. Conventionele excisiewondmodellen bij knaagdieren zijn echter beperkt door snelle wondcontractie als gevolg van de panniculus carnosus, wat significant verschilt van de menselijke wondgenezing. Bij mensen vindt genezing voornamelijk plaats via de vorming van granulatieweefsel en re-epithelialisatie. Deze studie beschrijft een excisiewondmodel bij ratten dat is ontworpen om wondcontractie te beperken en tegelijkertijd een beschermde omgeving te bieden voor het testen van gevoelige therapeutische interventies. Full-thickness dorsale excisiewonden van 10 mm werden gemaakt in Sprague Dawley-ratten en gestabiliseerd met een O-ring van nitrilbutadieenrubber (NBR), vastgezet met onderbroken hechtingen. Om een vochtige wondomgeving te behouden, werden een Eakin-cohesieve afdichting en een transparante hechtdocumentfilm aangebracht om een kamer te vormen die geschikt is voor topische toediening van cellen, biomaterialen of farmaceutische verbindingen. Aanvullende beschermlagen bestaande uit een schuimverband, plakband, een tubulair verband en een dubbele schouderfixatiesysteem werden gebruikt om te voorkomen dat de dieren het verband zouden verwijderen. Wondgenezing werd gedurende 14 dagen gemonitord via digitale planimetrie en histologische beoordeling met hematoxyline- en eosinekleuring. De procedure nam ongeveer 30 min per dier in beslag en leverde consistente resultaten van wondgenezing op. De NBR O-ring werd gebruikt als spalk om wondcontractie te beperken. Genezing vond voornamelijk plaats via de vorming van granulatieweefsel en re-epithelialisatie. Verbanden bleven tot zeven dagen intact zonder tekenen van infectie. Histologische analyse toonde actieve weefselreparatie aan, gekenmerkt door epidermale regeneratie en infiltratie van inflammatoire cellen. Dit model biedt een platform voor preklinische evaluatie van wondtherapeutica en geavanceerde regeneratieve behandelingen.

Inleiding

Huidwonden, waaronder moeilijk genezende wonden, treffen wereldwijd meer dan 40 miljoen patiënten en vormen een aanzienlijke belasting voor de gezondheidszorg, met jaarlijkse kosten van $22 miljard tegen 2024. In Europa alleen al lijden jaarlijks 4 miljoen patiënten aan moeilijk genezende wonden, die tot de helft van de beschikbare acute opnames in beslag nemen1. Ondanks vorderingen in chirurgische technieken, intraoperatieve praktijken en de beschikbaarheid van geavanceerde wondverbanden, zijn sommige wonden refractair, waarbij uiteindelijk complicaties zullen ontstaan. Daarom is het essentieel om nieuwe therapeutische benaderingen te ontwikkelen, waarvoor een experimenteel diermodel voor huidwonden nodig is om een breed scala aan topische materialen te testen.

Onder de experimentele diermodellen voor huidwonden is huidexcisie de meest toepasbare techniek voor het creëren van een wondgenezingsmodel2. Een dergelijk model kan helpen bij het onderzoeken van bloedingen, ontstekingsreacties, granulatie, re-epithelialisatie, angiogenese en weefselremodellering3. Excisie-wonden worden hoofdzakelijk op de rug van het dier gemaakt door chirurgische verwijdering van een gedefinieerd huidoppervlak. De wond moet een kritische grootte hebben om spontane genezing te voorkomen. Deze excisie-wond van kritieke grootte biedt directe toegang voor het onderzoeken van de topische toepassing van verschillende chemicaliën, cellen of biomaterialen en hun betrokkenheid bij het genezingsproces4,5.

Knaagdieren en de menselijke huid vertonen overeenkomsten in de cellulaire en moleculaire fasen van wondgenezing, waaronder hemostase, ontsteking, proliferatie en remodellering. Ratten en muizen zijn de meest gebruikte soorten in wondmodellen vanwege hun beschikbaarheid, geringe omvang, relatieve gemak van genetische manipulatie en hanteerbaarheid. Ratten bieden verschillende praktische voordelen ten opzichte van muizen, waaronder een grotere lichaamsomvang en een dikkere huid, die uit meer lagen keratinocyten bestaat dan die van muizen. Wonden bij muizen genezen doorgaans binnen 7 dagen, terwijl bij ratten het genezingsproces gedurende ongeveer 12–14 dagen kan worden geëvalueerd6.

Een grote uitdaging bij het gebruik van knaagdieren met een losse huid is wondcontractie3. De huid van knaagdieren heeft een panniculus carnosus-laag, die na letsel samentrekt om het blootgestelde oppervlak te verkleinen. In tegenstelling hiermee hebben menselijke wonden een beperkt vermogen tot contractie en zijn ze voor herstel afhankelijk van granulatie en re-epithelialisatie7. Een aanpak om de beperkingen van diermodellen te overwinnen, is het uitvoeren van fysieke fixatie of spalking van de huid rondom het wondgebied8. Titanium wondkamers behoorden tot de apparaten die succesvol zijn ontwikkeld om wondcontractie te voorkomen9, maar hadden nadelen zoals hoge stress bij de dieren door het gewicht van de kamer, complexe chirurgische plaatsing, de mogelijkheid dat het apparaat verschuift, infectierisico en hoge kosten. Het concept van het gespalkte wondmodel werd in 2004 geïntroduceerd door Galiano et al.10 door een rigide siliconen ring rond de wondrand te hechten. Deze aanpak vermindert wondcontractie aanzienlijk11, maar kent verschillende nadelen en beperkingen, die primair centered zijn rond de kans op weke delen beschadiging, een hoog percentage verschuiving van de spalk en inconsistente wondgenezing. Spalken (zoals rigide siliconen ringen) kunnen overmatige druk op de omliggende huid veroorzaken, wat leidt tot ischemie, irritatie en necrose, vooral bij onjuiste toepassing. Siliconen spalken raken vaak beschadigd, breken of raken los door bewegingen of verzorgingsgedrag van het dier 8,11. Ongelijkmatige hechtingen zorgen vaak voor een ongelijkmatige spanning rond de wond, wat leidt tot inconsistente genezing. In het hier gepresenteerde model wordt een Nitril-butadieen-rubber (NBR) O-ring op de rand van de huidwond gehecht door 8-12 eenvoudige onderbroken polyamide hechtingen gelijkmatig rond de ring te plaatsen. Van deze aanpak wordt verwacht dat de bovengenoemde risico's worden geminimaliseerd en wondcontractie voldoende wordt beperkt, waardoor de wond kan genezen door vorming van granulatieweefsel en re-epithelialisatie, vergelijkbaar met het menselijke wondgenezingsproces. Dit genezingsmechanisme zou de vertaling van bevindingen uit diermodellen naar klinische toepassingen vergemakkelijken.

De theorie van vochtige wondgenezing werd in 1962 geïntroduceerd door George D. Winter als concept voor het ontwerp van wondverzorgingsproducten12. Op basis van deze theorie zijn de afgelopen decennia verschillende wondverbanden ontwikkeld, zoals gazen, transparante films, schuimen en hydrogels13. Aan de andere kant werd in 1974 een vormbare hydrocolloïde stoma-barrière ringafdichting ontworpen en ontwikkeld om lekken te voorkomen en ertegen te beschermen. Deze kunnen gemakkelijk worden gevormd en gemodelleerd om aan de wondrand aan te passen, in het bijzonder bij stomaverzorgingstoepassingen. In dit model wordt een cohesieve afdichting aan de buitenkant van de wond aangebracht, die samen met steriele, transparante films een vochtige kamer creëert die de klinische situatie van patiënten met huidwonden onder behandeling nabootst, waardoor de epithelialisatie van de wond wordt bevorderd en lokale middelen (bijv. cellen, biomaterialen, verbindingen) tegen lekkage worden beschermd.

Wondverzorging is essentieel voor het beschermen van het wondbed tegen fysiek trauma en microbiële infectie. Wondverzorging bij ratten is altijd een uitdaging geweest vanwege hun lage tolerantie hiervoor. Ratten verwijderen of vernietigen verbanden vaak door eraan te bijten en te scheuren, vrijwel direct nadat ze zich hebben hersteld van de anesthesie. Dit maakt het behoud van topische middelen, zoals cellen en farmaceutica, zeer moeilijk en maakt de bescherming van wonden tegen externe pathogenen en verontreinigingen onmogelijk. Dit is een verdere uitdaging in het knaagdiermodel, vooral in studies die een steriele omgeving vereisen, zoals biologische tests, celgebaseerde therapie en geavanceerde therapeutische geneesmiddelen. In het hier gepresenteerde model werden een schuimverband en plakband gebruikt om de vochtige kamer te bedekken. Een elastisch kousverband, een fixatieverband en micropore chirurgisch plakband werden vervolgens gebruikt om een dubbel schouderkruisverband aan te brengen om te voorkomen dat de ratten de verbanden verwijderen of beschadigen.

Het hier beschreven model combineert verschillende elementen uit diverse protocollen en is over een periode van meerdere jaren ontwikkeld. Het doel was om een model van een excisie-wond bij ratten te vestigen met behulp van een vochtige kamer die goed wordt getolereerd door het dier, om zo het testen van gevoelige topische middelen, met name in vloeibare vorm, te faciliteren.

Protocol

Alle onderstaande dierprocedures zijn goedgekeurd door de ethische commissie van Linköping (Dnr 5163-2023), Zweden. De gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de Tabel met materialen.

1. Experi​mentale dieren

  1. Gebruik volwassen mannelijke Sprague Dawley-ratten in de leeftijd van 8–14 weken.
  2. Acclimatiseer de ratten vóór het experiment gedurende ten minste 1 week in een licht/donkercyclus van 12 u met een standaarddieet.

2. Preoperatieve voorbereiding

  1. Anestheseer het dier met 1,5%–2,5% isofluraan (4,5% voor inductie) gemengd met 1,0–1,5 L/min zuurstof. Plaats het dier in buikligging op een warmtemat om het warm te houden. Breng oogsmeersel aan om de ogen te beschermen en dien 0,05 mg/kg Buprenorfine lichaamsgewicht, verdund in saline, subcutaan toe op de rug van het dier voor postoperatieve pijnstilling.
    OPMERKING: Het is belangrijk om een dunne laag wegwerponderlegger als isolatie tussen het dier en de mat te hebben.
    WAARSCHUWING: Isofluraan is een depressivum van het centrale zenuwstelsel en een respiratoire irritant. Gebruik een gekalibreerde verdamper met een actief afzuigingssysteem voor afvalgassen om blootstelling aan dampen te voorkomen.
  2. Scheren het dorsale gebied met een elektrische trimmer vanaf de basis van de nek naar beneden over ongeveer 10 cm. Reinig het geschoren gebied grondig tweemaal met chloorhexidine en 70% ethanol, en dek het dier vervolgens af met een gefenestreerd chirurgisch laken waarbij alleen het gereinigde gebied bloot blijft.

3. Aanmaken van een excisie-wond

  1. Gebruik geschikte gesteriliseerde chirurgische instrumenten, zoals scharen en pincetten.
  2. Teken met een sjabloon en een chirurgische permanente marker een cirkel met een diameter van 10 mm, ongeveer 4 cm caudaal van de basis van de nek.
  3. Pak het centrum van de gemarkeerde huid vast met een pincet en exciseer het gemarkeerde huidweefsel met een schaar. De diepte van de wond moet reiken tot aan de oppervlakkige fascia. Deze kan worden geïdentificeerd door de volledige dikte van de huid los te maken en de semitransparante fascia te visualiseren die de spier bedekt.
  4. Plaats een NBR O-ring op de rand van de huidwond en zet deze op positie door 8-12 hechtingen aan te brengen. Het doel van de ringfixatie is om huidcontractie te voorkomen. Zorg ervoor dat de primaire hechtingen zich op de 12 uur-positie bevinden, gevolgd door de 6 uur-, 3 uur- en vervolgens de 9 uur-positie. In het geval van 8 hechtingen wordt elke hechting in het midden van de ruimte tussen elke twee primaire hechtingen geplaatst (Figuur 1A).
  5. Breng aan de buitenkant van de NBR O-ring een cohesieve afdichting aan, waarbij gebruik wordt gemaakt van de adhesieve eigenschappen, om samen met een steriele transparante en adhesieve film een vochtige kamer te creëren (Figuur 1B). In dit stadium is de wond gespalkt met de NBR O-ring, en worden de zijwanden van de applicatiekamer gevormd door zowel de huidrand als de cohesieve afdichting; de bodem wordt gevormd door het rauwe wondoppervlak, terwijl het dak wordt gevormd door de transparante film.
  6. Bedek de wond met één laag van de film en dien vervolgens de behandelingsoplossing (celoplossing of verbindingoplossing) door de film toe op het wondoppervlak. Een kamer van de beschreven grootte kan gemakkelijk 100 µL bevatten.
  7. Bedek de injectieplaats met nog een laag van de film om lekkage van de behandeling te voorkomen (Figuur 1C).
  8. Bedek de film met een zacht silicone verband om de film te beschermen (Figuur 1D).
  9. Breng adhesieve tapes aan (Figuur 1E), gevolgd door een elastisch kousverband in een double-shoulder configuratie rond de rat met een fixatieverband en micropore chirurgische tapes (Figuur 1F–H).
  10. Trim de klauwen van de ratten om te voorkomen dat het verband door de ratten wordt losgerukt.
  11. Dien carprofen (5 mg/kg lichaamsgewicht), verdund in zoutoplossing, subcutaan toe aan het dier voordat de anesthesie wordt beëindigd.

4. Postoperatieve procedures

  1. Houd het dier op het warmtekussen, bedekt met een deken, totdat het wakker is uit de anesthesie. Plaats de dieren in afzonderlijke kooien of in één kooi met een scheidingswand om te voorkomen dat de dieren elkaar bijten en het verband verwijderen.
  2. Dien de volgende ochtend subcutaan carprofen toe (5 mg/kg lichaamsgewicht verdund in saline) om postoperatieve pijn te beheersen. De ratten moeten dagelijks worden gecontroleerd op postoperatieve pijn of gewichtsverlies, en indien nodig kan een extra dosis analgesica worden toegediend.

5. Wondmetingen en het wisselen van het verband

  1. Controleer elk dier dagelijks in de eerste week na de wondoperatie. Het verband moet worden geïnspecteerd en gecorrigeerd als de dieren moeite hebben met bewegen of ongemak vertonen.
  2. Vervang het verband op dag 7 terwijl het dier onder anesthesie is, zoals beschreven in stap 2.1.
  3. Verwijder voorzichtig de verbandbedekking van de huid. Er worden foto's van de wond gemaakt met een liniaal voor de schaal. De afbeeldingen werden geanalyseerd met Fiji/ImageJ-software om het wondoppervlak te evalueren.
  4. Voer metingen of andere procedures uit zoals vereist door de onderzoeker.
  5. Breng een schoon verband aan zoals in stap 3.8–3.11 en laat het dier herstellen zoals beschreven in stap 4.1.

6. Wondafname en euthanasie

  1. Dien anesthesie toe zoals vermeld in punt 2.1 op dag 14, of anders volgens het specifieke experimentele plan. Verwijder het verband en maak foto's van de wondplaatsen.
  2. Verwijder het verband en maak foto's van de wondplaatsen.
  3. Neem wondhuidweefsel af. Exciteer met een scalpel de huid rondom de wond, inclusief een deel gezond weefsel.
  4. Plaats het excisaat in een 2 mL buisje en vries het direct in met vloeibare stikstof voor latere moleculaire analyse, of bewaar het in 4% gebufferd formaldehyde bij kamertemperatuur voor histologie. Snijd het excisaat alternatief in twee stukken om beide analyses uit te voeren.
  5. Euthanaseer het dier na het verwijderen van het wondweefsel door CO2-inhalatie of een alternatieve methode conform de ethische goedkeuring.
    WAARSCHUWING: CO2 veroorzaakt pijn, stress en snelle verzuring van de slijmvliezen voordat het bewustzijn verloren gaat. Gebruik een geregelde debietmeter om de luchtkamer te verdringen.

7. Histochemische kleuring: Fixatie, inbedding en coupesnijden van de wond

  1. Fixeer de biopsieën van het wondweefsel in een 4% formaldehydeloplossing gedurende 3 u bij kamertemperatuur en bewaar ze vervolgens een nacht bij 4 °C.
    WAARSCHUWING: Formaldehyde is toxisch, een krachtige sensibilisator en een bekend menselijk carcinogeen. Hanteer de oplossing in een chemische zuurkast terwijl u persoonlijke beschermingsmiddelen draagt.
  2. Was de biopsieën twee keer met PBS gedurende telkens 30 min.
  3. Vervang het PBS door ethanol (70%) en bewaar dit bij 4 °C.
  4. Bewaar de biopsieën maximaal 24–48 u voor verdere verwerking om verlies van antigenen te voorkomen, of 1–2 weken voor eenvoudige histologische karakterisering.
  5. Was de biopsieën grondig met stromend kraanwater om resterend formaldehyde te verwijderen.
  6. Dehydrateer het weefsel in ethanolbaden in de volgende volgorde: 70% ethanol gedurende 20 min; 2 wissels van 95% ethanol gedurende telkens 20 min; 2 wissels van 100% ethanol gedurende telkens 20 min.
  7. Bewaar de biopsieën bij 65 °C in het paraffinebad.
  8. Giet de gesmolten paraffine in de daarvoor bestemde mal, waarbij de biopsieën in het midden worden geplaatst, en laat dit afkoelen en stollen. De biopsieën moeten loodrecht op het oppervlak van de mal worden georiënteerd om visualisatie van alle huidlagen bij het snijden mogelijk te maken.
  9. Snijd het in paraffine ingebedde weefselblok met een microtoom in coupes van 5 μm dikte en laat deze drijven in een waterbad van 39 °C met gedeïoniseerd water.
  10. Breng de coupes over op objectglazen en laat ze drogen, zodat het weefsel aan het oppervlak van het glas hecht. De objectglazen kunnen bij 4 °C worden bewaard voor later gebruik of direct worden verwerkt voor histochemische kleuring.

8. Hematoxyline en eosine (HE)-kleuring

  1. Ontwas de coupes op warmteplaten bij 60 °C gedurende 30 min, vervolgens in 3 opeenvolgende baden xylol (of een vervanger) van elk 5 min, gevolgd door 1 bad PBS gedurende 2 min.
    WAARSCHUWING: Xylol is toxisch en zeer brandbaar. Verwerk de oplossing in een zuurkast en pas de standaard persoonlijke beschermingsmaatregelen toe.
  2. Voer de rehydratatie uit in 100% ethanol, 96% ethanol en daarna in dH2O, telkens gedurende 5 min.
  3. Pas de hematoxyline-kleuring toe gedurende 5 min en was vervolgens gedurende 5 min onder stromend kraanwater.
  4. Differentieer met 0,3% zuuralcohol (0,3% zoutzuur in 70% ethanol) door de coupes enkele keren kort onder te dompelen, en was daarna gedurende 5 min onder stromend kraanwater.
  5. Kleur met eosine Y (0,2%) gedurende 30 s en was vervolgens gedurende 5 min onder stromend kraanwater.
  6. Dehydrateer in 96% ethanol gedurende 1 min en in 100% ethanol gedurende 1 min.
  7. Breng enkele druppels monteermedium aan en plaats vervolgens het dekglas.
  8. Observeer de coupes onder een lichtmicroscoop en maak digitale foto's.

Resultaten

De chirurgische ingreep voor het excisie-wondmodel bij ratten duurde ongeveer 30 min per dier wanneer deze efficiënt werd uitgevoerd. De verschillende stappen van de modelcreatie, de fixatie van de O-ring en het verbinden zijn weergegeven in Figuur 1.

Figuur 2 laat de voortgang van de wondgenezing op dag 7 en 14 zien. De wondradius werd gemeten in mm en het oppervlak werd berekend met de formule (oppervlak = πr2) waarbij r = 5 mm op dag 0. De progressie van de wondsluiting werd weergegeven als een percentage van het niet-bedekte oppervlak ten opzichte van het geïnduceerde wondoppervlak op dag 14. Met Fiji/ImageJ-software werd een digitale afbeelding van het wondoppervlak geanalyseerd, waarbij de schaal werd gekalibreerd op 10 mm met behulp van een liniaal in de afbeelding (Figuur 2D). Nadat het wondoppervlak was omlijnd en gemeten, werd de oppervlakte weergegeven in mm2. Het resterende wondoppervlak op dag 14 (29,4% ± 10,1%; n = 7) wordt weergegeven in Figuur 3.

De HE-kleuring van de huidwond op dag 14 wordt weergegeven in Figuur 4. De coupes lieten zien dat de biopsieën het natuurlijke genezingsproces van huidwonden volgden, van de periferie naar het centrum. De wondgenezing bleef onvolledig, waarbij het centrum verstoken was van de normale klassieke multilamellaire structuur met een dunne epidermale laag. De dermis vertoonde overvloedige infiltratie van ontstekingscellen, wat belangrijk is voor het proces van fysiologische genezing. Over het algemeen werd het model goed getolereerd door de dieren, met een belemmering van de huidcontractie en een onvolledige maar fysiologische genezing.

figure-results-1
Figuur 1: Procedure voor het creëren van een excisie-wond en het aanbrengen van het verband. (A) Excisie-wond gecreëerd op het dorsale oppervlak van de rat, waarbij een O-ring rond de wondrand is gehecht. (B) Vormbare hydrocolloïde barrièrering aangebracht rond de O-ring. (C) Twee lagen transparante adhesieve folie aangebracht over de hydrocolloïde barrièrering. (D) Schuimverband geplaatst over de transparante adhesieve folie. (E) Elastische adhesieve tape aangebracht om het verband te fixeren. (F–H) Een tubulair retentieverband aangebracht rond de rat, gevolgd door een fixatiewindsel en chirurgische tape in een dubbele schouderconfiguratie om het verband te zekeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Representatieve beelden van wondgenezing. (A) Representatief wondbeeld verkregen op dag 7. (B–D) Representatieve wondbeelden verkregen op dag 14, waarbij de wond met de O-ring ter plaatse wordt getoond (B) en na verwijdering van de O-ring (C,D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Kwantificering van het wondoppervlak op dag 14. Percentage van het resterende wondoppervlak op dag 14, wat de afname van de wondgrootte aantoont. Gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde ± standaarddeviatie (SD) (n = 7). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Histologische evaluatie van wondgenezing op dag 14. Representatieve met hematoxyline en eosine (HE) gekleurde coupes van wondweefsel bij 10×, 20× en 40× vergroting. Het centrum van de wond vertoonde onvolledige re-epithelialisatie, terwijl de wondranden fysiologische epidermale genezing vertoonden. De dermis bevatte overvloedige ontstekingscellen die overeenkwamen met de normale wondgenezingsrespons. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Moeilijk genezende huidwonden zijn wonden die binnen het verwachte tijdsbestek niet door de normale genezingsfasen gaan; deze kunnen het gevolg zijn van chirurgische ingrepen, trauma en allergische reacties, naast het secundair zijn aan vele andere gezondheidsproblemen, waaronder vasculaire insufficiëntie, diabetes en obesitas14. Ondanks de beschikbaarheid van verschillende behandelmethoden genezen veel patiënten niet op de juiste wijze. Het onderzoeken van nieuwe behandelingswegen, zoals celgebaseerde therapieën, chemicaliën, plantextracten en recent ontdekte verbindingen, is cruciaal voor het identificeren van nieuwe beheersingsstrategieën. Het model kan worden toegepast op een breed scala aan wondgenezingsstudies. De vaststelling van een gestandaardiseerd protocol voor het testen van medicijnen, cellen en biologische behandelingen kan preklinisch wondgenezingsonderzoek faciliteren. Het excisie-wondmodel en het hier beschreven protocol pakken de belangrijkste beperkingen van het rattenhuidwondmodel in onderzoek aan: namelijk huidcontractie en wondverzorging.

Titanium spalken worden veelvuldig gebruikt om wondcontractie te verminderen in murine excisional wondmodellen; hun toepassing is echter niet zonder beperkingen. De stijfheid van de spalk verandert de mechanische omgeving van de wond en het omliggende weefsel, wat de cellulaire respons, ontsteking en matrixremodellering kan beïnvloeden. Hierdoor vindt de genezing plaats onder omstandigheden die verschillen van die in onbehandelde knaagdierhuid. Hoewel het beperken van contractie de vergelijkbaarheid met menselijke wondsluiting verbetert, kunnen de mechanische beperkingen die door de spalk worden opgelegd ook artefacten introduceren die het genezingsproces beïnvloeden, wat in overweging moet worden gebracht bij de interpretatie van experimentele bevindingen15.

Hiervoor werden NBR O-ringen in het model gebruikt om huidcontractie te beperken en werden deze aan de oorspronkelijke wondrand bevestigd. De ringen werden goed getolereerd door de dieren en bleven gedurende de 14 dagen van het experiment op hun plaats gefixeerd. Hoewel er kwalitatief geen noemenswaardige wondcontractie bij enig dier werd waargenomen, zou het tatoeëren van de wondrand of andere kwantitatieve methoden de beoordeling van wondcontractie in toekomstige studies versterken. Tatoeëren kan daarom worden beschouwd als een optionele stap in dit protocol.

Het aanbrengen van verbanden beschermde wonden tegen contaminatie en infectie, terwijl de behandeling op de wondplaats behouden bleef, wat cruciaal is voor huidwondgenezingsmodellen. Het komt echter regelmatig voor dat sommige dieren verschillende soorten verbanden verwijderen. Ratten verzorgen en manipuleren vaak het wondgebied, wat kan leiden tot verschuiving of volledige verwijdering van het verband, ondanks het gebruik van adhesieve films of secundaire fixatiemethoden. Het verlies van de verbandbedekking kan de wondomgeving veranderen, de toediening van de behandeling beïnvloeden en de variabiliteit tussen dieren vergroten16. In het hier gepresenteerde model bleef het verband tot 7 dagen intact, zonder dat het door de dieren werd verwijderd of beschadigd. Er waren geen tekenen van huidwondinfectie bij een van de proefdieren. Het is raadzaam om de verbanden wekelijks te vervangen, omdat de pasvorm strakker wordt naarmate de dieren groeien en aan gewicht winnen. Er moet zorgvuldig worden afgewogen tussen een stevige fixatie en de mobiliteit van het dier, waarbij moet worden gewaarborgd dat het verband niet te los zit en niet door de dieren kan worden afgehaald.

Het protocol is flexibel en aanpasbaar. Hoewel wij isofluraan-inhalatie aanbevelen vanwege het snelle herstel en de hoge veiligheid, kunnen onderzoekers alternatief injecteerbare anesthesie gebruiken, zoals ketamine/xylazine, indien een isofluraan-verdampersysteem niet beschikbaar is. Hoewel in deze studie alleen mannelijke ratten zijn gebruikt, is het protocol evenzeer toepasbaar op vrouwelijke ratten.

Wij raden de toediening van buprenorfine als analgeticum aan in combinatie met carprofen, wat de pijnstilling verbetert. Buprenorfine alleen kan mogelijk ook adequate postoperatieve analgesie bieden vanwege de relatief lange werkingsduur. Dit geneesmiddel heeft een minimaal effect op de immuunfunctie in vergelijking met andere opioïden, wat een voordeel biedt voor de wondgenezing in overeenstemming met het ontstekingsproces17. Niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen, die ontstekingen onderdrukken en pijn verminderen, moeten worden vermeden bij het onderzoeken van inflammatie. Hoewel er in deze studie per dier één wond werd aangemaakt, kunnen onderzoekers aanvullende wonden aanmaken met hetzelfde protocol, in overeenstemming met hun ethische goedkeuring en experimentele ontwerp. Overwegingen met betrekking tot dierenwelzijn en de principes van de 3V moeten zorgvuldig worden afgewogen. Onderzoekers moeten voldoen aan de 3V-principes (vervanging, vermindering en verfijning) en het dierenwelzijn respecteren bij het gebruik van diermodellen. Chirurgische procedures moeten in overeenstemming zijn met de richtlijnen en strikt het goedgekeurde dierprotocol volgen. In deze studie werd de wondgenezing beoordeeld door metingen van het wondoppervlak en histologische evaluatie, waarbij re-epithelialisatie een component van de genezingsrespons vertegenwoordigde. De aanwezigheid van de hechtingen in relatie tot de ringfixatie kan de lokale genezing beïnvloeden. Het aantal hechtingen moet consistent zijn tussen de dieren. De evaluatie van het wondoppervlak moet alle rauwe gebieden omvatten, inclusief de hechtplaatsen18. Dit model kan worden ontwikkeld om diverse onderliggende aandoeningen te includeren die geassocieerd zijn met huidwonden, zoals ischemie, diabetes en veroudering. De belangrijkste beperkingen van deze studie waren de afwezigheid van een niet-gesplinte controlegroep, het gebrek aan kwantitatieve beoordeling van wondcontractie en de beperkte kwantitatieve biologische uitkomstmaten buiten de beoordeling van het wondoppervlak en beschrijvende histologie. Tijdens de ontwikkeling van dit model waren diverse technische uitdagingen en probleemoplossingen evident. Een correct passend beschermend vest/verband is essentieel voor het dierenwelzijn en een succesvolle wondgenezing. Een los verband kan door het dier worden verwijderd na het herstel van de anesthesie, terwijl een te strak verband de beweging kan beperken, de circulatie kan belemmeren of de ademhaling kan beïnvloeden. Het verband moet voldoende ruimte laten voor één vinger (of een pink bij kleinere ratten) tussen het verband en de huid. Dieren moeten dagelijks worden gemonitord en het verband moet worden aangepast als er tekenen van ongemak, beperkte mobiliteit of een abnormale houding worden waargenomen. Postoperatieve pijnbeheersing kan variëren tussen individuele dieren vanwege verschillen in analgetische gevoeligheid. Dieren moeten regelmatig worden beoordeeld op pijn-gerelateerde tekenen, waaronder een gebogen rug, verminderde activiteit, verminderde eetlust en gewichtsverlies. Aanvullende analgesie moet indien nodig worden toegediend volgens de institutionele richtlijnen. Consistente fixatie van de ring is cruciaal om wondcontractie te voorkomen. De 8–12 enkelvoudige onderbroken hechtingen moeten gelijkmatig rond de ring worden verdeeld om de spanning uniform te spreiden en optillen of vervorming te voorkomen. Elke hechting moet worden vastgezet met een chirurgische knoop om het losraken tijdens het herstel te minimaliseren. Tot slot raden wij aan om binnen een bepaalde studie ratten van dezelfde stam, leeftijd, lichaamsgewicht en geslacht te gebruiken om variatie te minimaliseren. Daarnaast kan dezelfde ervaren onderzoeker alle chirurgische procedures uitvoeren. Om bias te voorkomen, raden wij dubbelblinde beoordeling aan voor histologische en moleculaire analyses.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te melden.

Dankbetuigingen

De auteurs willen de Regio erkentelijk zijn Östergeötland voor het financieren van dit onderzoek. De auteurs bedanken de heer Anders Delleskog bij CBR, Linköping University voor suggesties, ondersteuning en hulp bij het opzetten van het diermodel. De auteurs danken ook Dr. Maria Ntzouni van de Core Facility, Linköping University voor ondersteuning en begeleiding bij het inbedden, snijden en HE-kleuren van huidweefsel. Speciale dank aan Sallam Abdallah bij het R&D-eenheid voor huid en gekweekte cellen, Koppelingöping University, voor de voorbereiding van huidmonsters en HE-kleuring.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BuprenorfineSalfarm Scandinavia451790              Conc. 0,3 mg/mL
CarprofenZoetis Animal Health191380              Rimadyl 50 mg/mL
Eakin-sealSwemed2076152              Dikte 3 mm
Inbedstation Leica BiosystemsEG1150 H&C              
Eosine Histolab1650              0,2% kleuringsoplossing
Absolute ethanolSolveco1015              Analytische zuiverheid
FixatieverbandSwemed2048934              4 cm x 4 m PA/viscose
FormaldehydeHistolab2176              4% in PBS, pH 7,2-7,4
HaarsnijderSwevetF95000              Snijlengte: 0,5 mm
HemotoxylinHistolab1800              Harris HTX
Histolab-ClearHistolab14250              Xyleenvervanger
IsofluraanVM Pharma448210              Attane vet 1000 mg/g
LekotapeSwemed2056774
MepilexSwemed2059125              7,5x8,5 cm 
Mepore-folieSwemed2057753               6x7 cm inclusief lijst
Micropore chirurgische tape Swemed2063856               1,2 cm x 9,1 m 
MicrotoomThermo Fisher Scientific387861               Microm HM355S
Montagemedium Histolab00840-05               Pertex
O-ringRuilogodB0B1TRQBRT               11 mm binnendiameter 1 mm wanddikte
Hechtdraad (ethilon 4-0)Scandivet21274-A               Niet-absorbeerbaar polyamide     
Weefseldehydratie Leica Biosystems Leica TP1020               
Tubifast 2-richtingsrekSwemed2069292               7,5 cm x 10 m PES/PA

Referenties

  1. Europe advanced wound care market size & share 2025-2034: market size by product, by application, by end use, regional forecast. Global Market Insights. Available from: https://www.gminsights.com/industry-analysis/europe-advanced-wound-care-market.
  2. Nauta AC, Gurtner GC, Longaker MT. Adult stem cells in small animal wound healing models. In: Gourdie RG, Myers TA, editors. Wound Regeneration and Repair Methods and Protocols. New York (NY): Humana Press; 2013. p. 81-98.
  3. Masson-Meyers DS, et al. Experimental models and methods for cutaneous wound healing assessment. Int J Exp Pathol. 2020;101(1-2):21-37.
  4. Wong VW, et al. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. J Biomed Biotechnol. 2011;2011:969618.
  5. Shahin H, et al. MicroRNA-155 mediates multiple gene regulations pertinent to the role of human adipose-derived mesenchymal stem cells in skin regeneration. Front Bioeng Biotechnol. 2024;12:1328504.
  6. Ojeh N, et al. The Wound Reporting in Animal and Human Preclinical Studies (WRAHPS) guidelines. Wound Repair Regen. 2024;33(1):e13232.
  7. Flynn K, et al. Chronic wound healing models. ACS Pharmacol Transl Sci. 2023;6(5):783-801.
  8. Davidson JM, Yu F, Opalenik SR. Splinting strategies to overcome confounding wound contraction in experimental animal models. Adv Wound Care (New Rochelle). 2013;2(4):142-148.
  9. Nuutila K, et al. Titanium wound chambers for wound healing research. Wound Repair Regen. 2016;24(6):1097-1102.
  10. Galiano RD, Michaels J, Dobryansky M, Levine JP, Gurtner GC. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair Regen. 2004;12(4):485-492.
  11. Miller AW, Anderson AR, Suarez-Arnedo A, Segura T. Wound healing splinting devices for faster access and use. JID Innov. 2024;5(2):100332.
  12. Winter GD. Formation of the scab and the rate of epithelialization of superficial wounds in the skin of young domestic pig. Nature. 1962;193:293-294.
  13. Laurano R, Boffito M, Ciardelli G, Chiono V. Wound dressing products: a translational investigation from the bench to the market. Eng Regen. 2022;3(2):182-200.
  14. Rhea L, Dunnwald M. Murine excisional wound healing model and histological morphometric wound analysis. J Vis Exp. 2020;(162):61616.
  15. Davidson JM, Yu F, Opalenik SR. Splinting strategies to overcome confounding wound contraction in experimental animal models. Adv Wound Care (New Rochelle). 2013;2(4):142-148.
  16. Bae SH, Bae YC, Nam SB, Choi SJ. A skin fixation method for decreasing the influence of wound contraction on wound healing in a rat model. Arch Plast Surg. 2012;39(5):457-462.
  17. DeMarco GJ, Nunamaker EA. A review of the effects of pain and analgesia on immune system function and inflammation: relevance for preclinical studies. Comp Med. 2019;69(6):520-534.
  18. Jorgensen LB, Sorensen JA, Jemec GBE, Yderstraede KB. Methods to assess area and volume of wounds: a systematic review. Int Wound J. 2016;13(4):540-553.

Herprints en machtigingen

Tags

Rattenwondmodelwondgenezing van de huidgranulatieweefselwondcontractiere-epithelialisatiehistologische beoordelingdigitale planimetriepreklinische wondtherapeuticaepidermale regeneratie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.